TW202344687A

TW202344687A - 靶向血管緊張素原的ｓｉＲＮＡ及其醫藥用途

Info

Publication number: TW202344687A
Application number: TW111144253A
Authority: TW
Inventors: 林曉燕; 李云飛; 張瑱; 董玉瓊; 侯哲; 張建羽; 耿俊; 茅松; 黃龍飛; 周雅琴; 呂珍珍; 黃燕芬; 黃金宇
Original assignee: 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2023-11-16
Also published as: WO2023088427A1

Abstract

本揭露關於靶向血管緊張素原的siRNA及其醫藥用途。具體而言，本揭露關於靶向血管緊張素原(AGT)基因的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA、組成物及其醫藥用途。本揭露還關於包含該siRNA的醫藥組成物、細胞或試劑盒，以及該siRNA用於治療和/或預防AGT相關失調(例如高血壓)的方法。

Description

靶向血管緊張素原的siRNA及其醫藥用途

本揭露關於靶向血管緊張素原(AGT)的siRNA、雙鏈核糖核酸(dsRNA)、綴合物、及其應用。

AGT也被稱為SERPINA8或ANHU。AGT由AGT基因編碼，主要由肝臟產生，是腎素-血管緊張素系統(RAS)的一種限速受質，也是血管緊張素肽的前體。在血漿中活性腎素的作用下，AGT分裂成血管緊張素I，其隨後藉由循環和局部表達的血管緊張素-轉化酶(ACE)的作用轉化成血管緊張素II。而血管緊張素II是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)中最主要的生物活性物質，它藉由與血管緊張素II 1型受體(AT1R)的結合，導致動脈血管收縮、腎上腺皮質醛固酮的分泌，因此在機體血壓調節中起著關鍵作用。當血管緊張素II過度產生或AT1R過度刺激，導致RAAS系統功能失調將會引起高血壓。眾多研究表明AGT基因上的多態現象與機體的血壓調控能力密切相關，而在中國漢族人群的關聯研究顯示AGT M235T位點多態性與原發性高血壓(ER)的發生有關。

高血壓(Hypertension)是一種世界性常見的心血管疾病，全球患病率高達10%至20%，並可導致腦血管、心臟以及腎臟的併發症，是各種疾病、失調和病症的主要風險因素(如腦中風、冠心病、慢性腎病、心肌梗塞、心力衰竭、動脈瘤、外周動脈疾病、心臟損傷等其他心血管相關疾病)。目前，治療高血壓的藥物主要有五類，包括利尿藥、β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑以及血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑。儘管可用於治療高血壓的抗壓藥品種多，但超過三分之二的受試者用一種抗壓藥不能得到控制並且需要兩種或更多種不同類別的抗壓藥。由於依從性和副作用隨著用藥增加而增加，這進一步降低了具有受控血壓的受試者的數量。

RNA干擾RNAi是一種有效的沉默基因表達的方式，藉由轉錄後調控機制，可以特異性降解靶基因mRNA。據統計，疾病相關蛋白中，超過80%的蛋白質不能被目前常規的小分子藥物以及生物大分子製劑所靶向，屬於不可成藥蛋白。AGT作為RAAS中最上游的前體，其級聯作用在血壓調節中已被證實，抑制肝臟中AGT的合成，可能導致AGT蛋白的持久性降低，最終導致血管收縮劑AngII的持久性降低，對其抑制作用將會具有良好的抗高血壓作用。

本揭露提供一種靶向血管緊張素原(AGT)的siRNA。

一些實施方案中，本揭露提供了一種siRNA，其包含形成雙鏈區的正義鏈與反義鏈；

該正義鏈包含與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列相差不超過3個(例如0、1、2、3)核苷酸序列，且包含至少15個(例如16、17、18、19、20、21)連續核苷酸；

該反義鏈包含與SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12任一的核苷酸序列相差不超過3個(例如0、1、2、3)核苷酸序列，且包含至少15個(例如16、17、18、19、20、21)連續核苷酸。

一些實施方案中，反義鏈與靶序列至少部分地反向互補以介導RNA干擾。在一些實施方案中，反義鏈與靶序列之間存在不多於5個、不多於4個、不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配。在一些實施方案中，反義鏈與靶序列完全反向互補。

一些實施方案中，正義鏈與反義鏈至少部分地反向互補以形成雙鏈區。在一些實施方案中，正義鏈與反義鏈之間存在不多於5個、不多於4個、不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配。在一些實施方案中，正義鏈與反義鏈完全反向互補。

一些實施方案中，本揭露siRNA包含一個或兩個平端。

一些具體的實施方案中，siRNA的每條鏈各自獨立地包含具有1至2個未配對的核苷酸。

一些實施方案中，本揭露siRNA包含位於該siRNA反義鏈3’端的突出端。

一些實施方案中，正義鏈和反義鏈各自獨立地具有16至35個、16至34個、17至34個、17至33個、18至33個、18至32個、18至31個、18 至30個、18至29個、18至28個、18至27個、18至26個、18至25個、18至24個、18至23個、19至25個、19至24個、或19至23個核苷酸。

一些實施方案中，正義鏈和反義鏈長度相同或不同，該正義鏈的長度為19-23個核苷酸，反義鏈的長度為19-26個核苷酸。本揭露提供的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/19、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些實施方式中，該siRNA的正義鏈和反義鏈的長度比為19/21、21/23或23/25。在一些實施方式中，該siRNA的正義鏈和反義鏈的長度比為19/21。

一些實施方案中，該正義鏈包含至少15個連續核苷酸，且與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列相差不超過2個核苷酸。一些實施方案中，核苷酸序列相差不超過1個核苷酸；一些實施方案中，相差1個核苷酸；

一些實施方案中，該反義鏈包含至少15個連續核苷酸序列，且與SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12核苷酸序列相差不超過2個核苷酸；一些實施方案中，核苷酸序列相差不超過1個核苷酸；一些實施方案中，相差1個核苷酸。

一些實施方案中，正義鏈包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列至少15個連續核苷酸。一些實施方案中，至少16個連續核苷酸。一些實施方案中，至少18個連續核苷酸。一些實施方案中，至少19個連續核苷酸。

一些實施方案中，反義鏈包含SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12任一的核苷酸序列至少15個連續核苷酸。一些實施方案中，至少18個連續核苷酸。一些實施方案中，至少19個連續核苷酸。一些實施方案中，至少20個連續核苷酸。一些實施方案中，至少21個連續核苷酸。

一些實施方案中，該正義鏈包含選自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6。

一些實施方案中，該反義鏈包含選自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12。

一些實施方案中，本揭露所述正義鏈和反義鏈分別包含的至少一個核苷酸是修飾的核苷酸。一些實施方案中，本揭露所述該正義鏈的全部核苷酸和該反義鏈的全部核苷酸是修飾的核苷酸。

本揭露提供了一種siRNA，其包含形成雙鏈區的正義鏈與反義鏈；

該正義鏈包含與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸序列，且包含至少15個連續核苷酸；該反義鏈包含與SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12任一的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸序列，且包含至少15個連續核苷酸；該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(例如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)上的至少一個核苷酸包含2'-甲氧基修飾或式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

式(I)選自：

其中，Y選自O、NH和S；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

Q₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q₂為

；

其中，

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基；

其中，該式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾不是

。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

一些實施方案中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、異鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、C2修飾的嘌呤、N8修飾的嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鳥嘌呤、7-脫氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿苷、4-硫尿苷、C5修飾的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，B是該反義鏈的修飾核苷酸對應位置的鹼基。

一些實施方案中，式(I)選自式(I-1)：

其中，

Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

式(I-1)的一些實施方案中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，B是該反義鏈的修飾的核苷酸對應位置的鹼基。

一些實施方案中，式(I)選自式(I-2)：

其中，

Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基；r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

式(I-2)的一些實施方案中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，上述化學修飾或其互變異構體修飾不是

在一些實施方案中，每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

R₁選自H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，q=1、2或3；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環。

B如式(I)中所定義。

在一些實施方案中，每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H、甲基、乙基、正丙基或異丙基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

R₃選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，p=1或2；

R₁選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，q=1或2；

R₂選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r=1或2；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環。

B如式(I)中所定義。

一些實施方案中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯中的那些。

在一些實施方案中，Y為O或NH；每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環。

在一些實施方案中，在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾選自：

其中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾選自：

一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾選自：

其中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位中對應位置的鹼基。

一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’區域的第5位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第5位中對應位置的鹼基。

一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’區域的第6位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第6位中對應位置的鹼基。

一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’區域的第7位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

一些實施方案中，包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸選自包含式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸，

其中，Y選自O、NH和S；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

Q_1’為

，Q_2’為R₂；或者Q_1’為R₂，Q_2’為

；

其中，

J₁為H或C₁-C₆烷基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基；

M為O或S；

其中，該式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾不是

。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

式(I’)的一些實施方案中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，式(I’)選自式(I’-1)：

其中，Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

M為O或S；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I’)中所定義。

式(I’-1)的一些實施方案中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，式(I’)選自式(I’-2)：

其中Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

M為O或S；

B如式(I’)中所定義。

式(I’-2)的一些實施方案中，B是鹼基；例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，上述化學修飾或其互變異構體修飾不是

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環。

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環。

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環。

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環。

在一些實施方案中，該式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾選自：

其中，M為O或S；

B如式(I’)中所定義。

其中，M為O或S；

B如式(I’)中所定義。

其中，M為O或S；

B如式(I’)中所定義。

在一些實施方案中，該式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾包括但不限於：

、

、

以及它們結構中的腺嘌呤被置換為鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的那些。

在一些實施方案中，該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(例如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中的至少一個核苷酸包含2'-甲氧基修飾。

在一些實施方案中，該反義鏈在其5’區域的第5位、第6位、第7位中任一核苷酸包含2'-甲氧基修飾。

在一些實施方案中，修飾的核苷酸位於反義鏈在其5’區域的第2位至第8位任一。

在一些實施方案中，修飾的核苷酸位於反義鏈5’區域的第5位、第6位或第7位任一。

在一些實施方案中，式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’區域的第5位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第5位中對應位置的鹼基。

在一些實施方案中，式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’區域的第6位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第6位中對應位置的鹼基。

在一些實施方案中，式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’區域的第7位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

一些實施方案中，該siRNA正義鏈和/或反義鏈中至少一個另外的核苷酸為修飾的核苷酸，修飾的核苷酸選自：2'-甲氧基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-經取代的胺基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2'-脫氧-2'-氟修飾的核苷酸、3'-脫氧-胸腺嘧啶核苷酸、異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA、GNA。一些實施方案中，修飾的核苷酸相互獨立地選自：2'-甲氧基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸和2'-脫氧修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，siRNA的正義鏈中三個連續的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，siRNA的正義鏈中，位於5’端第7-9位的三個連續的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，siRNA的正義鏈中位於5’端第7-9位的三個連續的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸，正義鏈其餘位置均為非2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、9、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在另一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該正義鏈含有如下式所示的核苷酸序列(5’-3’)：

N_aN_aN_aN_aXN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a

其中，每個X獨立地為N_a或N_b；

N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，正義鏈含有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；或，

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，正義鏈選自如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；或，

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

在一些實施方案中，反義鏈含有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；或，

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸或包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，W’表示包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸；

在一些具體的實施方案中，式(I)選自：

、

或

；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些具體的實施方案中，B選自反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

在一些具體的實施方案中，式(I)選自：

、

，和

；其中，M為O或S；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些具體的實施方案中，B選自反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

一些具體的實施方案中，M為S。一些具體的實施方案中，M為O。

在一些具體的實施方案中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，正義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基。該修飾基團使得該siRNA在生物樣品或環境中具有增加的穩定性。在一些實施方案中，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫磷酸酯基。

在一些實施方案中，硫磷酸酯基存在於選自以下的位置中的至少一處：

該正義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該正義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該正義鏈的3'末端端部第1個核苷酸末端；

該正義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該正義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'末端端部第1個核苷酸末端；

該反義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，正義鏈和/或反義鏈中包括多個硫磷酸酯基，該硫磷酸酯基存在於：

該正義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該正義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和，

該反義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和

該反義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和

該反義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和

該反義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，正義鏈包含如下式所示的核苷酸序列：

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3’，

其中，Nm表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A；Nf表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A；

小寫字母s表示與該字母s相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s上游相鄰的一個磷酸酯基為硫代磷酸酯基。

在一些實施方案中，反義鏈包含如下式所示的核苷酸序列：

5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’sNm’sNm’-3’或，

5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nf’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’sNm’sNm’-3’

其中，Nm’表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A；Nf’表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A；

小寫字母s表示與該字母s相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接，小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s上游相鄰的一個磷酸酯基為硫代磷酸酯基；

W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸或包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

一些實施方案中，式(I)選自：

、

或

；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些實施方案中，B是反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

一些實施方案中，式(I)選自：

、

，和

；其中，M為O或S；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些具體的實施方案中，B是反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

在一些實施方案中，該正義鏈包含與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的序列，且包含至少15個連續核苷酸。

在一些實施方案中，該正義鏈包含與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的序列，且包含至少19個連續核苷酸；在一些實施方案中，核苷酸序相差不超過1個核苷酸。

在一些實施方案中，該反義鏈包含與SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：18任一的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的序列，且包含至少21個連續核苷酸；在一些實施方案中，核苷酸序列相差不超過1個核苷酸；其中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸，或包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該正義鏈核苷酸選自：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一項。

在一些實施方案中，該反義鏈核苷酸選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：18任一項，其中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸，或包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

一些實施方案中，式(I)選自：

、

或

一些實施方案中，式(I)選自：

、

，和

；其中，M為O或S；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；在一些具體的實施方案中，B是反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

一些具體的實施方案中，正義鏈包含SEQ ID NO：135至SEQ ID NO：162任一項。

一些具體的實施方案中，反義鏈包含SEQ ID NO：189至SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：243至SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：273至SEQ ID NO：289任一項。

一些具體的實施方案中，正義鏈選自SEQ ID NO：135至SEQ ID NO：162任一項；

一些具體的實施方案中，反義鏈選自SEQ ID NO：189至SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：243至SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：273至SEQ ID NO：289任一項。

一些具體的實施方案中，siRNA包含選自表26中任一項所示的正義鏈和反義鏈。

一些具體的實施方案中，本揭露所述的siRNA選自以下任一項：

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：140，反義鏈選自SEQ ID NO：194；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：143，反義鏈選自SEQ ID NO：197；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：144，反義鏈選自SEQ ID NO：199；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：146，反義鏈選自SEQ ID NO：200；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：147，反義鏈選自SEQ ID NO：201；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：148，反義鏈選自SEQ ID NO：202；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：149，反義鏈選自SEQ ID NO：203；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：150，反義鏈選自SEQ ID NO：204；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：151，反義鏈選自SEQ ID NO：205；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：152，反義鏈選自SEQ ID NO：206；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：153，反義鏈選自SEQ ID NO：207；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：154，反義鏈選自SEQ ID NO：208；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：155，反義鏈選自SEQ ID NO：209；或，

本揭露所述的siRNA，正義鏈選自SEQ ID NO：156，反義鏈選自SEQ ID NO：210。

本揭露還提供了一種siRNA綴合物或dsRNA，其包含上述siRNA中的任意一種和連接至該siRNA的靶向配體。

在一些實施方案中，靶向配體包含靶向部分。

在一些實施方案中，siRNA和該靶向配體共價或非共價連接。

在一些實施方案中，該靶向配體靶向肝臟。在一些實施方案中，該靶向配體結合脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)。在一些實施方案中，該靶向配體包括半乳糖簇或半乳糖衍生物簇。該半乳糖衍生物選自N-乙醯基-半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺。

在一些實施方案中，該靶向配體與該siRNA的正義鏈3’末端連接。

在一些實施方案中，為了促進siRNA進入細胞，可以在siRNA正義鏈的末端引入膽固醇等親脂性的基團。親脂性的基團包括以共價鍵與siRNA結合(如末端引入膽固醇、脂蛋白、維生素E等)，以利於藉由由脂質雙分子層構成的細胞膜與細胞內的mRNA發生作用。同時，siRNA也可以進行非共價鍵修飾(如藉由疏水鍵或離子鍵結合磷脂分子、多肽、陽離子聚合物等)增加穩定性和生物學活性。

在一些實施方案中，靶向配體藉由磷酸酯基團、硫磷酸酯基團或膦酸基團與siRNA末端連接。在一些實施方案中，靶向配體藉由磷酸酯基團、硫磷酸酯基團或膦酸基團與siRNA末端間接連接。在一些實施方案中，靶向配體藉由磷酸酯基團、硫磷酸酯基團或膦酸基團與siRNA末端直接連接。在一些實施方案中，靶向配體藉由磷酸酯基團或硫磷酸酯基團與siRNA末端直接連接。在一些實施方案中，靶向配體藉由磷酸酯基團或硫磷酸酯基團與siRNA正義鏈3’末端直接連接。

一些實施方案中，靶向配體協助引導將與其連接的治療性試劑遞送至所需靶位置。在一些情況中，靶向部分可以結合細胞或細胞受體，並且啟動內吞作用以促進治療性試劑進入細胞。靶向部分可以包括對細胞受體或細胞表面分子具有親和性的化合物。含有靶向部分的各種靶向配體可以與治療性試劑和其它化合物連接以將試劑靶向細胞和特定細胞受體。

一些實施方案中，靶向部分的類型包括碳水化合物、膽固醇和膽甾醇基團或類固醇。可以結合細胞受體的靶向部分包括糖類，諸如半乳糖、半乳糖衍生物(如N-乙醯基-半乳糖胺，N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺)、甘露糖和甘露糖衍生物。

已知結合脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的靶向部分可特別用於引導遞送寡聚化合物(如siRNA或其綴合物或dsRNA)至肝臟。脫唾液酸糖蛋白受體在肝臟細胞上大量表達。靶向ASCPR的細胞受體靶向部分包括半乳糖和半乳糖衍生物。具體而言，半乳糖衍生物的簇，包括由2、3、4或超過4個N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)組成的簇，可以促進肝細胞對某些化合物的攝取。偶聯寡聚化合物的GalNAc簇用於引導治療性試劑至肝臟，N-乙醯基-半乳糖胺糖能夠結合肝臟細胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體。脫唾液酸糖蛋白受體的結合被認為將啟動受體介導的內吞作用，從而促進治療性試劑進入細胞內部。

一些實施方案中，靶向配體可以包括2、3、4或超過4個靶向部分。在一些實施方式中，本文所公開的靶向配體可以包括1、2、3、4或超過4個藉由L₂連接至分支基團的靶向部分。

在一些實施方式中，靶向配體是半乳糖簇的形式。

在一些實施方式中，各靶向部分獨立地是半乳糖胺衍生物，其為N-乙醯基-半乳糖胺。可用作靶向部分且對脫唾液酸糖蛋白受體具有親和性的其他糖可選自半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺和N-異丁醯基-半乳糖胺等。

在一些實施方式中，本揭露中的靶向配體包括N-乙醯半乳糖胺作為靶向部分，

在一些實施方式中，靶向配體包括三個末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(諸如N-乙醯基-半乳糖胺)，其各自對唾液酸糖蛋白受體均具有親和性。在一些實施方式中，靶向配體包括三個末端N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作為靶向部分。

在一些實施方式中，靶向配體包括四個末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(諸如N-乙醯基-半乳糖胺)，其各自對脫唾液酸糖蛋白受體均具有親和性。在一些實施方式中，靶向配體包括四個末端N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作為靶向部分。

當述及三個末端N-乙醯基-半乳糖胺時，本領域常用的術語包括三觸角(tri-antennary)、三價物(tri-valent)和三聚體。

當述及四個末端N-乙醯基-半乳糖胺時，本領域常用的術語包括四觸角(tetra-antennary)、四價物(tetra-valent)和四聚體。

一些實施方案中，靶向配體選自如式(II)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，L₁為C₁-C₃₀烷基鏈、或包含被一個或多個氧、硫、氮原子或C=O間斷的C₁-C₃₀烷基鏈；

R₁₁和R₁₂獨立地為化學鍵、NR₁₆、C=O或-OC(=O)-；

Q₃為

或

；

為單鍵或雙鍵，且當

為單鍵時，R₁₃獨立地為CR₁₇R₁₈、NR₁₆、O或S，

當

為雙鍵時，R₁₃獨立地為CR₁₉或N；

R₁₄獨立地為CR₁₉或N；

環A為存在或不存在的環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基，且當環A存在時，R₁₅獨立地為CR₁₉或N，當環A不存在時，R₁₅獨立地為CR₁₇R₁₈、NR₁₆或O；

R₁₆和R₁₉獨立地為氫、氘、烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR'或C(=O)NR'(R")，該烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-7環烷基、3-12員雜環烷基、6-12員芳基、5-12員雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR'和C(=O)NR'(R")中的基團所取代；

R₁₇和R₁₈獨立地為氫、氘、烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR'或C(=O)NR'(R")，該烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-7環烷基、3-12員雜環烷基、6-12員芳基、5-12員雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR和C(=O)NR'(R")中的基團所取代；

R'和R"獨立地為氫、氘、羥基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基，該烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、羥基、側氧、硝基和氰基中的取代基所取代；

m1、n1、p1和q1獨立地為0、1、2、3或4；

B1為

或

；

R_b1、R_b2、R_b3、R_b4、R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-、-NHC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-；

z1、z2、z3、z4、z5、z6、z7、z8和z9獨立地為0-10的整數；

L₂為C₁-C₃₀烷基鏈、或包含被一個或多個氧、硫、氮原子或C=O間斷的C₁-C₃₀烷基鏈；

r1為1-10的整數。

在一些實施方案中，L₁為C₁-C₃₀烷基鏈、或包含被一個或多個氧、硫、氮原子或C=O間斷的C₁-C₃₀烷基鏈；

R₁₁和R₁₂獨立地為化學鍵、NR₁₆或C=O；

Q₃為

；

R₁₃為CR₁₇R₁₈、NR₁₆、O或S；

R₁₄為CR₁₉；

R₁₅獨立地為CR₁₇R₁₈、NR₁₆或O；

R₁₆至R₁₉獨立地為氫、氘或烷基；

m1、p1和q1獨立地為0、1、2、3或4；

B1為

；

R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-、-NHC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-；

z5、z6、z7、z8和z9獨立地為0-10的整數；

r1為1-10的整數。

在一些實施方案中，L₁為-(CH₂)_j11-C(=O)-(CH₂)_j12-；

R₁₁和R₁₂獨立地為化學鍵、NR₁₆或C=O；

R₁₆為氫或C_1-6烷基；

Q₃為

；

R₁₃為CR₁₇R₁₈或O；

R₁₄為CR₁₉；

R₁₅獨立地為CR₁₇R₁₈或O；

R₁₇至R₁₉獨立地為氫或烷基；

m1、p1和q1獨立地為0或1；

B1為

；

R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-；

z8和z9獨立地為0-10的整數；

L₂為-(CH₂)_j15-(OCH₂CH₂)_1-4-(CH₂)_j16-或

；

j15和j16獨立地為0-4的整數；

r1為3、4、5或6。

在一些實施方案中，L₁可為L₃或L₃-R₁₁₀-R₁₁₁-L₃，其中，L₃獨立地為C₁-C₁₂烷基鏈、-(CH₂)_j11-C(=O)-(CH₂)_j12-或-(CH₂)_j13-(CH₂CH₂O)_1-4-(CH₂)_j14-，R₁₁₀和R₁₁₁獨立地為化學鍵、-NR₁₁₂-、-C(=O)-或-OC(=O)-，R₁₁₂為氫或C₁-C₁₂烷基，j11、j12、j13和j14獨立地為0-10的整數。在一些實施方案中，j11、j12、j13和j14獨立地為0-2或4-10的整數。在一些實施方案中，j11、j12、j13和j14獨立地為0、1、2、6、7、8、9或10。

在一些實施方案中，L₁可為-(CH₂)_j11-C(=O)-(CH₂)_j12-，j11和j12的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，L₁可為

，j12的定義同前任一方案所述，其中，a1端與B1相連，b1端與R₁₁相連。

在一些實施方案中，L₁可為

、

、

、

或

，其中，a1端與B₁相連，b1端與R₁₁相連。

在一些實施方案中，R₁₁可為化學鍵且R₁₂可為C=O。

在一些實施方案中，R₁₁可為化學鍵且R₁₂可為NR₁₆，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₁可為化學鍵且R₁₂可為-OC(=O)-。

在一些實施方案中，R₁₁可為NR₁₆且R₁₂可為C=O，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁可為NR₁₆且R₁₂可為-OC(=O)-，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₂可為NR₁₆且R₁₁可為C=O，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₂可為NR₁₆且R₁₁可為-OC(=O)-，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₁可為NH且R₁₂可為C=O。

在一些實施方案中，R₁₂可為NH且R₁₁可為C=O。

在一些實施方案中，R₁₆可為氫或C_1-6烷基。

在一些實施方案中，R₁₆可為氫、甲基、乙基、丙基或異丙基。

在一些實施方案中，R₁₆可為氫。

在一些實施方案中，R₁₇和R₁₈可為氫。

在一些實施方案中，R₁₉可為氫。

在一些實施方案中，環A存在時，環A可為C_6-12芳基。

在一些實施方案中，環A可為苯基。

在一些實施方案中，m1可為0或1。

在一些實施方案中，m1可為3。

在一些實施方案中，n1可為0或1。

在一些實施方案中，p1和q1獨立地為0或1。

在一些實施方案中，p1=1且q1=1。

在一些實施方案中，p1=1且q1=0。

在一些實施方案中，p1=0且q1=1。

在一些實施方案中，p1=0且q1=0。

在一些實施方案中，z1、z2、z3、z4、z5、z6、z7、z8和z9可獨立地為0-4的整數。在一些實施方案中，z1、z2、z3、z4、z5、z6、z7、z8和z9可獨立地為0、1或2。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b1、R_b2、R_b3和R_b4獨立地為-C(=O)-或-NHC(=O)-，N原子與L₁相連，z1、z2、z3和z4的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b1、R_b2、R_b3和R_b4獨立地為-C(=O)-或-NHC(=O)-，N原子與L₁相連，R_b1、R_b3和R_b4相同，z1、z2、z3和z4的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

。

在一些實施方案中，B₁可為

。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-，N原子與L₁相連，z5、z6、z7、z8和z9的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-，N原子與L₁相連，R_b5、R_b6和R_b7相同，z5、z6、z7、z8和z9的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

。

在一些實施方案中，L₂可為L₄或L₄-R₁₃-R₁₄-L₄，其中，L₄獨立地為C₁-C₁₂烷基鏈或-(CH₂)_j15-(OCH₂CH₂)_1-4-(CH₂)_j16-，R₁₃和R₁₄獨立地為化學鍵、-NR₁₁₅-、-C(=O)-或-OC(=O)-，R₁₁₅獨立地為氫或C₁-C₁₂烷基，j15和j16獨立地為0-10的整數。在一些實施方案中，j15和j16獨立地為0-6的整數。在一些實施方案中，j15和j16獨立地為0、1、2、3或4。

在一些實施方案中，L₂可為-(CH₂)_j15-(OCH₂CH₂)_1-4-(CH₂)_j16-，j15和j16的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，L₂可為

或

。在一些實施方案中，L₂可為

，其中，一側與O原子相連，另一側與B₁相連。

在一些實施方案中，L₂可為C₁-C₁₂烷基鏈。

在一些實施方案中，L₂可為

、

、

在一些實施方案中，L₂可為

。在一些實施方案中，L₂可為

。在一些實施方案中，L₂可為

。在一些實施方案中，L₂可為

。其中，a3端與O原子相連，b3端與B₁相連。

在一些實施方案中，L₂可為

，其中，a3端與O原子相連，b3端與B₁相連。

在一些實施方案中，r1可為3、4、5或6。在一些實施方案中，r1可為3。

在一些實施方案中，Q₃可為

或

。在一些實施方案中，Q₃可為

。其中，R₁₃、R₁₄、R₁₅和n1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

，其中，R₁₃、R₁₄、R₁₅、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

、

、

或

在一些實施方案中，

可為

、

或

。在一些實施方案中，

可為

或

。在一些實施方案中，

可為

。p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

、

、

在一些實施方案中，

可為

、

、

在一些實施方案中，

可為

、

、

或

。p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

，其中，R₁₃、R₁₄、n1、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

或

在一些實施方案中，

可為

或

在一些實施方案中，

可為

。n1、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

或

，n1、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，該靶向配體可為以下任一結構或其藥學上可接受的鹽，

在一些實施方案中，該靶向配體選自以下結構或其藥學上可接受的鹽，

在一些實施方案中，可以用N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺替換以上靶向配體中的N-乙醯基-半乳糖胺部分。

在一些實施方案中，該siRNA和該靶向配體共價或非共價連接。

在一些實施方案中，該正義鏈的3’端和/或5’端與該靶向配體綴合。

在一些實施方案中，該正義鏈的3’端與該靶向配體綴合。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團(磷酸二酯基團)或硫代磷酸酯基團(磷酸二酯基團)與該siRNA末端連接。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團(磷酸二酯基團)或硫代磷酸酯基團(磷酸二酯基團)與該siRNA的正義鏈3’末端連接。

一些具體的實施方案中，正義鏈包含SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：188任一項；

一些具體的實施方案中，反義鏈包含SEQ ID NO：217至SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：260至SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：290至SEQ ID NO：302任一項。

一些具體的實施方案中，正義鏈選自SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：188任一項；

一些具體的實施方案中，反義鏈選自SEQ ID NO：217至SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：260至SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：290至SEQ ID NO：302任一項。

一些具體的實施方案中，dsRNA或siRNA綴合物包含選自表26中任一項所限定的正義鏈和反義鏈。

一些具體的實施方案中，該dsRNA或siRNA綴合物選自以下任一項：

本揭露所述的dsRNA或siRNA綴合物或化合物，正義鏈選自SEQ ID NO：163，反義鏈選自SEQ ID NO：217；或，

本揭露所述的dsRNA或siRNA綴合物或化合物，正義鏈選自SEQ ID NO：172，反義鏈選自SEQ ID NO：226；或，

本揭露所述的dsRNA或siRNA綴合物或化合物，正義鏈選自SEQ ID NO：173，反義鏈選自SEQ ID NO：227；或，

本揭露所述的dsRNA或siRNA綴合物或化合物，正義鏈選自SEQ ID NO：174，反義鏈選自SEQ ID NO：228；或，

本揭露所述的dsRNA或siRNA綴合物或化合物，正義鏈選自SEQ ID NO：175，反義鏈選自SEQ ID NO：229；或，

本揭露所述的dsRNA或siRNA綴合物或化合物，正義鏈選自SEQ ID NO：176，反義鏈選自SEQ ID NO：230。

在一些實施方案中，該dsRNA或siRNA綴合物其為如下結構或其藥學上可接受的鹽：

其中，

Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；

Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；

Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；

Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；

Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；

Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；

Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；

Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)。

表示硫代磷酸二酯基，

表示磷酸二酯基，

NAG0052表示

，

(-)hmpNA(C)表示

。

在一些實施方案中，該藥學上可接受的鹽可為本領域常規的鹽，包括但不限於：鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、胺鹽等。在一些實施方案中，該dsRNA或siRNA綴合物選自TRD008096、TJR100053、TJR100296。

在一些實施方案中，該dsRNA或siRNA綴合物為TRD008096，其為如下結構：

在一些實施方案中，該dsRNA或siRNA綴合物為TJR100053，其為如下結構或：

在一些實施方案中，該dsRNA為TJR100296，其為如下結構：

其中，

Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；

Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；

Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；

Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；

Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；

Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；

Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；

Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)。

表示硫代磷酸二酯基，

表示磷酸二酯基，

NAG0052表示

，

(-)hmpNA(C)表示

。

本揭露另一方面提供一種化合物，選自組1)至組6)任一項：

組1)，SEQ ID NO：1所示的正義鏈和SEQ ID NO：7所示的反義鏈；

組2)，SEQ ID NO：2所示的正義鏈和SEQ ID NO：8所示的反義鏈；

組3)，SEQ ID NO：3所示的正義鏈和SEQ ID NO：9所示的反義鏈；

組4)，SEQ ID NO：4所示的正義鏈和SEQ ID NO：10所示的反義鏈；

組5)，SEQ ID NO：5所示的正義鏈和SEQ ID NO：11所示的反義鏈；

組6)，SEQ ID NO：6所示的正義鏈和SEQ ID NO：12所示的反義鏈。

本揭露提供一種化合物，包含正義鏈和反義鏈，該正義鏈選自SEQ ID NO：135至SEQ ID NO：162任一項；該反義鏈選自SEQ ID NO：189至SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：243至SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：273至SEQ ID NO：289任一項。

本揭露提供一種化合物，包含正義鏈和反義鏈，該正義鏈選自SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：188任一項；該反義鏈選自SEQ ID NO：217至SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：260至SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：290至SEQ ID NO：302任一項。

本揭露提供一種化合物，其包含選自表26中任一項所限定的正義鏈和反義鏈。

本揭露另一方面提供一種組成物，其包含本揭露所述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA，或化合物，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑，例如載劑(vehicle)、運載體(carrier)、稀釋劑、和/或遞送聚合物。

各種遞藥系統是已知的並且可以用於本揭露siRNA或siRNA綴合物或dsRNA，例如封裝在脂質體中、微粒、微囊、能夠表達siRNA或siRNA綴合物或dsRNA的重組細胞、受體介導的細胞內吞作用、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分。

本揭露另一方面提供一種上述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或組成物在製備治療受試者疾病的藥物中的用途，在一些實施方案中選自肝源性疾病。

本揭露另一方面提供一種治療受試者疾病的法，包括向受試者給予上述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或組成物。

本揭露另一方面提供一種抑制受試者體內mRNA表達的方法，該方法包括給予受試者上述siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或組成物。

本揭露另一方面提供一種體內遞送表達抑制性寡聚化合物至肝臟的方法，給與受試者上述siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或組成物。

本文所公開的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或組成物和方法可以在細胞、細胞群、細胞群、組織或受試者中降低靶mRNA的水平，包括：向受試者給予治療有效量的本揭露所述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或組成物，該siRNA與靶向配體連接，從而抑制靶mRNA在受試者中的表達。

在一些實施方式中，該受試者已在先前被鑑定為在靶向的細胞或組織中具有靶基因的病理性上調。

本揭露中所述的受試者是指確診患有(或疑似患有、或易感於)將會受益於靶mRNA表達之減少或抑制的疾病或病症的受試者。

遞送可以是藉由局部給藥(例如，直接注射、植入、或局部給予)，全身給藥，或皮下，靜脈內，腹膜內，或胃腸外途徑，包括顱內(例如，心室內，實質內和鞘內)，肌肉內，透皮，氣道(氣溶膠)，鼻，口服，直腸，或局部(包括口頰和舌下)給藥。

可選的實施方案中，本揭露提供的醫藥組成物可以藉由注射給予，例如，靜脈內、肌內、皮內、皮下、十二指腸內或腹膜內注射。

可選的實施方案中，當靶向配體與siRNA連接成綴合物後，該綴合物可被包裝在試劑盒中。

本揭露還提供了一種醫藥組成物，其包含本揭露的siRNA或siRNA綴合物或dsRNA。

在一些實施方案中，該醫藥組成物中還可以包含藥學上可接受的輔料和/或佐劑，該輔料可以為一種或多種本領域常規採用的各種製劑或化合物。例如，該藥學上可接受的輔料可以包括pH緩衝劑、保護劑和滲透壓調節劑中的至少一種。

在一些實施方案中，上述siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，如所測定的(例如藉由psiCHECK活性篩選、螢光素酶報告基因檢測法、PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法、Western Blot、或流式細胞術)，上述siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物會抑制靶基因表達的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%。

在一些實施方案中，上述siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，如所測定的(例如藉由psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法、PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法、Western Blot或流式細胞術)，上述siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物引起的靶基因mRNA剩餘表達百分比為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。

在一些實施方案中，siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，如所測定的(例如藉由psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法、PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法、Western Blot、或流式細胞)，siRNA、 siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物在保持在靶(on-target)活性的同時，將脫靶(off-target)活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

在一些實施方案中，siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，如所測定的(例如藉由psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法、PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法、Western Blot、或流式細胞術)，siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物使在靶活性降低至多20%、至多19%、至多15%、至多10%、至多5%或超過1%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

在一些實施方案中，siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，如所測定的(例如藉由psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法、PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法、Western Blot、或流式細胞術)，siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物使在靶活性提高至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

本揭露還提供了一種細胞，其包含本揭露的siRNA或siRNA綴合物或dsRNA。

本揭露還提供了一種試劑盒，其包含本揭露的siRNA或siRNA綴合物或dsRNA。

本揭露還提供了一種用於沉默細胞中靶基因或靶基因的mRNA的方法，該方法包括將根據本揭露的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA和/或醫藥組成物引入該細胞中的步驟。

本揭露還提供了一種用於在體內或在體外沉默細胞中靶基因或靶基因的mRNA的方法，該方法包括將根據本揭露的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA和/或醫藥組成物引入該細胞中的步驟。

本揭露還提供了一種用於抑制靶基因或靶基因的mRNA表達的方法，該方法包括向有其需要的受試者施用有效量或有效劑量的根據本揭露的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA和/或醫藥組成物。

在一些實施方案中，施用藉由包括肌肉內、支氣管內、胸膜內、腹膜內、動脈內、淋巴、靜脈內、皮下、腦脊髓、或其組合的給藥方式進行。

在一些實施方案中，siRNA、siRNA綴合物或dsRNA和/或醫藥組成物的有效量或有效劑量為約0.001mg/kg體重至約200mg/kg體重、約0.01mg/kg體重至約100mg/kg體重或約0.5mg/kg體重至約50mg/kg體重。

在一些實施方案中，靶基因是AGT基因。

在一些實施方案中，上述siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達AGT的細胞時，如所測定的(例如藉由PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法、Western Blot或流式細胞術)，上述siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物會抑制AGT的表達至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%。

在一些實施方案中，上述siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達AGT的細胞時，如所測定的(例如藉由PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法、Western Blot或流式細胞術)，上述siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物引起的AGT mRNA剩餘表達百分比為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。

本揭露提供了一種抑制AGT基因表達的方法，包括給予受試者有效量或有效劑量的根據本揭露所述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或、醫藥組成物。

本揭露提供了一種治療和/或預防受試者與AGT基因表達相關的疾病的方法，包括給予受試者有效量或有效劑量的本揭露所述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物。

本揭露提供了一種治療和/或預防受試者與RAAS途徑相關的疾病的方法，包括給予受試者有效量或有效劑量的本揭露所述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物。

本揭露提供了一種治療和/或預防疾病的方法，包括給予受試者有效量或有效劑量的本揭露所述的siRNA或siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物。一些實施方案中，該疾病選自高血壓或心臟病。一些實施方案中，該疾病選自臨界性高血壓、原發性高血壓、繼發性高血壓、孤立性收縮期或舒張期高血壓、妊娠相關高血壓、糖尿病性高血壓、頑固性高血壓、難治性高血壓、陣發性高血壓、腎血管性高血壓、戈德布拉特氏高血壓、低血漿腎素活性或血漿腎素濃度相關的高血壓、眼高血壓、青光眼、肺動脈高血壓、門靜脈高血壓、系統性靜脈高血壓、收縮期高血壓、不穩定性高血壓；高血壓性心臟病、高血壓性腎病、動脈粥樣硬化、動脈硬化、血管病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、腎小球硬化症、主動脈縮窄、主動脈瘤、心室纖維化、心力衰竭、心肌梗塞、心絞痛、心臟瓣膜病、中風、腎疾病、腎衰竭、系統性硬化症、宮內發育遲緩(IUGR)、胎兒生長受限、肥胖、肝脂肪變性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)；葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)和代謝綜合症。

本揭露提供了一種體內遞送抑制AGT基因表達和/或複製的siRNA至肝臟的方法，包括給與受試者本揭露所述的siRNA或siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物。

本揭露還提供了一種製備siRNA或siRNA綴合物或dsRNA的方法，其包括：合成本揭露所述的siRNA、siRNA綴合物或dsRNA或醫藥組成物。

本揭露還提供了一種siRNA或siRNA綴合物或dsRNA，其特徵在於以鹼基T，替換本揭露任一siRNA或siRNA綴合物或dsRNA的一個或多個鹼基U，例如1個、2個、3個、3個、5個、6個、7個、8個、9個、10個。

本揭露中所述化合物可藥用鹽選自無機鹽或有機鹽，本揭露所述化合物可與酸性或鹼性物質反應成相應鹽。

另一方面，在不指明構型的情況下，本揭露化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本揭露設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)-和(+)-對映體、(R)-和(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬本揭露的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本揭露的範圍之內。

另外，在不指明構型的情況下，本揭露的化合物和中間體還可以以不同的互變異構體形式存在，並且所有這樣的形式包含於本揭露的範圍內。術語“互變異構體”或“互變異構體形式”是指可經由低能壘互變的不同能量的結構異構體。例如，質子互變異構體(也稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子遷移的互變，如酮-烯醇及亞胺-烯胺、內醯胺-內醯亞胺異構化。內醯胺-內醯亞胺平衡實例是在如下所示的A和B之間。

本揭露中的所有化合物可以被畫成A型或B型。所有的互變異構形式在本揭露的範圍內。化合物的命名不排除任何互變異構體。

本揭露化合物可以是不對稱的，例如，具有一個或多個立體異構體。除非另有說明，所有立體異構體都包括，如對映異構體和非對映異構體。本揭露的含有不對稱碳原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或藉由使用手性原料或手性試劑合成。

可以藉由的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(R)-和(S)-異構體以及D和L異構體。如果想得到本揭露某化合物的一種對映體，可以藉由不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團(如胺基)或酸性官能團(如羧基)時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後藉由本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是藉由使用色譜法完成的，該色譜法採用手性固定相，並視需要地與化學衍生法相結合(例如由胺生成胺基甲酸鹽)。

本揭露還包括一些與本文中記載的那些相同的，但一個或多個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本揭露化合物。可結合到本揭露化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，諸如分別為²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

除另有說明，當一個位置被特別地指定為氘(D)時，該位置應理解為具有大於氘的天然豐度(其為0.015%)至少1000倍的豐度的氘(即，至少10%的氘摻入)。示例中化合物的具有大於氘的天然豐度可以是至少1000倍的豐度的氘、至少2000倍的豐度的氘、至少3000倍的豐度的氘、至少4000倍的豐度的氘、至少5000倍的豐度的氘、至少6000倍的豐度的氘或更高豐度的氘。本揭露還包括各種氘化形式的式I和式II的化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。所屬技術領域具有通常知識者能夠參考相關文獻合成氘化形式的式I和式II化合物。在製備氘代形式的式I和式II化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

在不指明構型的情況下，本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”表示未指定構型，即如果化學結構中存在手性異構體，鍵“

”可以為“

”或“

”，或者同時包含“

”和“

”兩種構型。雖然為簡便起見將全部上述結構式畫成某些異構體形式，但是本揭露可以包括所有的異構體，如互變異構體、旋轉異構體、幾何異構體、非對映異構體、外消旋體和對映異構體。本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”並未指定構型，即鍵“

”的構型可以為E型或Z型，或者同時包含E和Z兩種構型。

術語解釋

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了一些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。

如無特別說明，在本揭露上下文中，術語“血管緊張素原”與“AGT”在本文可互換地使用。AGT也被稱為SERPINA8和ANHU。AGT包括但不限於人類AGT、食蟹猴AGT、小鼠AGT、大鼠AGT，其胺基酸和完整編碼序列、mRNA序列容易利用已公開的數據庫取得，例如，GenBank、UniProt、OMIM和獼猴(Macaca)基因組計劃網站。

術語“AGT”亦指AGT基因的天然存在的DNA序列變異，如AGT基因中的單核苷酸多態性(SNP)。示例性SNP可在dbSNP數據庫中發現。

術語“靶序列”指在AGT基因轉錄期間所形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括作為主要轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。該靶序列中被靶向的部分應當足夠長，才能作為iRNA指導的切割(iRNA-directed cleavage)的受質。在一個實施方式中，該靶序列在AGT的蛋白質編碼區內。

如本文所使用的，在RNA介導的基因沉默的情形中，siRNA的正義鏈(又稱SS、SS鏈或有義鏈)是指包含與靶mRNA序列相同或基本上相同的序列的鏈；siRNA的反義鏈(又稱AS或AS鏈)是指具有與靶mRNA序列互補的序列的鏈。

在描述本文所述的siRNA正義鏈的上下文中，術語“與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸序列，且包含至少15個連續核苷酸”旨在表示本文所述的siRNA正義鏈包含如與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中任一正義鏈的至少15個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中任一正義鏈的至少15個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列(視需要地，相差不超過2個核苷酸序列；視需要地，相差1個核苷酸序列)。視需要地，本文所述的siRNA正義鏈包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一正義鏈的至少16個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6任一正義鏈的至少16個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列(視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列)。

在描述本文所述的siRNA反義鏈的上下文中，術語“與SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12任一反義鏈相差不超過3個核苷酸序列，且包含至少15個連續核苷酸”旨在表示本文所述的siRNA反義鏈包含如SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12中任一反義鏈的至少15個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12中任一反義鏈的至少15個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列(視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列)。

本揭露中，正義鏈或反義鏈的“5’區域”也即“5’端”、“5’末端”，可替換使用。例如反義鏈5’區域的第2位至第8位的核苷酸，也可替換為反義鏈5’端的第2位至第8位的核苷酸。同理，正義鏈或反義鏈的“3’區域”、“3’末端”和“3’端”也可替換使用。

如無特別說明，在本揭露上下文中，大寫字母C、G、U、A、T表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母d表示該字母d下游相鄰的一個核苷酸為脫氧核糖核苷酸；小寫字母m表示該字母m上游相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f上游相鄰的一個核苷酸為氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s相鄰的兩個核苷酸之間為硫磷酸酯基連接。

如本揭露所使用的，術語“2'-氟修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，“非2'-氟修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。

如本揭露所使用的，術語“2'-甲氧基修飾的核苷酸”指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

如本文所使用的，術語“互補”或“反向互補”一詞可互相替代使用，並具有所屬技術領域具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤(A)始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶(t)(或者在RNA中為尿嘧啶(U))相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤(C)始終與嘧啶鹼基胞嘧啶(G)相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。與此相應地，“錯配”在本領域中意指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補的形式配對存在。

如本文所使用的，術語“抑制”，可以與“減少”、“沉默”、“下調”、“阻抑”和其他類似術語交替使用，並且包括任何水平的抑制。抑制可藉由這些變量中的一個或多個與對照水平相比的絕對或相對水平的減少來評估。該對照水平可以是本領域中使用的任何類型的對照水平，例如給藥前基線水平或從未經處理或經對照(例如僅緩衝液對照或惰性劑對照)處理的受試者、細胞、或樣品確定的水平。例如，可以採用mRNA剩餘表達量來表徵siRNA對靶基因表達的抑制程度，如mRNA剩餘表達量為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。靶基因表達的抑制率可以採用Dual-Glo® Luciferase Assay System檢測，分別讀取螢火蟲化學發光值(Fir)和海腎化學發光值(Ren)，計算相對值Ratio=Ren/Fir；本揭露中，剩餘mRNA表達量比例(或剩餘活性%)=Ratio(siRNA處理組)/Ratio(無siRNA對照組)，抑制率(%)=100%-剩餘mRNA表達量(%)。

如無特殊說明，本揭露的“化合物”、“配體”、“核酸配體綴合物”、“核酸”、“綴合物”、化學修飾”、“配體”、“dsRNA”、“RNAi”均可獨立地以鹽、混合鹽或非鹽(例如游離酸或游離鹼)的形式存在。當以鹽或混合鹽的形式存在時，其可為藥學上可接受的鹽。

術語“藥學上可接受的鹽”包括藥學上可接受的酸加成鹽和藥學上可接受的鹼加成鹽。

“藥學上可接受的酸加成鹽”是指能夠保留游離鹼的生物有效性而無其它副作用的，與無機酸或有機酸所形成的鹽。無機酸鹽包括但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機酸鹽包括但不限於甲酸鹽、乙酸鹽、2,2-二氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、十一碳烯酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、癸二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、油酸鹽、肉桂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、谷胺酸鹽、焦谷胺酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、4-胺基水楊酸鹽、萘二磺酸鹽等。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

“藥學上可接受的鹼加成鹽”是指能夠保持游離酸的生物有效性而無其它副作用的、與無機鹼或有機鹼所形成的鹽。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。較佳的無機鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽，較佳鈉鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於以下的鹽：第一胺類、第二胺類及第三胺類，被取代的胺類，包括天然的被取代胺類、環狀胺類及鹼性離子交換樹脂，例如胺、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、普魯卡因、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。較佳的有機鹼包括異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己基胺、膽鹼及咖啡因。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

“有效量”或“有效劑量”指獲得任一種或多種有益的或所需的治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，諸如減少各種本揭露靶基因、靶mRNA或靶蛋白相關病症的發病率或改善該病症的一個或更多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩患者的本揭露靶基因、靶mRNA或靶蛋白相關病症的進展。

如本文所使用的，“患者”、“受試者”或“個體”可互換使用，包括人類或者非人類動物，例如哺乳動物，例如人或猴。

本揭露提供的siRNA可以藉由本領域常規的製備方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已經有商業化訂制服務。可以藉由使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本揭露該siRNA中，製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。

術語“化學修飾”或“修飾”包括核苷酸經化學手段的所有改變，例如化學部分的添加或去除、或以一個化學部分取代另一個化學部分。

術語“鹼基”包含任何已知的DNA和RNA鹼基、鹼基類似物，例如嘌呤或嘧啶，其還包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、次黃苷和天然類似物。

術語“平端”或“平末端”可互換使用，是指在siRNA的給定的末端沒有非配對的核苷酸或核苷酸類似物，即，沒有核苷酸突出。大多數情況下，兩個末端都是平末端的siRNA將在其整個長度範圍內是雙鏈的。

術語“約”、“大約”是指數值在由所屬技術領域具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測(即測量體系的限度)。例如，“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍，例如1%至15%之間、在1%至10%之間、在1%至5%之間、在0.5%至5%之間、在0.5%至1%之間變化。本揭露中，數字或數值範圍之前有術語“約”的每種情況也包括給定數的實施方案。除非另外說明，否則當具體值在本揭露和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

除另有說明，“視需要地”、“視需要”、“可選的”或“可選”是指意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如“視需要地，R₁和R₂直接相連成環”是指R₁和R₂直接相連成環可以發生但不必須存在，該說明包括R₁和R₂直接相連成環的情形和R₁和R₂不成環的情形。

本揭露中，術語“包含”可替換為“由......組成”。

術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團。在一些實施方案中選自含有1至12個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。在一些實施方案中選自的是含有1至6個碳原子的烷基，非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基在一些實施方案中選自一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基或羧酸酯基。

術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基在一些實施方案中選自一個或多個以下基團，其獨立地選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基，該C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基所取代。同理，“炔氧基”、“烯氧基”、“環烷氧基”、“雜環烷氧基”、“環烯氧基”的定義如上述“烷氧基”定義。

術語“烯基”指直鏈或支鏈的非芳香族烴基，其含有至少一個碳-碳雙鍵，並且具有2-10個碳原子。在這樣的基團中可以存在多達5個碳-碳雙鍵。例如，“C_2-C₆”烯基被定義為具有2-6個碳原子的烯基。烯基的示例包括但不限於：乙烯基、丙烯基、丁烯基和環己烯基。烯基的直鏈、支鏈或環狀部分可以含有雙鍵，並且在正常化合價所允許的任何位置視需要地被單-、二-、三-、四-或五-取代。

術語“環烯基”表示具有特定數量的碳原子和至少一個碳-碳雙鍵的單環烴基。

術語“炔基”指直鏈或支鏈的烴基，其含有2-10個碳原子並且含有至少一個碳-碳三鍵。可以存在多達5個碳-碳三鍵。因此，“C₂-C₆炔基”表示具有2-6個碳原子的烯基。炔基的示例包括但不限於：乙炔基、2-丙炔基和2-丁炔基。炔基的直鏈、支鏈部分可以含有正常化合價所允許的三鍵，並且在正常化合價所允許的任何位置視需要地被單-、二-、三-、四-或五-取代。

術語“酮”指代本文所述藉由羰基橋連接的任何烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環基、雜芳基或芳基。酮基的示例包括但不限於：烷醯基(例如，乙醯基，丙醯基，丁醯基，戊醯基，己醯基)，烯醯基(例如，丙烯醯基)，炔醯基(例如，乙炔醯基，丙炔醯基，丁炔醯基，戊炔醯基，己炔醯基)，芳醯基(例如，苯甲醯基)，雜芳醯基(例如，吡咯醯基，咪唑醯基，喹啉醯基，吡啶醯基)。

術語“烷氧基羰基”指藉由羰基橋連接的上述定義的任何烷氧基(即，-C(O)O-烷基)。烷氧基羰基的示例包括但不限於：甲氧基羰基，乙氧基羰基，異丙氧基羰基，正丙氧基羰基，第三丁氧基羰基，苄氧基羰基或正戊氧基羰基。。

術語“芳氧基羰基”指藉由氧羰基橋連接的上述定義的任何芳基(即，-C(O)O-芳基)。芳氧基羰基的例子包括但不限於：苯氧基羰基和萘氧基羰基。

術語“雜芳氧基羰基”指藉由氧基羰基橋連接的上述定義的任何雜芳基(即，-C(O)O-雜芳基)。雜芳基氧基羰基的示例包括但不限於：2-吡啶氧基羰基，2-噁唑基氧基羰基，4-噻唑基氧基羰基或嘧啶基氧基羰基。

術語“環烷基”或“碳環”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子。在一些實施方案中選自包含3至7個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基等。多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。環烷基可以是取代的或未取代的。當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代。在一些實施方案中選自一個或多個以下基團，獨立地選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基，該C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基所取代。

該環烷基環可以稠合於芳基或雜芳基環上，其中與母體結構連接在一起的環為環烷基，非限制性實例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環庚烷基等。環烷基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基在一些實施方案中選自一個或多個以下基團，其獨立地選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基，該C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基所取代。

術語“雜環烷基”或“雜環”或“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。在一些實施方案中選自包含3至12個環原子，其中1至4個是雜原子。在一些實施方案中選自包含3至7個環原子。單環雜環烷基的非限制性實例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫咪唑基、二氫呋喃基、二氫吡唑基、二氫吡咯基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環烷基包括螺環、稠環和橋環的雜環烷基。“雜環烷基”非限制性實例包括：

，等等。

術語“羥基”指-OH基團。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

術語“鹵烷基”指被鹵素取代的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“氰基”指-CN。

術語“硝基”指-NO₂。

術語“側氧”指=O基團，例如，碳原子與氧原子藉由雙鍵連接，其中形成酮或醛基。

術語“胺基”指-NH₂。

術語“羧基”指-C(O)OH。

術語“醛基”指-CHO。

在本揭露的化學結構式中，“

”或

其可以根據本文所述發明範圍連接一個或多個任何基團；星號“*”表示手性中心。

本揭露中，如無特別說明“磷酸酯基”為磷酸二酯基。

本揭露中，硫代磷酸酯基是指一個非橋接氧原子被硫原子替代而修飾的磷酸二酯基，可用

、

(M為S原子)互換使用。

本揭露上下文中，基團

中的

可以替換為能夠與相鄰核苷酸實現連接的任意基團。

術語“連接”，當表示兩個分子之間的聯繫時，指兩個分子藉由共價鍵連接或者兩個分子經由非共價鍵(例如，氫鍵或離子鍵)關聯，包括直接連接、間接連接。

術語“直接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團在沒有任何間插原子或原子基團的情況下連接。

術語“間接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團藉由中間基團、化合物或分子(例如，連接基團)連接。

術語“取代的”表示指定原子(通常是碳、氧和氮原子)上的任何一個或多個氫原子被本文所限定的任何基團所替代，條件是不超過該指定原子的正常化合價並且取代生成穩定化合物。取代基的非限制性示例包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羥基、側氧基、羧基、環烷基、環烯基、雜環基、雜芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基或鹵素(例如，F、Cl、Br、I)。當取代基是酮或側氧(即，=O)時，則原子上有兩個(2個)氫被替代。

“被一個或多個......取代”是指可以被單個或多個取代基取代。當被多個取代基取代時，可以是複數個相同取代基，也可以是一個或複數個不同取代基的組合。

本揭露中的一些縮略語定義如下：

DCE：二氯乙烷；

Sc(OTf)₃：三氟甲烷磺酸鈧；

TFH：四氫呋喃；

Pd/C：鈀-碳；

TFA：三氟乙酸；

DMF：二甲基甲醯胺；

DIPEA：N-乙基二異丙基胺；

HoBt：1-羥基苯并三唑；

EDCI：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；

DMTrCl：4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯；

DIEA：N,N-二異丙基乙胺；

HATU：2-(7-氮雜苯并三唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽；

LiOH：氫氧化鋰；

DMAP：4-二甲胺基吡啶；

HBTU：苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽；

DMTrCl：1-[氯(4-甲氧基苯基)苄基]-4-甲氧基苯

CF₃SO₃H：三氟甲磺酸；

BnBr：溴化苄；

DEPBT：3-(二乙氧基磷醯氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮；

Bz：苯甲醯基保護基；

MMTr：甲氧基苯基二苯甲基；

DMTr：二甲氧三苯甲基保護基。

圖1為TRD002218和TRD007205在給藥後第7天TTR中mRNA的表達量。

圖2為TRD002218和TRD007205在給藥後第28天TTR中mRNA的表達量。

以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，則該試劑可自任意分子生物學試劑的供應商以用於分子生物學應用的質量/純度而獲得。

第一部分. 防脫靶修飾

實施例1. 化學修飾的製備

1.1 合成化合物1-1a和化合物1-1b

將化合物1(500mg,3.42mmol)和三乙胺(Et₃N，692mg,6.84mmol,0.95mL)溶於二氯甲烷(DCM，10mL)中，冰浴下滴加4-甲苯磺醯氯(tsCl,717mg,3.76mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，滴加完畢後反應在室溫下攪拌過夜，待反應完畢後，用水淬滅，水相用二氯甲烷(15mL)提取三次，合併的有機相先用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑得到粗品2(820mg,80%)，直接用於下一步反應。MS m/z：C₁₄H₂₁O₅S，[M+H]⁺理論：301.10實測：301.2。

將化合物3(239mg,1.22mmol)溶解於二甲基甲醯胺(DMF，10mL)中，冰浴下加入NaH(60%溶解在礦物油中，93mg,2.33mmol)溶液，該反應下攪拌30分鐘，然後滴加化合物2(350mg,1.16mmol)，滴加完畢後反應在60℃下攪拌5小時，反應完畢後，加水淬滅，水相用乙酸乙酯(15mL)提取三次，合併的有機相先用水(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(10mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-50%(A：H₂O，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到220mg化合物4。MS m/z：C₁₉H₂₁N₅O₃Na，[M+Na]⁺理論：390.16，實測：390.3。

室溫下將化合物4(1.50g,4.08mmol)溶解於20mL的醋酸和水(4：1)的混合溶液中，60℃下攪拌30分鐘，待反應完畢後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-25%(A：H₂O，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1.10g化合物5。MS m/z：C₁₆H₁₈N₅O₃，[M+H]⁺理論：328.13，實測：328.4。

將化合物5(1.00g,3.05mmol)溶於吡啶(Py，10mL)中，冰浴下滴4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl,1.50g,4.58mmol)的吡啶(5mL)溶液，滴加完畢後反應在室溫下攪拌過夜，待反應完畢後，用水淬滅，減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-80%(A：H₂O，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1.00g化合物6。MS m/z：C₃₇H₃₆N₅O₅，[M-H]⁺理論：630.26，實測：630.5。消旋體化合物6經手性管柱(Daicel CHIRALPAK® IE 250*4.6mm,5μm，A：正己烷，B：乙醇)拆分得410mg 6A(-)和435mg 6B(+)。

將化合物6A(-)(200mg,0.32mmol)，四唑(11mg,0.16mmol)，N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)，3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入二氯甲烷(30mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-100%(A：水，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到200mg化合物1-1a。MS m/z：C₄₀H₃₉N₆O₇P，[M-二異丙基+OH]⁺理論：747.26，實測：747.6。1H NMR(400MHz，乙腈-d ₃)δ 7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。

將化合物6B(+)(200mg,0.32mmol)，四唑(11mg,0.16mmol)，N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)，3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入二氯甲烷(30mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-100%(A：水，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到200mg化合物1-1b。MS m/z：C₄₀H₃₉N6O₇P，[M-二異丙基+OH]⁺理論：747.26，實測：747.5。

1.2 合成化合物1-6a

將化合物1(10g,68.404mmol)、化合物2(15g,62.186mmol)和三苯基膦(32.62g,124.371mmol)溶於無水THF(30mL)，於0℃下緩慢滴加DIAD(24.656mL，124.371mmol)。該反應液在25度下反應12h.LCMS顯示反應完成。將該反應液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥將濾液濃縮，得到的殘留物用正向管柱純化(DCM/MeOH=10/1)得目標產物3(20g)。

將化合物3(20g,28.585mmol)溶於醋酸(24mL,426.016mmol)和H2O(12mL)中，60℃攪拌1小時。之後將反應液旋乾加入THF(12mL)和H2O(12mL)，80℃攪拌7小時。LCMS顯示反應完成。將反應液加入乙酸乙酯(200mL)和水(100mL)萃取，水相加入碳酸鈉固體直到水相有大量固體析出。將固體過濾，用水洗滌，將濾餅用油泵拉乾，得到目標化合物5(9g)。

在氮氣保護下，將化合物5(6.8g,18.581mmol)溶於吡啶(80mL)中，於0度下緩慢加入TMSCl(14.250mL,111.489mmol)，攪拌2h。之後在0度下加入異丁醯氯(2.044mL,19.511mmol)，於25度下攪拌1h.LCMS顯示反應完成。用二氯甲烷(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥旋乾後拌樣，用正向管柱純化(DCM：MeOH=10：1)過管柱，在4.8%處出峰)，得到黃色油狀化合物6(12g)。

在氮氣保護下，將化合物6(5.5g,12.392mmol)溶於吡啶(30mL)，加入分子篩4A 1/16(7g,12.392mmol)，然後在0℃下分批加入DMTrCl(5.04g,14.870mmol)固體，25℃反應2h.TLC(PE：EtOAc=1：1,Rf=0.69)顯示反應已經完成。該反應液和TJN200879-040-P1合併一起處理。將反應液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥旋乾後拌樣用正向管柱純化(PE：EtOAc過管柱，在84%處出峰)，得到黃色油狀化合物7(12g)。

將化合物7(12g,15.389mmol)溶於EtOAc(140mL)，加入濕鈀碳Pd/C(7g,15.389mmol)該反應液在25度，氫氣(15Psi)下反應2小時。TLC(PE：EtOAc=0：1,Rf=0.09)顯示反應已經完成。將反應液過濾，濾餅用乙酸乙酯(30mL)沖洗三遍後，收集濾液。濾液旋乾後加入50mL二氯甲烷和2mL三乙胺拌樣用正向管柱純化(DCM：MeOH=10：1過管柱，在0.5%處出峰)，得到9g(黃色泡沫狀固體).將所得消旋化合物SFC拆分，得到產品目標化合物7A(-)(3.9g)和目標化合物7B(+)(3.8g)。

將化合物7A(-)(3.30g,5.40mmol)，四唑(190mg,2.70mmol)，1-甲基咪唑(90mg,1.10mmol)，3A分子篩(500mg)溶於30mL的乙腈中，室溫下加入化合物8(2.50g,8.10mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(150mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(30mL*3)，再用飽和食鹽水(30mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18，條件：5-100%(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-6a(2.9g,66%)。MS m/z：C43H55N7O7P[M+H]+，理論：812.38，實測：812.5。1H NMR(400MHz，乙腈-d3)δ 7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。

1.3 合成化合物1-7a

在氮氣保護下，將化合物1(5g,23.1272mmol)，化合物2(6.76g,46.254mmol)和三苯基磷(7.28g,27.753mmol)溶於30mL二噁烷中，於0℃緩慢滴加入DEAD(5.502mL,27.753mmol)。滴加完成後，反應緩慢升溫至25℃繼續反應1h.在反應液裡加入100mL H₂O和100mL EtOAc萃取，有機相合併乾燥過濾濃縮後拌樣過管柱，用正向管柱純化(PE：EtOAc=1：1過管柱得目標產物(4g)。

將化合物3(3.3g)溶於HOAc(16mL)和H2O(4mL)，油浴60℃加熱0.5h.將反應液旋乾得到的殘留物用正向管柱純化(PE：EtOAc=0：1過管柱)，得到目標產物4(3g)。

將化合物4(3g,8.873mmol)溶於5mL吡啶中，在氮氣保護下於0℃緩慢滴加DMTrCl(3.91g,11.535mmol)的10mL吡啶的溶液。滴加完畢後反應升溫至25℃並繼續反應1h。在反應液中加入50mL水和100mL乙酸乙酯萃取。水相再用100mL乙酸乙酯萃取三次，有機相合併乾燥過濾濃縮用正向管柱純化(用PE：EtOAc=2：1)。得到目標產物5(4g)。

將化合物5(4g,5.769mmol)溶於甲醇(10mL)，加入飽和的NH3甲醇溶液(40mL)，0℃反應6h.將反應液旋乾用正向管柱純化(用PE：EtOAc=0：1)得消旋化合物2.4g SFC拆分，得到目標產物6A(750mg,100%純度)和目標產物6B(400mg,99.16%純度)。

將化合物6A(-)(700mg,1.40mmol)，四唑(50mg,0.70mmol)，1-甲基咪唑(23mg,0.28mmol)，3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(630mg,2.10mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(50mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(10mL*3)，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18，條件：5-100%(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-7a(700mg,72%)。MS m/z：C38H47N4O7PNa[M+Na]+，理論：725.32，實測：725.5。

1.4 合成化合物1-8a

將化合物1(8.5g,76.508mmol)、化合物2(30.64g,91.809mmol)溶於DMF(150mL)，加入CS2CO3(29.91g,91.809mmol)，反應於氮氣保護下，90℃反應12h。LCMS檢測反應完成。將反應液過濾，油泵旋乾，正向管柱分離純化(80g,DCM/MeOH=10/1至5/1)得到目標產物3(13.5g,80%純度)。

將化合物3(10.5g,35.105mmol)溶於吡啶(65mL)和CH3CN(65mL)，向溶液中滴加BzCl(4.894mL,42.126mmol)，於25℃反應2h。LCMS檢測大部分原料反應完成，加H2O(100mL)淬滅，EtOAc(100mL×3)萃取，乾燥旋乾，管柱分離(合併TJN200872-101)純化(80g,PE/EtOAc=10/1至0/1,DCM/MeOH=10/1)得到目標產物4(14g,90%純度)。

將化合物4(14g,36.694mmol)溶於HOAc(56mL,314.796mmol)和H2O(14mL)，於60℃反應2h,LCMS顯示反應完成。油泵濃縮，正向管柱分離(40g,DCM/MeOH=1/0至5/1)得到目標產物5(8.4g,90%純度& 2.4g,80%純度)。

將化合物5(7.4g,21.957mmol)、DMAP(0.54g,4.391mmol)、分子篩4A(11.1g,2.967mmol)溶於吡啶(60mL)，冰浴下攪拌10min，然後加入DMTrCl(8.93g,26.348mmol)，反應攪拌1.8h.LCMS檢測約19%原料剩餘，約60%目標MS。合併(TJN200872-105&106)一起純化。向反應液中加入H2O(50mL)，經DCM(50mL×3)萃取，乾燥，旋乾，管柱分離(120g,PE/(EA：DCM：TEA=1：1：0.05)=1/0至0/1至DCM/MeOH=10/1)得到黃色固體化合物6(11g,89%純度，TJN200872-105&106&107)，回收原料(3.0g,70%純度)。

化合物6(15g,22.041mmol)經SFC(DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*50mm,10um)；0.1% NH3H2O EtOH，B：45%-45%；200ml/min)分離得到目標產物6A(5.33g,94.29%純度)，目標產物6B(6.14g,97.91%純度)，化合物6回收1.0g。

將化合物6B(-)(5.4g,8.92mmol)，四唑(312mg,4.46mmol)，1-甲基咪唑(146mg,1.78mmol)，3A分子篩(500mg)溶於40mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(4g,13.4mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(200mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(30mL*3)，再用飽和食鹽水(50mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18，條件：5-100%(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-8a(5.8g,80%)。MS m/z：C45H51N5O7P，[M+H]+，理論：804.36，實測：804.4。

實施例2. siRNA的合成

siRNA的合成與通常的亞磷醯胺固相合成法無異，在合成AS鏈5’第7位修飾的核苷酸時，使用上述合成的亞磷醯胺單體替換母序列原核苷酸。合成過程簡要描述如下：於Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上，以通用CPG載體為起始，根據合成程序逐個連接核苷亞磷醯胺單體。除上述描述的AS鏈5’第7位的核苷亞磷醯胺單體外，其餘核苷單體原料2’-F RNA、2’-O-甲基RNA等核苷亞磷醯胺單體購自上海兆維或蘇州吉瑪。採用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑(0.6M乙腈溶液)，使用0.22M的PADS溶於1：1體積比的乙腈和三甲基吡啶(蘇州柯樂瑪)溶液作為硫化試劑，使用碘吡啶/水溶液(柯樂瑪)作為氧化劑。

固相合成完成後，寡核糖核苷酸自該固體支撐物裂解，採用3：1的28%氨水和乙醇溶液在50℃條件下浸泡16小時。然後離心，將上清液轉移到另一個離心管中，濃縮蒸發乾後，使用C18反向色譜純化，流動相為0.1M TEAA和乙腈，並使用3%三氟乙酸溶液脫除DMTr。目標寡核苷酸收集後凍乾，並經LC-MS鑑定為目標產物，再經過UV(260nm)定量。

所得到的單鏈寡核苷酸，根據等莫耳比，按照互補配對，退火，最後所得到的雙鏈siRNA溶於1×PBS中，並調整至實驗所需濃度備用。

實施例3. psiCHECK活性篩選實驗

siRNA樣品合成見前述，質粒來源於生工生物工程(上海)股份有限公司。psiCHECK實驗耗材如表1所示。

表1. psiCHECK實驗耗材和試劑

實驗步驟：細胞鋪板、細胞轉染，其中，轉染複合物具體配製量如表2所示。

表2. 96孔板每孔所需轉染複合物用量

依照表3，根據不同的實驗需求稀釋至不同濃度作為工作液備用，現用現配。轉染24h後，按照Dual-Glo® Luciferase Assay System檢測試劑盒的實驗操作方案進行檢測。

計算相對值Ratio=Ren/Fir(海腎/螢火蟲比值)；

計算抑制率1-(Ratio+siRNA/僅報告基因)*100%=抑制率(%)；

本揭露中，剩餘活性%(也稱為mRNA剩餘表達量%或mRNA剩餘表達比例)=100%-抑制率(%)。

表3. 多濃度的稀釋方案

實施例4. 包含不同化學修飾的siRNA的在靶活性和脫靶活性實驗

利用實施例1的化合物、採用實施例2的方法合成siRNA，並藉由實施例3的方法驗證各siRNA的在靶活性和脫靶活性，其中各siRNA採用相同的正義鏈，且反義鏈5’端第7位分別為以下修飾核苷酸/化學修飾，

其中，我們將由2-羥甲基-1,3-丙二醇為起始原料合成的核苷酸定義hmpNA；

(+)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1b藉由固相合成獲得，絕對構型為(S)-hmpNA(A)；

(-)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1a藉由固相合成獲得，絕對構型為(R)-hmpNA(A)。

類似的，替換hmpNA的鹼基種類，藉由固相合成獲得以下結構並確認絕對構型：

(+)hmpNA(G)，絕對構型為(S)-hmpNA(G)；

(-)hmpNA(G)，絕對構型為(R)-hmpNA(G)；

(+)hmpNA(C)，絕對構型為(S)-hmpNA(C)；

(-)hmpNA(C)，絕對構型為(R)-hmpNA(C)；

(+)hmpNA(U)，絕對構型為(R)-hmpNA(U)；

(-)hmpNA(U)，絕對構型為(S)-hmpNA(U)。

(S)-hmpNA(G)，(R)-hmpNA(G)，(S)-hmpNA(C)，(R)-hmpNA(C)，(S)-hmpNA(U)和(R)-hmpNA(U)的絕對構型由其中間體或衍生物經X-Ray衍射而確認。

中間體或衍生物的結構為：

TJ-NA067：檢測晶體為無色塊狀(0.30×0.10×0.04mm3)，屬單斜晶系P21空間群。晶胞參數a=16.0496(5)Å,b=4.86260(10)Å,c=16.4686(5)Å,α=90°,β=118.015(4)°,γ=90°,V=1134.65(7)Å3,Z=4。計算密度Dc=1.389g/cm3，單胞中電子數F(000)=504.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.840mm-1，衍射實驗溫度T=150.00(11)K。

6A(+)：檢測晶體為無色塊狀(0.30×0.20×0.10mm3)，屬單斜晶系P21空間群。晶胞參數a=22.6688(7)Å,b=8.5595(2)Å,c=23.3578(5)Å,α=90°,β=113.876(3)°,γ=90°,V=4144.3(2)Å3,Z=2。計算密度Dc=0.999g/cm3，單胞中電子數F(000)=1318.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.570mm-1，衍射實驗溫度T=100.01(18)K。

TJ-NA048：檢測晶體為無色針狀(0.30×0.04×0.04mm3)，屬單斜晶系P1空間群。晶胞參數a=7.6165(4)Å,b=11.3423(5)Å,c=17.3991(8)Å,α=85.007(4)°,β=88.052(4)°,γ=70.532(4)°,V=1411.75(12)Å3,Z=2。計算密度Dc=1.366g/cm3，單胞中電子數F(000)=620.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.856mm-1，衍射實驗溫度T=150.00(13)K。

TJ-NA092：檢測晶體為無色棱柱狀(0.30×0.10×0.10mm3)，屬三斜晶系P1空間群。晶胞參數a=5.17960(10)Å,b=8.0667(2)Å,c=12.4077(2)Å,α=93.146(2)°,β=101.266(2)°,γ=96.134(2)°,V=503.993(18)Å3,Z=2。計算密度Dc=1.412g/cm3，單胞中電子數F(000)=228.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.945mm-1，衍射實驗溫度T=100.00(10)K。

實施例5. 包含不同化學修飾的siRNA的序列依賴性實驗

在多條不同序列上測試了本揭露的實驗化合物。使用了靶向不同基因mRNA的siRNA，使用(+)hmpNA(A)、(-)hmpNA(A)和作為對照的GNA(A)化合物修飾AS鏈5’端第7位(序列如表4-1、表4-2所示)。

表4-1. 靶向不同基因的siRNA正義鏈

表4-2. 靶向不同基因的包含化學修飾的siRNA反義鏈

在靶活性實驗結果參見表5，GNA(A)顯現出明顯的序列依賴性，不同序列的在靶活性差異明顯。本揭露的實驗化合物沒有顯示出明顯的序列依賴性，普遍適用性更強。

表5. 針對不同靶序列的siRNA的在靶活性結果

脫靶活性實驗結果參見表6，可以看出，相對於母序列，本揭露的實驗化合物明顯降低了siRNA的脫靶活性。

表6. 針對不同靶序列的siRNA的脫靶活性結果

實施例6. 評估AS鏈9位和10位不同修飾

本實驗考察本揭露的不同位點2’-氟修飾的siRNA綴合物或dsRNA在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率。

將雄性6-8週齡C57BL/6小鼠隨機分組，每組共6隻，每個時間點各3隻，分別向每組小鼠給予測試綴合物(2個，TRD007047和TRD006870)、對比綴合物(TRD002218)以及PBS。所有動物依據體總計算給藥量，採用皮下注射方式單次給藥，siRNA綴合物或dsRNA給藥劑量(以siRNA的量計)為1mg/kg，給藥體積為5mL/kg。給藥7天後處死小鼠，收集肝臟，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；隨後用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用組織RNA提取試劑盒(凡知醫療科技，FG0412)根據操作說明書標註的操作步驟提取得到肝組織總RNA。將總RNA反轉錄成cDNA並採用實時螢光定量PCR方法檢測肝組織中的TTR mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內參基因，使用針對TTR和GAPDH的Taqman探針引子分別檢測TTR和GAPDH的mRNA表達量。化合物信息參見表7，小鼠體內實驗化合物分組信息參見表8，引子參見表9。

表7. AS鏈9位和10位修飾

NAG1結構為：

。

按照專利WO2021254360A1所述的方法製備了化合物NAG1；

L96結構為：

按照專利WO2014025805A1所述的方法製備了對照化合物L96。

表8.小鼠體內實驗分組信息

表9. 檢測引子序列

給藥28天後，本揭露的不同位點氟修飾的siRNA綴合物或dsRNA的在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率見表10。參比陽性對照TRD002218，不同位點氟修飾的siRNA綴合物在給藥後28天對於TTR mRNA的表達抑制高於參比陽性對照，兩種修飾方法均表現出高抑制效率且無顯著性差異，說明AS鏈9位和10位兩種修飾方法能夠介導更高效抑制效率。

表10. 7天和28天檢測結果

TTR mRNA表達量按照如下等式計算：

TTR mRNA表達量=[(測試組TTR mRNA表達量/測試組GAPDH mRNA表達量)/(對照組TTR mRNA表達量/對照組GAPDH mRNA表達量)]×100%

第二部分. 靶向配體

實施例7. 製備NAG0052、L96

化合物NAG0024、NAG0026購買自天津藥明康德新藥開發有限公司。除非特別說明，以下實施例中所用的試劑均為市售商品。

(1)化合物NAG0052的合成

起始原料化合物1採購自江蘇倍達醫藥科技有限公司。

化合物2

在0度以及氮氣保護下，往化合物1(12.3mL,101mmol)的THF(300mL)溶液中分批加入NaH(12.2g,304mmol，純度60%)。該混合物在20℃下攪拌1小時之後再次冷卻到0℃，接著往體系中逐滴加入苄溴(36.3mL,304mmol)，並且在20℃攪拌12小時。將該反應液用H₂O(100mL)淬滅後，用EtOAc(200mL×2)萃取。合併後的有機相用飽和食鹽水(100mL)洗滌，Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮得到的殘留物經過矽膠管柱層析分離後得到目標化合物2(20.0g,51.8mmol，產率51%)。

LCMS：t_R=2.615 and 2.820min in 30-90AB_7min_220&254_Shimadzu.lcm(Xtimate C18,3um,2.1*30mm),MS(ESI)m/z=351.2[M+Na]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.35-7.12(m,10H),5.06-4.95(m,1H),4.51-4.39(m,4H),4.24-3.87(m,2H),3.50-3.40(m,2H),3.38-3.20(m,3H),2.20-1.91(m,2H)。

化合物3和化合物4

在20℃以及氮氣保護下，往化合物2(13.0g,33.6mmol)的DCM(300mL)溶液中一次性加入TMSCN(13.5mL,101mmol)，接著逐滴加入TMSOTf(9.14mL,50.5mmol)的DCM(30mL)溶液。該反應液在20℃下攪拌15小時。反應結束之後用飽和NaHCO₃水溶液(80mL)淬滅該體系，並且用DCM(150mL×2)萃取，合併後的有機相用飽和食鹽水(80mL)洗滌，Na₂SO₄乾燥，過濾以及濃縮後藉由矽膠管柱層析分離後得到目標化合物3(3.30g,9.18mmol，產率27%)以及淡黃色油狀液體化合物4(8.50g,9.18mmol，產率70%)。

化合物3

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.42-7.29(m,10H),4.81(t,J=7.8Hz,1H),4.65-4.49(m,4H),4.30-4.21(m,2H),3.65-3.57(m,1H),3.57-3.49(m,1H),2.49-2.40(m,2H)。

化合物4

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.42-7.26(m,10H),4.93-4.87(m,1H),4.65-4.48(m,4H),4.43-4.38(m,1H),4.21-4.17(m,1H),3.79-3.70(m,1H),3.54(d,J=4.0Hz,1H),2.45-2.37(m,2H)。

化合物5

在0℃及氮氣保護下將化合物4(3.00g,9.28mmol)的THF(15mL)溶液，滴加到LiAlH₄(0.79g,20.9mmol)的THF(15mL)溶液中，滴加完後體系在0℃反應1小時。TLC(PE：EtOAc=3：1)監測到原料完全消失。向反應液中緩慢加入十水硫酸鈉，加至不冒泡為止。之後將反應液過濾，濾餅用二氯甲烷(60mL)洗滌三次後，收集濾液旋乾，得目標化合物5(3.00g，產率90%).

¹ H NMR：(400MHz,DMSO-d ₆)δ ppm 7.40-7.14(m,10H),4.54-4.38(m,4H),4.06-3.99(m,2H),3.91(q,J=6.4Hz,1H),3.48-3.37(m,2H),2.67-2.52(m,2H),2.21-2.18(m,1H),1.77-1.73(m,1H)。

化合物6

在氮氣保護下，將化合物5(3.00g,8.25mmol)溶於DCM(30mL)，加入TEA(3.44mL,24.7mmol)和CbzCl(1.76mL,12.4mmol)，20℃反應2小時。LCMS顯示反應完成。將反應液加入二氯甲烷(30mL)和水(60mL)萃取。有機相用水(60mL×3)洗滌三次，無水硫酸鈉乾燥，濃縮用正向管柱純化(PE：EtOAc=1：1)，得到目標化合物6(2.5g，產率90%)。

LCMS：t_R=0.810min in 5-95AB_1min,MS(ESI)m/z=462.2[M+H]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.39-7.29(m,15H),5.35(s,1H),5.15-5.01(m,2H),4.72(d,J=6.0Hz,1H),4.54-4.40(m,3H),4.26(s,1H),4.23-4.18(m,1H),4.11-4.04(m,1H),3.54-3.41(m,3H),3.37-3.25(m,1H),2.34-2.23(m,1H),1.85-1.79(m,1H)。

化合物7

在氮氣保護下，將化合物6(2.00g,3.90mmol)溶於DCM(5mL)，在-78℃下加入BCl₃的THF溶液(1M,27.3mL)，反應1小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)監測到原料完全消失。將反應液在-78℃下加入甲醇(20mL)淬滅，濃縮，用正向管柱純化(DCM：MeOH=10：1)，得到目標化合物7(2.00g，產率60%)。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.41-7.23(m,5H),5.08(s,2H),4.25-4.07(m,2H),3.85-3.75(m,1H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.48(m,1H),3.30-3.27(m,2H),2.34-2.21(m,1H),1.71-1.64(m,1H)。

化合物8

在氮氣保護下，將化合物7(0.50g,1.78mmol)溶於吡啶(5mL)中，在0℃下加入4A分子篩(500mg)和DMTrCl(0.66mL,2.13mmol)，之後升溫至20℃反應1.5小時。TLC(PE：EtOAc=2：1)監測到原料完全消失。將反應液加入乙酸乙酯(60mL)和水(60mL)萃取，有機相用水(60mL×3)洗滌三次後用無水硫酸鈉乾燥，濃縮，用正向管柱純化(PE：EtOAc=1：1)，得到目標化合物8(800mg，產率90%)。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.44(d,J=7.6Hz,2H),7.37-7.23(m,11H),7.22-7.15(m,1H),6.84(d,J=8.8Hz,4H),5.09(s,2H),4.31-4.17(m,2H),4.02-3.91 (m,1H),3.84-3.73(m,6H),3.33(s,1H),3.28(s,1H),3.19-3.01(m,2H),2.34-2.25(m,1H),1.70-1.62(m,1H)。

化合物9

將化合物8(800mg,1.234mmol)溶於EtOAc(5mL)，加入Pd/C 10%(800mg,7.517mmol)，反應在H₂條件(15Psi)，20℃下反應1小時。LCMS顯示反應已經完成。反應液過濾，濾餅用二氯甲烷(100mL)和甲醇(100mL)洗滌三次，濃縮，經過反相管柱分離得到化合物9(300mg,54%)。

LCMS：t_R=2.586min in 10-80CD_3min MS(ESI)m/z=450.2[M+H]⁺。

化合物11

將化合物10(435mg,1.780mmol)溶於DCM(10mL)，加入DIEA(0.441mL,2.67mmol)和HATU(677mg,1.78mmol)後，再加入化合物9(400mg,0.890mmol)，20℃反應1小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)監測反應完成。將反應液加入二氯甲烷(60mL)和水(60mL)萃取，有機相用水(60mL×3)洗滌三次，無水硫酸鈉乾燥，濃縮用正向管柱純化(PE：EtOAc=0：1過管柱，在100%處出產品峰)，得到目標化合物11(600mg，產率90%)。

LCMS：t_R=2.745min in 30-90CD_3min,MS(ESI)m/z=698.4[M+Na]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.46-7.38(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.16(m,1H),6.90-6.78(m,4H),4.29-4.21(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.77(s,6H),3.66-3.62(m,3H),3.41(s,1H),3.18-3.04(m,2H),2.36-2.17(m,5H),1.71-1.50(m,5H),1.39-1.25(m,14H)。

化合物12

將化合物11(600mg,0.799mmol)溶於THF(3mL)和H₂O(1mL)，加入LiOH.H₂O(134mg,3.20mmol)，20℃反應12小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)顯示反應完成。將反應液旋乾，用水(5mL)和甲醇(5mL)溶解，用反向管柱純化(H₂O：CH₃CN=1：1，在35%左右出峰)，得到目標化合物12(460mg，產率100%，鋰鹽)。

LCMS：t_R=1.346min in 10-80CD_3min,MS(ESI)m/z=684.3[M+Na]⁺。

HPLC：t_R=1.879min in 10-80CD_6min。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.47-7.39(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.15(m,1H),6.91-6.79(m,4H),4.31-4.18(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.78(s,6H),3.44-3.33(m,2H),3.18-3.04(m,2H),2.35-2.27(m,1H),2.24-2.10(m,4H),1.70-1.51(m,5H),1.31-1.23(m,12H)。

化合物13

室溫環境，氮氣保護下，將化合物NAG0024(271mg,0.151mmol)溶解於無水THF(2mL)和無水DMF(4mL)，加入3A分子篩，再依次加入化合物12(100mg,0.151mmol),HOBt(25mg,0.181mmol),DCC(38mg,0.181mmol)和DIEA(39mg,0.302mmol)。反應液45℃反應16h.LC-MS顯示反應完全後，加水淬滅，過濾。濾液濃縮後，經C18反相管柱純化(H₂O/MeCN)，得到化合物13(210mg，產率57%)。

化合物NAG0052

室溫環境下，化合物13(230mg，0.094mmol)溶於吡啶(5mL)，加入分子篩，加入DMAP(12mg，0.283mmol)，丁二酸酐(28mg，0.283mmol)。氮氣保護，50℃攪拌16小時。LCMS檢測反應完全，過濾旋乾。過C18反相管柱純化後，由製備HPLC二次純化，得到目標化合物NAG0052(123mg，0.048mmol，產率51%)。

MS(ESI)m/z=2535.3[M-1]^-.理論：2536.2。

¹H NMR(400MHz，乙腈-d ₃)δ 7.48-7.43(m,2H),7.37-7.12(m,11H),7.00-6.85(m,10H),6.66(s,1H),5.31(dd,J=3.4,1.1Hz,3H),5.20-5.13(m,1H),5.05(dd,J=11.3,3.4Hz,3H),4.56(d,J=8.5Hz,3H),4.30(dd,J=7.7,5.3Hz,1H),4.18-3.93(m,14H),3.79(s,10H),3.65(q,J=4.7,3.6Hz,13H),3.56-3.07(m,24H),2.56(s,6H),2.37(t,J=5.8Hz,10H),2.17(t,J=7.5Hz,9H),2.02-1.96(m,20H),1.88(s,8H),1.82-1.73(m,2H),1.60(dt,J=15.0,7.3Hz,16H),1.27(s,13H)。

實施例8. siRNA綴合物或dsRNA的合成

1.自製帶有載體的樹脂

將含有羧酸基團的化合物NAG0052(157mg,0.062mmol)溶於無水DMF(3mL)，待受質完全溶解後，依次加入無水乙腈(4mL)、DIEA(0.03mL,0.154mmol，2.5eq)和HBTU(35mg,0.093mmol，1.5eq)。反應液混合均勻後，再加入大孔胺甲基樹脂(476mg，空白載量為0.41mmol/g，目標載量為0.1mmol/g)。將反應液放入搖床上(溫度：25℃，轉速：200rpm)振搖過夜。反應液過濾，濾餅依次分別用DCM，無水乙腈洗滌，收集固體，真空乾燥過夜。

將上步固體分散於無水乙腈(5mL)，依次加入吡啶(0.18mL)，DMAP(3mg)，NMI(0.12mL)和CapB1(2.68mL)。將反應液放入搖床上(溫度：25℃，轉速：200rpm)振搖2h。反應液過濾，濾餅用無水乙腈洗滌，收集固體，真空乾燥過夜，得到帶有載體的樹脂。載量經過測定為0.1mmol/g。

2.對於已經連接在樹脂上的NAG0052，使用該樹脂作為起始，按照核苷酸排布順序自3’-5’方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應。操作為本領域常規。

製得的siRNA綴合物或dsRNA具有表11和表12中所示的有義鏈和反義鏈。

表11 siRNA綴合物或dsRNA列表

表12有義鏈和反義鏈的核酸序列

表13. 綴合物的結構

其中，綴合物TRD002218作為參比陽性化合物。

實施例9. siRNA綴合物或dsRNA在體內對靶基因mRNA表達量的抑制

本實驗考察本揭露的綴合不同結構的siRNA綴合物或dsRNA在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率。

將雄性6-8週齡C57BL/6小鼠隨機分組，每組共6隻，每個時間點各3隻，分別向每組小鼠給予本揭露的綴合物TRD007205、參比陽性核酸配體綴合物TRD002218以及PBS。

所有動物依據體總計算給藥量，採用皮下注射方式單次給藥，siRNA綴合物或dsRNA給藥劑量(以siRNA的量計)為1mg/kg，給藥體積為5mL/kg。給藥7天、28天後處死小鼠，收集肝臟，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；隨後用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用組織RNA提取試劑盒(凡知醫療科技，FG0412)根據操作說明書標註的操作步驟提取得到肝組織總RNA。將總RNA反轉錄成cDNA並採用實時螢光定量PCR方法檢測肝組織中的TTR mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內參基因，使用針對TTR和GAPDH的Taqman探針引子分別檢測TTR和GAPDH的mRNA表達量。檢測引子的序列同表9。

表14小鼠體內實驗化合物分組信息

TTR mRNA表達量按照如下等式計算：

TTR mRNA表達量=[(測試組TTR mRNA表達量/測試組GAPDH mRNA表達量)/(對照組TTR mRNA表達量/對照組GAPDH mRNA表達量)]x 100%。

給藥7天、28天後，本揭露的綴合不同結構的siRNA綴合物或dsRNA的在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率分別見圖1和圖2。

由圖1的結果可知，綴合物TRD007205在給藥後7天對於TTR mRNA的表達抑制均具有良好的效果，說明其能夠介導更高效的遞送效率。由圖2可知，給藥28天後，TRD007205對靶基因mRNA表達量的抑制作用均優於TRD002218。

實施例10. 合成siRNA-NAG0052綴合物

1.自製帶有載體的樹脂

具體操作同實施例8。

2.使用帶有NAG0052的樹脂作為起始，按照核苷酸排布順序自3’-5’方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應。

具體參照實施例2的合成方法。製得的siRNA綴合物或dsRNA具有表15和表16-1、表16-1中所示的有義鏈和反義鏈。

表15. siRNA綴合物或dsRNA列表

表16-1. siRNA綴合物或dsRNA的有義鏈和反義鏈

表16-2. siRNA綴合物或dsRNA的有義鏈和反義鏈的對應的核酸序列的裸序列

其中，(-)hmpNA(A)、(-)hmpNA(G)、(-)hmpNA(C)、(-)hmpNA(U)的結構參見實施例4。

NAG0052’的結構為：

實施例11. siRNA-NAG0052綴合物對不同靶點的在靶活性

表17中為陽性對照。

表17. 陽性對照化合物序列信息

其中，TRD007779參照US11015201B製備獲得；

GNA(A)的結構參見實施例4；GNA(t)的結構為

；

L96結構為

。

在HEK293A細胞中採用11個濃度梯度對表15及表17中的siRNA綴合物或dsRNA進行體外分子水平模擬在靶活性篩選。

以AGT基因構建siRNA對應的在靶序列，插入到psiCHECK-2質粒中。該質粒包含海腎螢光素酶基因及螢火蟲螢光素酶基因。作為雙報告基因系統，siRNA的靶序列插入到海腎螢光素酶基因的3’UTR區域，siRNA對於靶標序列的活性可以藉由經螢火蟲螢光素酶校準後的海腎螢光素酶表達情況的檢測來反映，檢測使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)。

HEK293A細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將HEK293A細胞接種於96孔板，接種密度為每孔8×10³個細胞，每孔100μL培養基。

按照說明書，使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，11668019)對細胞共轉染siRNA及對應質粒，Lipofectamine2000每孔使用0.2μL。質粒轉染量為20ng每孔對於在靶序列質粒，siRNA共設置11個濃度點，最高濃度點終濃度為20nM，3倍梯度稀釋，20nM，6.6667nM，2.2222nM，0.7407nM，0.2469nM，0.0823nM，0.0274nM，0.0091nM，0.0030nM，0.0010nM和0.0003nM。轉染後24h，採用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)檢測在靶水平。

實驗材料和儀器詳見表18和表19。稀釋過程見表20。結果如表21所示。

Psi-CHECK質粒購自於生工生物工程(上海)股份有限公司。

表18. psi-CHECK實驗耗材和試劑

表19. psi-CHECK實驗儀器

表20. 樣品多濃度稀釋方案

表21. psi-CHECK在靶活性篩選結果

以上結果表明，參比對照TRD007779，TRD008028、TRD008029、TRD008030、TRD008031在psiCHECK系統針對AGT基因具有高水平的在靶抑制活性。

實施例12. 對Huh7細胞中人AGT的抑制-7個濃度點抑制活性

在Huh7細胞中採用11個濃度梯度對表15和表17中siRNA綴合物或dsRNA進行Huh7細胞活性篩選。各個樣品轉染起始終濃度為10nM，5倍梯度稀釋，7個濃度點。

Huh7細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將Huh7細胞接種於96孔板，接種密度為每孔1萬個細胞，每孔100μL培養基。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的終濃度為10nM，2nM，0.4nM，0.08nM，0.016nM，0.0032nM和0.00064nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人AGT的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照樣品處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC₅₀結果見表22。

表22. 在Huh7中對人AGT多劑量抑制活性

結果表明，在Huh7細胞中TRD008028、TRD008029、TRD008030、TRD008031對AGT有很好的抑制活性。

實施例13. 對Hep3B細胞中人AGT的抑制-7個濃度點抑制活性

在Hep3B細胞中採用7個濃度梯度對樣品進行活性篩選。各個樣品轉染起始終濃度為10nM，5倍梯度稀釋，7個濃度點。

Hep3B細胞培養於含10%胎牛血清的MEM培養基中，在37℃，5% CO2條件下培養。轉染前24h，將Hep3B細胞接種於96孔板，接種密度為每孔1萬個細胞，每孔100μL培養基。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的終濃度為10nM，2nM，0.4nM，0.08nM，0.016nM，0.0032nM，0.00064nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人AGT的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照樣品處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC₅₀結果見表23。

表23. Hep3B中人AGT多劑量抑制活性

結果表明，在Hep3B細胞中，TRD008028、TRD008029、TRD008030、TRD008031對AGT有很好的抑制活性。

第三部分. 靶向AGT的生物學評價

實施例14. 人AGT siRNA的設計

以人AGT基因(NM_001384479.1)作為靶基因，以滿足活性siRNA的一般規則設計19/21nt的siRNA。未經修飾的正義鏈及反義鏈序列詳見表24、表25；7位化學修飾的反義鏈詳見表24；經過修飾的正義鏈和反義鏈見表26、表27、表28；本揭露還提供了表26、表27、表28中正義鏈和反義鏈均不含有硫代磷酸酯基的序列。

表24. 人siRNA的未修飾的正義鏈、反義鏈；7位化學修飾的反義鏈

在合成AS鏈5’第7位修飾的核苷酸時，使用實施例1合成的亞磷醯胺單體或經過2’-甲氧基修飾磷醯胺單體的替換母序列原核苷酸。其中，W’選自：

、

或

所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸，或2’-甲氧基修飾的核苷酸；

其中，M為O或S；

B選自表24中與SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12的5’端第7位置的鹼基。例如SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：7對應、SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：11對應。

表25. 人siRNA的未修飾的正義鏈、反義鏈

表26.經過修飾的正義鏈和反義鏈

NAG0052結構為：

L96結構為：

。

表27. AS鏈7位的不同旋光化學修飾

表28. 經過修飾的正義鏈和反義鏈

NAG0052結構為：

實施例15. 對人肝癌細胞系(Hep3B)中AGT的抑制活性

在人肝癌細胞系(Hep3B)中以10nM和0.1nM最終雙鏈體濃度進行了雙劑量實驗和以0.1nM最終雙鏈體濃度進行了單劑量實驗。實驗耗材參見表29。

轉染前24h，將Hep3B細胞以約20,000細胞/孔塗布於96-孔平板上，每孔100μL培養基。轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為10nM和/或0.1nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒(FG0417-L/FG0418-XL，磁珠法)進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗(Takara PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)和定量實時PCR(Takara PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)檢測，Taqman探針引子信息參見表30。測定人AGT的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

Taqman探針Q-PCR檢測實驗完畢後，按照系統自動設定的閾值獲取相應的Ct值，可以藉由Ct值比較，相對定量某個基因的表達：比較Ct指的是藉由與內參基因Ct值之間的差值來計算基因表達差異，也稱之是2^-△△Ct，△△Ct=[(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)]。抑制率(%)=(1-目的基因表達剩餘量)*100%。

表29. 細胞活性篩選(核酸提取儀)實驗耗材

表30. Taqman探針引子信息表

結果以相對於經過對照樣品處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示，抑制率的IC₅₀結果見表31。

表31. 對人肝癌細胞系(Hep3B)中人AGT的抑制活性結果

由表31數據可知：

TRD007716在低濃度0.1nM時對AGT的增殖抑制活性明顯優於TRD007343、TRD007344、TRD007345、TRD007346、TRD007347、TRD007348、TRD007349、TRD007350、TRD007351、TRD007352、TRD007353、TRD007354、TRD0269和TRD0270。其中14條序列的母序列是由TRD007716母序列，即TJR100299左右平移n個鹼基而來，修飾均相同。

TRD007770在低濃度0.1nM時對AGT的增殖抑制活性明顯優於TRD007657、TRD007658、TRD007659。其中3條序列的母序列是由TRD007770母序列，即TJR100283左右平移n個鹼基而來，修飾均相同。

以上結果顯示出來源於TJR100299和TJR100283序列本身具更優的針對AGT的表達抑制活性。

實施例16. 對人肝癌細胞系(Hep3B)中AGT的抑制-多濃度點抑制活性

在人肝癌細胞系(Hep3B)中採用7濃度梯度進行劑量響應實驗。

轉染前24h，將Hep3B細胞以約20,000細胞/孔塗布於96-孔平板上，每孔100μL培養基。轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0.00064nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照樣品處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示，抑制率的IC₅₀結果見表32。實驗操作參考實施例15。

表32. 對Hep3B細胞中人AGT的抑制活性

由表32數據可知：

TRD007716、TRD007925、TJR100023、TJR100024和TJR100104對AGT的抑制活性優於TJR100025；TRD008029、TRD007920、TRD007770、TJR100101和TJR100102對AGT的抑制活性優於TJR100189、TJR100190、TJR100191、TJR100192、TJR100193和TJR100167。結果表明，相比對照序列，來源於TJR100283、TJR100299母序列多種不同修飾展現出更好的抑制活性。

TJR100283對AGT的抑制活性優於TJR100286、TJR100290、TJR100291、TJR100292和TJR100293；TJR100299對AGT的抑制活性明顯優於TJR100302、TJR100303、TJR100304、TJR100305、TJR100306、TJR100307、TJR100308、TJR100309、TJR100310、TJR100311、TJR100312和TJR100313；TJR100320對AGT的抑制活性明顯優於TJR100322、TJR100323、TJR100324、TJR100325、TJR100326、TJR100327和TJR100328。這些樣品的序列是分別針對TJR100283、TJR100299和TJR100320三條序列進行5’端首位鹼基突變，左右位移鹼基等方式變換而來。結果表明3條序列本身，即TJR100283、TJR100299和TJR100320展現出更好的對AGT的抑制活性，若鹼基變化均削弱對AGT的抑制活性。

實施例17. psiCHECK在靶水平驗證

在HEK 293A細胞中採用11個濃度梯度對樣品進行體外分子水平模擬脫靶水平篩選，實驗結果見表34。

針對樣品序列構建對應的在靶序列，即構建樣品靶序列的在靶質粒(GSCM)，插入到psiCHECK質粒中，該質粒包含海腎螢光素酶基因及螢火蟲螢光素酶基因。作為雙報告基因系統，樣品對於靶標序列的活性可以藉由經螢火蟲螢光素酶校準後的海腎螢光素酶表達情況的檢測來反映，檢測使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)。

HEK 293A細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將HEK 293A細胞接種於96孔板，接種密度為每孔8000個細胞，每孔100μL培養基。

按照說明書，使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，11668019)對細胞共轉染樣品及對應質粒，每孔使用0.2μL Lipofectamine2000。質粒轉染量為10ng每孔。對於脫靶序列質粒，樣品共設置11個濃度點，最高濃度點終濃度為20nM，3倍梯度稀釋，20nM，6.667nM，2.222nM，0.741nM，0.247nM，0.082nM，0.0274nM，0.0091nM，0.0030nM，0.001nM和0.0003nM。多濃度點樣品稀釋方案參見表33。轉染後24h，採用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)檢測脫靶水平。計算相對值Ratio=Ren/Fir；計算抑制率1-(Ratio+siRNA/僅報告基因)*100%=抑制率(%)。

表33. 多濃度稀釋方案

表34. psiCHECK在靶活性-11濃度點的抑制活性篩選結果

由數據可知：

TRD008029、TJR100053、TJR100101、TJR100102和TRD008096-1對AGT的抑制活性優於TJR100160、TJR100161、TJR100162和TRD0321。說明相比對照序列，來源於TJR100283母序列的各種dsRNA或者siRNA綴合物展現出更好的抑制活性。

TJR100024、TJR100072、TJR100103和TJR100104對AGT的抑制活性優於TJR100025。說明來源於TJR100299母序列的各種dsRNA或者siRNA綴合物展現出更好的抑制活性。

實施例18. AS鏈和SS鏈psiCHECK脫靶水平驗證

在HEK 293A細胞中採用11個濃度梯度進行體外分子水平模擬脫靶水平篩選，實驗結果見表35。

對應的靶標質粒構建規則如下：

針對每個樣本的AS鏈的脫靶序列設計，即構建與反義鏈5’端1-8位完全互補，而其它位置的鹼基完全不匹配的脫靶質粒(GSSM)，鹼基錯配對應規則為A與C互配、G與T互配；為了提高檢測靈敏度，構建了GSSM-5hits脫靶質粒，即5條相同的GSSM序列藉由TTCC連接組成，插入到psiCHECK質粒中，該質粒包含海腎螢光素酶基因及螢火蟲螢光素酶基因。作為雙報告基因系統，靶序列插入到海腎螢光素酶基因的3’UTR區域。

針對正義鏈，分別構建與SS鏈完全互補的脫靶質粒(PSCM)；構建與正義鏈5’端1-8位完全互補，而其它位置的鹼基完全不匹配的脫靶質粒(PSSM)，鹼基錯配對應規則為A與C互配、G與T互配，為了提高檢測靈敏度，構建了PSSM-5hits脫靶質粒，即5條相同的PSSM序列藉由TTCC連接組成。

對於靶標序列的活性可以藉由經螢火蟲螢光素酶校準後的海腎螢光素酶表達情況的檢測來反映，檢測使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)。其餘實驗過程參見實施例17。

表35.正義鏈和反義鏈psiCHECK脫靶活性篩選結果

結果顯示所列樣品無脫靶風險或者風險極小。

實施例19. 對人肝癌細胞系(Huh7)中AGT的抑制-多濃度點抑制活性

在人肝癌細胞系(Huh7)中採用7濃度梯度對siRNA進行劑量響應實驗。

轉染前24h，將Huh7細胞以約20,000細胞/孔塗布於96-孔平板上，每孔100μL培養基。轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0.00064nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照樣品處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示，抑制率的IC₅₀結果見表36。實驗操作參考實施例12。

表36. 對Huh7細胞中人AGT的7濃度抑制活性

Huh7中TRD007920、TRD008096、TJR100053三條序列對AGT mRNA的抑制活性優於TJR100189、TJR100190、TJR100191、TJR100192和TJR100193。

實施例20. 對人原代肝細胞(PHH)中AGT的抑制活性

在人原代肝細胞(PHH)中採用8濃度梯度和7濃度梯度進行劑量響應實驗。

轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為20、6.67、2.22、0.74、0.25、0.082、0.027和0.009nM。另外一組使用了梯度濃度為：10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064nM。將用Opti-MEM I稀釋後的RNAiMAX和樣品等體積混勻，室溫孵育15分鐘後，以每孔10μL的量加入96孔板中，然後每孔加入90μL復蘇的凍存PHH細胞懸液(6.7E5細胞/mL)。轉染24小時後收集細胞，使用RNeasy 96 Kit(Qiagen-74182)提取細胞總RNA。參照反轉錄試劑盒(天根，KR106)說明書，加入隨機引子反轉錄成cDNA。採用qPCR的方法檢測樣品中的AGT mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

每個樣品目的AGT mRNA的表達水平藉由△△Ct相對定量法進行計算。目的基因相對表達量使用2^-△△CT表示，計算公式如下：

△CT=目的基因平均Ct值-內參基因平均Ct值；

△△CT=△CT(加藥組)組-△CT(對照組)；

目的基因mRNA相對表達量=2^-△△CT

應用GraphPad Prism軟體(four parameter logistic equations)計算IC₅₀。結果見表37。

表37. 對PHH細胞中AGT的抑制活性

所有序列在PHH中表現出對AGT mRNA良好的抑制活性。

實施例21. 對猴原代肝細胞(PCH)中AGT的抑制-多濃度點抑制活性

在猴原代肝細胞(PCH)中採用7濃度梯度對樣品進行劑量響應實驗。

轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0.00064nM。將用Opti-MEM I稀釋後的RNAiMAX和樣品等體積混勻，室溫孵育15分鐘後，以每孔10μL的量加入96孔板中，然後每孔加入90μL復蘇的凍存PCH細胞懸液(6.7E5細胞/mL)。轉染24小時後收集細胞，使用RNeasy 96 Kit(Qiagen-74182)提取細胞總RNA。參照反轉錄試劑盒(天根，KR106)說明書，加入隨機引子反轉錄成cDNA。採用qPCR的方法檢測樣品中的AGT mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對猴的AGT的mRNA水平進行校正，探針引子序列信息見表38。

△CT=目的基因平均Ct值-內參基因平均Ct值；

△△CT=△CT(加藥組)組-△CT(對照組)；

目的基因mRNA相對表達量=2^-△△CT

應用GraphPad Prism軟體(four parameter logisti cequations)計算IC₅₀。結果見表39。

表38. Taqman探針引子信息表

表39.對PCH細胞中猴AGT的7濃度抑制活性

前7條序列在PCH中表現出優秀的對AGT的抑制活性，同時TJR100283活性明顯優於TJR100292，TJR100293和TJR100295。說明不論是TJR100283序列本身還是其綴合物或者dsRNA對AGT的抑制活性都很強。

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Claims

一種siRNA，其包含形成雙鏈區的正義鏈與反義鏈；

該正義鏈包含至少15個連續核苷酸，且與SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6中的任一核苷酸序列相差不超過3個核苷酸；

該反義鏈包含至少15個連續核苷酸，且與SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12中的任一核苷酸序列相差不超過3個核苷酸；

該siRNA靶向血管緊張素原。
如請求項1所述的siRNA，其中，

該正義鏈包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中的任一核苷酸序列的至少17個連續核苷酸；

該反義鏈包含選自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12中的任一核苷酸序列的至少19個連續核苷酸；

較佳地，該正義鏈包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中的任一核苷酸序列；

較佳地，該反義鏈包含選自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12中的任一核苷酸序列。
如請求項1或2所述的siRNA，其包含或選自以下任一組：

組1)，SEQ ID NO：1所示的正義鏈和SEQ ID NO：7所示的反義鏈；

組2)，SEQ ID NO：2所示的正義鏈和SEQ ID NO：8所示的反義鏈；

組3)，SEQ ID NO：3所示的正義鏈和SEQ ID NO：9所示的反義鏈；

組4)，SEQ ID NO：4所示的正義鏈和SEQ ID NO：10所示的反義鏈；

組5)，SEQ ID NO：5所示的正義鏈和SEQ ID NO：11所示的反義鏈；

組6)，SEQ ID NO：6所示的正義鏈和SEQ ID NO：12所示的反義鏈。
如請求項1至3中任一項所述的siRNA，其中，該正義鏈和/或反義鏈中至少一個核苷酸為修飾的核苷酸。
如請求項1至4中任一項所述的siRNA，其中，該反義鏈在其5’端的第2位至第8位中的至少一個核苷酸是修飾核苷酸，其中，

-該修飾核苷酸是2'-甲氧基修飾的核苷酸，或

-該修飾核苷酸包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾，該式(I)所示的化學修飾選自：

B各自獨立地選自反義鏈5’端的第2位至第8位對應位置的鹼基。
如請求項1至5中任一項所述的siRNA，其中，該反義鏈在其5’端的第5位、第6位或第7位的核苷酸是：

-2'-甲氧基修飾的核苷酸，或

-包含如請求項5所定義的式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾；

當式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’端的第5位時，B是該反義鏈在其5’端的第5位的鹼基；

當式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’端的第6位時，B是該反義鏈在其5’端的第6位的鹼基；

當式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾在5’端的第7位時，B是該反義鏈在其5’端的第7位的鹼基。
如請求項1至中6任一項所述的siRNA，其中，該正義鏈中的三個連續核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸；和/或

按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、9、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸；或

按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。
如請求項1至中7中任一項所述的siRNA，其中，該正義鏈含有或選自下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；或，

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。
如請求項1至中7中任一項所述的siRNA，其中，該反義鏈含有或選自下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；或，

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，

N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，

N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

W’是2'-甲氧基修飾的核苷酸，或W’是如請求項5定義式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。
如請求項9所述的siRNA，其中，W’選自包含
、
或
修飾的核苷酸；其中，B是鹼基；較佳的，B選自反義鏈在其5’端的第7位中對應位置的鹼基。
如請求項10所述的siRNA，其中，W’選自2'-甲氧基修飾的核苷酸。
如請求項1至11中任一項所述的siRNA，其中，

該正義鏈包含或選自SEQ ID NO：135至SEQ ID NO：162任一項；

該反義鏈包含或選自SEQ ID NO：189至SEQ ID NO：216任一項。
一種雙鏈核糖核酸，其包含：

如請求項1至12中任一項所述的siRNA，和連接至該siRNA末端的靶向配體；

較佳地，該靶向配體連接至該siRNA的正義鏈3’末端。
如請求項13所述的雙鏈核糖核酸，其中，

該靶向配體包含至少一個靶向部分，

該靶向部分各自獨立地選自：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺和N-異丁醯基-半乳糖胺；

較佳地，該靶向部分是N-乙醯基-半乳糖胺；

更佳地，該靶向配體包含三個相同或不同的靶向部分。
如請求項14所述的雙鏈核糖核酸，其中，該靶向配體是如式(II)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，該式(II)為：
一種雙鏈核糖核酸，其包含形成雙鏈區的正義鏈與反義鏈；

該正義鏈選自SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：188任一項；

該反義鏈選自SEQ ID NO：217至SEQ ID NO：242任一項；

較佳的，該雙鏈核糖核酸選自TRD008096、TJR100053或TJR100296。
一種醫藥組成物，其包含：

如請求項1至12中任一項所述的siRNA或如請求項13至16中任一項所述的雙鏈核糖核酸，和

藥學上可接受的載體。
一種抑制血管緊張素原基因表達的方法，包括給予受試者有效量或有效劑量的：

如請求項1至12中任一項所述的siRNA、或

如請求項13至16中任一項所述的雙鏈核糖核酸、或

如請求項17所述的醫藥組成物。
一種治療和/或預防疾病的方法，包括給予受試者有效量或有效劑量的如請求項1至12中任一項所述的siRNA、或如請求項13至16中任一項所述的雙鏈核糖核酸、或如請求項17所述的醫藥組成物；

較佳的，該疾病是高血壓。
一種將siRNA或雙鏈核糖核酸體內遞送至肝臟的方法，其中，

該siRNA或雙鏈核糖核酸抑制血管緊張素原基因表達和/或複製，

該方法包括給與受試者如請求項13至16中任一項所述的雙鏈核糖核酸、或如請求項17所述的醫藥組成物。
一種製備siRNA或雙鏈核糖核酸的方法，其包括：

合成如請求項1至12中任一項所述的siRNA或如請求項13至16中任一項所述的雙鏈核糖核酸。