KR102562784B1 - 신규 벡터 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 벡터, 이를 제조하기 위한 조성물 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.
특정 유전자의 발현 억제 기술은 RNAi (RNA interference) 기술을 기반으로 하며, 보통 상보적으로 합성된 두 가닥의 짧은 RNA를 이용하거나 짧은 RNA 발현을 유도하는 H1 혹은 U6 프로모터에 의해 short hairpin RNA (shRNA)가 발현될 수 있도록 제작된 벡터 시스템을 사용한다.
하지만, 두 방식 모두 적용된 모든 세포에서 작용하기 때문에, 선택적 발현이 불가능하였고, 이에 특정 세포에서만 발현 억제가 필요할 경우 사용이 불가능하였다.
1994년, Tyler Jacks 박사 연구팀은 cre-lox 시스템을 사용함으로써 짧은 RNA만 발현이 가능한 U6 프로모터와 shRNA 사이에 CMV 프로모터와 형광 단백질 유전자 서열을 두 개의 loxP와 함께 삽입하여 cre가 있을 경우, CMV 프로모터와 형광 단백질 유전자가 제거되면서 U6 프로모터와 shRNA가 근접하게 만나 발현이 유도될 수 있도록 하는 조건적 발현 시스템 (Conditional RNA interference)을 보고하였다(미국공개특허 US 2005-0289659 A1).
이 시스템은 생체내 (in vivo) 적용을 목적으로 하여 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터 시스템으로 개발되었으며, 현재까지도 많은 연구자들이 세포 선택적 (cell-type specific) 발현 억제를 위하여 이 시스템 (pSico vector)을 사용하고 있다.
그러나, 이 시스템은 Cre 재조합효소를 발현하는 세포에서는 형광단백질이 제거되기 때문에 실제로 발현이 억제되는 세포를 육안으로 확인하기 어려우며, 면역염색실험 등의 추가적인 실험을 진행하여야 확인할 수 있다는 단점이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 예의 연구 노력한 끝에 Cre 재조합효소가 있는 경우에만 선택적으로 형광단백질과 shRNA를 동시에 발현할 수 있는 dual-AAV 벡터를 개발하였으며, leaky한 발현 없이 타겟 세포에서만 Cre 의존적으로 발현이 조절되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 벡터를 제조하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 벡터 또는 조성물을 포함하는, 타겟 유전자 발현 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 타겟 유전자 발현 억제용 조성물을 이용한, 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 벡터 또는 조성물을 이용하는 타겟 유전자 발현이 억제된 동물 모델의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 동물 모델을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 (a) RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터;
(b) 서로 반대방향으로 배열된 제1 loxP 부위 한 쌍;
(c) 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자;
(d) 서로 반대방향으로 배열된 제2 loxP 부위 한 쌍;
(e) 형광 단백질을 코딩하는 서열; 및
(f) RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터를 포함하는 벡터로,
(b) 및 (d)는 (c)와 (e)에 대해 이중-플록스드(double-floxed) 구조를 형성하며,
상기 (a)는 (c)와 동일한 방향으로, (f)는 (e)와 동일한 방향으로, (c)는 (e)와 반대 방향으로 연결되고,
(d)는 TATA box 서열을 포함하는 TATAlox이며,
(a) 하단의 (b)와 (d)의 loxP 부위 사이에 TATA box 서열이 추가로 존재하는, 벡터를 제공한다.
본 발명에서, "벡터"는 유전 물질의 인위적 운반자로 사용되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서, "작동 가능하게 연결된" 은 프로모터와 같은 조절 서열(regulatory sequence)이 적절한 위치에 배치되어 프로모터 하단에 연결된 서열의 발현을 가능하게 하는 구성을 의미한다.
본 발명의 벡터는 Cre-loxP 시스템에 의한 재조합 방식을 이용하여, 벡터에 포함된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
본 발명에서, "Cre-loxP 시스템" 이란 Cre 재조합효소가 두 개의 loxP 부위를 인식하여 재조합을 일으키는 원리를 이용한 시스템을 말한다.
Cre 재조합 효소 (cre recombinase)는 P1 박테리오파지(bacteriophage)에서 분리된 단백질로, 두 개의 loxP 부위를 인식하여 재조합을 일으킨다.
loxP 부위는 palindromic 시퀀스와 spacer 부위를 포함하는데, spacer 부위는 회문 구조가 아니므로 loxP에는 방향성이 생기게 된다. Cre 재조합 효소는 palindromic 시퀀스에 결합하고 spacer 부위의 DNA를 자르고 교환한 후 DNA를 다시 연결 시킨다.
이를 이용하여, 한 쌍의 loxP 부위 사이에 유전자가 존재하도록 배열함으로써 Cre 재조합효소 의존적인 유전자 조작이 가능하다. 상기 한 쌍의 loxP 부위 사이에 인접하여 존재하는 염기서열을 "플록스드(floxed; lox 서열과 인접)" 서열이라고 한다.
상기 spacer의 방향성에 따라, 플록스드 서열의 삭제 (excision) 또는 역전 (inversion)이 일어난다. 구체적으로, loxP 부위가 같은 방향이면 삭제가 일어나고, 반대방향으로 위치하고 있으면 서열이 역전된다.
한편, 도 1에 도시된 바와 같은 2쌍의 상이한 loxP 부위가 배열된 구조를 본원에서는 "이중-플록스드(double-floxed)" 구조라고 지칭한다. 즉, 도 1의 두 쌍의 loxP 부위는, 도 1에 표시된 유전자(gene)에 대해 이중-플록스드 구조를 형성하는 것으로 지칭할 수 있다.
도 1에 표시된 바와 같이, 이중-플록스드 구조는 Cre 재조합 효소의 존재 하에 2쌍의 loxP (loxP, loxP') 부위 중 어느 한 쌍에 의한 유전자 역전이 발생하고, 이에 따라 다른 한 쌍의 loxP 부위는 같은 방향으로 배열되며, 이로 인해, 같은 방향으로 배열된 loxP에 의한 결실이 일어나게 된다.
상기 이중-플록스드 구조를 이용하여 Cre 재조합효소 의존적으로 특정 유전자의 발현이 가능하도록 배열할 수 있다. 예를 들어, 이중 플록스드 구조를 형성하는 2쌍의 loxP 부위를 각각 제1 loxP 부위, 제2 loxP 부위라고 지칭하고, 2쌍의 loxP 부위 사이에 위치하는 유전자는 제1 loxP 부위 상단의 프로모터와 반대 배향인 경우, Cre 재조합 효소 존재 하에서만 상기 유전자의 발현이 가능하게 된다.
이중-플록스드 구조에서, 2쌍의 loxP 부위 사이에 위치하는 유전자가 2종류일 경우, Cre 재조합효소 의존적으로 2가지 유전자의 발현을 조절하는 것이 가능하다. 일 예로, 2종류의 유전자를 각각 제1 유전자와 제2 유전자로 지칭하고, 제1 프로모터가 작동되는 방향을 정방향, 그와 반대 방향을 역방향이라고 지칭하는 경우,
제1 프로모터(정방향) - 제1 loxP 부위(정방향) - 제2 loxP 부위(정방향) - 제2 유전자(정방향) - 제1 유전자 (역방향) - 제1 loxP 부위(역방향) - 제2 loxP 부위 (역방향) - 제2 프로모터 (역방향)
과 같이 배열하면, Cre 재조합효소 존재 하에, 각각 제1 유전자는 제1 프로모터와, 제2 유전자는 제2 프로모터와 동일한 방향으로 연결되고; 제1 프로모터-제1 유전자와 제2 프로모터-제2 유전자는 서로 반대 방향으로 존재하게 된다.
따라서 본 발명에서 제공하는 벡터는,
(a) RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터;
(b) 서로 반대방향으로 배열된 제1 loxP 부위 한 쌍;
(c) 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자;
(d) 서로 반대방향으로 배열된, 제2 loxP 부위 한 쌍;
(e) 형광 단백질을 코딩하는 서열; 및
(f) RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터를 포함하는 벡터로,
(b) 및 (d)는 (c)와 (e)에 대해 이중-플록스드(double-floxed) 구조를 형성하며,
(a)는 (c)와 동일한 방향으로, (f)는 (e)와 동일한 방향으로, (c)는 (e)와 반대 방향으로 연결되어 있는 구조를 가지는 바,
이는 Cre 재조합 효소의 존재 하에 (b) 및 (d) 중 어느 하나의 loxP 쌍 사이의 서열이 역전(inversion)되면, (f)의 프로모터와 (c)의 서열이; (a)의 프로모터와 (e)의 형광 단백질을 코딩하는 서열이 각각 동일한 방향으로 연결되는 배열을 가진다.
본 발명에서 제공하는 벡터는, (a) 하단의 (b)의 loxP 부위와 (d)의 loxP 부위 사이에 TATA box 서열을 추가로 삽입하여, Cre 재조합효소 존재 하에서만 형광 단백질과 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 서열이 동시에 발현되도록 한 것에 그 특징이 있다.
따라서 본 발명에서 제공하는 벡터는, Cre 의존적으로 (e)의 프로모터와 (b)의 RNA 서열이 작동 가능하게 연결되고, (f)의 프로모터와 (c)의 서열이 작동 가능하게 연결되고, (a)의 프로모터와 (e) 의 형광 단백질을 코딩하는 서열이 작동 가능하게 연결되는 배열을 갖는 것일 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 벡터에서 상기 (b)의 제1 loxP 부위는 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, (d)의 제2 loxP 부위는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 벡터는 도 7의 개열지도를 가지는 것일 수 있다. 상기 벡터에서 loxP는 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, TATAlox는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 발명의 벡터는 도 2b의 개열지도를 가지는 것일 수 있다. 구체적으로는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "TATA box"는 프로모터 서열의 일종이며, 주로 진핵세포에서 발견되는 보존된 DNA 영역이다. TATA box의 서열은 약 25-35 bp의 보존된 서열로 이루어지며, 주로 TATAAA의 염기서열을 포함한다. 구체적으로 본 발명의 TATA box 서열은 TATAAA 서열일 수 있다.
본 발명에서, "TATAlox"는 TATA box 서열을 포함하는 loxP 서열을 의미한다. 상기 TATAlox는 구체적으로 TATAAA 서열을 포함하는 loxP 서열을 지칭하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 TATAlox는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "타겟 유전자"는 벡터가 도입되어 발현 수준을 조절하고자 하는 목적 유전자를 의미한다. 구체적으로, 상기 발현 수준의 조절은 발현 수준의 감소일 수 있다.
상기 타겟 유전자는 예를 들면, 칼륨 채널인 TWIK (TWIK-1, TWIK-2, KCNK7), TREK (TREK-1, TREK-2, TRAAK), TASK (TASK-1, TASK-3, TASK-5), TALK (TASK-2, TALK-1, TALK-2), THIK (THIK-1, THIK-2), 및 TRESK를 코딩하는 유전자 중 어느 하나일 수 있고, 일 예로, TREK-1을 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, RNA-간섭은 일반적으로 double strand RNA에 의해 서열 특이적으로 타겟으로 하는 mRNA 서열이 분해되어 특정 유전자의 발현을 억제하는 현상을 의미한다.
본 발명에서, 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자는 dsRNA이면 특별히 제한되지 않으나, siRNA, shRNA 및 miRNA 중 적절한 핵산 분자를 선택할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자는 shRNA일 수 있다.
상기 핵산 분자의 서열은 타겟 유전자 서열에 따라 당업자가 공지된 방법을 토대로 적절히 결정할 수 있다.
본 발명에서, 형광 단백질은 고유한 파장 영역의 빛을 흡수하여 여기(excitation)되고, 그 에너지가 기저 상태로 회복되면서 독특한 파장대의 빛을 방출하는 단백질을 말한다. 형광 단백질을 이용하면 살아있는 세포나 생체 내에서 세포 성장 및 분화 양상을 실시간으로 분석할 수 있다는 이점이 있다.
본 발명의 벡터는 shRNA가 발현되는 조건에서 형광 단백질이 함께 발현되는 구조를 가지므로, 유전자 발현의 억제를 형광 단백질의 발현으로 쉽게 확인할 수 있다는 이점을 갖는다.
본 발명에서 사용될 수 있는 형광 단백질의 종류의 예시는 mCherry, DsRed2, mScarlet, mStrawberry, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby, mPlum, mKate2, mNeptune, CFP, GFP, Emerald, Superfolder GFP, TagGFP2, mClover2, mClover3, mEos2 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “RNA 폴리머레이즈 Ⅱ”는 “PolⅡ” 라고도 불리며 DNA를 mRNA로 전사하는 기능을 가지는 진핵세포의 단백질 복합체를 지칭하며 일반적으로 핵 안에서 발견된다. “RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터”는 상기 RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 전사를 개시하도록 하는 서열을 포함한다. 상기 프로모터의 예시로는 EF1α, CAGGS, CMV, PGK, UbiC 프로모터 등이 있다. 구체적으로 본 발명의 RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터는 EF1α 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 “RNA 폴리머레이즈 Ⅲ”는 “PolⅢ”라고도 불리며 tRNA, 5s RNA와 같은 짧은 길이의 RNA를 중합하는 역할을 하는 단백질 복합체를 지칭한다. “RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터”는 상기 RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 전사를 개시하도록 하는 서열을 포함한다. 상기 프로모터의 예시로는 7SK, U6, H1, T7 프로모터 등이 있다. 구체적으로 본 발명의 RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터는 U6 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로 EF1α 프로모터는 단백질 등의 발현에, U6 프로모터는 shRNA와 같은 짧은 RNA 서열의 발현에 널리 사용된다. 그러나 본 발명의 일 구현예에서는, EF1α 프로모터를 형광 단백질을 코딩하는 서열과 작동 가능하게 연결하고, U6 프로모터를 shRNA의 발현에 작동 가능하게 연결하기 위하여 도 2a와 같은 벡터를 제작한 결과, Cre 재조합 효소가 존재하지 않아 서열의 역전이 일어나지 않은 상태에서도 shRNA가 EF1α 프로모터에 의해 발현되어 유전자 발현의 억제가 일어나 정확성이 떨어지는 문제점이 있음을 발견하였다. 이에, TATA box 유전자 서열을 추가적으로 삽입하여, 도 2b의 개열지도를 갖는 벡터를 제작하여, leaky한 발현 없이 타겟 세포에서만 Cre 의존적으로 발현이 조절되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터와 loxP 부위를 포함하는 제1 벡터; 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자를 삽입할 수 있는 제한효소 서열, TATAlox 부위 및 형광단백질 유전자를 포함하는 제2벡터; 및 RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터, loxP 부위 및 TATAlox 부위를 포함하는 제3벡터를 포함하는, 벡터 제조용 조성물을 제공한다.
상기 용어, RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터, 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자, loxP, TATAlox, 형광단백질 유전자, RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터 및 벡터에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 조성물에서 제3벡터의 RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터는 RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터와 상대적으로 역방향일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물에는 벡터의 재조합에 필요한 다른 임의의 구성이 포함될 수 있다. 또한 상기 조성물에 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자를 추가로 삽입하여, 전술한 본 발명의 벡터를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 3종의 벡터 및 shRNA의 삽입을 통해, (a) RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터; (b) 서로 반대방향으로 배열된 제1 loxP 부위 한 쌍; (c) 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자; (d) 서로 반대방향으로 배열된, 제2 loxP 부위 한 쌍; (e) 형광 단백질을 코딩하는 서열; 및 (f) RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터를 포함하는 벡터로, (b) 및 (d)는 (c)와 (e)에 대해 이중-플록스드(double-floxed) 구조를 형성하며, (a)는 (c)와 동일한 방향으로, (f)는 (e)와 동일한 방향으로, (c)는 (e)와 반대 방향으로 연결되어, Cre 재조합 효소의 존재 하에 (b) 및 (d) 중 어느 하나의 loxP 쌍 사이의 서열이 역전(inversion)되면, (f)의 프로모터와 (c)의 서열이; (a)의 프로모터와 (e)의 형광 단백질을 코딩하는 서열이 각각 작동 가능하게 연결되는 배열을 가지며, (d)는 TATA box 서열을 포함하는 TATAlox이며, (a) 하단의 (b)의 loxP 부위와 (d)의 loxP 부위 사이에 TATA box 서열이 추가로 존재하는 벡터를 제조하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 전술한 본 발명의 벡터; 또는 상기 벡터 제조용 조성물 및 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자를 Cre 재조합효소를 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 제공한다.
상기 벡터, 이의 제조용 조성물, 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 세포는 인간을 제외한 동물의 세포 또는 분리된 세포일 수 있다.
전술한 바와 같이 본 발명의 벡터는 Cre 재조합 효소의 존재 하에 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자가 발현되어 타겟 유전자의 발현을 억제하므로, 목적하는 유전자의 발현 억제에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 상기 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 이용하여 특정 유전자의 과발현을 원인으로 하는 질환의 치료에도 널리 적용될 수 있다. 특정 유전자의 과발현을 원인으로 하는 질환은 당업계에 널리 알려져 있으며, 목적하는 질환에 따라 타겟 유전자를 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 타겟 유전자를 TREK-1로 하여 제조한 본 발명의 벡터를 Cre 재조합효소를 발현하는 세포에 도입한 결과, TREK-1의 발현 수준이 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 전술한 본 발명의 벡터; 또는 상기 벡터 제조용 조성물 및 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자를 포함하는, 타겟 유전자의 발현 억제용 조성물을 제공한다.
상기 벡터, 이의 제조용 조성물, 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 조성물에는, Cre 재조합효소가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 전술한 본 발명의 벡터; 또는 상기 벡터 제조용 조성물 및 타겟 유전자의 RNA- 간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자를 인간을 제외한 동물의 Cre 재조합효소를 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 타겟 유전자의 발현이 억제된 동물 모델의 제조 방법; 및 이에 의해 제조된 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 벡터는 세포에서 선택적으로 타겟 유전자의 발현 조절이 가능하므로, 다양한 질환 동물 모델의 제조에 사용될 수 있고, 그 밖에 동물 모델에서 특정 조직에서 타겟 유전자의 발현 변화에 따른 행동 변화를 확인하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 하나의 형광단백질을 발현하도록 제작하기 때문에 다양한 파장대의 형광 단백질 (BFP, GFP, RFP, Far-Red protein)과 함께 적용이 가능하여, 다른 형광단백질을 발현하는 시스템에서도 동시 사용이 가능한 넓은 적용범위를 가진다. 또한, HEK293 세포주를 이용한 생체 외(in vitro) 시스템과 세포 유형 선택적 cre-BFP 바이러스와 함께 적용한 생체 내 (in vivo) 시스템에서 효과적으로 작용할 수 있다. 아울러, leaky한 발현 없이 타겟 세포에서만 Cre 의존적으로 엄격하게 발현이 조절되므로 선택적인 발현 조절이 가능하다.
이를 동물 모델에 적용하였을 경우 적출된 조직에서 바로 발현이 억제된 세포를 확인할 수 있으므로 전기생리학 실험 등에 유용하게 사용될 수 있으며, 동물의 행동 실험을 진행한 이후에 행동의 변화와 발현 억제의 양상이 상호연관성이 있는지 또한 빠르고 정확한 분석이 가능하므로, 세포 선택적 발현 조절이 요구되는 뇌과학 등 여러 분야의 연구에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 이중 플록스드(double floxed) 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 벡터를 제작하기 위한 과정을 나타내는 모식도이며 도 2b는 TATAbox를 추가 삽입하여 최종 제작된 벡터의 개열지도를 나타낸다. 도 2b에서 loxP511은 TATAlox 서열(서열번호 2)에 해당한다.
도 3는 본 발명에 따라 최초로 제조된 벡터(v1)를 플라스미드 (plasmid) 형태로 HEK293T 세포주에 도입한 후, 타겟이 되는 mouse TREK-1 유전자와 동시에 발현하여 타겟 유전자의 발현 감소를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 도 2a에서 제작된 벡터의 단점을 보완하여 새롭게 제조된 도 2b의 벡터 (Red-CREon)를 플라스미드 형태로 HEK293T 세포주에 도입한 후, 타겟이 되는 mouse TREK-1 유전자와 동시에 발현하여 Cre 의존적으로 타겟유전자의 발현이 감소하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 의해 제작된 Red-CREon 벡터를 내재적인 TREK-1의 발현이 확인된 인간 전립선암 세포주 (PC3)에 도입하여 Cre 의존적으로 TREK-1의 감소가 확인된 결과를 나타낸 도면이다. 도 5a는 내재적인 TREK-1 mRNA의 발현 감소를 보여주었으며, 도 5b는 내재적인 TREK-1 단백질의 감소를 보여주었다. 도 5c는 알려진 결과와 마찬가지로 TREK-1의 감소와 함께 세포 증식이 감소된 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 Red-CREon 벡터가 세포 선택적 Cre virus와 함께 사용되면 생체 내에서 세포 선택적인 타겟 유전자 발현의 감소를 보여준다는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6a는 세포선택적 발현 확인을 위해 제작한 AAV 벡터의 간략한 모식도이며, 도 6b는 생체 내에서 Red-CREon벡터와 함께 적용하였을 경우, Cre에 의해 발현된 mCherry 신호를 생쥐 해마 조직에서 보여주고 있으며, 도 6c는 Red-Creon에 의해 타겟유전자인 TREK-1이 Cre 의존적으로 감소되고 있음을 보여준다.
도 7은 본 발명에서 제공하는 벡터의 개열지도를 표시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 벡터를 제작하기 위한 과정을 나타내는 모식도이며 도 2b는 TATAbox를 추가 삽입하여 최종 제작된 벡터의 개열지도를 나타낸다. 도 2b에서 loxP511은 TATAlox 서열(서열번호 2)에 해당한다.
도 3는 본 발명에 따라 최초로 제조된 벡터(v1)를 플라스미드 (plasmid) 형태로 HEK293T 세포주에 도입한 후, 타겟이 되는 mouse TREK-1 유전자와 동시에 발현하여 타겟 유전자의 발현 감소를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 도 2a에서 제작된 벡터의 단점을 보완하여 새롭게 제조된 도 2b의 벡터 (Red-CREon)를 플라스미드 형태로 HEK293T 세포주에 도입한 후, 타겟이 되는 mouse TREK-1 유전자와 동시에 발현하여 Cre 의존적으로 타겟유전자의 발현이 감소하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 의해 제작된 Red-CREon 벡터를 내재적인 TREK-1의 발현이 확인된 인간 전립선암 세포주 (PC3)에 도입하여 Cre 의존적으로 TREK-1의 감소가 확인된 결과를 나타낸 도면이다. 도 5a는 내재적인 TREK-1 mRNA의 발현 감소를 보여주었으며, 도 5b는 내재적인 TREK-1 단백질의 감소를 보여주었다. 도 5c는 알려진 결과와 마찬가지로 TREK-1의 감소와 함께 세포 증식이 감소된 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 Red-CREon 벡터가 세포 선택적 Cre virus와 함께 사용되면 생체 내에서 세포 선택적인 타겟 유전자 발현의 감소를 보여준다는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6a는 세포선택적 발현 확인을 위해 제작한 AAV 벡터의 간략한 모식도이며, 도 6b는 생체 내에서 Red-CREon벡터와 함께 적용하였을 경우, Cre에 의해 발현된 mCherry 신호를 생쥐 해마 조직에서 보여주고 있으며, 도 6c는 Red-Creon에 의해 타겟유전자인 TREK-1이 Cre 의존적으로 감소되고 있음을 보여준다.
도 7은 본 발명에서 제공하는 벡터의 개열지도를 표시한 것이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: CREon 벡터의 제작
세포 선택적인 shRNA 발현과, 이 세포를 표지할 수 있는 형광단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터를 제작하고자 하였다.
구체적으로 도 2a와 같이 프로모터와 발현 유전자 서열이 서로 상보적인 위치에 존재하도록 벡터서열을 디자인하였다. 1차로 디자인한 dual AAV 벡터를 이용한 실험 결과를 도 3에 나타내었다.
확인 결과, 형광단백질인 mCherry의 발현이 Cre 의존적으로 잘 조절되었으나, shRNA 발현은 EF-1α 프로모터에 의해서도 가능함을 알 수 있었다.
따라서, 도 2a의 gBlcok-2 Entry 플라스미드의 SalI site와 TATAlox(loxP511; 서열번호 2) 사이에 추가적인 TATA box 유전자를 삽입하여 EF-1α 프로모터에 의해서는 shRNA가 정확한 위치에서 전사를 시작할 수 없도록 도 2b의 개열지도를 가지는 벡터(서열번호 3)를 제작하여, 실험 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 타겟유전자인 TREK-1이 Cre가 있는 경우에서만 선택적으로 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, western blot 실험을 통해 정량적으로 분석을 진행하여 목적하였던 벡터의 제작을 완성하였다.
제작된 도 2b의 벡터를 AAV-Red-CREon 벡터라고 명명하였다.
실시예 2: CREon 벡터를 이용한 타겟 유전자 발현 억제 실험 (in vitro)
상기 실시예 1에서 확보한 AAV-Red-CREon 벡터를 내재적인 TREK-1이 다량 존재하는 것으로 보고된 인간 전립선암 세포주 (PC3)에 적용하여 Cre 의존적인 타겟유전자의 감소를 유도하는지 확인하였다.
AAV-Red-CREon 벡터는 플라스미드 형태로 사용하였으며, CMV 프로모터에 의해 발현이 유도되는 HA-Cre 벡터와 함께 PC3 세포주에 전기천공법(electroporation)으로 도입하였다.
사용된 인간 TREK-1 shRNA의 서열은 기존에 PC3 세포주를 이용한 실험에서 사용된 것과 동일한 서열을 사용하였으며, 유전자를 도입한 지 3일이 경과되는 시점에 내재적인 mRNA 양과 단백질 양의 감소를 확인하여, 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, Cre가 발현되고 타겟 유전자에 선택적인 shRNA가 발현하는 조건에서만 타겟유전자인 TREK-1의 mRNA와 단백질이 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
특히, 도 5c에서 기존에 TREK-1 shRNA를 PC3 세포주에 발현하였을 때 관찰되었던 세포 증식 억제 효과가 본 발명으로 제작된 AAV-Red-CREon 벡터와 Cre 벡터가 함께 있을 때에만 완벽하게 재현되는 것을 확인할 수 있었다.
이는 본 발명의 벡터의 on/off 기능이 Cre 의존적으로 매우 엄격하게 조절되고 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 3: CREon 벡터를 이용한 타겟 유전자 발현 억제 실험 (in vivo)
실시예 1에서 제작한 CREon 벡터가 생체 내에서 세포 선택적으로 작동할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
먼저 신경세포에서 Cre를 발현할 수 있도록, 신경세포 선택적인 Cre AAV 벡터 (hSyn promoter)와 별아교세포 선택적인 Cre AAV 벡터 (GFAP promoter)를 추가적으로 제작하였다(도 6a). 이 벡터는 Cre 유전자의 발현을 쉽게 확인할 수 있도록 BFP (Blue fluorescent protein) 유전자를 함께 발현하도록 제작하였다. 대조군 실험을 위하여 Cre 유전자가 제거된 벡터를 함께 사용하였다(CREoff).
shRNA가 충분히 발현할 수 있도록 생쥐의 해마에 삽입한 뒤, 3주 경과 후 형광면역염색화학법을 이용하여 유전자 발현을 확인하였다.
그 결과, 바이러스를 감염시킨 후 3주가 경과하면 모든 해마에서 강한 BFP 단백질의 신호 (Blue)가 관찰되었으며, 더불어 Cre가 있는 경우에 있어서만 본 발명의 CREon 벡터에 의해 유도된 mCherry 단백질의 신호 (Red) 가 관찰되었다(도 6b).
타겟 유전자인 TREK-1의 감소를 확인하기 위하여 고정된 조직을 이용하여 형광면역염색화학법 (Immunohistochemistry) 실험을 수행하였으며, 그 결과 BFP와 mCherry 신호가 보이는 세포 (Cre 발현세포)에서는 타겟 유전자인 TREK-1의 발현이 거의 관찰되지 않는다는 것을 확인하였다(도 6c).
이는 본 발명으로 제작된 AAV-CREon 벡터가 생체 내에서도 Cre 의존적으로 새로운 형광단백질 (mCherry)과 shRNA를 선택적으로 잘 발현하고 있음을 보여주는 결과이다.
이를 통해, 본 발명의 벡터가 leaky한 발현 없이 Cre 의존적으로 잘 작동하며 in vivo에서도 발현의 억제를 용이하게 확인할 수 있는 것임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> Novel vector and a method for regulating expression of gene using
thereof
<130> KPA200962-KR
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxP
<400> 1
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TATAlox
<400> 2
ataacttcgt atagtataaa ttatacgaag ttat 34
<210> 3
<211> 6684
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV-CREon Vector
<220>
<221> repeat_region
<222> (1)..(141)
<223> AAV2 ITR
<220>
<221> promoter
<222> (242)..(1419)
<223> EF-1a promoter
<220>
<221> intron
<222> (473)..(1410)
<223> EF-1a intron A
<220>
<221> protein_bind
<222> (1444)..(1477)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (1498)..(1503)
<223> TATAbox
<220>
<221> protein_bind
<222> (1532)..(1565)
<223> loxP511
<220>
<221> misc_feature
<222> (1577)..(1597)
<223> shRNA(TREK1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1607)..(1627)
<223> shRNA(TREK1)
<220>
<221> CDS
<222> (1652)..(2362)
<223> mCherry
<220>
<221> misc_feature
<222> (2359)..(2368)
<223> Kozak sequence
<220>
<221> protein_bind
<222> (2385)..(2418)
<223> loxP
<220>
<221> protein_bind
<222> (2469)..(2502)
<223> loxP511
<220>
<221> misc_feature
<222> (2811)..(3399)
<223> WPRE
<220>
<221> CDS
<222> (3282)..(3293)
<223> Factor Xa site
<220>
<221> polyA_signal
<222> (3431)..(3907)
<223> hGH poly(A) signal
<220>
<221> repeat_region
<222> (3947)..(4087)
<223> AAV2 ITR
<220>
<221> rep_origin
<222> (4162)..(4617)
<223> f1 ori
<220>
<221> promoter
<222> (4899)..(5003)
<223> AmpR promoter
<220>
<221> CDS
<222> (5004)..(5861)
<223> AmpR
<220>
<221> rep_origin
<222> (6035)..(6623)
<223> ori
<400> 3
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtaagct ttgcaaagat ggataaagtt 180
ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat 240
tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 300
gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 360
tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 420
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 480
cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 540
tacttccact ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 600
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 660
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 720
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 780
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 840
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 900
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 960
ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 1020
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 1080
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 1140
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 1200
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1260
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1320
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1380
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gtaccggatc ctctagatcc 1440
ggaataactt cgtatagcat acattatacg aagttatgtc gacgtgtgtt ttgagactat 1500
aaagctgcta ttagcaatat gaaacctctt aataacttcg tatagtataa attatacgaa 1560
gttataagcc ttgtttgcgt ggagatctac gacaagtttc aagagaactt gtcgtagatc 1620
tccacgcttt tttactagtt actaggatcc g cta ctt gta cag ctc 1666
Leu Leu Val Gln Leu
1 5
gtc cat gcc gcc ggt gga gtg gcg gcc ctc ggc gcg ttc gta ctg ttc 1714
Val His Ala Ala Gly Gly Val Ala Ala Leu Gly Ala Phe Val Leu Phe
10 15 20
cac gat ggt gta gtc ctc gtt gtg gga ggt gat gtc caa ctt gat gtt 1762
His Asp Gly Val Val Leu Val Val Gly Gly Asp Val Gln Leu Asp Val
25 30 35
gac gtt gta ggc gcc ggg cag ctg cac ggg ctt ctt ggc ctt gta ggt 1810
Asp Val Val Gly Ala Gly Gln Leu His Gly Leu Leu Gly Leu Val Gly
40 45 50
ggt ctt gac ctc agc gtc gta gtg gcc gcc gtc ctt cag ctt cag cct 1858
Gly Leu Asp Leu Ser Val Val Val Ala Ala Val Leu Gln Leu Gln Pro
55 60 65
ctg ctt gat ctc gcc ctt cag ggc gcc gtc ctc ggg gta cat ccg ctc 1906
Leu Leu Asp Leu Ala Leu Gln Gly Ala Val Leu Gly Val His Pro Leu
70 75 80 85
gga gga ggc ctc cca gcc cat tgt ctt ctt ctg cat tac ggg gcc gtc 1954
Gly Gly Gly Leu Pro Ala His Cys Leu Leu Leu His Tyr Gly Ala Val
90 95 100
gga ggg gaa gtt ggt gcc gcg cag ctt cac ctt gta gat gaa ctc gcc 2002
Gly Gly Glu Val Gly Ala Ala Gln Leu His Leu Val Asp Glu Leu Ala
105 110 115
gtc ctg cag gga gga gtc ctg ggt cac ggt cac cac gcc gcc gtc ctc 2050
Val Leu Gln Gly Gly Val Leu Gly His Gly His His Ala Ala Val Leu
120 125 130
gaa gtt cat cac gcg ctc cca ctt gaa gcc ctc ggg gaa gga cag ctt 2098
Glu Val His His Ala Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gly Glu Gly Gln Leu
135 140 145
caa gta gtc ggg gat gtc ggc ggg gtg ctt cac gta ggc ctt gga gcc 2146
Gln Val Val Gly Asp Val Gly Gly Val Leu His Val Gly Leu Gly Ala
150 155 160 165
gta cat gaa ctg agg gga cag gat gtc cca ggc gaa ggg cag ggg gcc 2194
Val His Glu Leu Arg Gly Gln Asp Val Pro Gly Glu Gly Gln Gly Ala
170 175 180
acc ctt ggt cac ctt cag ctt ggc ggt ctg ggt gcc ctc gta ggg gcg 2242
Thr Leu Gly His Leu Gln Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Val Gly Ala
185 190 195
gcc ctc gcc ctc gcc ctc gat ctc gaa ctc gtg gcc gtt cac gga gcc 2290
Ala Leu Ala Leu Ala Leu Asp Leu Glu Leu Val Ala Val His Gly Ala
200 205 210
ctc cat gtg cac ctt gaa gcg cat gaa ctc ctt gat gat ggc cat gtt 2338
Leu His Val His Leu Glu Ala His Glu Leu Leu Asp Asp Gly His Val
215 220 225
atc ctc ctc gcc ctt gct cac cat ggtggcgg tggcgaccgg tagcataact 2390
Ile Leu Leu Ala Leu Ala His His
230 235
tcgtataatg tatgctatac gaagttattt gccttaaccc agaaattatc actgttattc 2450
tttagaatgg tgcaaagaat aacttcgtat aatttatact atacgaagtt ataattactt 2510
tacagttagg gtgagtttcc ttttgtgctg ttttttaaaa taataattta gtatttgtat 2570
ctcttataga aatccaagcc tatcatgtaa aatgtagcta gtattaaaaa gaacagatta 2630
tctgtctttt atcgcacatt aagcctctat agttactagg aaatattata tgcaaattaa 2690
ccggggcagg ggagtagccg agcttctccc acaagtctgt gcgagggggc cggcgcgggc 2750
ctagagatgg cggcgtcgga tctctagagc gggcccgaat tcgatatcaa gcttatcgat 2810
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 2870
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 2930
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 2990
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 3050
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 3110
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 3170
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 3230
gcctatgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc t 3281
tcg gcc ctc aat ccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 3330
Ser Ala Leu Asn
1
tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 3390
cctccccgca tcgataccga gcgctgctcg agagatctac gggtggcatc cctgtgaccc 3450
ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct 3510
aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg 3570
gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt 3630
ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc 3690
ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat 3750
gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag 3810
gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg 3870
attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg 3930
cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 3990
cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 4050
gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc 4110
cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct 4170
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 4230
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 4290
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 4350
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 4410
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 4470
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt 4530
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 4590
ttaacaaaat attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 4650
ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 4710
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 4770
agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 4830
ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 4890
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 4950
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agt 5003
atg agt att caa cat ttc cgt gtc gcc ctt att ccc ttt ttt gcg gca 5051
Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala
1 5 10 15
ttt tgc ctt cct gtt ttt gct cac cca gaa acg ctg gtg aaa gta aaa 5099
Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys
20 25 30
gat gct gaa gat cag ttg ggt gca cga gtg ggt tac atc gaa ctg gat 5147
Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp
35 40 45
ctc aac agc ggt aag atc ctt gag agt ttt cgc ccc gaa gaa cgt ttt 5195
Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe
50 55 60
cca atg atg agc act ttt aaa gtt ctg cta tgt ggc gcg gta tta tcc 5243
Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser
65 70 75 80
cgt att gac gcc ggg caa gag caa ctc ggt cgc cgc ata cac tat tct 5291
Arg Ile Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser
85 90 95
cag aat gac ttg gtt gag tac tca cca gtc aca gaa aag cat ctt acg 5339
Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr
100 105 110
gat ggc atg aca gta aga gaa tta tgc agt gct gcc ata acc atg agt 5387
Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser
115 120 125
gat aac act gcg gcc aac tta ctt ctg aca acg atc gga gga ccg aag 5435
Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys
130 135 140
gag cta acc gct ttt ttg cac aac atg ggg gat cat gta act cgc ctt 5483
Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu
145 150 155 160
gat cgt tgg gaa ccg gag ctg aat gaa gcc ata cca aac gac gag cgt 5531
Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg
165 170 175
gac acc acg atg cct gta gca atg gca aca acg ttg cgc aaa cta tta 5579
Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu
180 185 190
act ggc gaa cta ctt act cta gct tcc cgg caa caa tta ata gac tgg 5627
Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp
195 200 205
atg gag gcg gat aaa gtt gca gga cca ctt ctg cgc tcg gcc ctt ccg 5675
Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro
210 215 220
gct ggc tgg ttt att gct gat aaa tct gga gcc ggt gag cgt ggg tct 5723
Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser
225 230 235 240
cgc ggt atc att gca gca ctg ggg cca gat ggt aag ccc tcc cgt atc 5771
Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile
245 250 255
gta gtt atc tac acg acg ggg agt cag gca act atg gat gaa cga aat 5819
Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn
260 265 270
aga cag atc gct gag ata ggt gcc tca ctg att aag cat tgg taactgtca 5870
Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp
275 280 285
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 5930
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 5990
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 6050
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 6110
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 6170
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 6230
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 6290
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 6350
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 6410
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 6470
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 6530
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 6590
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 6650
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgt 6684
Claims (14)
- (a) RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터;
(b) 서로 반대방향으로 배열된 제1 loxP 부위 한 쌍;
(c) 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자;
(d) 서로 반대방향으로 배열된 제2 loxP 부위 한 쌍;
(e) 형광 단백질을 코딩하는 서열; 및
(f) RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터를 포함하는 벡터로,
상기 (b) 및 (d)는 (c)와 (e)에 대해 이중-플록스드(double-floxed) 구조를 형성하며,
(a)는 (c)와 동일한 방향으로, (f)는 (e)와 동일한 방향으로, (c)는 (e)와 반대 방향으로 연결되고,
(d)는 TATA box 서열을 포함하는 TATAlox이며,
(a) 하단의 (b)의 loxP 부위와 (d)의 loxP 부위 사이에 TATA box 서열이 추가로 존재하는, 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 Cre 재조합 효소의 존재 하에 (b) 및 (d) 중 어느 하나의 loxP 쌍 사이의 서열에 역전(inversion)이 발생하여, (f)의 프로모터와 (c)의 서열이 작동 가능하게 연결되고, (a)의 프로모터와 (e)의 형광 단백질을 코딩하는 서열이 작동 가능하게 연결되는 배열을 갖는 것인, 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 하기 도 7의 개열지도를 갖는 것인, 벡터:
[도 7]
.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 하기 도 2b의 개열지도를 갖는 것인, 벡터:
[도 2b]
.
- 제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자 서열에 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자는 shRNA인 것인, 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 (a)의 프로모터는 EF1α 프로모터인 것인, 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 (f)의 프로모터는 U6 프로모터인 것인, 벡터.
- RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의해 작동가능한 프로모터와 loxP 부위를 포함하는 제1 벡터;
타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자를 삽입할 수 있는 제한효소 서열, TATAlox 부위 및 형광단백질 유전자를 포함하는 제2벡터; 및
RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 작동가능한 프로모터, loxP 부위 및 TATAlox 부위를 포함하는 제3벡터를 포함하는,
제1항의 벡터 제조용 조성물.
- 제8항의 조성물 및 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자; 또는 제1항의 벡터를 Cre 재조합효소를 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 타겟 유전자의 발현 억제 방법으로,
상기 세포는 인간을 제외한 동물의 세포 또는 분리된 세포인 것인, 방법.
- 삭제
- 제9항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 TREK-1인 것인, 타겟 유전자의 발현 억제 방법.
- 제1항의 벡터 또는 제8항의 조성물을 포함하는, 타겟 유전자의 발현 억제용 조성물.
- 제8항의 조성물 및 타겟 유전자의 RNA-간섭을 일으킬 수 있는 핵산 분자; 또는 제1항의 벡터를, 인간을 제외한 동물의 Cre 재조합효소를 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 타겟 유전자의 발현이 억제된 동물 모델의 제조 방법.
- 제13항의 방법으로 제조된, 동물 모델.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020200138651A KR102562784B1 (ko) | 2020-10-23 | 2020-10-23 | 신규 벡터 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법 |
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KR102131883B1 (ko) * | 2018-11-13 | 2020-07-09 | 한국과학기술연구원 | Cre 재조합효소 의존적으로 TREK-1 발현이 억제되는 항우울 동물모델 및 이의 제조방법 |
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2020
- 2020-10-23 KR KR1020200138651A patent/KR102562784B1/ko active IP Right Grant
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US20050289659A1 (en) | 2004-05-18 | 2005-12-29 | Jacks E T | Cre-lox based method for conditional RNA interference |
Non-Patent Citations (1)
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이상현, 포항공과대학교 대학원 생명과학과, 석사학위 논문(2016.02.) |
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