KR102131883B1 - Cre 재조합효소 의존적으로 TREK-1 발현이 억제되는 항우울 동물모델 및 이의 제조방법 - Google Patents
Cre 재조합효소 의존적으로 TREK-1 발현이 억제되는 항우울 동물모델 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102131883B1 KR102131883B1 KR1020180138749A KR20180138749A KR102131883B1 KR 102131883 B1 KR102131883 B1 KR 102131883B1 KR 1020180138749 A KR1020180138749 A KR 1020180138749A KR 20180138749 A KR20180138749 A KR 20180138749A KR 102131883 B1 KR102131883 B1 KR 102131883B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- trek
- gene
- animal
- animal model
- brain
- Prior art date
Links
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 18
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title description 2
- 108010083945 potassium channel protein TREK-1 Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 102100023204 Potassium channel subfamily K member 2 Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims abstract description 22
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 23
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 claims description 19
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 claims description 4
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 claims description 3
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 claims description 2
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 claims 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 35
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012048 forced swim test Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 239000002438 stress hormone Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 3
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 208000005223 Alkalosis Diseases 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N Corticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000037326 chronic stress Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N corticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002442 prefrontal cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000002381 Brain Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 101001049834 Homo sapiens Potassium channel subfamily K member 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 208000008574 Intracranial Hemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002340 alkalosis Effects 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 230000007357 depressive behavior Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000003492 excitotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000063 excitotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
- A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 TREK-1의 선택적 발현억제를 통한 항우울 동물모델의 제조에 관한 것으로서, 본 발명자들은 TREK-1 넉다운 동물모델을 제작하기 위하여, Cre-loxP 유전자 발현 시스템을 이용하여 조건부 TREK-1 shRNA 발현을 유도하는 형질전환 마우스를 제작하고, 상기 형질전환 마우스가 스트레스에 대하여 항우울 효과를 보이는 것을 확인하였다.
본 발명으로 제작된 마우스를 이용하면 항우울 효과를 유도하는 중요 뇌 부위 및 관련 기전 연구에 활용할 수 있으며, TREK-1 유전자와 관련된 다양한 질환연구에도 활용이 가능할 것으로 기대된다.
본 발명으로 제작된 마우스를 이용하면 항우울 효과를 유도하는 중요 뇌 부위 및 관련 기전 연구에 활용할 수 있으며, TREK-1 유전자와 관련된 다양한 질환연구에도 활용이 가능할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 TREK-1 shRNA를 이용한 선택적 발현억제를 통한 항우울 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 TREK-1 shRNA의 발현을 유도하는 서열들을 포함하는 표적벡터(Targeting vector); 상기 표적벡터를 이용하여 생성된 항우울 동물모델 제작용 동물세포; 이를 이용하여 얻은 TREK-1 넉다운(knock-down; KD) 항우울 동물모델; 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
TREK-1(KCNK2, potassium channel, subfamily K, member 2)은 뇌내 신경세포 및 비신경세포에 모두 발현하는 것으로 알려진 포타슘(K+) 이온채널로, 저산소증(hypoxia), 뇌허혈(brain ischemia), 알칼리 혈증 (alkalosis), 전립선암, 고혈압 등의 다양한 질환과 관련되어 있어, 질환 기전 연구에 있어서는 뇌영역 및 주요 세포 유형에 대한 선택적인 조절 연구가 필요하다. 그러나, 현재까지 주요 뇌영역이나 주요 세포 유형에 대한 선택적인 조절 연구가 제대로 이루어지지 않아 우울증에 대한 TREK-1의 작용 기전이 명확하게 밝혀지지 않고 있었다.
기존에 특정 단백질에 대한 발현을 조절하기 위한 방법으로는 해당 단백질의 유전자 중 특정 exon을 제거하는 방식의 동물모델(floxed mice)를 이용하였으나, 제작 비용과 시간이 매우 소요되는 단점이 존재한다. 또한, 질병과 유관한 많은 유전자들의 발현이 실제로는 감소하는 경향을 보이며, 완전히 사라지지는 않는다는 것을 고려할 때, 넉아웃(KO) 동물모델보다 넉다운(Knock-down; KD) 동물모델이 질병과 유관한 연구를 수행할 때는 더욱 유용한 동물모델이 될 수 있다.
이에 본 발명자들은 Cre 재조합효소를 이용하여 선택적으로 TREK-1을 억제함으로써 해마 영역의 TREK-1이 넉다운된 동물모델을 제작하였으며, 동물모델의 행동실험을 통해 해마영역의 TREK-1이 항우울 효과에 중요한 역할을 한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EF-1a 프로모터; 붉은 형광단백질(monomeric Cherry) 유전자; U6 프로모터; 제 1 loxP(locus of X-over P1) 부위; CMV 프로모터; 녹색 형광단백질(Green fluorescence protein) 유전자; 제 2 loxP 부위; TREK-1 shRNA 서열; hGH polyA 서열의 순서로 이루어진 DNA 서열을 포함하는 항우울 동물모델 제작용 TREK-1 넉다운 유전자 표적 벡터(targeting vector)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TREK-1 KD 유전자 표적벡터로 형질 전환시키는 단계를 포함하는 동물세포 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 동물세포를 대리모에 주입하는 단계를 포함하는, TREK-1 KD 항우울 동물모델 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 동물모델의 뇌 영역에 cre 단백질을 발현시키는 바이러스를 감염시키는 단계를 포함하는, 항우울 동물모델 제조방법을 제공한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 EF-1a 프로모터; 붉은 형광단백질(monomeric Cherry) 유전자; U6 프로모터; 제 1 loxP(locus of X-over P1) 부위; CMV 프로모터; 녹색 형광단백질(Green fluorescence protein) 유전자; 제 2 loxP 부위; TREK-1 shRNA 서열; hGH polyA 서열의 순서로 이루어진 DNA 서열을 포함하는 TREK-1 KD(knock-down) 유전자 표적 벡터(targeting vector)를 제공한다.
상기 발현벡터는 Cre-loxP 재조합 시스템을 이용한 것으로, Cre-loxP 재조합 시스템이란 bacteriophage P1 Cre 재조합 효소가 loxP 부위를 인식함으로써 loxP 서열 사이에 있는 shRNA 서열이 잘리게 되고 해당 shRNA 서열이 목표 유전자를 비활성화시키는 것이다.
상기 유전자 표적벡터는 주형으로 pSico 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 유전자 표적벡터의 주형으로 pSico 벡터를 사용함으로써 cre 단백질에 의한 shRNA의 안정적인 발현이 가능하도록 하였다. 또한 유전자의 절단(excision)이 일어나는 경우 리포터 유전자가 같이 절단되어 유전자 침묵 여부를 파악하기 어려웠던 기존 Cre-lox 시스템의 단점을 개선하기 위하여, 2개의 loxP 부위 사이에 있는 리포터 유전자와 상이한 특징을 갖는 리포터 유전자를 loxP 부위 상단에 연결하였는 바, 유전자 억제가 일어나는지 보다 간편하게 관찰할 수 있다는 특징이 있다.
상기 리포터 유전자로는 상이한 색의 형광단백질을 발현하는 유전자가 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 2개의 loxP 부위 사이에 있는 리포터 유전자로 GFP를 이용하였고 프로모터의 하단, loxP 부위 상단에 mCherry 유전자를 클로닝하였으며 loxP 부위 하단에 TREK-1을 타겟으로 하는 유전자를 클로닝하여 도 1과 같은 유전자 개열지도를 포함하는 타겟벡터를 완성하였다. 이와 같은 벡터를 이용하면, Cre 재조합효소의 부재 하에서는 타겟 유전자 특이적 shRNA가 발현되지 않고 붉은 형광단백질(mCherry)과 초록 형광단백질(GFP)이 동시에 발현되어 타겟 유전자가 발현되지 않는 것을 노란색 형광으로 확인할 수 있다. 반면 Cre 재조합 효소의 존재 하에서는 PCMV 및 GFP 영역의 삭제(excision)에 의해 GFP 발현량이 감소하고, shRNA 발현으로 인해 타겟 유전자의 발현이 감소하게 된다. 즉, GFP 발현이 감소하고 붉은빛 형광단백질만 관찰되는 것으로 타겟 유전자의 발현 억제를 확인할 수 있다.
본 발명의 용어, "TREK-1"은 "KNCK-2"와 상호교환적으로 사용되며, 2-기공 도메인 K+(K2P) 채널 패밀리에 속하고, 뇌내 신경세포 및 비신경세포에 모두 발현하는 것으로 알려진 포타슘(K+) 이온채널을 의미한다.
TREK-1은 파킨슨병, 알츠하이머, 정신분열증, 수면장애 등의 질환에 관련되어 있는 단백질로, 최근에 작용 기작이 연구되어 성상교세포의 글루타메이트의 빠른 방출에 관여하며, 글루타메이트 빠른 방출 기작과 관련된 중독(addiction), 글루타메이트 과방출에 의한 발작(epileptic seizures), 발작 동안의 글루타메이트 유발 흥분 독성(glutamate induced excitotoxicity), 허혈(ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상 및 저산소증(hypoxia) 의 원인이 될 수 있다는 사실이 밝혀졌으나, 뇌의 어느 영역의 TREK-1 단백질이 우울증의 발병에 중요하게 작용하는지는 아직까지 밝혀진 바 없다.
상기 TREK-1을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어, "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산분자를 의미하며, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다. shRNA는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성할 수 있고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 shRNA는 TREK-1에 특이적으로 작용하여 TREK-1 mRNA 분자를 절단하여 RNA간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써 상기 TREK-1을 억제할 수 있다. shRNA 및 siRNA 제조방법은 특별히 한정되지 않으며 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 표적벡터로 형질전환하는 단계를 포함하는 동물세포 제조방법; 상기 방법을 이용하여 수득한 동물세포를 대리모에 주입하는 단계를 포함하는 TREK-1 KD 항우울 동물모델의 제조방법; 상기 방법을 이용하여 수득한 동물모델의 뇌 영역에 cre 단백질을 발현시키는 바이러스를 감염시키는 단계를 포함하는, 항우울 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 표적벡터로 형질전환하는 단계를 포함하는 동물세포 제조방법은 전술한 표적벡터를 수정란에 도입하는 단계일 수 있다.
구체적으로, 상기 벡터를 도입하는 단계를 통해 형질전환 동물을 제작할 수 있다. 본 발명의 용어, "형질전환"은 유전물질을 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법으로서, 상기 형질전환은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(nonviral delivery technique), 그리고 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation)등이 사용될 수 있다. 구체적으로, 마우스의 형질전환 방법으로는 수정란에 전핵 주입으로 클로닝된 유전자를 직접 주사하거나, 착상 전(preimplantation) 분열 단계의 배아에 외부 유전정보를 갖는 레트로바이러스로 감염시키거나, 배아줄기 세포(embryonic stem cell)에 외부 DNA를 주입하는 방법이 사용될 수 있다.
상기 벡터를 수정란으로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 제한 없이 포함될 수 있으며, 예를 들어, 1) 수정 직후 전핵 단계에 있는 접합체의 웅성전핵 내에 미세조작 기술로 유전자를 주입하는 미세주입법 (Microinjection technique), 2) 배아 줄기세포 (embryonic stem cells)에 유전자를 삽입하고 이를 배반포기의 수정란 내에 이식하는 방법 (Stem cell insertion technique), 3) 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터를 이용하여 유전자를 수정란 내에 주입하는 방법 (retrovirus insertion technique), 및 4) 수컷의 정소 내에 유전자를 주입하여 정자에 삽입시키고, 이를 난자와 수정시키는 방법 (sperm-mediated gene transfer technique) 등이 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서는 제작된 표적벡터의 주요 부위를 포함하도록 절단하여 벡터를 선형화한 후 이를 마우스 수정란에 주사하는 미세주입법을 이용하여 형질전환 생쥐를 제작하였다.
상기 항우울 동물모델 제조 방법은 상기 표적벡터로 형질전환하여 수득한 동물세포를 대리모에 주입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 항우울 동물모델 제조 방법은 상기 동물세포를 대리모에 주입하여 수득한 TREK-1 KD 항우울 동물모델에 cre 단백질을 발현시키는 바이러스를 감염시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
전술한 유전자 표적벡터가 도입된 형질전환동물에 Cre 재조합효소가 작용할 경우 shRNA가 발현되어 타겟 유전자의 활성이 억제될 수 있으므로, Cre 재조합효소의 전달 영역 및 시기를 선택함으로써 보다 효과적으로 항우울 동물모델을 제작할 수 있으며, 동물모델의 특정 생에 주기에서만 TREK-1을 억제함으로써 우울증의 연령별 특성을 관찰하기 용이하다는 이점이 있다.
Cre를 과발현하도록 조작한 마우스를 이용하지 않는 경우, 상기 Cre 재조합효소는 특정세포 또는 조직에 직접 도입될 수 있으며, 구체적으로는 엑소솜(exosome), 바이러스 등에 의한 감염 또는 상동재조합(homologous recombination)에 의한 타겟팅 등으로 도입될 수 있고, 보다 구체적으로는 바이러스를 이용한 감염에 의해 도입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 "뇌 영역"은 TREK-1이 발현되는 부위라면 제한없이 포함되며, 구체적으로는 뇌 영역의 선조체(striatum), 전두엽(frontal lobe), 해마(hippocampus) 부위일 수 있고, 보다 구체적으로는 해마 부위일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 해마 부위 내의 치상회(dentate gyrus) 영역일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 해마 부위 내의 치상회 영역 특이적으로 TREK-1을 억제한 마우스에 만성 스트레스를 유도한 후 행동실험 및 스트레스 호르몬 수치를 측정하여, 상기 특이적으로 TREK-1을 억제할 경우 항우울 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방법에 의해 제조된, 항우울증 동물모델을 제공한다.
전술한 방법을 이용하여 뇌영역별, 뇌세포별, 연령별 항우울증 동물모델을 제작할 수 있으며, 상기 동물모델의 행동 특성을 확인하여 우울증의 특성 연구에 본 발명의 항우울증 동물모델을 사용할 수 있다.
본 발명의 항우울증 마우스 모델 제조방법은 제작이 간편하고 유전자 조작 여부 확인이 간편하므로, 기존의 넉아웃 마우스보다 빠르고 쉬우며 경제적이라는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 제조방법을 통해 뇌영역별, 뇌세포별, 연령별로 선택하여 TREK-1 유전자를 억제할 수 있으므로, 우울증의 작용 기전 연구뿐 아니라 TREK-1의 발현이 중요한 다른 뇌영역의 기전 연구에도 활용이 가능하다.
도 1은 본 발명에서 이용한 벡터의 주요 유전자 부위의 개열지도이다.
도 2a는 각각의 뇌 샘플에서 녹색 형광단백질 발현량을 웨스턴 블럿(western blot)으로 정량분석한 결과이다.
도 2b는 웨스턴 블럿 실험 결과 가장 높은 발현을 보인 생쥐의 유전형 분석(genotyping)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3은 TREK-1의 shRNA(short hairpin RNA)가 삽입된 벡터 구조에 Cre 재조합 효소를 처리하였을 때 형광단백질(GFP 및 mCherry)의 변화 및 타겟 유전자의 발현 양상을 나타내는 모식도이다.
도 4는 생쥐의 해마(hippocampus)에 면역염색을 수행한 결과이다. 도 4a는 대조군인 전전두엽의 면역염색 결과이고, 도 4b는 실험을 대략적으로 나타낸 도면이며 도 4c는 생쥐 해마부위에 Cre 재조합효소(recombinase)를 발현하는 바이러스를 주사하고 면역염색을 통해 관찰한 결과이다.
도 5는 TREK-1의 전사체와 단백질의 발현양을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하여 측정한 결과이다.
도 6a는 TREK-1의 해마 특이적 억제를 수행한 생쥐의 행동실험 스케줄을 간략하게 나타낸 것이고, 도 6b는 혈중 코르티코스테론 측정치, 도 6c는 강제수영실험(Forced swim test, FST)과 꼬리현수실험(Tail suspension test, TST) 수행결과 부동성을 측정한 결과이다.
도 2a는 각각의 뇌 샘플에서 녹색 형광단백질 발현량을 웨스턴 블럿(western blot)으로 정량분석한 결과이다.
도 2b는 웨스턴 블럿 실험 결과 가장 높은 발현을 보인 생쥐의 유전형 분석(genotyping)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3은 TREK-1의 shRNA(short hairpin RNA)가 삽입된 벡터 구조에 Cre 재조합 효소를 처리하였을 때 형광단백질(GFP 및 mCherry)의 변화 및 타겟 유전자의 발현 양상을 나타내는 모식도이다.
도 4는 생쥐의 해마(hippocampus)에 면역염색을 수행한 결과이다. 도 4a는 대조군인 전전두엽의 면역염색 결과이고, 도 4b는 실험을 대략적으로 나타낸 도면이며 도 4c는 생쥐 해마부위에 Cre 재조합효소(recombinase)를 발현하는 바이러스를 주사하고 면역염색을 통해 관찰한 결과이다.
도 5는 TREK-1의 전사체와 단백질의 발현양을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하여 측정한 결과이다.
도 6a는 TREK-1의 해마 특이적 억제를 수행한 생쥐의 행동실험 스케줄을 간략하게 나타낸 것이고, 도 6b는 혈중 코르티코스테론 측정치, 도 6c는 강제수영실험(Forced swim test, FST)과 꼬리현수실험(Tail suspension test, TST) 수행결과 부동성을 측정한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 형질전환 생쥐 제조
특정 뇌 영역 내지는 특정 뇌세포에서 TREK-1의 역할을 확인하기 위하여, 조직 선택적으로 TREK-1의 발현을 억제하고 이를 확인할 수 있는 벡터를 제작하였으며 이를 도입하여 형질전환 생쥐를 제작하였다.
구체적으로 EF1a 프로모터 하단에 순서대로 mCherry, U6-loxP-CMV-GFP-loxP 및 TREK-1 shRNA 서열이 오도록 벡터를 제작하였으며 이를 포함하는 선형의 유전자 절편을 확보하였다. 상기 유전자절편의 개열지도를 도 1에 나타내었다.
상기 유전자 절편을 생쥐의 수정란에 도입하여, 목표 유전자가 생쥐의 유전체로 도입되고 다음 세대에 전달된 것이 확인된 7종의 생쥐를 확보하였다. 7종의 생쥐로부터 뇌조직 샘플을 채취하여 녹색 형광 단백질(GFP) 발현량을 측정하기 위한 웨스턴 블럿을 수행하였다. 정량적 분석 결과 73번 생쥐(Line-73)가 GFP를 가장 많이 발현하고 있음을 확인하였으며, 해당 생쥐의 2세대에 대한 유전체 분석을 수행한 결과 세대간에 지속적으로 유전자 전달이 이루어지고 있음을 확인하였다(도 2).
이와 같은 실험결과를 통해, 제작한 벡터를 이용하여 생쥐가 성공적으로 형질전환되었음을 확인하였는바, 이후 실험에 73번 생쥐를 사용하였다.
실시예 2: Cre 재조합효소 발현 바이러스를 이용한 TREK-1 선택적 넉다운 확인
실시예 1에서 제조한 형질전환 생쥐의 해마조직에서 TREK-1을 선택적으로 넉다운시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 2-1: 조직특이적 넉다운 확인
실시예 1에서 제조한 형질전환 생쥐의 해마 부위에 mCherry와 Cre 재조합효소를 발현하는 바이러스를 감염시켰으며 대조군으로는 mCherry만 발현하는 바이러스를 감염시켰다. 바이러스를 주사하지 않거나 바이러스를 주사한 생쥐의 해마 영역에 대해 면역염색을 수행하여 도 4에 나타내었다.
실험 결과, 바이러스를 감염시키지 않은 해마영역은 어둡게 나타났으나(도 4a) 바이러스를 주사한 생쥐의 해마영역에서 mCherry로 인해 붉은빛이 관찰되었다. 또한, Cre 재조합효소를 발현하는 바이러스를 감염시킨 생쥐의 해마조직에서는 붉은빛만 관찰된 반면, mCherry만 발현하는 바이러스를 감염시킨 경우 mCherry와 GFP가 동시에 발현되어 노란빛을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, Cre 재조합효소를 뇌조직 특이적으로 발현시킴으로써 TREK-1 발현을 뇌조직 특이적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-2: 해마에서의 TREK-1 넉다운의 정량적 분석
해마 부위의 TREK-1 발현 감소를 유전자 및 단백질 수준에서 정량적으로 분석하기 위해 실시예 2-1과 같이 Cre 재조합효소와 mCherry를 발현하는 바이러스(Cre-mCherry) 또는 mCherry만 발현하는 바이러스(Con-mCherry)를 감염시켜 RT-PCR 및 웨스턴 블럿 실험을 수행하였다. 비교를 위해 바이러스를 주사하지 않은 전전두엽(Prefrontal Cortex)에서의 TREK-1의 발현을 측정하여 도 5에 나타내었다.
실험 결과, 대조군인 mCherry만 발현하는 바이러스를 주사한 경우 전전두엽 및 해마에서의 TREK-1 단백질과 mRNA 발현 수준이 유사하게 측정되었으나, Cre-mCherry 바이러스를 주사한 경우 단백질 및 mRNA 발현 수준이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 Cre 재조합효소에 의해 TREK-1의 발현이 조절됨을 확인하였는바, 이로부터 Cre 재조합효소의 양을 조절하여 TREK-1 발현수준을 정량적으로 조절할 수 있음을 유추할 수 있다.
종합하면, 본 발명의 벡터와 Cre 재조합효소를 이용하여 뇌조직 특이적으로 TREK-1 발현이 감소된 마우스를 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 해마 특이적인 TREK-1 넉다운 효과의 확인
실시예 1 및 2의 결과를 토대로, 해마 특이적으로 TREK-1을 넉다운시킨 경우 항우울효과가 나타나는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 2와 마찬가지로 실시예 1에서 제조한 형질전환 생쥐의 해마 부위에 mCherry와 Cre 재조합효소를 발현하는 바이러스를 감염시켜 해마 특이적으로 TREK-1의 발현을 감소시킨 동물 모델을 이용하였으며 대조군으로는 mCherry만 발현하는 바이러스를 사용하였다.
실시예 3-1: 스트레스 호르몬 수치 측정
항우울 효과를 생리적인 측면에서 확인하기 위하여 TREK-1 특이적 억제 마우스의 스트레스 호르몬 수준을 측정하였다.
구체적으로, 매일 동일한 시간대에 6시간씩 50 ml 둥근 튜브에 생쥐를 가두어 전혀 움직일 수 없는 결박모델을 만들고 이로 인한 만성 스트레스를 유도하였다. 14일간 지속적으로 스트레스를 가한 후 대표적인 스트레스 호르몬인 코르티코스론(corticosterone)의 혈중 수치를 측정하였다.
실험 결과, 대조군에 비해 TREK-1을 해마 선택적으로 억제한 동물 모델에서 코르티코스테론의 수치가 유의하게 낮은 것을 확인하였다.
실시예 3-2: 스트레스 행동실험
행동실험으로는 강제수영실험(Forced swim test, FST)과 꼬리현수실험(Tail suspension test, TST)을 수행하였다.
구체적으로, 강제실험수영은 발이 닿지 않는 원형수조에 쥐를 빠뜨린 다음 8분간 머물게 하여 마지막 6분동안의 부동시간을 측정하여 수행하였다. 또한 테이프를 이용해 생쥐의 꼬리에 테이프를 감아 꼬리 끝부분을 30 cm의 상자에 고정시켜 총 8분간 거꾸로 매달아 놓은 후, 마지막 6분간만 부동행동을 측정하여 꼬리현수실험을 수행하였다. FST 및 TST를 우울행동에 대한 평가지표로 사용하였다.
FST 실험결과 부동행동이 감소하는 경향성을 나타냈고 TST 실험결과 또한 부동행동이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
종합하면, 해마 선택적으로 TREK-1을 억제한 마우스에서 항우울 효과를 확인하였는바, 해마조직에서 TREK-1의 선택적 억제를 통해 우울증을 완화 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> Animal model of cre-dependent anti-depressant phenotype and
manufacturing method thereof
<130> KPA180855-KR
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TREK-1 shRNA
<400> 1
gcgtggagat ctacgacaag tttcaagaga acttgtcgta gatctccacg ctttttt 57
Claims (8)
- EF-1a 프로모터; 붉은 형광단백질(monomeric Cherry) 유전자; U6 프로모터; 제 1 loxP(locus of X-over P1) 부위; CMV 프로모터; 녹색 형광단백질(Green fluorescence protein) 유전자; 제 2 loxP 부위; TREK-1 shRNA 서열; hGH polyA 서열의 순서로 이루어진 DNA 서열을 포함하는 TREK-1 KD(knock-down) 유전자 표적 벡터(targeting vector).
- 제1항의 표적벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 동물세포 제조방법으로, 상기 동물은 인간을 제외한 동물인, 동물세포 제조방법.
- 제2항의 방법으로 제조된 동물세포를 인간을 제외한 대리모에 주입하는 단계를 포함하는, TREK-1 KD 항우울 동물모델 제조방법으로, 상기 동물은 인간을 제외한 동물인, 항우울 동물모델 제조방법.
- 제3항의 방법으로 제조된 동물모델의 뇌 영역에 cre 단백질을 발현시키는 바이러스를 감염시키는 단계를 포함하는, 항우울 동물모델 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 뇌 영역은 뇌의 해마(hippocampus) 부위인 것인, 항우울 동물모델 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 뇌 영역은 뇌의 해마(hippocampus) 부위 내 치상회(dentate gyrus) 영역인 것인, 항우울 동물모델 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 TREK-1 shRNA 유전자는 서열번호 1로 구성되는 것인, 유전자 표적벡터.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것인, 항우울 동물모델 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180138749A KR102131883B1 (ko) | 2018-11-13 | 2018-11-13 | Cre 재조합효소 의존적으로 TREK-1 발현이 억제되는 항우울 동물모델 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180138749A KR102131883B1 (ko) | 2018-11-13 | 2018-11-13 | Cre 재조합효소 의존적으로 TREK-1 발현이 억제되는 항우울 동물모델 및 이의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200055279A KR20200055279A (ko) | 2020-05-21 |
| KR102131883B1 true KR102131883B1 (ko) | 2020-07-09 |
Family
ID=70910309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180138749A KR102131883B1 (ko) | 2018-11-13 | 2018-11-13 | Cre 재조합효소 의존적으로 TREK-1 발현이 억제되는 항우울 동물모델 및 이의 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102131883B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102562784B1 (ko) * | 2020-10-23 | 2023-08-03 | 한국과학기술연구원 | 신규 벡터 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101919485B1 (ko) * | 2017-03-09 | 2018-11-16 | 고려대학교 산학협력단 | 우울증 예방 또는 치료를 위한 콜린성 유전자의 용도 |
-
2018
- 2018-11-13 KR KR1020180138749A patent/KR102131883B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Nature Communications. 2014, vol. 5:3227, pp. 1-15. |
| Nature Neuroscience. 2006, vol. 9, no. 9, pp. 1134-1141. |
| Nucleic Acids Research. 2007, vol. 35, no. 12, e90. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200055279A (ko) | 2020-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102076784B1 (ko) | 세포 형질감염 방법 | |
| CN107075514A (zh) | 亨廷顿氏病的治疗化合物 | |
| CN110438160B (zh) | 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用 | |
| Hims et al. | A humanized IKBKAP transgenic mouse models a tissue-specific human splicing defect | |
| Jordan et al. | Expression of green fluorescent protein in the chicken using in vivo transfection of the piggyBac transposon | |
| Baup et al. | Variegation and silencing in a lentiviral-based murine transgenic model | |
| WO2010010887A1 (ja) | 組織発現プロモーター | |
| Kleinhammer et al. | Conditional RNAi in mice | |
| KR102131883B1 (ko) | Cre 재조합효소 의존적으로 TREK-1 발현이 억제되는 항우울 동물모델 및 이의 제조방법 | |
| JP2003144141A (ja) | ＲＮＡｉ効果が増強したＥＳ細胞 | |
| EP2258858A1 (en) | Transgenic LSD1 animal model for cancer | |
| CN110218743B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法 | |
| O′ Shea et al. | Transplacental RNAi: Deciphering Gene Function in the Postimplantation‐Staged Embryo | |
| US8895715B2 (en) | S100B mini-promoters | |
| CA2651423A1 (en) | Compositions and methods for generating transgenic animals | |
| US9611304B2 (en) | TNNT1 mini-promoters | |
| US10851388B2 (en) | Tissue selective transgene expression | |
| US9546357B2 (en) | UGT8 mini-promoters | |
| US20180208942A1 (en) | Nr2e1 mini-promoters | |
| Leung et al. | Molecular techniques used to explore glutamate receptors in synaptic plasticity and memory | |
| US10253330B2 (en) | CLDN5 mini-promoters | |
| WO2006085590A1 (ja) | TetR発現非ヒトトランスジェニック動物及びその製造方法 | |
| US8383800B2 (en) | MK167 mini-promoters | |
| EP1580264A1 (en) | Construction of knockdown animal by transferring double-stranded rna expression vector | |
| CN114958923A (zh) | 一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |