CN114958923A - 一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于转基因技术领域，具体地涉及一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用，所述方法包括使用CRISPR‑Cas9技术靶向敲除小鼠Nr1d1基因基因；进一步的，包括合成针对Nr1d1基因的gRNA1，序列如SEQ ID NO.1所示；合成针对Nr1d1基因的gRNA2，序列如SEQ ID NO.2所示；我们选择小鼠Nr1d1基因的Exon 2~5之间的序列作为敲除区域，敲除的Exon 3起始于整个编码区域的1.73%，敲除的Exon 2~5占据整个编码区域的66.12%。本发明所述的构建方法步骤简单，方法易行，周期短并且得到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以加快研究孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder，ASD）的致病机理的进度，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。

Description

一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于转基因技术领域，具体地涉及一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder，ASD)是一种儿童早期疾病，以社交及交流障碍和行为刻板两大核心症状为主要表现的神经发育障碍性疾病，主要包括儿童孤独症、阿斯伯格综合征以及未分类的广泛性发育障碍。它是一种先天精神疾病，与后天家庭教养无关。该病男女患病率差异显著，在我国男女患病率比例为6～9：1，据统计，目前有1.5％的儿童被诊断为孤独症谱系障碍，该疾病与发育早期问题有关，是一种先天精神疾病，与后天家庭教育无关。该疾病的发生经常伴有其他疾病，包括多动症、恐慌、自残和睡眠障碍，其中睡眠障碍 (包括失眠或睡眠周期短)是最常见和最痛苦的问题之一，据估计自闭症患儿中 44～83％具有睡眠问题，而正常发育的儿童25～40％有睡眠问题。
Nr1d1是昼夜节律相关基因，是大多数生物体内细胞的基本调节因子，位于人类基因组17q11.2，在大脑中高表达，是ASD的易感区域。在哺乳动物中，单个细胞的自主节律是由下丘脑中央生物钟的激素和神经元信号来控制，并且每天通过光线进行重置。生物钟的核心机制是由两个连锁的转录负反馈环组成的。主环中转录因子Bmal1和Clock形成DNA结合异源二聚体，驱动Per1/2/3和Cry1/2 基因的表达，这些蛋白最终会抑制Bmal1-Clock的活性。另外该环还会驱动Nr1d1 和Nr1d2的节律性表达，而Nr1d1-Nr1d2也会有节律的负反馈抑制Bma11-Clock 的表达。近期研究表明Nr1d1以及其他可能影响其产物功能的昼夜相关基因突变在ASD患者匹配对照表中频繁出现，因此生物钟机制的受损有可能与ASD的发病机制密切相关。为了研究该疾病的发病机制以及开发更为有效的治疗方法，构建该疾病的实验模型对于疾病的研究不可或缺，如何快速准确的构建Nr1d1基因敲除小鼠动物模型，是目前急需解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，所述方法包括使用 CRISPR-Cas9技术靶向敲除小鼠Nr1d1基因基因。本发明利用CRISPR/Cas9技术构建Nr1d1基因敲除小鼠模型，Nr1d1作为诱导ASD的生理相关基因其功能将被进一步揭示，一些与Nr1d1相关的因子及其作用机制也将被逐步发现，进而揭示这一功能系统的全貌，为ASD发病机制的深入研究奠定基础，也为该疾病的诊断及临床治疗提供重要的参考依据。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
合成针对Nr1d1基因的gRNA1，序列如SEQ ID NO.1所示；
合成针对Nr1d1基因的gRNA2，序列如SEQ ID NO.2所示。。
使用上述gRNA,减少脱靶的可能性。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，选择小鼠Nr1d1 基因的Exon 2～5之间的序列作为敲除区域，敲除的Exon 2起始于整个编码区域的1.73％，敲除的Exon 2～5占据整个编码区域的66.12％。
Nr1d1基因位于小鼠11号染色体上，共有2种转录本形式且Nr1d1-202不包含ORF序列。我们选择Nr1d1-201作为目标转录本，该转录本共有8个外显子 (Exon),起始密码子ATG位于Exon 1，终止密码子TGA位于Exon 8。本发明共设计两条gRNA，gRNA1靶向切割Exon 2的5’端，gRNA2靶向切割Exon 5的3’端，这两条gRNA在Cas9蛋白的作用下可以切除Exon 2～5之间的序列，敲除的 Exon 2起始于整个编码区域的1.73％，敲除的Exon 2～5占据整个编码区域的 66.12％(且该敲除区域不含有其他已知基因)。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
从NCBI数据库中下载小鼠Nr1d1基因的核苷酸序列，并进行同源比对，选择敲除Nr1d1基因Exon 2～5，包含Nr1d1基因整个编码区的66.12％；根据小鼠 Nr1d1基因的序列，设计并合成了两条针对该基因的gRNA序列：
gRNA1＝SEQ ID NO.1＝5’-CTAATAACGACTAGGTTGACCGG-3’；
gRNA2＝SEQ ID NO.2＝5’-CGAGGGGGCCTTGGAAGATTGGG-3’。
敲除区域序列是非3的倍数，将会导致移码突变造成编码区域提前终止，从而达到敲除Nr1d1的目的。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)敲除方案设计：选择敲除Nr1d1基因Exon 2～5，包含Nr1d1基因整个编码区的66.12％；
2)gRNA序列设计：合成针对Nr1d1基因的gRNA1和gRNA2；
3)原核注射：获得F0小鼠；
4)Nr1d1基因敲除小鼠的PCR鉴定：获得F1小鼠，筛选纯合子，即为Nr1d1 基因敲除小鼠动物模型。
本发明所述的方法仅需26天就可以生产F0小鼠，相比现有方法大大节省时间，并提高了成功率。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，所述步骤3)原核注射包括以下步骤：
选取4～6周龄SPF级雌性小鼠作为卵子供体，小鼠腹腔注射PMSG，48h后注射hCG，随即与生殖能力正常的种公鼠进行交配，从输卵管收集小鼠受精卵，消化洗涤之后置于37℃培养箱中待用。将Cas9 mRNA与人工合成的针对Nr1d1基因敲除的gRNA1和gRNA2混匀后通过显微注射技术注射到小鼠受精卵胞质或原核中，注射后的胚胎保存在特定培养基中，37℃条件下5％CO2温箱中培养至3.5 天，每15～30个囊胚移植到代孕雌鼠的输卵管壶腹部中，代孕鼠每隔一周进行体重称量，初步判断是否怀孕，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠5天后剪鼠尾编号送检。
上述鉴定方法简单，整个试验周期短。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，所述步骤4)Nr1d1 基因敲除小鼠的PCR鉴定包括以下步骤：
根据Nr1d1基因敲除区域，分别在Exon 2的5’端以及Exon 5的3’端设计一对引物F1R1；对出生的F0小鼠鼠尾提取DNA，进行PCR扩增并测序，该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为642bp，在野生型小鼠中以相同的程序不能扩增出产物，但更改扩增条件可在野生型小鼠中扩增的产物为2785bp；随后将鉴定正确的阳性小鼠与野生型小鼠交配获得F1小鼠，小鼠出生14天后进行PCR扩增鉴定小鼠纯杂合，使用两对引物F1R1和F1R2，纯合小鼠扩增产物为642bp，杂合小鼠扩增产物为573bp/642bp，野生型小鼠扩增产物为642bp；纯合子即为Nr1d1基因敲除小鼠动物模型。上述鉴定方法简单，成功率高。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，
所述步骤4)Nr1d1基因敲除小鼠的PCR鉴定，鉴定引物为：
F1＝SEQ ID NO.3＝5’-CAGGGTCCATCACTGGAAAGG-3’；
R1＝SEQ ID NO.4＝5’-GCGTGAAGCTCATAGAGAAGTC-3’；
R2＝SEQ ID NO.5＝5’-TGTGGGACAACCTTGAGTCAG-3’；
测序引物＝SEQ ID NO.6＝5’-CAGGGTCCATCACTGGAAAGG-3’。
上述鉴定引物经过精心的设计和筛选，实践发现鉴定成功率高。
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，
小鼠PCR鉴定部位为鼠尾，对于鼠尾鉴定选择粗裂解的方法提取DNA；PCR 反应体系如下：
Figure BDA0003717572860000041
PCR反应程序如下：
Figure BDA0003717572860000042
Figure BDA0003717572860000051
进一步的，上述Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法在孤独症谱系障碍疾病的发病机制研究中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明设计了两条特异性靶向Nr1d1基因的gRNA序列，利用cas9蛋白将 Nr1d1基因的Exon 2～5敲除，所敲区域序列为非3的倍数，导致移码突变，造成编码区域提前终止，从而达到将该基因敲除的目的。使用CRISPR/Cas9系统构建Nr1d1基因敲除小鼠模型方法步骤简单，方法易行，周期短并且得到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以加快研究该疾病的致病机理的进度，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。
附图说明
附图1为本发明Nr1d1基因敲除小鼠的构建方案示意图；图中深色区域表示敲除区域，实心矩形代表基因的外显子，gRNA region代表gRNA的剪切区域；
附图2为本发明Nr1d1基因敲除小鼠的鉴定策略；图中深色区域表示敲除区域，实心矩形代表基因的外显子，gRNA region代表gRNA的剪切区域；F1，R1， R2代表用于小鼠鉴定的引物结合区域；
附图3为本发明Nr1d1基因敲除小鼠的鉴定结果：利用PCR引物进行PCR 筛选，基因敲除后的扩增产物：642bp；野生型的扩增产物：2785bp；左图为 DNA分子量标记，右图为PCR的鉴定产物图；PCR反应在25μL体系中扩增35个循环，Taq DNA聚合酶使用P222，使用的阴性对照为：Water(不加DNA 模板)和WT(野生型小鼠基因组DNA)；
附图4为PCR产物测序结果：箭头处指示Nr1d1基因被删除2143bp。
测序引物序列＝SEQ ID NO.6＝5’-CAGGGTCCATCACTGGAAAGG-3’。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
实施例1
敲除方案设计：
根据需求，查找Nr1d1基因详细信息，选择基因敲除的区域需尽可能包括基因的功能域部分，最好占据编码区的前50％，另外也要根据实际情况选择敲除区域，我们选择敲除Nr1d1基因Exon 2～5，包含Nr1d1基因整个编码区的66.12％，如附图1所示。
实施例2
gRNA序列设计
根据小鼠Nr1d1基因的序列，设计并合成了两条针对该基因的gRNA序列，序列信息如下：
gRNA1＝SEQ ID NO.1＝5’-CTAATAACGACTAGGTTGACCGG-3’；
gRNA2＝SEQ ID NO.2＝5’-CGAGGGGGCCTTGGAAGATTGGG-3’。
实施例3
原核注射
选取4～6周龄SPF雌性小鼠(Cyagen)作为卵子供体，小鼠腹腔注射PMSG (孕马血清促性腺素)，48h后注射hCG(人血绒膜促性腺素)，随即与生殖能力正常的种公鼠进行交配，从输卵管收集小鼠受精卵，消化洗涤之后置于37℃培养箱中待用。将Cas9 mRNA(20～200ng/μL)与人工合成的针对Nr1d1基因敲除的gRNA1和gRNA2(20～50ng/μL)混匀后通过显微注射技术注射到小鼠受精卵胞质或原核中，注射后的胚胎保存在M2中，37℃条件下5％CO2温箱中培养至3.5天，每15～30个囊胚移植到代孕雌鼠的输卵管壶腹部中，代孕鼠每隔一周进行体重称量，初步判断是否怀孕，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠5天后剪鼠尾编号送检。
实施例4
Nr1d1基因敲除小鼠的PCR鉴定
根据Nr1d1基因敲除区域，分别在Exon 2的5’端以及Exon 5的3’端设计一对引物F1R1；对出生的F0小鼠鼠尾提取DNA，进行PCR扩增并测序，测序结果见附图4；该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为642bp，在野生型小鼠中以相同的程序不能扩增出产物，但更改扩增条件可在野生型小鼠中扩增的产物为2785bp；随后将鉴定正确的阳性小鼠与野生型小鼠交配获得F1小鼠，小鼠出生 14天后进行PCR扩增鉴定小鼠纯杂合，使用两对引物F1R1和F1R2，纯合小鼠扩增产物为642bp，杂合小鼠扩增产物为573bp/642bp，野生型小鼠扩增产物为 642bp；纯合子即为Nr1d1基因敲除小鼠动物模型。
鉴定引物为：
F1＝SEQ ID NO.3＝5’-CAGGGTCCATCACTGGAAAGG-3’；
R1＝SEQ ID NO.4＝5’-GCGTGAAGCTCATAGAGAAGTC-3’；
R2＝SEQ ID NO.5＝5’-TGTGGGACAACCTTGAGTCAG-3’；
测序引物＝SEQ ID NO.6＝5’-CAGGGTCCATCACTGGAAAGG-3’
小鼠PCR鉴定部位为鼠尾，对于鼠尾鉴定选择粗裂解的方法提取DNA；PCR 反应体系如下表1：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003717572860000071
PCR反应程序如下表2：
表2 PCR反应程序
Figure BDA0003717572860000072
Figure BDA0003717572860000081
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如附图3所示，基因敲除后的扩增产物：642bp；野生型的扩增产物：2785bp；左图为DNA分子量标记，右图为PCR的鉴定产物图；PCR反应在25μL体系中扩增35个循环，Taq DNA聚合酶使用P222，使用的阴性对照为：Water(不加DNA模板)和WT(野生型小鼠基因组DNA)。
由以上实施例可知：本发明设计了两条特异性靶向Nr1d1基因的gRNA序列，利用cas9蛋白将Nr1d1基因的Exon 2～5敲除，所敲区域序列为非3的倍数，导致移码突变，造成编码区域提前终止，从而达到将该基因敲除的目的。使用 CRISPR/Cas9系统构建Nr1d1基因敲除小鼠模型方法步骤简单，方法易行，周期短并且得到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以加快研究该疾病的致病机理的进度，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即但凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 赛业（苏州）生物科技有限公司
<120> 一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
<130> 2022
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
ctaataacga ctaggttgac cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
cgagggggcc ttggaagatt ggg 23
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<212> DNA
<213> artificial
<400> 3
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<213> artificial
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<213> artificial
<400> 5
tgtgggacaa ccttgagtca g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<400> 6
cagggtccat cactggaaag g 21

Claims (10)

1.一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括使用CRISPR-Cas9技术靶向敲除小鼠Nr1d1基因基因。
2.根据权利要求1所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
合成针对Nr1d1基因的gRNA1，序列如SEQ ID NO.1所示；
合成针对Nr1d1基因的gRNA2，序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，选择小鼠Nr1d1基因的Exon 2～5之间的序列作为敲除区域，敲除的Exon 3起始于整个编码区域的1.73％，敲除的Exon 2～5占据整个编码区域的66.12％。
4.根据权利要求3所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
从NCBI数据库中下载小鼠Nr1d1基因的核苷酸序列，并进行同源比对，选择敲除Nr1d1基因Exon 2～5，包含Nr1d1基因整个编码区的66.12％；根据小鼠Nr1d1基因的序列，设计并合成了两条针对该基因的gRNA序列：
gRNA1＝SEQ ID NO.1＝5’-CTAATAACGACTAGGTTGACCGG-3’；
gRNA2＝SEQ ID NO.2＝5’-CGAGGGGGCCTTGGAAGATTGGG-3’。
5.根据权利要求4所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)敲除方案设计：选择敲除Nr1d1基因Exon 2～5，包含Nr1d1基因整个编码区的66.12％；
2)gRNA序列设计：合成针对Nr1d1基因的gRNA1和gRNA2；
3)原核注射：获得F0小鼠；
4)Nr1d1基因敲除小鼠的PCR鉴定：获得F1小鼠，筛选纯合子，即为Nr1d1基因敲除小鼠动物模型。
6.根据权利要求4所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，
所述步骤3)原核注射包括以下步骤：
选取4～6周龄SPF级雌性小鼠作为卵子供体，小鼠腹腔注射PMSG，48h后注射hCG，随即与生殖能力正常的种公鼠进行交配，从输卵管收集小鼠受精卵，消化洗涤之后置于37℃培养箱中待用。将Cas9 mRNA与人工合成的针对Nr1d1基因敲除的gRNA1和gRNA2混匀后通过显微注射技术注射到小鼠受精卵胞质或原核中，注射后的胚胎保存在特定培养基中，37℃条件下5％CO2温箱中培养至3.5天，每15～30个囊胚移植到代孕雌鼠的输卵管壶腹部中，代孕鼠每隔一周进行体重称量，初步判断是否怀孕，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠5天后剪鼠尾编号送检。
7.根据权利要求4所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，
所述步骤4)Nr1d1基因敲除小鼠的PCR鉴定包括以下步骤：
根据Nr1d1基因敲除区域，分别在Exon 2的5’端以及Exon 5的3’端设计一对引物F1R1；对出生的F0小鼠鼠尾提取DNA，进行PCR扩增并测序，该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为642bp，在野生型小鼠中以相同的程序不能扩增出产物，但更改扩增条件可在野生型小鼠中扩增的产物为2785bp；随后将鉴定正确的阳性小鼠与野生型小鼠交配获得F1小鼠，小鼠出生14天后进行PCR扩增鉴定小鼠纯杂合，使用两对引物F1R1和F1R2，纯合小鼠扩增产物为642bp，杂合小鼠扩增产物为573bp/642bp，野生型小鼠扩增产物为642bp；纯合子即为Nr1d1基因敲除小鼠动物模型。
8.根据权利要求7所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤4)Nr1d1基因敲除小鼠的PCR鉴定，鉴定引物为：
F1＝SEQ ID NO.3＝5’-CAGGGTCCATCACTGGAAAGG-3’；
R1＝SEQ ID NO.4＝5’-GCGTGAAGCTCATAGAGAAGTC-3’；
R2＝SEQ ID NO.5＝5’-TGTGGGACAACCTTGAGTCAG-3’；
测序引物＝SEQ ID NO.6＝5’-CAGGGTCCATCACTGGAAAGG-3’。
9.根据权利要求7所述的一种Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，小鼠PCR鉴定部位为鼠尾，对于鼠尾鉴定选择粗裂解的方法提取DNA；PCR反应体系如下：
Figure FDA0003717572850000031
PCR反应程序如下：
Figure FDA0003717572850000032
10.根据权利要求1-9任一项所述的Nr1d1基因敲除小鼠动物模型的构建方法在孤独症谱系障碍疾病的发病机制研究中的应用。
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