MX2014005972A - Agentes de iarn, composiciones y metodos de uso de los mismos para tratar enfermedades asociadas con transtiretina (ttr). - Google Patents

Agentes de iarn, composiciones y metodos de uso de los mismos para tratar enfermedades asociadas con transtiretina (ttr).

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Abstract

La presente invención proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, que se dirigen al gen de la transtiretina (TTR) y métodos para utilizar los agentes de iARN para tratar o prevenir enfermedades asociadas a TTR.

Description

AGENTES DE iARN, COMPOSICIONES Y METODOS DE USO DE LOS MISMOS PARA TRATAR ENFERMEDADES ASOCIADAS CON TRANSTIRETINA (TTR) ANTECEDENTES DE LA INVENCION La transtiretina (TTR, por sus siglas en inglés) (también conocida como prealbúmina) se encuentra en el suero y fluido cerebroespinal (FCE, por sus siglas en inglés) . La TTR transporta proteína de unión a retinol (RBP , por sus siglas en inglés) y tiroxina (T4) y también actúa como portadora de retinol (vitamina A) a través de su asociación con RBP en la sangre y el FCE. La transtiretina recibe su nombre por su transporte de tiroxina y retinol . La TTR también funciona como una proteasa y puede escindir proteínas, incluida apoA-I (la principal apolipoproteína HDL) , péptido ß amiloide y neuropéptido Y. Ver Liz, M.A. et al. (2010) IUBMB Life, 62 (6) :429-435.
La TTR es un tetrámero de cuatro subunidades idénticas de 127 aminoácidos (monómeros) que son ricas en estructura de lámina beta. Cada monómero tiene dos láminas beta de 4 hebras y la forma de un elipsoide prolato. Interacciones de láminas beta antiparalelas unen a los monómeros para formar dímeros. Un bucle corto de cada monómero forma la principal interacción dímero-dímero. Estos dos pares de bucles separan las láminas betas opuestas convexas de los dímeros para formar un canal interno.
Ref. 248372 El hígado es el sitio principal de expresión de la TTR. Otros sitios importantes de expresión incluyen el plexo carotídeo, la retina (en particular el epitelio pigmentario retiniano) y el páncreas.
La transtiretina es uno de al menos 27 tipos distintos de proteínas que son proteínas precursoras en la formación de fibrillas amiloides. Ver Guan, J. efc al. (Nov. 4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Corazón Circ Physiol, doi : 10.1152/ajpcorazón.00815.2011. La acumulación extracelular de fibrillas amiloides en órganos y tejidos es el distintivo de la amiloidosis. Las fibrillas amiloides están compuestas por acumulaciones de proteínas plegadas incorrectamente, lo cual puede ser el resultado de la producción en exceso de proteínas precursoras de mutaciones específicas de las mismas El potencial amiloidogénico de la TTR puede relacionarse con su extensa estructura de láminas beta; estudios cristalográficos por rayos X indican que ciertas mutaciones amiloidogénicas destabilizan la estructura tetramérica de la proteína. Ver, por ejemplo, Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12) :1-11.
La amiloidosis es un término general para el grupo de enfermedades amiloides que se caracterizan por depósitos amiloides. Las enfermedades amiloides se clasifican en base a su proteína precursora; por ejemplo, el nombre comienza con "A" de amiloide y sigue con una abreviación de la proteína precursora. Por ejemplo, ATTR se refiere a transtiretina amloidogénica . Ibid.
Existen numerosas enfermedades asociadas a la TTR, la mayoría de las cuales son enfermedades amiloides. La TTR de secuencia normal se asocia con la amiloidosis cardíaca en personas de edad avanzada y se denomina amiloidosis sistémica senil (ASS) (también denominada amiloidosis cardíaca senil (ACS) o amiloidosis cardíaca) . La ASS a menudo viene acompañada de depósitos microscópicos en muchos otros órganos. La amiloidosis con TTR se manifiesta de varias formas. Cuando el sistema nervioso periférico se ve afectado más prominentemente, la enfermedad se denomina polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) . Cuando el corazón está implicado principalmente pero no el sistema nervioso, la enfermedad se denomina cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF, por sus siglas en inglés) . Un tercer tipo principal de amiloidosos con TTR es la amiloidosis leptomeníngea, también conocida como amiloidosis leptomeníngea o meningocerebrovascular, amiloidosis del sistema nervioso central (SNC) o amiloidosis de forma VII. Las mutaciones en la TTR también pueden provocar opacidades vitreas amiloidóticas , síndrome del túnel carpiano e hipertiroxinemia eutiroidea, que es una enfermedad no amiloidótica que se cree es secundaria a una mayor asociación de tiroxina con TTR debido a una molécula de TTR mutante con mayor afinidad por la tiroxina. Ver, por ejemplo, Moses et al. (1982) J. Clin. Invest . , 86, 2025-2033.
Las proteínas amiloidogénicas anormales pueden heredarse o adquirirse a través de mutaciones somáticas. Guan, J. et al . (Nov. 4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Corazón Circ Physiol, doi : 10.1152/ajpcorazón.00815.2011. La ATTR asociada a la transtiretina es la forma de amiloidosis sitémica hereditaria más frecuente. Lobato, L. (2003) J. Nephrol . , 16:438-442. Las mutaciones en la TTR aceleran el proceso de formación amiloide de TTR y constituyen el factor de riesgo más importante para el desarrollo de ATTR. Se sabe que más de 85 variantes de TTR amiloidogénica provocan amiloidosis familar sistémica. Las mutaciones de TTR a menudo provocan la acumulación amiloide sistémica, con participación particular del sistema nervioso central, aunque algunas mutaciones se asocian con cardiomiopatía u opacidades vitreas. Ibid.
La mutación V30M es la mutación de TTR más prevalerte . Ver, por ejemplo, Lobato, L. (2003) J Nephrol , 16:438-442. La mutación V122I es portada por el 3.9% de la población afroamericana y es la causa más común de CAF. Jacobson, D.R. et al. (1997) jV. Engl . J. Med. 336 (7) : 466-73. Se estima que la ASS afecta a más del 25% de la población mayor de 80. estermark, P. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 87 (7) : 2843-5.
Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de tratamientos efectivos para enfermedades asociadas con la TTR.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, que se dirigen al gen de transtiretina (TTR) . La presente invención también proporciona métodos para inhibir la expresión de TTR y métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto utilizando los agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, de la invención. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de agentes de iARN que comprenden modificaciones químicas particulares que muestran una habilidad superior para inhibir la expresión de TTR. Los agentes que incluyen un cierto patrón de modificaciones químicas (por ejemplo, un agente alternado) y un ligando se muestran en la presente como efectivos para silenciar la actividad del gen de la TTR. Adicionalmente, los agentes que incluyen uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, incluido uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión de los agentes, muestran una actividad de silenciamiento del gen de la TTR sorprendentemente mejorada. Cuando en el agente está presente un motivo químico simple, es preferible que esté en o cerca de la región de escisión para mejorar la actividad de silenciamiento del gen. La región de escisión es la región alrededor del sitio de escisión, es decir, el sitio en el ARNm objetivo en el cual ocurre la escisión.
De esta forma, en un aspecto, la presente invención presenta agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, para inhibir la expresión de una transtiretina (TTR) . El agente de iARN de doble hebra incluye una hebra sentido complementaria a una hebra antisentido. La hebra antisentido incluye una región complementaria a una parte de una transtiretina que codifica ARNm. Cada hebra tiene 14 a 30 nucleótidos y el agente de iARN de doble hebra se representa mediante la fórmula (III) : sentido: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb - (Z Z Z) j -Na - nq 3 ' antisentido: 3· np ' -Na ' - (X 'X 'X ' ) k-Nb ' -Y ? 'Y ' -Nb ' - (Z ' Z ' Z ' ) i-Na'- nq' 5' (III) · En la fórmula III, i, j, k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; p, p', q y q' son cada uno independientemente 0-6; cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos incluidos 0-25 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, incluyendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos incluidos 0-10 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos; cada np, np', nq y nq' independientemente representa un nucleótido saliente; cada XXX, YYY, ZZZ, 'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos; modificaciones en % difieren de la modificación en Y y modificaciones en Nb' difieren de la modificación en Y'. En algunas modalidades, la hebra sentido se conjuga con al menos un ligando, por ejemplo, al menos un ligando, por ejemplo, al menos un ligando unido al extremo 3' de la hebra sentido. En otras modalidades, el ligando puede conjugarse con la hebra antisentido .
En algunas modalidades, i es 1; j es 1 ; o tanto i como j son 1.
En algunas modalidades, k es l; 1 es 1 ; o tanto k como 1 son 1.
En algunas modalidades , i es 0; j es 1.
En algunas modalidades , i es 1, j es 0.
En algunas modalidades , k es 0; 1 es 1.
En algunas modalidades , k es 1; 1 es 0.
En algunas modalidades, XXX es complementario a X'X'X' YYY es complementario a Y' Y' Y' y ZZZ es complementario a Z'Z' Z' .
En algunas modalidades, el motivo YYY se encuentra en o cerca del sitio de escisión de la hebra sentido.
En algunas modalidades, el motivo ??'?' se encuentra en las posiciones 11, 12 y 13 de la hebra antisentido del extremo 5' .
En algunas modalidades, el Y' es 2 ' -O-metilo .
En algunas modalidades, el Y' es 2'-fluoro.
En algunas modalidades, la fórmula (III) se representa como la fórmula (Illa) : sentido: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3' antisentido: 3' np' -Na' -Y'Y'Y' -Nb' -Z ' Z 'Z ' -Na'nq' 5' (Illa) .
En la fórmula Illa, cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos incluidos 1-5 nucleótidos modificados.
En algunas modalidades, la fórmula (III) se representa como la fórmula (Illb) : sentido: 5' np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Na-nq 3' antisentido: 3' np' -Na' -X'X'X' -Mb' -Y'Y'Y' -Na' -nq' 5* (Illb) .
En la fórmula IIIb cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos incluidos 1-5 nucleótidos modificados.
En algunas modalidades, la fórmula (III) se representa como la fórmula (IIIc) : sentido: 5' np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Nb-Z Z Z -Na-nq 3' antisentido: 3' np ' -Na ' -X 'X 'X ' -Nb ' -Y ? ? ' -Nb ' -Z ' Z ' Z ' -Na ' -nq ' 5 ' (IIIc) .
En la fórmula lile, cada ?¾ y - b' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos incluidos 1-5 nucleótidos modificados y cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos incluidos 2-10 nucleótidos modificados.
En muchas modalidades, las regiones dúplex tienen 15-30 pares de nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la región de dúplex tiene 17-23 pares de nucleótidos de longitud, 17-25 pares de nucleótidos de longitud, 23-27 pares de nucleótidos de longitud, 19-21 pares de nucleótidos de longitud, o 21-23 pares de nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, cada hebra tiene 15-30 nucleótidos .
En algunas modalidades, las modificaciones en los nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-0-alquilo, 2'-0-alilo, 2'-C- alilo, 2'-fluoro, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades preferidas, las modificaciones en los nucleótidos son 2'-0-metilo o 2'-fluoro.
En algunas modalidades, el ligando es uno o más derivados de N-acetilgalactosamina (GalNAc) unidos a través de un enlazante ramificado bivalente o trivalente. En modalidades particulares, el ligando es En algunas modalidades, el ligando está unido al extremo 3' de la hebra sentido.
En algunas modalidades, el agente de iARN se conjuga con el ligando tal como se muestra en el siguiente esquema en donde X es 0 o S .
En algunas modalidades, el agente de iARN se conjuga con el ligando tal como se muestra en el siguiente esquema En algunas modalidades, el agente de iARN adicionalmente incluye al menos una conexión internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato . En algunas modalidades, la conexión internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato está en el extremo terminal 3' de una hebra. En algunas modalidades, la hebra es la hebra antisentido. En otras modalidades, la hebra es la hebra sentido.
En algunas modalidades, el par de bases en la posición 1 del extremo 5' del dúplex es un par de bases AU.
En algunas modalidades, los nucleótidos Y contienen una modificación 2'-fluoro.
En algunas modalidades, los nucleótidos Y' contienen una modificación 2'-0-metilo.
En algunas modalidades, p'>0. En algunas de las modalidades, cada n es complementario al ARNm objetivo. En las otras modalidades, cada n es no complementario al ARNm objetivo. En algunas modalidades, p, p' , q y q' son 1-6. En algunas modalidades preferidas, p' = 1 o 2. En algunas modalidades preferidas, p'=2. En algunas de las modalidades, q'=0, p=0, q=0 y los nucleótidos salientes p' son complementarios al ARNm objetivo. En las otras modalidades, q'=0, p=0, q=0 y los nucleótidos salientes p' son no complementarios al ARNm objetivo.
En algunas modalidades, la hebra sentido tiene un total de 21 nucleótidos y la hebra antisentido tiene un total de 23 nucleótidos .
En algunas modalidades, conexiones entre np' incluyen conexiones de fosforotioato . En algunas de las modalidades, las conexiones entre np' son conexiones de fosforotioato .
En algunas modalidades, el agente de iARN se selecciona del grupo de agentes que figuran en la Tabla 1.
En modalidades preferidas, el agente de iARN se selecciona del grupo que consiste en AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547.
En una modalidad aun más preferida, el agente de iARN es AD-51547 que tiene la siguiente estructura: sentido: 5'- UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgAfL96-3 ' (SEQ ID NO: 2) antisentido: 5'- uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc-3 ' (SEQ ID N0:3) en donde los nucleótidos en minúscula (a, u, g, c) indican nucleótidos 2 ' -0-metilo ; Nf (por ejemplo, Af) indica un nucleótido 2'-fluoro; s indica una conexión de fosfotiorato; L96 indica un ligando GalNAc3.
En otro aspecto, la presente invención presenta una célula que contiene el agente de iARN para inhibir la expresión de TTR.
En un aspecto adicional, la presente invención presenta una composición farmacéutica que comprende un agente de iARN para inhibir la expresión de TTR. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es una solución que comprende el agente de iARN. En algunas modalidades, la solución que comprende el agente de iARN es una solución sin amortiguar, por ejemplo, solución salina o agua. En otras modalidades, la solución es una solución amortiguadora, por ejemplo, una solución de solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) . En otras modalidades, la composición farmacéutica es un liposoma o una formulación lipídica. En algunas modalidades, la formulación lipídica comprende XTC o MC3.
En otro aspecto adicional, la presente invención presenta métodos para inhibir la expresión de transtiretina (TTR) en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra, en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en la célula, inhibiendo así la expresión de TTR en la célula.
En algunas modalidades, la expresión de TTR se inhibe al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90%.
En otras modalidades, la célula se pone en contacto in vitro con el agente de iARN. En otras modalidades, la célula está presente dentro de un sujeto. En modalidades preferidas, el sujeto es un humano.
En modalidades adicionales, el sujeto es un sujeto que padece una enfermedad asociada a TTR y la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva. En otras modalidades, el sujeto es un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a TTR y la cantidad efectiva es una cantidad profilácticamente efectiva. En algunas modalidades, un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a TTR es un sujeto que porta un gen de la mutación de TTR que se asocia con el desarrollo de una enfermedad asociada a TTR.
En algunas modalidades, la enfermedad asociada a TTR se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis sistémica senil (ASS) , amiloidosis familiar sistémica, polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) , cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF) , amiloidosis leptomeníngea/del Sistema Nervioso Central (SNC) e hipertiroxinemia .
En algunas modalidades, el sujeto tiene una amiloidosis asociada a TTR y el método reduce un depósito de TTR amiloide en el sujeto.
En otras modalidades, el agente de iARN se administra al sujeto mediante un medio de administración que se selecciona del grupo que consiste en subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrabronquial , intrapleural , intraperitoneal , intraarterial , linfática, cerebroespinal y cualquier combinación de las mismas. En algunas modalidades, el agente de iARN se administra al sujeto mediante administración subcutánea o intravenosa. En modalidades preferidas, el agente de iARN se administra al sujeto mediante administración subcutánea. En algunas de las modalidades, la administración subcutánea incluye administración mediante bomba subcutánea o depósito subcutáneo.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra al sujeto de forma tal que el agente de iARN se libera en un sitio específico dentro del sujeto. En algunas modalidades, el sitio se selecciona del grupo que consiste en hígado, plexo coroideo, retina y páncreas. En modalidades preferidas, el sitio es el hígado. En algunas modalidades, la liberación del agente de iARN es mediada por el receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) presente en hepatocitos.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra a una dosis de entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 0.5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, entre aproximadamente 15 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, entre aproximadamente 20 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, entre aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, o entre aproximadamente 40 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg.
En algunas modalidades, el agente de iAR se administra a una dosis de aproximadamente 0.25 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 16 mg/kg, aproximadamente 17 mg/kg, aproximadamente 18 mg/kg, aproximadamente 19 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg. aproximadamente 21 mg/kg, aproximadamente 22 mg/kg, aproximadamente 23 mg/kg, aproximadamente 24 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 26 mg/kg, aproximadamente 27 mg/kg, aproximadamente 28 mg/kg, aproximadamente 29 mg/kg, 30 mg/kg, aproximadamente : 31 mg/kg, aproximadamente 32 mg/kg, aproximadamente 33 mg/kg, aproximadamente 34 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 36 mg/kg, aproximadamente 37 mg/kg, aproximadamente 38 mg/kg, aproximadamente 39 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 41 mg/kg, aproximadamente 42 mg/kg, aproximadamente 43 mg/kg, aproximadamente 44 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 46 mg/kg, aproximadamente 47 mg/kg, aproximadamente 48 mg/kg, aproximadamente 49 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra en dos o más dosis. En modalidades particulares, el agente de iARN se administra a intervalos que se seleccionan del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 2 horas, una vez cada aproximadamente 3 horas, una vez cada aproximadamente 4 horas, una vez cada aproximadamente 6 horas, una vez cada aproximadamente 8 horas, una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas, una vez cada aproximadamente 96 horas, una vez cada aproximadamente 120 horas, una vez cada aproximadamente 144 horas, una vez cada aproximadamente 168 horas, una vez cada aproximadamente 240 horas, una vez cada aproximadamente 336 horas, una vez cada aproximadamente 504 horas, una vez cada aproximadamente 672 horas y una vez cada aproximadamente 720 horas .
En otras modalidades, el método adicionalmente incluye evaluar el nivel de expresión de ARNm de TTR o expresión de proteína TTR en una muestra derivada del sujeto.
En modalidades preferidas, la administración del agente de iARN no resulta en una respuesta inflamatoria en el sujeto tal como se evalúa en base al nivel de una citoquina o quimioquina seleccionada del grupo que consiste en G-CSF, IFN-?, IL-10, IL-12 (p70), ??,?ß, IL-lra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, ???-?a, ???-?ß, TNF y cualquier combinación de las mismas, en una muestra del sujeto.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra utilizando una composición farmacéutica.
En modalidades preferidas, el agente de iARN se administra en una solución. En algunas de las modalidades, el ARNip se administra en una solución sin amortiguar. En una modalidad, el ARNip se administra en agua. En otras modalidades, el ARNip se administra con una solución amortiguadora, tal como un amortiguador de acetato, un amortiguador de citrato, un amortiguador de prolamina, un amortiguador de carbonato, o un amortiguador de fosfato o cualquier combinación de las mismas. En algunas modalidades, la solución amortiguadora es solución salina amortiguada con fosfato (PBS) .
En otra modalidad, la composición farmacéutica es un liposoma o una formulación lipídica que comprende SNALP o XTC En una modalidad, la formulación lipídica comprende un MC3.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva o cantidad profilácticamente efectiva de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra, tratando o previniendo así la enfermedad asociada a TTR en el sujeto.
En algunas modalidades, la expresión de TTR en una muestra derivada del sujeto se inhibe al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60% o al menos aproximadamente 70% al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90%.
En algunas modalidades, el sujeto es un humano.
En algunas modalidades, el sujeto es un sujeto que padece una enfermedad asociada a TTR. En otras modalidades, el sujeto es un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a TTR.
En algunas modalidades, el sujeto es un sujeto que porta un gen de la mutación de TTR que se asocia con el desarrollo de una enfermedad asociada a TTR.
En algunas modalidades, la enfermedad asociada a TTR se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis sistémica senil (ASS) , amiloidosis familiar sistémica, polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) , cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF) , amiloidosis leptomeníngea/del Sistema Nervioso Central (SNC) e hipertiroxinemia .
En algunas modalidades, el sujeto tiene una amiloidosis asociada a TTR y el método reduce un depósito de TTR amiloide en el sujeto.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra al sujeto mediante un medio de administración que se selecciona del grupo que consiste en subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrabronquial , intrapleural , intraperitoneal , intraarterial , linfática, cerebroespinal y cualquier combinación de las mismas. En algunas modalidades, el agente de iARN se administra al sujeto mediante administración subcutánea o intravenosa. En modalidades preferidas, el agente de iARN se administra al sujeto mediante administración subcutánea. En algunas de las modalidades, la administración subcutánea incluye administración mediante bomba subcutánea o depósito subcutáneo.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra al sujeto de forma tal que el agente de iARN se libera en un sitio específico dentro del sujeto. En algunas de las modalidades, el sitio se selecciona del grupo que consiste en hígado, plexo coroideo, retina y páncreas. En modalidades preferidas, el sitio es el hígado. En algunas modalidades, la liberación del agente de iARN es mediada por el receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) presente en hepatocitos.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra a una dosis de entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 0.5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, entre aproximadamente 15 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, entre aproximadamente 20 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, entre aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, o entre aproximadamente 40 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra a una dosis de aproximadamente 0.25 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 16 mg/kg, aproximadamente 17 mg/kg, aproximadamente 18 mg/kg, aproximadamente 19 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 21 mg/kg, aproximadamente 22 mg/kg, aproximadamente 23 mg/kg, aproximadamente 24 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 26 mg/kg, aproximadamente 27 mg/kg, aproximadamente 28 mg/kg, aproximadamente 29 mg/kg, 30 mg/kg, aproximadamente 31 mg/kg. aproximadamente 32 mg/kg, aproximadamente 33 mg/kg, aproximadamente 34 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 36 mg/kg, aproximadamente 37 mg/kg, aproximadamente 38 mg/kg, aproximadamente 39 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 41 mg/kg, aproximadamente 42 mg/kg, aproximadamente 43 mg/kg, aproximadamente 44 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 46 mg/kg, aproximadamente 47 mg/kg, aproximadamente 48 mg/kg, aproximadamente 49 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra en dos o más dosis. En modalidades particulares, el agente de iARN se administra a interva Los que se seleccionan del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 2 horas, una vez cada aproximadamente 3 horas, una vez cada aproximadamente 4 horas, una vez cada aproximadamente 6 horas, una vez cada aproximadamente 8 horas, una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas, una vez cada aproximadamente 96 horas, una vez cada aproximadamente 120 horas, una vez cada aproximadamente 144 horas, una vez cada aproximadamente 168 horas, una vez cada aproximadamente 240 horas, una vez cada aproximadamente 336 horas, una vez cada aproximadamente 504 horas, una vez cada aproximadamente 672 horas y una vez cada aproximadamente 720 horas .
En otras modalidades, el método adicionalmente incluye evaluar el nivel de expresión de ARNm de TTR o expresión de proteína TTR en una muestra derivada del sujeto.
En modalidades preferidas, la administración del agente de iARN no resulta en una respuesta inflamatoria en el sujeto tal como se evalúa en base al nivel de una citoquina o quimioquina seleccionada del grupo que consiste en G-CSF, IFN-?, IL-10, IL-12 (p70), ?? ß, IL-lra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-IOÍ, ???-?ß, TNFa y cualquier combinación de las mismas, en una muestra del sujeto.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra utilizando una composición farmacéutica, por ejemplo, un liposoma .
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra en una solución. En algunas de las modalidades, el ARNip se administra en una solución sin amortiguar. En una modalidad, el ARNip se administra en solución salina o agua. En otras modalidades, el ARNip se administra con una solución amortiguadora, tal como un amortiguador de acetato, un amortiguador de citrato, un amortiguador de prolamina, un amortiguador de carbonato, o un amortiguador de fosfato o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, la solución amortiguadora es solución salina amortiguada con fosfato (PBS) .
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la expresión de transtiretina (TTR) en una célula que incluye poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra, en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en la célula. En un aspecto, el agente de iARN de doble hebra se selecciona del grupo de agentes que figuran en la Tabla 1, inhibiendo así la expresión de transtiretina (TTR) en la célula .
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la expresión de transtiretina (TTR) en una célula que incluye poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra, en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en la célula. En un aspecto, el agente de iAR de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547, inhibiendo así la expresión de transtiretina (TTR) en la célula.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto que incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra. En un aspecto, el agente de iARN de doble hebra se selecciona del grupo de agentes que figuran en la Tabla 1, tratando o previniendo así una enfermedad asociada a TTR en el sujeto.
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto que incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra. En un aspecto, el agente de iARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547, tratando o previniendo así una enfermedad asociada a TTR en el sujeto.
En aspectos adicionales, la invención proporciona kits para llevar a cabo los métodos de la invención. En un aspecto, la invención proporciona un kit para llevar a cabo un método para inhibir la expresión de transtiretina (TTR) en una célula que comprende poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iAR de doble hebra, en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de la TTR en la célula, inhibiendo así la expresión de TTR en la célula. El kit comprende un agente de iARN e instrucciones para su uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de iARN al sujeto.
La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante la siguiente descripción detallada y las figuras.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que ilustra que administrar a ratones una sola dosis subcutánea de un agente de iARN conjugado con GalNAc que se dirige a TTR resultó en una supresión dependiente de la dosis de ARNm de TTR.
La Figura 2 es una gráfica que ilustra que administrar a ratones una sola dosis subcutánea de 7.5 mg/kg o 30 mg/kg de un agente de iARN conjugado con GalNAc que se dirige a TTR resultó en una supresión de larga duración de ARNm de TTR.
La Figura 3 ilustra la secuencia de ARNm de TTR humana. La Figura 4 es una gráfica que ilustra la actividad de silenciamiento mejorada de agentes de iARN modificados con respecto al AD-45163 base.
La Figura 5 es una gráfica que ilustra la actividad de silenciamiento mejorada de agentes de iARN modificados con respecto al AD-45165 base.
La Figura 6 es una gráfica que ilustra el silenciamiento de captación libre mejorada tras la incubación de 4 horas con agentes de iARN modificados con respecto al AD-45163 base.
La Figura 7 es una gráfica que ilustra el silenciamiento de captación libre mejorada tras la incubación de 24 horas con agentes de iARN modificados con respecto al AD-45163 base La Figura 8 es una gráfica que ilustra el silenciamiento de captación libre mejorada tras la incubación de 4 horas con agentes de iARN modificados con respecto al AD-45165 base.
La Figura 9 es una gráfica que ilustra el silenciamiento de captación libre mejorada tras la incubación de 24 horas con agentes de iARN modificados con respecto al AD-45165 base Las Figuras 10A y 10B son gráficas que ilustran el silenciamiento de ARNm de TTR en ratones transgénicos que expresan V30M de TTRh tras la administración de una sola dosis subcutánea de agentes de iARN AD-51544, AD-51545, AD-45163, AD-51546, AD-51547 o AD-45165.
La Figura 11 es una gráfica que ilustra la supresión de la proteína TTR en ratones transgénicos que expresan V30M de TTRh tras la administración de una sola dosis subcutánea de 5 mg/kg o lmg/kg de agentes de iARN AD-51544, AD-51545 o AD-45163.
La Figura 12 es una gráfica que ilustra la supresión de la proteína TTR en ratones transgénicos que expresan V30M de TTRh tras la administración de una sola dosis subcutánea de 5 mg/kg o lmg/kg de agentes de iARN AD-51546, AD-51547 o AD-45165.
La Figura 13 ilustra el protocolo para extracciones de sangre post-dosis en monos que recibieron 5x5mg/kg de agente de iARN (línea superior) o 1x25 mg/kg de agente de iARN (línea inferior) .
La Figura 14 es una gráfica que ilustra la supresión de la proteína TTR en primates no humanos tras la administración subcutánea de cinco dosis de 5 mg/kg (panel superior) o una sola dosis de 25 mg/kg (panel inferior) de AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 o AD-51547.
La Figura 15 es una gráfica que ilustra la supresión de la proteína TTR en primates no humanos tras la administración subcutánea de AD-51547 a 2.5 mg/kg (cuadrados blancos), 5 mg/kg (cuadrados negros) o 10 mg/kg (cuadrados estampados) por dosis, o administración de PBS como un testigo negativo (cuadrados grises) .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, y composiciones que se dirigen al gen de la transtiretina (TTR) . La presente invención también proporciona métodos para inhibir la expresión de TTR y métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto que utiliza los agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, de la invención. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que agentes de iARN que comprenden modificaciones químicas particulares muestran una capacidad superior para inhibir la expresión de TTR. Los agentes que incluyen un cierto patrón de modificaciones químicas (por ejemplo, un patrón alterno) y un ligando demostraron en la presente ser efectivos en silenciar la actividad del gen de la TTR. Más aun, los agentes que incluyen uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, incluyendo uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión de los agentes, muestran sorprendentemente la actividad silenciadora del gen de la TTR mejorada. Cuando un solo motivo químico está presente en el agente, se prefiere que esté en o cerca de la región de escisión para mejorar la actividad de silenciamiento de genes. La región de escisión es la región que rodea el sitio de escisión, es decir, el sitio en el ARNm objetivo en el cual ocurre la escisión.
I. Definiciones Tal como se utiliza en la presente, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado al mismo en esta sección.
La expresión "que incluye" se utiliza en la presente para referirse a la frase "que incluye a modo no taxativo" y se utiliza de manera intercambiable con ésta.
El término "o" se utiliza en la presente para referirse al término "y/o", y se utiliza de manera intercambiable con éste, a menos que el contexto indique lo contrario.
Tal como se utiliza en la presente, una "transtiretina" ("TTR") se refiere al gen y la proteína bien conocidos. TTR también se conoce como prealbúmina, HsT2651, PALB y TBPA. La TTR funciona como transportador de la proteína de unión a retinol (RBP) , tiroxina (T4) y retinol y también actúa como una proteasa. El hígado secreta TTR en la sangre y el plexo coroideo secreta TTR en el fluido cerebroespinal . La TTR también se expresa en el páncreas y el epitelio de pigmento retinal. La mayor relevancia clínica de la TTR es que la proteína TTR normal y mutante puede formar fibrillas amiloides que se acumulan en depósitos extracelulares , provocando amiloidosis. Ver una reseña, por ejemplo, en Saraiva M.J. . (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12):1-11. La clonación molecular y la secuencia de nucleótidos de transtiretina de rata, así como la distribución de la expresión de AR m, fueron descrita por Dickson, P.W. et al. (1985) J. Biol . Che . 260(13)8214-8219. La estructura de cristal de rayos X de TTR humana se describió en Blake, C.C. et al. (1974) J Mol Biol 88, 1-12. La secuencia de un transcripto de ARNm de TTR humana puede encontrarse en el número de acceso RefSeq NM_000371 del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) . La secuencia de ARNm de TTR de ratón puede encontrarse en el número de acceso de RefSeq NM_013697.2, y la secuencia de ARNm de TTR de rata puede encontrarse en el número de acceso de RefSeq NM_012681.1.
Tal como se utiliza en la presente, "secuencia objetivo" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de la TTR, incluyendo ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "hebra que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia denominada utilizando la nomenclatura de nucleótidos estándar.
"G, " "C, " "A" y "U" cada uno significa generalmente un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como una base, respectivamente. "T" y "dT" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a un desoxirribonucleótido en donde la nucleobase es timina, por ejemplo, desoxirribotimina, 2 ' -desoxitimidina o timidina. Sin embargo, se comprenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" o "desoxirribonucleótido" también puede referirse a un nucleótido modificado, como se detalla adicionalmente a continuación, o un resto de reemplazo sustituto. El experto en la técnica es bien consciente de que la guanina, citosina, adenina y uracilo pueden reemplazarse por otros restos sin alterar básicamente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleotido que comprende un nucleótido que tiene el resto de reemplazo. Por ejemplo, a modo no taxativo, un nucleótido que comprende inosina como su base puede aparear bases con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina pueden reemplazarse en las secuencias de nucleótidos de la invención mediante un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden los restos de reemplazo son modalidades de la invención.
Un "agente de iARN de doble hebra" , una molécula de ARN de doble hebra (ARNdh) , también denominado "agente de AR dh" , "ARNdh", "ARNip" , "agente de ARNi" , tal como se utiliza de forma intercambiable en la presente, se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico que tiene una estructura de dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico antiparalelas y básicamente complementarias, como se define a continuación. En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle en la presente, cada una de las hebras o ambas pueden incluir uno o más no ribonucleótidos, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, tal como se utiliza en la presente descipcion, un "agente de iAR " puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas; un agente de iARN puede incluir modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos. Las modificaciones pueden incluir todo tipo de modificaciones descirbedas en la presente o conocidas en la técnica. Cualquiera de las modificaciones, tal como se utilizan en una molécula de tipo AR ip, abarcan el "agente de iARN" a los efectos de la presente descipcion y las reivindicaciones.
En otra modalidad, el agente de iARN puede ser un ARNip de una sola hebra que se introduce en una célula u organismo para inhibir un ARNm objetivo. Agentes de iARN de una sola hebra se unen a la endonucleasa Argonauta 2 de RISC, que escinde entonces el ARNm objetivo. Los ARNip de una sola hebra son generalmente 15-30 nucleótidos y están químicamente modificados. El diseño y la evaluación de los ARNip de una sola hebra se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 8,101,348 y en Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de referencia. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos antisentido descritas en la presente pueden utilizarse como un ARNip de una sola hebra como se describe en la presente o químicamente modificadas por los métodos descritos en Lima et al., (2012) Cell 150; : 883-894.
Las dos hebras que forman la estructura de dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos hebras son parte de una molécula más grande y de este modo están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3 ' de una hebra y el extremo 51 de la otra hebra respectiva que forma la estructura de dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina un "bucle de horquilla" . Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios diferentes a una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 31 de una hebra y el extremo 5 ' de la otra hebra respectiva que forma la estructura de dúplex, la estructura de conexión se denomina un "enlazante". Las hebras de ARN pueden tener el mismo o un diferente número de nucleótidos. El número máximo de pares de base es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNdh menos cualquier saliente presente en el dúplex. Además de la estructura de dúplex, un agente de iARN puede comprender una o más salientes de nucleótido. El término "ARNip" también se utiliza en la presente para referirse a un agente de iARN como se describió anteriormente .
En otro aspecto, el agente es una molécula de ARN antisentido de una sola hebra. Una molécula de ARN antisentido es complementaria a una secuencia dentro del ARNm objetivo. El ARN antisentido puede inhibir la traducción de un modo estequiométrico mediante apareamiento de bases al ARNm y mediante la obstrucción física de la máquina de traducción, ver Dias, N. et al., (2002) Mol Cáncer Ther 1:347-355. La molécula de ARN antisentido puede tener aproximadamente 15-30 nucleótidos que son complementarios al ARNm objetivo. Por ejemplo, la molécula de ARN antisentido puede tener una secuencia de al menos 15, 16 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias antisentido de la Tabla 1.
Tal como se utiliza en la presente, una "saliente de nucleótidos" se refiere a un nucleótido o nucleótidos no apareados que sobresalen de la estructura de dúplex de un agente de iARN cuando un extremo de una hebra del agente de iARN se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa. "Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos no apareados en ese extremo del agente de iARN de doble hebra, es decir, ninguna saliente de nucleótidos. Un agente de iARN de "extremo romo" es un ARNdh que es de doble hebra sobre su longitud entera, es decir, ninguna saliente de nucleótidos en ninguno de los extremos de la molécula. Los agentes de iARN de la invención incluyen agentes de iARN con salientes de nucleótidos en un extremo (es decir, agentes con una saliente y un extremo romo) o con salientes de nucleótidos en ambos extremos.
La expresión "hebra antisentido" se refiere a la hebra de un agente de iAR de doble hebra que incluye una región que es básicamente complementaria a una secuencia objetivo (por ejemplo, un ARNm de TTR humana) . Tal como se utiliza en la presente, la expresión "región complementaria a parte de un ARNm que codifica transtiretina" se refiere a una región en la hebra antisentido que es básicamente complementaria a parte de una secuencia de ARNm de TTR. Cuando la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia objetivo, los apareamientos incorrectos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, están generalmente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6 , 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.
La expresión "hebra sentido", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la hebra de ARNdh que incluye una región que es básicamente complementaria a una región de la hebra antisentido.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "región de escisión" se refiere a una región que se ubica inmediatamente adyacente al sitio de escisión. El sitio de escisión es el sitio en el objetivo en el cual ocurre la escisión. En algunas modalidades, la región escindible comprende tres bases en cualquier extremo de, e inmediatamente adyacente al sitio de escisión. En algunas modalidades, la región escindible comprende dos bases en cualquier extremo de, e inmediatamente adyacente al sitio de escisión. En algunas modalidades, el sitio de escisión se encuentra específicamente en el sitio unido por los nucleótidos 10 y 11 de la hebra antisentido, y la región escindible comprende nucleótidos los 11, 12 y 13.
Tal como se utiliza en la presente, y a menos que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos con relación a una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar una estructura de dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como comprenderá un experto en la técnica. Las condiciones pueden, por ejemplo, ser condiciones rigurosas, donde las condiciones rigurosas pueden incluir: 400 mM de NaCl, 40 mM de PIPES pH 6.4, 1 mM de EDTA, 50°C o 70°C durante 12-16 horas tras un lavado. Otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes como las que pueden encontrarse dentro de un organismo, pueden aplicarse. Un experto en la técnica será capaz de determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la última aplicación de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias puede ser "completamente complementarias" con respecto a la otra cuando hay apareamiento de bases de los nucleótidos de la primera secuencia de nucleótidos con los nucleótidos de la segunda secuencia de nucleótidos en la longitud total de la primera y la segunda secuencia de nucleótidos. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina "básicamente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en la presente, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias o pueden formar una o más, pero generalmente no más de 4, 3 o 2, pares de bases no coincidentes tras la hibridación, reteniendo a la vez la capacidad de hibridarse en las condiciones más relevantes a su última aplicación. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos se diseñan para formar, tras la hibridación, una o más salientes de una sola hebra, tales salientes no deberán considerarse como apareamientos incorrectos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNdh que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de largo, en donde el oligonucleó ido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, puede igualmente denominarse "completamente complementaria" a los efectos descritos en la presente.
Secuencias "complementarias", tal como se utiliza en la presente, también pueden incluir, o formarse completamente de, pares de bases no Watson-Crick y/o pares de bases formados de nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse . Los pares de bases no Watson-Crick incluyen, a modo no taxativo, apareamiento de bases de balanceo G-U o Hoogstein.
Las expresiones "complementaria", "completamente complementaria" y "básicamente complementaria" en la presente pueden utilizarse con respecto a la coincidencia de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNdh, o entre la hebra antisentido de un ARNdh y una secuencia objetivo, como se comprenderá del contexto de su uso.
Tal como se utiliza en la presente, un polinucleótido que es "básicamente complementario a al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es básicamente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, una ARNm que codifica TTR) incluyendo una UTR 5', un marco de lectura abierto (ORF) o una UTR 3'. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de TTR si la secuencia es básicamente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica TTR.
La expresión "que inhibe", tal como se utiliza en la presente, se utiliza de manera intercambiable con "que reduce", "que silencia", "que regula hacia abajo", "que suprime" y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
La frase "expresión inhibidora de una TTR", tal como se utiliza en la presente, incluye la inhibición de la expresión de cualquier gen de la TTR (tal como, por ejemplo, un gen de la TTR de ratón, un gen de la TTR de rata, un gen de la TTR de mono o un gen de la TTR de humano) así como variantes o imitantes de un gen de la TTR. Por lo tanto, el gen de la TTR puede ser un gen de la TTR natural, un gen de la TTR mutante (tal como un gen de la TTR mutante que dio lugar a deposición amiloide sistémica) o un gen de la TTR transgénico en el contexto de una célula, grupo de células, u organismos genéticamente manipulados.
"Expresión de inhibición de un gen de la TTR" incluye cualquier nivel de inhibición de un gen de la TTR, por ejemplo, al menos supresión parcial de la expresión de un gen de la TTR, tal como una inhibición de al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%. al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99%.
La expresión de un gen de la TTR puede evaluarse en base al nivel de cualquier variable asociada con la expresión del gen de la TTR, por ejemplo, nivel del ARNm de la TTR, nivel de proteína de la TTR, nivel de la proteína de unión a retinol, nivel de vitamina A, o el número o alcance de los depósitos amiloides. La inhibición puede evaluarse mediante una disminución en un nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables en comparación con un nivel testigo. El nivel testigo puede ser cualquier tipo de nivel testigo que se utiliza en la técnica, por ejemplo, un nivel de base de pre-dosis o un nivel determinado de un sujeto similar, célula o muestra que es tratada o no tratada con un testigo (tal como, por ejemplo, testigo sólo con solución amortiguadora o testigo de agente inactivo) .
La frase "poner en contacto una célula con un agente de iARN", tal como se utiliza en la presente, incluye poner en contacto una célula mediante cualquier medio posible. Poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra incluye poner en contacto una célula in vitro con el agente de iARN o poner en contacto una célula in vivo con el agente de iARN. El hecho de poner en contacto puede realizarse directamente o indirectamente. Por lo tanto, por ejemplo, el agente de iARN se puede poner en contacto físico con la célula por el individuo que realiza el método, o alternativamente, el agente de iARN se puede poner en una situación que permitirá o causará que se ponga en contacto posteriormente con la célula.
El hecho de poner en contacto una célula in vitro puede realizarse, por ejemplo, mediante la incubación de la célula con el agente de iARN. El hecho de poner en contacto una célula in vivo puede realizarse, por ejemplo, mediante la inyección del agente de iARN en o cerca del tejido donde está ubicada la célula, o mediante la inyección del agente de iARN en otra área, por ejemplo, el torrente sanguíneo o el espacio subcutáneo, de modo que el agente alcanzará posteriormente el tejido donde se encuentra la célula que se pondrá en contacto Por ejemplo, el agente de iARN puede contener y/o estar acoplado a un ligando, por ejemplo, un ligando GalNAc3, que dirige el agente de iARN a un sitio de interés, por ejemplo, el hígado. También son posibles combinaciones de métodos para poner en contacto in vitro e in vivo. En conexión con los métodos de la invención, una célula podría ponerse en contacto in vitro con un agente de iARN y posteriormente trasplantarse en un sujeto.
Un "paciente" o "sujeto" tal como se utiliza en la presente, pretende incluir un animal humano o no humano, preferiblemente un mamífero, por ejemplo, un mono. Más preferiblemente, el sujeto o paciente es un humano.
Una "enfermedad asociada a TTR", tal como se utiliza en la presente, pretende incluir cualquier enfermedad asociada con el gen o proteína TTR. La enfermedad puede ser causada, por ejemplo, mediante la producción en exceso de la proteína TTR, mediante mutaciones del gen de la TTR, mediante escisión anormal de la proteína TTR, mediante interacciones anormales entre TTR y otras proteínas u otras sustancias endógenas o exógenas . Una "enfermedad asociada a TTR" incluye cualquier tipo de amiloidosis por TTR (ATTR) en donde la TTR juega un rol en la formación de agregados extracelulares anormales o depósitos amiloides. Las enfermedades asociadas a TTR incluyen amiloidosis sistémica senil (ASS) , amiloidosis sistémica familiar, polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) , cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF) , amiloidosis leptomeníngea/del Sistema Nervioso Central (SNC) , opacidades vitreas amiloidóticas, síndrome del túnel carpiano e hipertiroxinemia . Síntomas de amiloidosis por TTR incluyen neuropatía sensorial (por ejemplo, parestesia, hipoestesia en miembros distales) , neuropatía autonómica (por ejemplo, disfunción gastrointestinal, tal como úlcera gástrica, o hipotensión ortostática) , neuropatía motora, crisis, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, opacidades vitreas, insuficiencia renal, nefropatía, IMCm (índice de Masa Corporal modificado) sustancialmente reducido, disfunción del disfunción de los nervios craneales y distrofia corneal reticular .
"Cantidad terapéuticamente efectiva", tal como se utiliza en la presente, pretende incluir la cantidad de un agente de iARN que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad asociada a TTR, es suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, disminuyendo, aliviando o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de enfermedad) . La "cantidad terapéuticamente efectiva" puede variar dependiendo del agente de iARN, cómo se administra el agente, la enfermedad y su gravedad y el antecedente, edad, peso, antecedente familiar, conformación genética, etapa de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR, los tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si existieron, y otras características individuales del paciente a tratar.
"Cantidad profilácticamente efectiva", tal como se utiliza en la presente, pretende incluir la cantidad de un agente de iARN que, cuando se administra a un sujeto que no experimenta o presenta síntomas de una enfermedad asociada a 5 TTR, pero que puede estar predispuesto a la enfermedad, es suficiente para prevenir o aliviar la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. Síntomas que pueden aliviarse incluyen neuropatía sensorial (por ejemplo, parestesia, hipoestesia en miembros distales) , neuropatía autonómica (por ejemplo, disfunción gastrointestinal, tal como úlcera gástrica, o hipotensión ortostática) , neuropatía motora, crisis, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, opacidades vitreas, insuficiencia renal, nefropatía, IMCm (índice de Masa Corporal modificado) sustancialmente reducido, disfunción del disfunción de los nervios craneales y distrofia corneal reticular. Aliviar la enfermedad incluye ralentizar el curso de la enfermedad o reducir la gravedad de una enfermedad desarrollada posteriormente. La "cantidad profilácticamente efectiva" puede variar dependiendo del agente de iAR , cómo se administra el agente, el grado de riesgo de enfermedad, y el antecedente, edad, peso, antecedente familiar, conformación genética, los tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si existieron, y otras características individuales del paciente a tratar.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad profilácticamente efectiva" también incluye una cantidad de un agente de iARN que produce algo de efecto local o sistémico deseado a una relación beneficio/riesgo razonable para cualquier tratamiento. Los agentes de iARN empleados en los métodos de la presente invención pueden administrarse en una cantidad suficiente para producir una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a el tratamiento.
El término "muestra", tal como se utiliza en la presente, incluye una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosas, plasma, fluido cerebroespinal, fluidos oculares, linfa, orina, saliva y similares. Muestras tisulares pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras pueden derivar de órganos particulares, partes de órganos o fluidos o células dentro de aquellos órganos. En ciertas modalidades, las muestras pueden derivar del hígado (por ejemplo, hígado entero o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado, tales como, por ejemplo, hepatocitos) , la retina o partes de la retina (por ejemplo, epitelio de pigmento retinal) , el sistema nervioso central o partes del sistema nervioso central (por ejemplo, ventrículos o plexo coroideo) , o el páncreas o ciertas células o partes del páncreas. En algunas modalidades, una "muestra derivada de un sujeto" se refiere a fluido cerebroespinal obtenido del sujeto. En modalidades preferidas, una "muestra derivada de un sujeto" se refiere a sangre o plasma extraído del sujeto. En modalidades adicionales, una "muestra derivada de un sujeto" se refiere a tejido del hígado (o subcomponentes del mismo) o tejido retinal (o subcomponentes del mismo) derivado del sujeto.
II. Agentes de iARN La presente invención proporciona agentes de iARN con actividad de silenciamiento de genes superior. Se muestra en la presente y en la Solicitud provisional No. 61/561,710 (de la cual la presente solicitud reivindica prioridad) que puede obtenerse un resultado superior mediante la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una hebra sentido y/o hebra antisentido de un agente de iARN, particularmente en o cerca del sitio de escisión. La hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN puede de otro modo modificarse completamente. La introducción de estos motivos interrumpe el patrón de modificación, si está presente, de la hebra sentido y/o antisentido. El agente de iARN también se conjuga opcionalmente con un ligando derivado GalNAc, por ejemplo en la hebra sentido. Los agentes de iARN resultantes presentan una actividad silenciadora de genes superior.
Los inventores descubrieron sorprendentemente que cuando la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN se modifican completamente, tener uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de al menos una hebra de un agente de iARN mejoró superiormente la actividad silenciadora de genes del agente de iARN.
Por consiguiente, la invención proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, capaces de inhibir la expresión de un gen objetivo (es decir, un gen de la TTR) in vivo. El agente de iARN comprende una hebra sentido y una hebra antisentido. Cada hebra del agente de iARN puede estar en el intervalo de 12-30 nucleotidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra puede tener de entre 14-30 nucleotidos de longitud, 17-30 nucleotidos de longitud, 25-30 nucleotidos de longitud, 27-30 nucleotidos de longitud, 17-23 nucleotidos de longitud, 17-21 nucleotidos de longitud, 17-19 nucleotidos de longitud, 19-25 nucleotidos de longitud, 19-23 nucleotidos de longitud, 19-21 nucleotidos de longitud, 21-25 nucleotidos de longitud o 21-23 nucleotidos de longitud.
La hebra sentido y la hebra antisentido típicamente forman un ARN de doble hebra dúplex ("ARNdh"), también denominado en la presente un "agente de iARN" . La región de dúplex de un agente de iARN puede tener de 12-30 pares de nucleotidos de longitud. Por ejemplo, la región de dúplex puede tener 14-30 pares de nucleotidos de longitud, 17-30 pares de nucleotidos de longitud, 27-30 pares de nucleotidos de longitud, 17-23 pares de nucleotidos de longitud, 17-21 pares de nucleotidos de longitud, 17-19 pares de nucleotidos de longitud, 19-25 pares de nucleótidos de longitud, 19-23 pares de nucleótidos de longitud, 19- 21 pares de nucleótidos de longitud, 21-25 pares de nucleótidos de longitud o 21-23 pares de nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, la región de dúplex se selecciona de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 27.
En una modalidad, el agente de iARN puede contener una o más regiones salientes y/o grupos protectores del agente de iARN en el extremo 31 o extremo 51 o ambos extremos de una hebra. La saliente puede ser de 1-6 nucleótidos de longitud, por ejemplo 2-6 nucleótidos de longitud, 1-5 nucleótidos de longitud, 2-5 nucleótidos de longitud, 1-4 nucleótidos de longitud, 2-4 nucleótidos de longitud, 1-3 nucleótidos de longitud, 2-3 nucleótidos de longitud o 1-2 nucleótidos de longitud. Las salientes pueden ser el resultado de una hebra que es más larga que la otra o el resultado de dos hebras de la misma longitud que son escalonadas. La saliente puede formar un apareamiento incorrecto con el ARNm objetivo o puede ser complementaria a las secuencias del gen al que se dirige o puede ser otra secuencia. La primera y segunda hebra también pueden unirse, por ejemplo, mediante bases adicionales para formar una horquilla o mediante otros enlazantes no base.
Los agentes de iARN proporcionados por la presente invención incluyen agentes con modificaciones químicas como se descirbe, por ejemplo, en la Solicitud provisional de los Estados Unidos No. 61/561,710, presentada el 18 de noviembre de 2011, Solicitud internacional No. PCT/US2011/051597 , presentada el 15 de setiembre de 2010, y Publicación PCT WO 2009/073809, cuyo contenido se incorpora en su totalidad a la presente a modo de referencia.
En una modalidad, los nucleótidos en la región saliente del agente de iARN pueden ser cada uno independientemente un nucleótido modificado o sin modificar incluyendo, a modo no taxativo 2 ' -modificado por azúcar, tal como, 2-F, 2'-0-metilo, timidina (T) , 2" -0-metoxietil-5-metiluridina (Teo) , 2"-0-metoxietiladenosina (Aeo) , 2 " -O-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, TT puede ser una secuencia saliente para cualquier extremo en cualquier hebra. La saliente puede formar un apareamiento incorrecto con el ARNm objetivo o puede ser complementaria a las secuencias del gen al que se dirige o puede ser otra secuencia .
Las salientes 5' o 3' en la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras del agente de iARN pueden fosforilarse . En algunas modalidades, la región saliente contiene dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre los dos nucleótidos, donde los dos nucleótidos pueden ser el mismo o diferente. En una modalidad, la saliente está presente en el extremo 31 de la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras. En una modalidad, esta saliente 3' está presente en la hebra antisentido. En una modalidad, esta saliente 3' está presente en la hebra sentido.
El agente de iARN puede contener sólo una sola saliente, que puede fortalecer la actividad de interferencia de la iARN, sin afectar su estabilidad general. Por ejemplo, la saliente de una sola hebra se ubica en el extremo 31 terminal de la hebra sentido o, alternativamente, en el extremo 3' terminal de la hebra antisentido. La iARN también puede tener un extremo romo, ubicado en el extremo 5' de la hebra antisentido (o el extremo 3' de la hebra sentido) o viceversa. Generalmente, la hebra antisentido de la iARN tiene una saliente de nucleótido en el extremo 3' y el extremo 5' es romo. Si bien los solicitantes no pretenden ceñirse a teoría alguna, el mecanismo teórico es que el extremo romo asimétrico en el extremo 5' de la hebra antisentido y una saliente del extremo 3' de la hebra antisentido favorecen la carga de la hebra guía en el proceso RISC.
En una modalidad, el agente de iARN es un oligonucleótido de dos extremos romos de 19 nt de longitud, en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 21 -F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 7, 8, 9 del extremo 5'. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En una modalidad, el agente de iARN es un oligonucleótido de dos extremos romos de 20 nt de longitud, en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 21 -F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 8, 9, 10 del extremo 5'. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En una modalidad, el agente de iARN es un oligonucleótido de dos extremos romos de 21 nt de longitud, en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2 ' -F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5'. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En otra modalidad, el agente de iARN comprende una hebra sentido de 21 nucleótidos (nt) y una hebra antisentido de 23 nucleótidos (nt) , en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9,10,11 del extremo 5'; la hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5', en donde un extremo del agente de iARN es romo, mientras el otro extremo comprende una saliente de 2 nt . Preferiblemente, la saliente de 2 nt está en el extremo 3' de la antisentido. Opcionalmente , el agente de iARN comprende además un ligando (preferiblemente GalNAc3) .
En una modalidad, el agente de iARN comprende una hebra sentido y una antisentido, en donde la hebra sentido es de 25-30 residuos de nucleótido de longitud, en donde comenzando en el nucleótido terminal 5' (posición 1) las posiciones 1 a 23 de la primera hebra comprenden al menos 8 ribonucleótidos; la hebra antisentido es de 36-66 residuos de nucleótidos de longitud y, comenzando en el nucleótido terminal 31 , comprende al menos 8 ribonucleótidos en las posiciones apareadas con las posiciones 1- 23 de la hebra sentido para formar un dúplex; en donde al menos el nucleótido terminal 31 de la hebra antisentido no está apareado con la hebra sentido, y hasta 6 nucleótidos terminales 3 ' consecutivos no están apareados con la hebra sentido, formando así una saliente de una sola hebra 3' de 1-6 nucleótidos; en donde el extremo 5' de la hebra antisentido comprende de 10-30 nucleótidos consecutivos que no están apareados con la hebra sentido, formando así una saliente 5' de una sola hebra de 10-30 nucleótidos; en donde al menos los nucleótidos de 5' terminal y 3 ' terminal de la hebra sentido se aparean en bases con nucleótidos de la hebra antisentido cuando las hebras sentido y antisentido están alineadas para una complementariedad máxima, formando así una región sustancialmente de dúplex entre las hebras sentido y antisentido; y la hebra antisentido es suficientemente complementaria a un ARN objetivo junto con al menos 19 ribonucleótidos de la longitud de la hebra antisentido para reducir la expresión de genes objetivo cuando el ácido nucleico de doble hebra se introduce en una célula de mamífero; y en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos, donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión.
En una modalidad, el agente de iAR comprende hebras sentido y antisentido, en donde el agente de iARN comprende una primera hebra que tiene una longitud que es al menos 25 y a lo sumo 29 nucleótidos y una segunda hebra que tiene una longitud que es a lo sumo 30 nucleótidos con al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en la posición 11,12,13 del extremo 5'; en donde el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra forman un extremo romo y la segunda hebra es 1-4 nucleótidos más larga en su extremo 3' que la primera hebra, en donde la región de dúplex que es de al menos 25 nucleótidos de longitud, y la segunda hebra es suficientemente complementaria a un ARNm objetivo junto al menos 19 nt de la longitud de la segunda hebra para reducir la expresión de genes objetivo cuando el agente de iARN se introduce en una célula de mamífero, y en donde escisión cortadora del agente de iARN preferentemente resulta in un ARNip que comprende el extremo 3' de la segunda hebra, reduciendo así la expresión del gen objetivo en el mamífero. Opcionalmente , el agente de iARN comprende además un ligando.
En una modalidad, la hebra sentido del agente de iARN contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos se encuentra en el sitio de escisión en la hebra sentido.
En una modalidad, la hebra antisentido del agente de iARN también puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido.
Para el agente de iARN que tiene una región de dúplex de 17-23 nt de longitud, el sitio de escisión de la hebra antisentido es típicamente alrededor de 10, 11 y 12 posiciones del extremo 5' . Por lo tanto, los motivos de tres modificaciones idénticas pueden encontrarse en las posiciones 9, 10, 11; posiciones 10, 11, 12; posiciones 11, 12, 13; posiciones 12, 13, 14; o posiciones 13, 14, 15 de la hebra antisentido, comenzando el recuento desde el 1er nucleótido del extremo 5' de la hebra antisentido o comenzando el recuento desde el 1er nucleótido apareado dentro de la región de dúplex del extremo 5' de la hebra antisentido. El sitio de escisión en la hebra antisentido también puede cambiar de acuerdo con la longitud de la región de dúplex de la iAR del extremo 51.
La hebra sentido del agente de iARN puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la hebra; y la hebra antisentido puede tener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido forman un dúplex de ARNdh, la hebra sentido y la hebra antisentido pueden alinearse de modo que un motivo de los tres nucleótidos en la hebra sentido y un motivo de los tres nucleótidos en la hebra antisentido tienen al menos una superposición de nucleótidos, es decir, al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra sentido forma un par de bases con al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra antisentido. Alternativamente, al menos dos nucleótidos pueden superponerse, o los tres nucleótidos pueden superponerse.
En una modalidad, la hebra sentido del agente de iARN puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El primer motivo debe encontrarse en o cerca del sitio de escisión de la hebra y los otros motivos pueden ser modificaciones de alas. La expresión "modificación de ala" en la presente se refiere a un motivo que ocurre en otra porción de la hebra que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión de la misma hebra. La modificación de ala es adyacente al primer motivo o está separada por al menos uno o más nucleótidos. Cuando los motivos son inmediatamente adyacentes entre sí la química de los motivos son distintas entre sí y cuando los motivos se separan por uno o más nucleótidos que las químicas pueden ser los mismos o diferentes. Dos o más modificaciones de alas pueden estar presentes. Por ejemplo, cuando dos modificaciones de alas están presentes, cada modificación de alas puede encontrarse en un extremo con respecto al primer motivo que está en o cerca del sitio de escisión o en cualquier lado del motivo principal.
Al igual que la hebra sentido, la hebra antisentido del agente de iAR puede contener al menos dos motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose al menos uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Esta hebra antisentido también puede contener una o más modificaciones de alas en una alineación similar a las modificaciones de alas que están presentes en la hebra sentido.
En una modalidad, la modificación de ala en la hebra sentido o hebra antisentido del agente de iARN típicamente no incluye el primero o dos primeros nucleótidos terminales en el extremo 3', extremo 5' o ambos extremos de la hebra.
En otra modalidad, la modificación de ala en la hebra sentido o hebra antisentido del agente de iARN típicamente no incluye el primero o dos nucleótidos apareados dentro de la región de dúplex en el extremo 3 ' , extremo 5 ' o ambos extremos de la hebra.
Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN contienen cada una al menos una modificación de ala, las modificaciones de alas pueden encontrarse en el mismo extremo de la región de dúplex y tener una superposición de uno, dos o tres nucleótidos.
Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN contienen cada una al menos dos modificaciones de alas, la hebra sentido y la hebra antisentido pueden alinearse de modo que dos modificaciones cada una de una hebra se encuentran en un extremo de la región de dúplex, que tiene una superposición de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones cada una de una hebra se encuentran en el otro extremo de la región de dúplex, que tiene una superposición de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones de una hebra se encuentran en cada lado del motivo principal, que tiene una superposición de uno, dos o tres nucleótidos en la región de dúplex.
En una modalidad, puede modificarse cada nucleótido en la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN, incluyendo los nucleótidos que son parte de los motivos. Cada nucleótido puede modificarse con la misma o diferente modificación, que puede incluir una o más alteraciones de uno o ambos oxígenos de fosfato no de unión y/o uno o más de los oxígenos de fosfato que no son de unión; alteración de un constituyente del azúcar ribosa, por ejemplo, del 2' hidroxilo en el azúcar ribosa; reemplazo general del resto de fosfato con enlazantes "defosfo" ; modificación o reemplazo de una base natural; y reemplazo o modificación de la estructura principal de ribosa-fosfato .
Dado que los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades, muchas de las modificaciones ocurren en una posición que está repetida dentro de un ácido nucleico, por ejemplo, una modificación de una base, o un resto de fosfato, o un 0 no enlazante de un resto de fosfato. En algunos casos la modificación ocurrirá en todas las posiciones del sujeto en el ácido nucleico pero en muchos casos no. A modo de ejemplo, una modificación puede ocurrir solamente en la posición terminal 3' o 5' en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una hebra. Una modificación puede ocurrir en una región de doble hebra, una región de una sola hebra o en ambas. Una modificación puede ocurrir solamente en la región de doble hebra de un ARN o puede ocurrir en una región de una sola hebra de un ARN. Por ejemplo, una modificación de fosforotioato en una posición 0 no enlazante puede ocurrir solamente en uno o ambos extremos terminales, puede ocurrir en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una hebra, o puede ocurrir en las regiones de doble hebra y de una sola hebra, particularmente en los extremos terminales. El extremo o extremos 5' pueden estar fosforilados .
Puede que sea posible, por ejemplo, mejorar la estabilidad, para incluir bases particulares en salientes, o para incluir nucleótidos modificados o sustitutos de nucleótidos en salientes de una sola hebra, por ejemplo, en una saliente 5' o 3', o en ambas. Por ejemplo, puede ser deseable incluir nucleótidos de purina en salientes. En algunas modalidades todas o algunas de las bases en una saliente 3' o 5' pueden modificarse, por ejemplo, con una modificación descrita en la presente. Modificaciones pueden incluir, por ejemplo, el uso de modificaciones en la posición 2' del azúcar ribosa con modificaciones que son conocidas en la técnica, por ejemplo, el uso de desoxirribonucleótidos, 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro (2'-F) o 2'-0-metilo modificados en lugar del riboazúcar de la nucleobase, y modificaciones en el grupo fosfato, por ejemplo, modificaciones de fosforotioato . Las salientes no necesitan ser homologas con la secuencia obj etivo .
En una modalidad, cada residuo de la hebra sentido y la hebra antisentido se modifica independientemente con ANB, HNA, CeNA, 2' -metoxietilo, 2'-0-metilo, 2'-0-alilo, 2'-C- alilo, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo o 2'-fluoro. Las hebras pueden contener más de una modificación. En una modalidad, cada residuo de la hebra sentido y la hebra antisentido se modifica independientemente con 21 -0-metilo o 2'-fluoro.
Al menos dos modificaciones diferentes se presentan típicamente en la hebra sentido y la hebra antisentido. Las dos modificaciones pueden ser las modificaciones 2 ' -0-metilo o 2'-fluoro, u otras.
En una modalidad, el Na y/o I¾ comprenden modificaciones de un patrón alternado. La expresión "motivo alternado", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, ocurriendo cada modificación en nucleótidos alternados de una hebra. El nucleótido alternado puede referirse a uno por cada otro nucleótido o uno por cada tres nucleótidos o un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada una un tipo de modificación del nucleótido, el motivo alternado puede ser "ABABABABABAB..." , "AABBAABBAABB..." , "AABAABAABAAB..." , "AAABAAABAAAB..." , "AAABBBAAABBB..." o "ABCABCABCABC..." , etc.
Los tipos de modificaciones contenidas en el motivo alternado pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, si A, B, C, D representan cada una un tipo de modificación en el nucleótido, el patrón alternado, es decir, las modificaciones en cada otro nucleótido, puede ser igual, pero cada una de la hebra sentido o hebra antisentido puede seleccionarse de varias posibilidades de modificaciones dentro del motivo alternado, tal como "ABABAB...", "ACACAC..." "BDBDBD..." o "CDCDCD...", etc.
En una modalidad, el agente de iARN de la invención comprende el patrón de modificación para el motivo alternado en la hebra sentido con respecto al patrón de modificación para el motivo alternado en la hebra antisentido se cambia. El cambio puede ser de forma tal que el grupo modificado de nucleótidos de la hebra sentido corresponde a un grupo modificado de modo diferente de nucleótidos de la hebra antisentido y viceversa. Por ejemplo, la hebra sentido cuando se aparea con la hebra antisentido en el ARNdh dúplex, el motivo alternado en la hebra sentido puede comenzar con "ABABAB" de 5' -3' de la hebra y el motivo alternado en la hebra antisentido puede comenzar con "BABABA" de 5' -3' de la hebra dentro de la región de dúplex. Como otro ejemplo, el motivo alternado en la hebra sentido puede comenzar con "AABBAABB" de 5' -3' de la hebra y el motivo alternado en la hebra antisentido puede comenzar con "BBAABBAA" de 5' -3' de la hebra dentro de la región de dúplex, de modo que existe un cambio completo o parcial de los patrones de modificación entre la hebra sentido y la hebra antisentido.
En una modalidad, el agente de iAR comprende el patrón del motivo alternado de la modificación 2 ' -O-metilo y la modificación 2'-F en la hebra sentido inicialmente tiene un cambio con respecto al patrón del motivo alternado de la modificación 2 ' -O-metilo y la modificación 2'-F en la hebra antisentido inicialmente, es decir, el nucleótido 2 '-O-metilo modificado en los pares de bases de hebra sentido con un nucleótido 2 ' -F modificado en la hebra antisentido y viceversa. La posición 1 de la hebra sentido puede comenzar con la modificación 2'-F, y la posición 1 de la hebra antisentido puede comenzar con la modificación 2 '-O-metilo.
La introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos a la hebra sentido y/o hebra antisentido interrumpe el patrón de modificación inicial presente en la hebra sentido y/o hebra antisentido. La interrupción del patrón de modificación de la hebra sentido y/o antisentido mediante la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos a la hebra sentido y/o antisentido mejora sorprendentemente la actividad silenciadora de genes al gen objetivo.
En una modalidad, cuando el motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos se introduce en cualquiera de las hebras, la modificación del nucleótido junto al motivo es una modificación diferente de la modificación del motivo. Por ejemplo, la porción de la secuencia que contiene el motivo es "..JSTaYYY b..." , donde "Y" representa la modificación del motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y "Na" y "Nb" representan una modificación al nucleótido junto al motivo "YYY" que es diferente a la modificación de Y, y donde Na y Nb pueden ser las mismas o diferentes modificaciones. Alternativamente, Na y/o Nb pueden estar presentes o ausentes cuando hay una modificación de la presente.
El agente de iARN puede comprender además al menos una conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato . La modificación de la conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato puede ocurrir en cualquier nucleótido de la hebra sentido o hebra antisentido o ambas en cualquier posición de la hebra. Por ejemplo, la modificación de la conexión internucleotídica puede ocurrir en todos los nucleótidos en la hebra sentido o hebra antisentido; cada modificación de la conexión internucleotídica puede ocurrir en un patrón alternado en la hebra sentido o hebra antisentido; o la hebra sentido o hebra antisentido pueden contener las modificaciones de la conexión internucleotídica en un patrón alternado. El patrón alternado de la modificación de la conexión internucleotídica en la hebra sentido puede ser la misma o diferente de la hebra antisentido, y el patrón alternado de la modificación de la conexión internucleotídica en la hebra sentido puede tener un cambio con respecto al patrón alternado de la modificación de la conexión internucleotídica en la hebra antisentido.
En una modalidad, la iAR comprende la modificación de la conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato en la región de saliente. Por ejemplo, la región saliente puede contener dos nucleótidos que tienen una conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato entre los dos nucleótidos. Las modificaciones de la conexión internucleotídica también pueden realizarse para unir los nucleótidos salientes con los nucleótidos apareados terminales dentro de la región de dúplex. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o todos los nucleótidos salientes pueden unirse a través de una conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato y opcionalmente , puede haber conexiones internucleotídicas de fosforotioato o metilfosfonato adicionales que unen el nucleótido saliente con un nucleótido apareado que está junto al nucleótido saliente. Por ejemplo, puede haber al menos dos conexiones internucleotídicas de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los cuales dos de los tres nucleótidos son nucleótidos salientes y el tercero es un nucleótido apareado junto al nucleótido saliente. Preferiblemente, estos tres nucleótidos terminales pueden estar en el extremo 3' de la hebra antisentido.
En una modalidad, el agente de iARN comprende uno o más apareamientos incorrectos con el objetivo, dentro del dúplex, o combinaciones de los mismos. El apareamiento incorrecto puede ocurrir en la región saliente o la región de dúplex. El par de bases puede puntuarse en base a su propensión para promover la disociación o fusión (por ejemplo, en la energía libre de asociación o disociación de un apareamiento particular, el abordaje más simple es para examinar los pares en un par de bases individual , aunque también puede utilizarse el vecino siguiente o un análisis similar) . En términos de promover la disociación: Se prefiere A:U a G:C; se prefiere G:U a G:C; y se prefiere I:C a G:C (I=inosina) . Los apareamientos incorrectos, por ejemplo, apareamientos no canónicos u otros que no son canónicos (como se describe en otra parte de la presente) se prefieren a apareamientos canónicos (A:T, A:U, G:C) ; y se prefieren los apareamientos que incluyen una base universal a apareamientos canónicos.
En una modalidad, el agente de iARN comprende al menos uno de los primeros 1, 2, 3, 4 o 5 pares de bases dentro de las regiones de dúplex del extremo 5 ' de la hebra antisentido pueden seleccionarse independientemente del grupo de: A:U, G:U, I:C, y pares no coincidentes, por ejemplo, apareamientos no canónicos u otros que no son canónicos o apareamientos que incluyen una base universal, para promover la disociación de la hebra antisentido en el extremo 5' del dúplex.
En una modalidad, el nucleótido en la posición 1 dentro de la región de dúplex del extremo 5 ' en la hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en A, dA( dU, U y dT. Alternativamente, al menos uno de los primeros 1, 2 o 3 pares de bases dentro de la región de dúplex del extremo 5 ' de la hebra antisentido es un par de bases AU. Por ejemplo, el primer par de bases dentro de la región de dúplex del extremo 5 ' de la hebra antisentido es un par de bases AU.
En una modalidad, la secuencia de la hebra sentido puede representarse mediante la fórmula (I) : 5' np-Na- (X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb- (Z Z Z )j-Na-nq 3' (I) en donde : i y j son cada uno independientemente 0 o 1; p y q son cada uno independientemente 0-6; cada Na independientemente representa una secuencia de oligonucleotidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleotidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados; cada np y nq independientemente representan un nucleótido saliente ; en donde Nb e Y no tienen la misma modificación; y cada XXX, YYY y ZZZ independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. Preferiblemente YYY es todo de nucleótidos 2'-F modificados .
En una modalidad, el Na y/o Nb comprenden modificaciones de un patrón alternado.
En una modalidad, el motivo YYY se encuentra en o cerca del sitio de escisión de la hebra sentido. Por ejemplo, cuando el agente de iARN tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo YYY puede estar en o cerca del sitio de escisión (por ejemplo, puede estar en las posiciones 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 u 11, 12, 13) de la hebra sentido, comenzando la cuenta desde el primer nucleótido a partir del extremo 5' ; u opcionalmente, comenzando la cuenta en el primer nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, a partir del extremo 5'.
En una modalidad, i es l y j es O, o i es O y j es l, o tanto i como j son 1. La hebra sentido puede, por lo tanto, estar representada mediante las siguientes fórmulas: 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (la); 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ib); o 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ic) .
Cuando la hebra sentido se representa mediante la fórmula (la) , Nb representa una secuencia de oligonucleotidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na independientemente puede representar una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra sentido se representa como la fórmula (Ib) , b representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na independientemente puede representar una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra sentido se representa como la fórmula (Ic) , cada Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Preferiblemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Cada Na independientemente puede representar una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X, Y y Z pueden ser iguales o diferentes entre sí.
En una modalidad, la hebra antisentido secuencia de la iARN puede representarse mediante la fórmula (II) : 5' nq--Na'- (Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- (X '?'?' ) i-N'a-np ' 3' (ID en donde : k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; p' y q' son cada uno independientemente 0-6; cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada b' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados; cada npr y nq ' independientemente representan un nucleótido saliente; en donde b' e Y' no tienen la misma modificación; y cada X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una modalidad, el Na' y/o Nb' comprenden modificaciones de un patrón alternado.
El motivo Y'Y'Y' se encuentra en o cerca del sitio de escisión de la hebra antisentido. Por ejemplo, cuando el agente de iARN tiene una región de dúplex de 17-23 nt de longitud, el motivo Y'Y'Y' puede estar en las posiciones 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; o 13 , 14, 15 de la hebra antisentido, comenzando la cuenta desde el primer nucleótido a partir del extremo 5'; u opcionalmente , comenzando la cuenta en el primer nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, a partir del extremo 5' . Preferiblemente, el motivo Y'Y'Y' se encuentra en las posiciones 11, 12, 13.
En una modalidad, un motivo Y'Y'Y' es todo de nucleótidos 2'-0Me modificados.
En una modalidad, k es l y l es O, o k es 0 y 1 es 1, o tanto k como 1 son 1.
La hebra antisentido puede, por lo tanto, estar representada mediante las siguientes fórmulas: 5' nq.-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np. 3' (Ha); 5' nq.-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-?'?'?'-??. 3' (Ilb) ; O 51 nq- -Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X 'X 'X' -Na ' -np- 3' (lie).
Cuando la hebra antisentido se representa mediante la fórmula (Ha) , Nb representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (Ilb) , Nb' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (lie) , cada Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 7 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Preferiblemente, ¾ es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Cada uno de X', Y' y Z' pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cada nucleotido de la hebra sentido y la hebra antisentido puede modificarse independientemente con LNA, HNA, CeNA, 2' -metoxietilo, 2'-0-metilo, 2'-0-alilo, 2'-C- alilo, 2 ' -hidroxilo, 2'-desoxi o 2'-fluoro. Por ejemplo, cada nucleotido de la hebra sentido y la hebra antisentido se modifica independientemente con 2'-0-metilo o 2'-fluoro. Cada X, Y, Z, X', Y' y ?', en particular, puede representar una modificación 2'-0-metilo o una modificación 2'-fluoro.
En una modalidad, la hebra sentido del agente de iARN puede contener un motivo YYY en las posiciones 9, 10 y 11 de la hebra cuando la región de dúplex es de 21 nt, comenzando la cuenta desde el primer nucleotido a partir del extremo 5', u opcionalmente , comenzando la cuenta en el primer nucleotido apareado dentro de la región de dúplex, a partir del extremo 5'; e Y representa una modificación 2'-F. La hebra sentido adicionalmente puede contener un motivo XXX o motivos ZZZ como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región de dúplex; y cada XXX y ZZZ independientemente representa una modificación 2'-OMe o modificación 2'-F.
En una modalidad la hebra antisentido puede contener un motivo Y'Y'Y' en las posiciones 11, 12, 13 de la hebra, comenzando la cuenta desde el primer nucleótido a partir del extremo 5', u opcionalmente, comenzando la cuenta en el primer nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, a partir del extremo 5'; e Y' representa una modificación 2'-0-metilo. La hebra antisentido adicionalmente puede contener un motivo X'X'X' o motivos Z'Z'Z' como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región de dúplex; y cada X'X'X' y Z'Z'Z' independientemente representa una modificación 2'-0Me o modificación 2'-F.
La hebra sentido representada mediante cualquiera de las fórmulas precedentes (la) , (Ib) y (Ic) forma un dúplex con una hebra antisentido representada mediante cualquiera de las fórmulas (lia), (Ilb) y (lie) , respectivamente.
De esta forma, los agentes de iAR de la invención pueden comprender una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, estando el dúplex de iARN representado por la fórmula (III) : sentido: 5' np -Na- (X X X) i -Nb- e Y Y -Nb - (Z Z Z)j-Na-nq 3 ' antisentido: 3' np' -Na' - (?' X 'X ' ) k-Nb' -Y ? ? ' -Nb' - {Z'Z'Z') i~Na -nq 5' (III) en donde : i, j, k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; p, ', q y q' son cada uno independientemente 0-6; cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados ; en donde cada ??' , np, nq' y nq independientemente representa un nucleótido saliente; y cada XXX, YYY, ZZZ, ?'?'?', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una modalidad, i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 1. En otra modalidad, k es 1 y 1 es 0; k es 0 y 1 es 1; o tanto k como 1 son 1.
Combinaciones ejemplares de la hebra sentido y la hebra antisentido que forman un dúplex de iARN incluyen las siguientes fórmulas: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq 5' (Illa) 5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (Illb) 5' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-riq 5' (Ule) Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (Illa) , cada Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-10, 1-7, 1-5 o 1-4 nucleótidos modificados. Cada Na independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (IIIb) , cada Nb, Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados .
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (lile), cada Nb, Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na, Na independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de Na, Na' , Nb y Nb independientemente 7 comprende modificaciones de un patrón alternado.
Cada X, Y y Z en la fórmulas (III), (Illa), (Illb) y (lile) pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (III) , (Illa) , (Illb) o (lile) , al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y'. De forma alternativa, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Y'; o los tres nucleótidos Y todos forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Y'.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (Illa) o (lile) , al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z'. De forma alternativa, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Z'; o los tres nucleótidos Z forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Z'.
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (Illb) o (lile) , al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X'. De forma alternativa, al menos dos de los nucleótidos X forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos X'; o los tres nucleótidos X todos forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos X'.
En una modalidad, la modificación en el nucleótido Y es diferente de la modificación en el nucleótido Y' , la modificación en el nucleótido Z es diferente de la modificación en el nucleótido Z' y/o la modificación en el nucleótido X es diferente de la modificación en el nucleótido X' .
En una modalidad, el agente de iARN es un multímero que contiene al menos dos dúplex representados por la fórmula (III), (Illa), (Illb) o (lile) , en donde los dúplex están conectados mediante un enlazante. El enlazante puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente , el multímero adicionalmente comprende un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
En una modalidad, el agente de iARN es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dúplex representados por la fórmula (III) , (Illa) , (Illb) o (lile) , en donde los dúplex están conectados mediante un enlazante. El enlazante puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero adicionalmente comprende un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
En una modalidad, dos agentes de iARN representados mediante la fórmula (III), (Illa), (Illb) o (lile) están enlazados entre sí en el extremo 5', y uno o ambos de los extremos 3' se conjugan opcionalmente con un ligando. Cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
Varias publicaciones describen agentes de iARN multiméricos . Las publicaciones incluyen los documentos WO2007/091269, Patente de los Estados Unidos No. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686 , WO2009/014887 y WO2011/031520 cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.
El agente de iARN que contiene conjugaciones de uno o más restos de carbohidratos con un agente de iARN puede optimizar una o más propiedades del agente de iARN. En muchos casos, el resto de carbohidrato estará unido a una subunidad modificada del agente de iARN. Por ejemplo, el azúcar ribosa de una o más subunidades de ribonucleótidos de un agente de ARNdh puede reemplazarse por otro resto, por ejemplo, un portador no carbohidrato (preferiblemente cíclico) al cual se une un ligando de carbohidrato. Una subunidad de ribonucleótidos en la cual el azúcar ribosa de la subunidad se ha reemplazado de este modo se denomina en la presente como una subunidad de modificación de reemplazo de ribosa (SMRR) . Un portador cíclico puede ser un sistema de anillos carbocíclico, es decir, todos los átomos del anillo son átomos de carbono, o un sistema de anillos heterocíclico, es decir, uno o más átomos del anillo pueden ser un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre. El portador cíclico puede ser un sistema de anillos monocíclico, o puede contener dos o más anillos, por ejemplo, anillos fusionados. El portador cíclico puede ser un sistema de anillos completamente saturados, o puede contener uno o más enlaces dobles .
El ligando puede estar unido al polinucleótido a través de un portador. Los portadores incluyen (i) al menos un "punto de unión de estructura principal", preferiblemente dos "puntos de unión de estructura principal" y (ii) al menos un "punto de unión de conexión" . Un "punto de unión a estructura principal" tal como se utiliza en la presente se refiere a un grupo funcional, por ejemplo, un grupo hidroxilo o, generalmente, un enlace disponible para, y que es adecuado para la incorporación del portador en la estructura principal, por ejemplo, el fosfato, o fosfato modificado, por ejemplo, azufre que contiene, estructura principal, de un ácido ribonucleico. Un "punto de unión de conexión" (TAP) en algunas modalidades se refiere a un átomo de anillo constituyente del portador cíclico, por ejemplo, un átomo de carbono o un heteroátomo (distinto de un átomo que proporciona un punto de unión de estructura principal) que conecta un resto seleccionado. El resto puede ser, por ejemplo, un carbohidrato, por ejemplo, monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido y polisacárido . Opcionalmente , el resto seleccionado se conecta mediante una conexión interviniente al portador cíclico. Por lo tanto, el portador cíclico a menudo incluirá un grupo funcional, por ejemplo, un grupo amino, o generalmente proporcionará un enlace que es adecuado para la incorporación o conexión de otra entidad química, por ejemplo, un ligando al anillo constituyente.
Los agentes de iA pueden conjugarse con un ligando mediante un portador, en donde el portador puede ser un grupo cíclico o acíclico; preferiblemente, el grupo cíclico se selecciona de pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, [1, 3] dioxolano, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y decalino; preferiblemente, el grupo acíclico se selecciona de estructura principal de serinol o estructura principal dietanolamina .
En algunas modalidades específicas, el agente de iARN de la invención es un agente que se selecciona del grupo de agentes que figuran en la Tabla 1 y consiste en D1000, D1001, D1002, D1003, D1004, D1005, D1006, D1007, D1008, D1009, D1010, D1011, D1012, D1013, D1014, D1015, D1016, D1017, D1018, D1019, D1020, D1021, D1022, D1023, D1024, D1025, D1026, D1027, D1028, D1029 D1030 D1031, D1032, D1033 D1034 D1035 D1036 D1037, D1038 D1039 D1040 D1041 D1042 D1043 D1044 D1045 D1046, D1047 D1048 D1049 D1050 D1051 D1052 D1053 D1054 D1055, D1056 D1057 D1058 D1059 D1060 D1061 D1062 D1063 D1064, D1065 D1066 D1067 D1068 D1069 D1070 D1071 D1072 D1073, D1074 D1075 D1076 D1077 D1078 D1079 D1080 D1081 D1082 , D1083 D1084 D1085 D1086 D1087 D1088 D1089 D1090 D1091, D1092 D1093 D1094 D1095 D1096 D1097 D1098 D1099 DllOO, D1101 D1102 D1103 D1104 D1105 D1106 D1107 D1108 D1109, DlllO Dllll D1112 D1113 D1114 D1115 D1116 D1117 D1118, D1119 D1120 D1121 D1122 D1123 D1124 D1125 D1126 D1127, D1128 D1129 D1130 D1131 D1132 D1133 D1134 D1135 D1136, D1137 D1138 D1139 D1140 D1141 D1142 D1143 D1144 D1145, D1146 D1147 D1148 D1149 D1150 D1151 D1152 D1153 D1154, D1155 D1156 D1157 D1158 D1159 D1160 D1161 D1162 D1163, D1164 D1165 D1166 D1167 D1168 D1169 D1170 D1171 D1172, D1173 D1174 D1175 D1176 D1177 D1178 D1179 D1180 D1181, D1182 D1183 D1184 D1185 D1186 D1187 D1188 D1189 D1190, D1191 D1192 D1193 D1194 D1195 D1196 D1197 D1198 D1199, D1200 D1201 D1202 D1203 D1204 D1205 D1206 D1207 D1208, D1209 D1210 D1211 D1212 D1213 D1214 D1215 D1216 D1217, D1218 D1219 D1220 D1221 D1222 D1223 D1224 D1225 D1226, D1227 D1228 D1229 D1230 D1231 D1232 D1233 D1234 D1235, D1236 D1237 D1238 D1239 D1240 D1241 D1242 D1243 D1244, D1245 D1246 D1247 D1248 D1249 D1250 D1251 D1252 D1253, D1255, D1256 D1257 D1258 D1259 D1260 D1261 D1262, D1264 D1265 D1266 D1267 D1268 D1269 D1270 D1271, D1273 D1274 D1275 D1276 D1277 D1278 D1279 D1280, D1282 D1283 D1284 D1285 D1286 D1287 D1288 D1289, D1291 D1292 D1293 D1294 D1295 D1296 D1297 D1298, D1300 D1301 D1302 D1303 D1304 D1305 D1306 D1307, D1309 D1310 D1311 D1312 D1313 D1314 D1315 D1316, D1318 D1319 D1320 D1321 D1322 D1323 D1324 D1325, D1327 D1328 D1329 D1330 D1331 D1332 D1333 D1334, D1336 D1337 D1338 D1339 D1340 D1341 D1342 D1343 , D1345, D1346 D1347 D1348 D1349 D1350 D1351 D1352, D1354 D1355 D1356 D1357 D1358 D1359 D1360 D1361, D1363 D1364 D1365 D1366 D1367 D1368 D1369 D1370, D1372, D1373 D1374 D1375 D1376 D1377 D1378 D1379, D1381, D1382 D1383 D1384 D1385 D1386 D1387 D1388, D1390 D1391 D1392 D1393 D1394 D1395 D1396 D1397, D1399 D1400 D1401 D1402 D1403 D1404 D1405 D1406, D1408, D1409 D1410 D1411 D1412 D1413 D1414 D1415, D1417, D1418 D1419 D1420 D1421 D1422 D1423 D1424, D1426, D1427 D1428 D1429 D1430 D1431 D1432 D1433, D1435, D1436 D1437 D1438 D1439 D1440 D1441 D1442 , D1444, D1445 D1446 D1447 D1448 D1449 D1450 D1451, D1453, D1454 D1455 D1456 D1457 D1458 D1459 D1460, D1462, D1463 D1464 D1465 D1466 D1467 D1468 D1469, D1471, D1472 D1473 D1474 D1475 D1476 D1477 D1478 , D1479 D1480 D1481 D1482 D1483 D1484 , D1485 , D1486 , D1487 D1488 D1489 D1490 D1491 D1492 D1493 D1494 D1495 D1496 D1497 D1498 D1499 D1500 D1501 D1502 D1503 D1504 D1505 D1506 D1507 D1508 D1509 D1510 D1511 D1512 D1513 D1514 D1515 D1516 D1517 D1518 D1519 D1520 D1521 D1522 D1523 D1524 D1525 D1526 D1527 D1528 D1529 D1530 D1531 D1532 D1533 D1534 D1535 D1536 D1537 D1538 D1539 D1540 D1541 D1542 D1543 D1544 D1545 D1546 D1547 D1548 D1549 D1550 D1551 D1552 D1553 D1554 D1555 D1556 D1557 D1558 D1559 D1560 D1561 D1562 D1563 D1564 D1565 D1566 D1567 D1568 D1569 D1570 D1571 D1572 D1573 D1574 D1575 D1576 D1577 D1578 D1579 D1580 D1581 D1582 D1583 D1584 D1585 D1586 D1587 D1588 D1589 D1590 D1591 D1592 D1593 D1594 D1595 D1596 D1597 D1598 D1599 D1600 D1601 D1602 D1603 D1604 D1605 D1606 D1607 D1608 D1609 D1610 D1611 D1612 D1613 D1614 D1615 D1616 D1617 D1618 D1619 D1620 D1621 D1622 D1623 D1624 D1625 D1626 D1627 D1628 D1629 D1630 D1631 D1632 D1633 D1634 D1635 D1636 D1637 D1638 D1639 D1640 D1641 D1642 D1643 D1644 D1645 D1646 D1647 D1648 D1649 D1650 D1651 D1652 D1653 D1654 D1655 D1656 D1657 D1658 D1659 D1660 D1661 D1662 D1663 D1664 D1665 D1666 D1667 D1668 D1669 D1670 D1671 D1672 D1673 D1674 D1675 D1676 D1677 D1678 D1679 D1680 D1681 D1682 D1683 D1684 D1685 D1686 D1687 D1688 D1689 D1690 D1691 D1692 D1693 D1694 D1695 D1696 D1697 D1698 D1699 D1700 D1701 D1702 D1703 D1704 , D1705 , D1706 , D1707 , D1708 , D1709 , D1710 , D1711 , D1712 D1713 D1714 D1715 D1716 D1717 D1718 D1719 D1720 D1721 D1722 D1723 D1724 D1725 D1726 D1727 D1728 D1729 D1730 D1731 D1732 D1733 D1734 D1735 D1736 D1737 D1738 D1739 D1740 D1741 D1742 D1743 D1744 D1745 D1746 D1747 D1748 D1749 D1750 D1751 D1752 D1753 D1754 D1755 D1756 D1757 D1758 D1759 D1760 D1761 D1762 D1763 D1764 D1765 D1766 D1767 D1768 D1769 D1770 D1771 D1772 D1773 D1774 D1775 D1776 D1777 D1778 D1779 D1780 D1781 D1782 D1783 D1784 D1785 D1786 D1787 D1788 D1789 D1790 D1791 D1792 D1793 D1794 D1795 D1796 D1797 D1798 D1799 D1800 D1801 D1802 D1803 D1804 D1805 D1806 D1807 D1808 D1809 D1810 D1811 D1812 D1813 D1814 D1815 D1816 D1817 D1818 D1819 D1820 D1821 D1822 D1823 D1824 D1825 D1826 D1827 D1828 D1829 D1830 D1831 D1832 D1833 D1834 D1835 D1836 D1837 D1838 D1839 D1840 D1841 D1842 D1843 D1844 D1845 D1846 D1847 D1848 D1849 D1850 D1851 D1852 D1853 D1854 D1855 D1856 D1857 D1858 D1859 D1860 D1861 D1862 D1863 D1864 D1865 D1866 D1867 D1868 D1869 D1870 D1871 D1872 D1873 D1874 D1875 D1876 D1877 D1878 D1879 D1880 D1881 D1882 D1883 D1884 D1885 D1886 D1887 D1888 D1889 D1890 D1891 D1892 D1893 D1894 D1895 D1896 D1897 D1898 D1899 D1900 D1901 D1902 D1903 D1904 D1905 D1906 D1907 D1908 D1909 D1910 D1911 D1912 D1913 D1914 D1915 D1916 D1917 D1918 D1919 D1920 D1921 D1922 D1923 D1924 D1925 D1926 D1927 D1928 y D2091.
Estos agentes pueden comprender, además, un ligando, tal como un ligando GalNAc.
Ligandos Los agentes de iARN de la invención, por ejemplo, agentes de iARN de doble hebra, pueden estar conjugados opcionalmente a uno o más ligandos. El ligando puede estar unido a la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras, en el extremo 3', extremo 5' o ambos extremos. Por ejemplo, el ligando puede estar conjugado con la hebra sentido. En modalidades preferidas, el ligando se conjuga al extremo 3' de la hebra sentido. En una modalidad preferida, el ligando es un ligando GalNAc. En modalidades particularmente preferidas, el ligando es GalNAc3 : una amplia variedad de entidades pueden acoplarse a los agentes de iARN de la presente invención. Restos preferidos son ligandos, que están acoplados, preferiblemente covalentemente , ya sea directamente o indirectamente a través de una conexión interviniente .
En modalidades preferidas, un ligando altera la distribución, objetivo o vida de la molécula a la cual está incorporada. En modalidades preferidas un ligando proporciona una afinidad mejorada para un objetivo seleccionado, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimiento, receptor, por ejemplo, un compartimiento celular o de órgano, tejido, órgano o región del cuerpo, como, por ejemplo, en comparación con una especie ausente tal como un ligando. Los ligandos que proporcionan afinidad mejorada para un objetivo seleccionado también se denominan ligandos dirigidos.
Algunos ligandos pueden tener propiedades endosomolíticas . Los ligandos endosomolíticos promueven la lisis del endosoma y/o transporte de la composición de la invención, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. El ligando endosomolítico puede ser un péptido polianiónico o peptidomimético que muestra una actividad de membrana dependiente de pH y fusogenecidad. En una modalidad, el ligando endosomolítico asume su conformación activa en el pH endosomal . La conformación "activa" es la conformación en la cual el ligando endosomolítico promueve la lisis del endosoma y/o el transporte de la composición de la invención, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. Ligandos endosomolíticos ejemplares incluyen el péptido GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), el péptido EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118: 1581-1586) y sus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys . Acta, 2002, 1559: 56-68). En una modalidad, el componente endosomolítico puede contener un grupo químico (por ejemplo, un aminoácido) que se someterá a un cambio en la carga o protonación en respuesta a un cambio en el pH. El componente endosomolítico puede ser lineal o ramificado.
Los ligandos pueden mejorar el transporte, hibridación y propiedades de especificidad y pueden mejorar también la resistencia de nucleasa del oligorribonucleótido modificado o natural resultante o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descrita en la presente y/o ribonucleótidos modificados o naturales.
Los ligandos en general pueden incluir modificantes terapéuticos, por ejemplo, para mejorar la captación; compuestos diagnósticos o grupos reporteros por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes de reticulación y restos que confieren resistencia a la nucleasa. Ejemplos generales incluyen lípidos, esteroides, vitaminas, azúcares, proteínas, péptidos, poliaminas e imitaciones de péptidos.
Los ligandos pueden incluir una sustancia natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina) ; un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico) ; o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un ácido de poliamina sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero) . Ejemplos de ácidos de poliamina incluyen ácido de poliamina es una polilisina (PLL) , poli L-ácido aspártico, poli L-ácido glutámico, copolímero de anhídrido de estireno- ácido maleico, copolímero poli (L-láctido-co-glicólido) , copolímero de anhídrido de éter maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil ) metacrilamida (HMPA, por sus siglas en inglés), polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés) , alcohol polivinílico (PVA, por sus siglas en inglés) , poliuretano, poli(2-ácido etilacrílico) , polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina . Ejemplo de poliaminas incluye: polietilenimina, polilisina (PLL) , espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido helicoidal alfa.
Los ligandos también pueden incluir grupos dirigidos, por ejemplo, un agente que se dirige a células o tejido, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico tal como una célula de riñon. Un grupo dirigido puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A tensioactiva, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente , galactosa multivalente , N-acetil-galactosamina, mañosa multivalente de N-acetil-gulucosamina, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transíerrina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, 9 biotina, un péptido RGD, una imitación de un péptido RGD o un aptámero .
Otros ejemplos de ligandos incluyen tintes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas) , reticuladores (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C) , porfirinas (TPPC4, texafirina, Sapphirina) , hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina) , endonucleasas artificiales o un quelante (por ejemplo, EDTA) , moléculas lipofílicas, por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, 1-ácido butírico de pireno, dihidrotestosterona, 1 , 3 -Bis-0 (hexadecil ) glicerol , grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol , borneol, mentol, 1,3-propanediol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03- (oleoil) litocólico, ácido 03-(oleoil) colénico, dimetoxitritilo, o fenoxazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido antennapedia, péptido Tat) , agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K) , MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radioetiquetados , enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina) , facilitadores de transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico) , ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupamientos de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos) , dinitrofenilo, HRP o AP .
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específica tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también incluyen hormonas y receptoras de hormonas. Ellos también pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente , galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, mañosa multivalente de N-acetil-gulucosamina, fucosa multivalente o aptámeros . El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de cinasa p38 MAP o un activador de NF-KB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de iAR en la célula, por ejemplo, mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, por ejemplo, mediante la alteración de los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol , j aplakinólido, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.
El ligando puede aumentar la captación del oligonucleótido en la célula mediante, por ejemplo, la activación de una respuesta inflamatoria. Ligandos ejemplares que tendrían el efecto incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa) , interleuquina- 1 beta o interferón gamma.
En un aspecto, el ligando es un lípido o molécula en base a lípidos. El lípido o molécula a base de lípidos se une preferiblemente a una proteína de suero, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés) . Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido objetivo, por ejemplo, un tejido objetivo no renal del cuerpo. Por ejemplo, el tejido objetivo puede ser el hígado, incluyendo células parenquimales del hígado. Otras moléculas que pueden unirse a HSA también pueden utilizarse como ligandos. Por ejemplo, también puede utilizarse naproxeno o aspirina. Un lípido o ligando en base a lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o transporte en una célula objetivo o membrana celular y/o (c) puede utilizarse para ajustar la unión a una proteína de suero, por ejemplo, HSA.
Un ligando en base a lípidos puede utilizarse para modular, por ejemplo, controlar la unión del conjugado a un tejido objetivo. Por ejemplo, será menos probable que un lípido o ligando en base a lípidos que se une a HSA más fuertemente sea dirigido al riñon y de este modo menos probable que sea eliminado del cuerpo. Un lípido o ligando en base a lípidos que se une a HSA menos fuertemente puede utilizarse para dirigir el conjugado al riñon.
En una modalidad preferida, el ligando en base a lípidos se une a HSA. Preferiblemente, se une a HSA con una afinidad suficiente de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente a un tejido no renal. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión HSA-ligando no pueda revertirse.
En otra modalidad preferida, el ligando en base a lípidos se une a HSA levemente o no se une en absoluto, de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente al riñon. Otros restos que se dirigen a las células de riñon también pueden utilizarse en lugar o además del ligando en base a lípidos .
En otro aspecto, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina, que es captado por una célula objetivo, por ejemplo, una célula proliferante. Estas son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por la proliferación de células no deseadas, por ejemplo, del tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Vitaminas ejemplares incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas ejemplares incluyen vitaminas B, por ejemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por células cancerosas . También se incluyen HAS, lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL) .
En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación de células, preferiblemente un agente de permeación de células helicoidales. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente ejemplar es un péptido tal como tat o antennopedia . Si el agente es un péptido, puede modificarse, incluyendo un peptidomimético, invertómeros , conexiones no peptídicas o pseudo-peptídicas , y el uso de D-aminoácidos . El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que preferiblemente tiene una fase lipofílica y una fase lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en la presente como un oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. El péptido o resto peptidomimético puede ser de aproximadamente 5-50 aminoácido de longitud, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud. Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación de células, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (por ejemplo, que consiste principalmente en Tyr, Trp o Phe) . El resto peptídico puede ser un péptido dendrímero, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS) . Un péptido que contiene MTS hidrófoba ejemplar es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID N0:4) . Un análogo RFGF (por ejemplo, secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP) (SEQ ID NO: 5) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto dirigido. El resto peptídico puede ser un péptido "de suministro", que puede portar moléculas polares grandes, incluyendo péptidos, oligonucleótidos y proteina en las membranas celulares. Por ejemplo, se ha encontrado que las secuencias de la proteína Tat VIH (GRKKRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO: 6) y la proteína Drosophila Antennapedia (RQIKI FQNRRMKWKK) (SEQ ID NO: 7) son capaces de funcionar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede codificarse mediante una secuencia aleatoria de ADN, de modo que un péptido identificado de una biblioteca que expresa bacteriófagos o una biblioteca combinatoria una-perla-un-compuesto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991) . Preferiblemente el péptido o peptidomimético conectado a un agente de iARN a través de una unidad de monómero incorporado es un péptido que se dirige a una célula tal como un péptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) o imitación de RGD. Un resto peptídico puede estar en el intervalo de longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos de péptido pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o dirigir propiedades conformacionales . Puede utilizarse cualquiera de las modificaciones estructurales descritas más adelante. Un resto peptídico RGD puede utilizarse para dirigirse a una célula tumoral, tal como una célula tumoral endotelial o una célula tumoral de cáncer de mama (Zitzmann et al., Cáncer Res., 62:5139-43, 2002). Un péptido RGD puede facilitar el direccionamiento de un agente de iAR a tumores de una variedad de otros te idos, incluyendo el pulmón, riñon, bazo o hígado (Aoki et al., Cáncer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Preferiblemente, el péptido RGD facilitará el direccionamiento de un agente de iARN al riñon. El péptido RGD puede ser lineal o cíclico y se puede modificar, por ejemplo, glicosilar o metilar, para facilitar el direccionamiento a tejidos específicos. Por ejemplo, un péptido RGD glicosilado puede suministrar un agente de iARN a una célula tumoral que expresa avS3 (Haubner et al., Jour. Nucí. Med., 42:326-336, 2001). Pueden utilizarse los péptidos que los marcadores objetivos enriquecieron en células proliferantes. Por ejemplo, el RGD que contiene péptidos y peptidomiméticos puede dirigirse a células cancerosas, en particular células que exhiben una integrina. Por lo tanto, uno puede utilizar péptidos RGD, péptidos cíclicos que contienen RGD, péptidos RGD que incluyen D-aminoácidos , así como imitaciones RGD sintéticas. Además de RGD, uno puede utilizar restos que se dirigen al ligando de integrina. Generalmente, los ligandos pueden utilizarse para controlar células proliferantes y angiogénesis . Conjugados preferidos de este tipo de ligando se dirigen a PECAM-1, VEGF u otro gen canceroso, por ejemplo, un gen canceroso descrito en la presente.
Un "péptido de permeacion celular" es capaz de permear una célula, por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido de permeacion celular microbiana puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropina Pl) , un péptido que contiene un enlace de disulfuro (por ejemplo, o¡ -defensina, ß-defensina o bactenecina) , o un péptido que contiene solamente uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo, PR-39 o indolicidina) . Un péptido de permeacion celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS) . Por ejemplo, un péptido de permeacion celular puede ser un péptido antipático bipartita, tal como MPG, que se deriva del dominio de péptido de fusión de VIH-1 gp41 y la NLS del antígeno T grande SV40 (Simeoni et al., Nucí. Acids Res. 31:2717-2724, 2003) .
En una modalidad, un péptido dirigido puede ser un péptido -helicoidal antipático. Péptidos a-helicoidales antipáticos ejemplares incluyen, a modo no taxativo, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforina, CPF, péptido similar a bombinina (BLP) , catelicidinas, ceratotoxinas , péptidos S. clava, péptidos antimicrobianos intestinales de mixinos (HFIAPs) , magaininas, brevininas-2 , dermaseptinas , melitinas, pleurocidina, péptidos H2A, péptidos Xenopus, esculentinis-1 y caerinas. Una cantidad de factores se considerarán preferiblemente para mantener la integridad de la estabilidad de la hélice. Por ejemplo, se utilizará una cantidad máxima de residuos de estabilización de hélice (por ejemplo, leu, ala o lys) y se utilizará una cantidad mínima de residuos de desestabilización de hélice (por ejemplo, prolina o unidades monoméricas cíclicas) . Se considerará el residuo protector (por ejemplo Gly es un residuo protector de N ejemplar y/o puede utilizarse la amidación del extremo C para proporcionar un enlace H extra para estabilizar la hélice. La formación de puentes salinos entre los residuos con cargas opuestas, separados por las posiciones i ± 3 o i ± 4 pueden proporcionar estabilidad. Por ejemplo, residuos catiónicos tales como lisina, arginina, homo-arginina, ornitina o histidina pueden formar puentes salinos con los residuos aniónicos glutamato o aspartato.
Los ligandos de péptido y peptidomimético incluyen aquellos que tienen péptidos naturales o modificados, por ejemplo, péptidos D o L; péptidos a, ß o ?; péptidos N-metilos; azapéptidos ; péptidos que tienen una o más amidas, es decir, péptido, conexiones reemplazadas con uno o más urea, tiourea, carbamato o conexiones de urea sulfonilo; o péptidos cíclicos .
El ligando dirigido puede ser cualquier ligando que es capaz de dirigirse a un receptor específico. Ejemplos son los siguientes: folato, GalNAc, galactosa, mañosa, manosa-6P, agrupamientos de azúcares tales como agrupamiento de GalNAc, agrupamiento de mañosa, agrupamiento de galactosa o un aptámero. Un agrupamiento es una combinación de dos o más unidades de azúcar. Los ligandos dirigidos también incluyen ligandos del receptor de integrina, ligandos del receptor de quimioquina, transferrina, biotina, ligandos del receptor de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligandos LDL y HDL. Los ligandos también pueden basarse en ácido nucleico, por ejemplo, un aptámero. El aptámero puede no estar modificado o tener cualquier combinación de modificaciones descirbedas en la presente.
Agentes de liberación endosomal incluyen imidazoles, poli u oligoimidazoles, PEIs, péptidos, péptidos fusogénicos, policaboxilatos , policationes , oligo o poli cationes o aniones enmascarados, acétales, poliacetales , cetales/poliacetales , ortoésteres, polímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o no enmascaradas, dendrímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o no enmascaradas .
Modulador FC significa modulador farmacocinético . Moduladores de la FC incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos fosfolípidos , péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas etc. Moduladores de la FC ejemplares incluyen, a modo no taxativo, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos , diacilglicérido, fosfolípidos , esfingolípidos , naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se conoce que los oligonucleótidos que comprenden una cantidad de conexiones de fosforotioato se unen a la proteína de suero, por lo tanto los oligonucleótidos cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples conexiones de fosforotioato en la estructura principal también son abordables para la presente invención como ligandos (por ejemplo, como ligandos moduladores de la FC) .
Además, los aptámeros que se unen a componentes de suero (por ejemplo, proteínas de suero) también son abordables para la presente invención como ligandos moduladores de la FC.
Otros conjugados de ligandos abordables para la invención se describen en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos USSN: 10/916,185, presentada el 10 de agosto de 2004; USSN: 10/946,873, presentada el 21 de setiembre 2004; USSN: 10/833,934, presentada el 3 de agosto de 2007; USSN : 11/115,989 presentada el 27 de abril de 2005 y USSN: 11/944,227 presentada el 21 de noviembre de 2007, que se incorporan a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos .
Cuando dos o más ligandos están presentes, los ligandos pueden tener las mismas propiedades, todos tienen propiedades diferentes o algunos ligandos tienen las mismas propiedades mientras que otros tienen diferentes propiedades. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de direccionamiento, tener actividad endosomolítica o tener propiedades moduladoras FC. En una modalidad preferida, todos los ligandos tienen propiedades diferentes.
Los ligandos pueden acoplarse a los oligonucleótidos en varios lugares, por ejemplo, extremo 3', extremo 5' y/o en una posición interna. En modalidades preferidas, el ligando está unido a los oligonucleótidos a través de una conexión interviniente , por ejemplo, un portador descrito en la presente. El ligando o ligando conectado puede estar presente en un monómero cuando el monómero se incorpora en la hebra en crecimiento. En algunas modalidades, el ligando puede incorporarse a través del acoplamiento a un monómero "precursor" después de que el monómero "precursor" se ha incorporado en la hebra de crecimiento. Por ejemplo, un monómero que tiene, por ejemplo, una conexión amino-terminada (es decir, que tiene un ligando no asociado) , por ejemplo, TAP- (CH2) nNH2 puede incorporarse en una hebra de oligonucleótido de crecimiento. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la hebra, un ligando que tiene un grupo electrofílico, por ejemplo, un éster pentafluorofenilo o grupo aldehido, puede estar unido posteriormente al monómero precursor mediante el acoplamiento del grupo electrofílico del ligando con el grupo nucleofílico de la conexión del monómero precursor.
En otro ejemplo, puede incorporarse un monómero que tiene un grupo químico adecuado para tomar parte en la reacción de una química "clic", por ejemplo, una conexión/enlazante terminado de azida o alquino. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la hebra, un ligando que tiene un grupo químico complementario, por ejemplo, un alquino o azida puede unirse al monómero precursor mediante el acoplamiento del alquino y la azida juntos.
Para los oligonucleótidos de doble hebra, los ligandos pueden unirse a una o ambas hebras. En algunas modalidades, un agente de iARN de doble hebra contiene un ligando conjugado con la hebra sentido. En otras modalidades, un agente de iARN de doble hebra contiene un ligando conjugado con la hebra antisentido.
En algunas modalidades, el ligando puede conjugarse a nucleobases, restos de azúcar o conexiones internucleosídicas de moléculas de ácido nucleico. La conjugación a nucleobases de purina o derivados de las mismas pueden ocurrir en cualquier posición incluyendo, átomos endocíclicos y exocíclicos. En algunas modalidades, las posiciones 2-, 6-, 7- u 8- de una nucleobase de purina se unen a un resto de conjugado. La conjugación a nucleobases de pirimidina o derivados de la misma también puede ocurrir en cualquier posición. En algunas modalidades, las posiciones 2-, 5- y 6-de una nucleobase de pirimidina pueden sustituirse con un resto de conjugado. La conjugación a restos de azúcar de nucleósidos puede ocurrir en cualquier átomo de carbono. Átomos de carbono ejemplares de un resto de azúcar que puede unirse a un resto de conjugado incluyen los átomos de carbono 2', 3' y 5'. La posición 1' también puede unirse a un resto de conjugado, tal como en un residuo abásico. Las conexiones internucleosídicas también pueden contener restos conjugados. Para las conexiones que contienen fósforo (por ejemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditiotato, fosforoamidato y similares) , el resto conjugado puede estar unido directamente al átomo de fósforo o a un átomo 0, N o S unido al átomo de fósforo. Para las conexiones internucleosídicas que contienen amina o amida (por ejemplo, APN) , el resto conjugado puede estar unido al átomo de nitrógeno de la amina o amida o a un átomo de carbono adyacente .
Puede utilizarse cualquier ligando adecuado en el campo de la interferencia de ARN, aunque el ligando es típicamente un carbohidrato, por ejemplo monosacárido (tal como GalNAc) , disacárido, trisacárido, tetrasacárido, polisacárido .
Las conexiones que conjugan el ligando al ácido nucleico incluyen aquellas descritas anteriormente. Por ejemplo, el ligando puede ser uno o más derivados de GalNAc (N-acetilglucosamina) unidos a través de enlazantes ramificados bivalentes o trivalentes.
En una modalidad, el ARNdh de la invención está conjugado con enlazantes ramificados bivalentes y trivalentes incluyen las estructuras que se muestran en cualquiera de las fórmulas (IV) - (VII) : Fómiula (VII) en donde : q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente para cada caso 0-20 y en donde la unidad de repetición puede ser la misma o diferente; p2A p2B p3A p3B p4A p4B p5A p5B p5C rp2A ,--2B IJI3A ,p3B T4A, T4B, T4A, T5B, T5C son cada una independientemente para cada caso ausente, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH o CH20; Q2\ Q2B / Q3\ Q3B Q A Q4B, Q5\ Q5B, Q5C son independientemente para cada caso ausente, alquileno, alquileno sustituido en donde uno o más metilenos pueden interrumpirse o terminarse por uno o más de 0, S, S(O) , S02, N(RN) , C ( R ' ) =C(R' ' ) , C=C o C ( 0 ) ; R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B , R5A, R5B, R5C son cada uno independientemente para cada caso ausente, NH , 0, S, CH2, C(0)0, C(0)NH, NHCH ( R ) C ( O ) , - C ( O ) - CH ( Ra ) - NH - , o heterociclilo; L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando; es decir, cada uno independientemente para cada caso un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tet rasacár ido , ol igosacár ido o polisacárido ; y Ra es H o una cadena lateral de aminoácidos.
Los derivados de GalNAc de conjugación trivalentes son particularmente útiles para su uso con agentes de iARN para inhibir la expresión de un gen objetivo, tal como aquellos de la fórmula (VII) : Fórmula VH) en donde L , L y L representan un monosacárido, tal como un derivado de GalNAc .
Ejemplos de derivados de GalNAc que conjugan grupos enlazantes ramificados bivalentes y trivalentes adecuados incluyen, a modo no taxativo, los siguientes compuestos: ?? En otras modalidades, el agente de iARN de la invención es un agente seleccionado del grupo que consiste en AD-45163, AD-45165, AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547.
III. Composiciones farmacéuticas Los agentes de iARN de la invención pueden formularse para administración en cualquier forma conveniente para su uso en medicamentos para humanos o animales, por analogía con otros productos farmacéuticos. Las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes de iARN de la invención pueden ser, por ejemplo, soluciones con o sin un amortiguador o composiciones que contienen portadores farmacéuticamente aceptables. Las composiciones incluyen, por ejemplo, composiciones acuosas o cristalinas, formulaciones liposomales, formulaciones micelares, emulsiones y vectores para terapia de genes .
En los métodos de la invención, el agente de iARN puede administrarse en una solución. Un agente de iARN libre puede administrarse en una solución sin amortiguar, por ejemplo, en solución salina o en agua. Alternativamente, el ARNip libre puede administrarse también en una solución amortiguadora adecuada. La solución amortiguadora puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad preferida, la solución amortiguadora es solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El pH y la osmolaridad de la solución amortiguadora que contiene el agente de iARN pueden ajustarse de manera tal que sea adecuado para administrar a un sujeto.
En algunas modalidades, la solución amortiguadora comprende además un agente para controlar la osmolaridad de la solución, de forma tal que la osmolaridad se mantenga en un valor deseado, por ejemplo, en los valores fisiológicos del plasma humano. Las solutos que pueden agregarse a la solución amortiguadora para controlar la osmolaridad incluyen, a modo no taxativo, proteínas, péptidos, aminoácidos, polímeros no metabolizados , vitaminas, iones, azúcares, metabolitos, ácidos orgánicos, lípidos o sales. En algunas modalidades, el agente para controlar la osmolaridad de la solución es una sal. En ciertas modalidades, el agente para controlar la osmolaridad de la solución es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En otras modalidades, el agente de iARN se formula como una composición que incluye uno o más agentes de iARN y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de retraso de absorción e isotónicos y similares, que sean compatibles con la administración farmacéutica. El uso de los medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones de la invención. Los compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones.
En una modalidad, la preparación del agente de iAR incluye al menos un segundo agente terapéutico (por ejemplo, un agente que no sea un ARN o un ADN) . Por ejemplo, la composición del agente de iARN para el tratamiento de una enfermedad asociada con la TTR, por ejemplo, una amiloidosis hereditaria relacionada con la transtiretina (polineuropatía amiloidótica familiar, PAF) , puede incluir un fármaco conocido para la mejora de la PAF, por ejemplo, Tafamidis (INN, o FX-1006A o Vyndaqel) .
Una composición del agente de iARN formulada puede asumir una variedad de estados. En algunos ejemplos, la composición es al menos parcialmente cristalina, uniformemente cristalina y/o anhidra (por ejemplo, contiene menos de 80, 50, 30, 20 o 10% de agua). En otro ejemplo, el agente de iARN se encuentra en una fase acuosa, por ejemplo, en una solución que incluye agua.
La fase acuosa o las composiciones cristalinas pueden incorporarse a un vehículo de administración, por ejemplo, un liposoma (particularmente para la fase acuosa) o una partícula (por ejemplo, una micropartícula que puede ser apropiada para una composición cristalina) . En general, la composición del agente de iARN se formula de forma tal que sea compatible con el método pretendido de administración, tal como se describe en la presente. Por ejemplo, en modalidades particulares, la composición se prepara mediante al menos uno de los siguientes métodos: secado por pulverización, liofilización, secado al vacío, evaporación, secado en lecho fluido o una combinación de estas técnicas; o sonicación con un lípido, secado por congelación, condensación y otro autoensamblado .
Una preparación de un agente de iARN puede formularse en combinación con otro agente, por ejemplo, otro agente terapéutico o un agente que estabiliza un agente de iARN, por ejemplo, una proteína que forma un ejemplo con agente de iARN para formar un RNPi . Otros agentes adicionales incluyen quelantes, por ejemplo, EDTA (por ejemplo, para quitar cationes divalentes tales como Mg2+) , sales, inhibidores de RNasa tales como R Asin) , etc.
En una modalidad, la preparación del agente de iARN incluye otro compuestos de AR ip, por ejemplo, un segundo agente de iARN que puede mediar iARN con respecto a un segundo gen, o con respecto al mismo gen. Otras preparaciones adicionales pueden incluir al menos 3, 5, diez, veinte, cincuenta o cien o más especies de agente de iARN diferentes. Los agentes de iARN pueden mediar la iARN con respecto a un número similar de genes diferentes.
Los agentes de iARN de la invención pueden formularse para uso farmacéutico. Las composiciones farmacéuticamente aceptables comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más de los agentes de ARNdh en cualquiera de las modalidades precedentes, cuando se toman solas o se formulan junto con uno o más de portadores (aditivos) , excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables .
Los métodos para preparar composiciones farmacéuticas de la invención incluyen la etapa de asociar un agente de iARN de la presente invención con el portador y, opcionalmente , uno o más ingredientes secundarios. En general, las composiciones se preparan asociando de manera uniforme y profunda un agente de iARN de la presente invención con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y luego, si es necesario, dar forma al producto.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse específicamente para administración en forma sólida o líquida, incluidas aquellas adaptadas para los siguiente casos: (1) administración oral, por ejemplo, líquidos para emparar (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, por ejemplo, aquellas dirigidas a absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa o inyección epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril o formulación de liberación sostenida; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o parche de liberación controlada o pulverización aplicada a la piel; (4) por vía intravaginal o intrarrectal , por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; (5) por vía sublingual; (6) por vía ocular; (7) por vía transdérmica; o (8) nasal. La administración mediante el uso de métodos subcutáneos o intravenosos puede ser particularmente ventajosa.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de una opinión médica sólida, son adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivos u otro problema o complicación, proporcionales con la relación beneficio/riesgo.
La frase "portador farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en la presente, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, asistente de fabricación (por ejemplo, lubricante, magnesio de talco, calcio o estearato de cinc o ácido estérico) , o un material que encapsula un disolvente, que participa en el transporte del compuesto en cuestión de un órgano o porción del cuerpo a otro órgano o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido que es compatible con los otros ingredientes de las composiciones y no es perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etil celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; (9) aceites, tales como aceite de maní, aceite de colza, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol ; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y poletilenglicol ; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones amortiguadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos ; (22) agentes espesantes, tales como polipéptidos y aminoácidos (23) componente de suero, tales como albúmina de suero, HDL y LDL; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en composiciones farmacéuticas.
Las composiciones pueden presentarse, de manera conveniente, en una forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de agente de iARN que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. El agente de iARN que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación única generalmente será la cantidad del agente de iARN que produce un efecto deseado, por ejemplo, un efecto terapéutico o profiláctico. En general, de un cien por ciento, esta cantidad estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de agente de iARN, preferiblemente de aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente 10 por ciento a aproximadamente 30 por ciento.
En ciertas modalidades, una composición de la presente invención comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste en ciclodextrinas , celulosas, liposomas, agentes de formación de micelas, por ejemplo, ácidos biliares y portadores poliméricos, por ejemplo, poliésteres y polianhidridos ; y un agente de iAR de la presente invención. En ciertas modalidades, una composición mencionada anteriormente hace que un agente de iARN de la presente invención esté biodisponible oralmente.
En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un agente de iARN, es deseable ralentizar la absorción del agente a partir de una inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse por medio del uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La tasa de absorción del agente de iARN depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de agente de iARN administrada parenteralmente puede lograrse disolviendo o suspendiendo el agente en un vehículo oleoso.
Liposomas Un agente de iARN de la invención puede formularse para administración en un ensamblado molecular membranoso, por ejemplo, un liposoma o una micela. Tal como se utiliza en la presente, el término "liposoma" se refiere a una vesícula de lípidos anfílicos dispuestos en al menos una bicapa, por ejemplo, una bicapa o una pluralidad de bicapas. Los liposomas incluyen vesículas unilamerales o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición del agente de iARN. El material lipolífico aisla el interior acuoso de un exterior acuoso, que normalmente no incluye la composición del agente de iARN, a pesar de que en algunos ejemplos, puede hacerlo. Los liposomas son útiles para la transferencia y administración de ingredientes activos al sitio de acción. Dado que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican los liposomas a un tejido, la bicapa liposomal se fusiona con la bicapa de las membranas celulares. A medida que avanza la fusión del liposoma y la célula, el contenido acuoso interno que incluye el agente de iARN se administra a la célula donde el agente de iARN puede unirse específicamente con un ARN objetivo y puede mediar iARN. En algunos casos, los liposomas también están específicamente dirigidos, por ejemplo, para dirigir el agente de iARN a tipos de células particulares.
Un liposoma contiene un agente de iARN que puede prepararse mediante una variedad de métodos. En un ejemplo, el componente lípido de un liposoma se disuelve en un detergente de forma que se formen micelas con el componente líquido. Por ejemplo, el componente lípido puede ser un lípido catiónico anfipático o un conjugado lípido. El detergente puede tener una concentración de micelas crítica y puede ser no iónico. Detergentes ejemplares incluyen colato, octilglucósido, desoxicolato y lauroil sarcosina. La preparación de agente de iARN se agrega luego a las micelas que incluyen el componente lípido. Los grupos catiónicos en el lípido interactúan con el agente de iARN y se condensan alrededor del agente de iARN para formar un liposoma. Después de la condensación, se quita el detergente, por ejemplo, mediante diálisis, para proporcionar una preparación liposomal de agente de iARN.
En caso de que sea necesario, un compuesto portador que asiste en la condensación puede agregarse durante la reacción de condensación, por ejemplo, mediante adición controlada. Por ejemplo, el compuesto portador puede ser un polímero que no sea un ácido nucleico (por ejemplo, espermina o espermidina) . El pH también puede ajustarse para favorecer la condensación.
Los métodos para la producción de vehículos de administración de polinucleótidos estables, que incorporan un complejo de polinucleótidos/lípidos catiónicos como componentes estructurales del vehículo de administración, se describen además, por ejemplo, en el documento WO 96/37194, cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de referencia. La formación de liposomas también puede incluir uno o más aspectos de métodos ejemplares descritos en Felgner, P. L. et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , Estados Unidos 8:7413-7417, 1987; Pat . de los Estados Unidos No. 4,897,355; Patente de los Estados Unidos No. 5,171,678; Bangham, et al. M. Mol. Biol . 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; y Fukunaga, et al. Endocrinol . 115:757, 1984. Las técnicas comúnmente utilizadas para preparar aglomerados lípidos de tamaño apropiado para utilizar como vehículos de administración incluyen sonicación y congelado-descongelado más extrusión (ver, por ejemplo, Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986) . Se puede utilizar microfluidización cuando se deseen aglomerados consistentemente pequeños (50 a 200 nm) y relativamente uniformes (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Estos métodos se adaptan fácilmente al empaquetado de las preparaciones de agente de iAR en liposomas .
Los liposomas que son sensibles al pH o de carga negativa atrapan a las moléculas de ácidos nucleicos en vez de formar complejos con éstos. Dado que tanto las moléculas de ácidos nucleicos como el lípido tienen carga similar, ocurre repulsión en vez de formación de complejos. Sin embargo, parte de las moléculas de ácidos nucleicos son atrapadas dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles a pH se han utilizado para administrar el ADN que codifica el gen de cinasa de timidina a monocapas celulares en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células objetivo (Zhou et al., Journal of Controlled Reléase, 19, (1992) 269-274) .
Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos que no sean fosfatidilcolina derivada de medios naturales. Las composiciones de los liposomas neutros, por ejemplo, pueden formarse de fosfatidilcolina de dimiristoilo (DMPC) o fosfatidilcolina de dipalmitoilo (DPPC) . Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman de fosfatidilglicerol de dimiristoilo, mientras que liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente de fosfatidiletanolamina de dioleoilo (DOPE) . Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Ejemplos de otros métodos para introducir liposomas en células in vitro e in vivo incluyen la Pat . de los Estados Unidos No. 5,283,185; la Pat. de los Estados Unidos No. 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Nati. Acad. Sci . 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; y Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
En una modalidad, se utilizan liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse con la membrana celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficientemente con la membrana de plasma, son captados por los macrofagos in vivo y pueden utilizarse para administrar agentes de iARN a macrofagos .
Otras ventajas de liposomas incluyen: los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables ; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger los agentes de iARN encapsulados en sus compartimientos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff , en "Pharmaceutical Dosage Forms, 11 Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volumen 1, pág. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga de la superficie de lípidos, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas .
Un lípido catiónico sintético de carga positiva, cloruro de N- [1- (2 , 3-dioleiloxi) ropil] -N, N, -trimetilamonio (DOTMA) , puede utilizarse para formar pequeños liposomas que interactúan de manera espontánea con el ácido nucleico para formar complejos de lípidos-ácidos nucleicos que son capaces de fusionarse con los lípidos de carga negativa de las membranas celulares de células de cultivo tisular, resultando en la administración de un agente de iARN (ver, por ejemplo, Felgner, P. L. efc al., Proc . Nati. Acad. Sci . , Estados Unidos 8:7413-7417, 1987 y la Pat . de los Estados Unidos No. 4,897,355 para una descripción de DOTMA y su uso con ADN) .
Un análogo de DOTMA, 1, 2-bis (oleoiloxi) -3- (trimetilamonio) ropano (DOTAP) , puede utilizarse en combinación con un fosfolípido para formar vesículas que forman complejos con ADN. Lipofectin™ de Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md. es un agente efectivo para la administración de ácidos nucleicos a células de cultivo de tejido que comprenden liposomas de DOTMA con carga positiva que interactúan espontáneamente con polinucleótidos de caga negativa para formar complejos. Cuando se utilizan suficientes liposomas con carga positiva, la carga neta en los complejos resultantes es positiva. Los complejos de carga positiva preparados de este modo se unen de manera espontánea a las superficies celulares de carga negativa, se fusionan con la membrana de plasma y entregan los ácidos nucleicos funcionales a, por ejemplo, células de cultivo de tejido. Otro lípido catiónico disponible en el mercado, 1,2- bis (oleoiloxi) -3,3- (trimetilamonio) ropano ( "DOTAP" ) (Boehringer Mannheim, Indianápolis , Indiana) difiere de DOTMA en que los restos de oleilo están unidos por éster, en vez de por conexiones de éter.
Otros compuestos lipidíeos catiónicos reportados incluyen aquellos que se han conjugado con una variedad de restos que incluyen, por ejemplo, la carboxiespermina que se ha conjugado con uno de dos tipos de lípidos e incluye compuestos tales como 5 -carboxiespermilglicina dioctaoleoilamida ("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) y dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermil-amida ("DPPES") (ver, por ejemplo, la Pat . de los Estados Unidos No. 5,171,678).
Otro conjugado lípido catiónico incluye la derivatización del lípido con colesterol ("DC-Col") que se ha formulado en liposomas en combinación con DOPE (Ver Gao, X. y Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Se ha informado que la lipopolilisina, realizada conjugando la polilisina con DOPE, es efectiva para la transfección en presencia de suero (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Para ciertas líneas celulares, se dice que estos liposomas que contienen lípidos catiónicos exhiben toxicidad y proporcionan una transfección más eficiente que las composiciones que contienen DOTMA. Otros productos lípidos catiónicos disponibles en el mercado incluyen DMRIE y D RIE-HP (Vical, La Jolla, California) y Lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland) . Otros lípidos catiónicos adecuados para la administración de oligonucleótidos se describen en el documento O 98/39359 y WO 96/37194.
Las formulaciones liposomales son particularmente adecuadas para administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Las ventajas incluyen menos efectos secundarios relacionados con la absorción sistémica alta del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en el objetivo deseado y la capacidad de administrar un agente de iARN a la piel. En algunas implementaciones, los liposomas se utilizan para administrar el agente de iARN a células epidérmicas y también para mejorar la penetración del agente de iARN a los tejidos dérmicos, por ejemplo, a la piel. Por ejemplo, los liposomas pueden aplicarse tópicamente. La administración tópica de los fármacos como liposomas a la piel se ha documentado (ver, por ejemplo, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol . 2,405-410 y du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. y Fould-Fogerite , S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz . 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. y Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. y Huang, L., Proc . Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 84:7851-7855, 1987).
Los sistemas liposomales no iónicos también han sido examinados para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol . Las formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) y Novasome II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) se utilizaron para administrar un fármaco a la dermis de la piel de ratón. Las formulaciones con el agente de iAR son útiles para tratar un trastorno dermatológico .
Los liposomas que incluyen un agente de iARN pueden hacerse altamente deformables. La deformabilidad puede hacer que los liposomas penetren a través de los poros que son más pequeños que el radio promedio del liposoma. Por ejemplo, las transferosomas son un tipo de liposomas deformables. Los transferosomas pueden hacerse agregando activadores de borde de superficie, normalmente tensioactivos , a una composición liposomal estándar. Los transferosomas que incluyen el agente de iARN pueden administrarse, por ejemplo, por vía subcutánea por infección con el fin de administrar un agente de iARN a queratinocitos en la piel. Para cruzar la piel de mamífero intacta, las vesículas lipídicas pasan a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro de menos de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Adicionalmente, debido a las propiedades lipídicas, estas transferosomas pueden autooptimizarse (adaptables a la forma de los poros, por ejemplo, en la piel) , autorrepararse y pueden frecuentemente alcanzar sus objetivos sin fragmentarse, y a menudo pueden ser autocargables .
Otras formulaciones aplicables a la presente invención se describen en las solicitudes provisionales de los Estados Unidos Nos. de serie: 61/018,616, presentada el 2 de enero de 2008; 61/018,611, presentada el 2 de enero de 2008; 61/039,748, presentada el 26 de marzo de 2008; 61/047,087, presentada el 22 de abril de 2008 y 61/051,528, presentada el 8 de mayo de 2008. La solicitud PCT no. PCT/US2007/080331 , presentada el 3 de octubre de 2007 también describe formulaciones que son aplicables a la presente invención.
Tensioactivos Los tensioactivos tienen un amplio campo de aplicabilidad en formulaciones tales como emulsiones (incluidas las microemulsiones) y liposomas (ver anteriormente) . Las composiciones de agente de iARN (o un precursor, por ejemplo un ARNidh que se puede procesar para obtener ARNip, o un ADN que codifica un precursor de AR ip) pueden incluir un tensioactivo . En una modalidad, el ARNip se formula como una emulsión que incluye un tensioactivo. La forma más común de clasificar y jerarquizar las propiedades de muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, consiste en utilizar el balance de hidrófilos/lipófilos (BHL) . La naturaleza del grupo hidrófilo proporciona el medio más útil para categorizar los distintos tensioactivos utilizados en formulaciones (Rieger, en "Pharmaceutical Dosage Forms," Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, 1988, pág. 285) .
Si la molécula tensioactiva no se ioniza, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos tienen un amplio campo de aplicabilidad en productos farmacéuticos y se pueden utilizar en un gran intervalo de valores de pH. En general, sus valores de BHL varían de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol , ésteres de propilenglicol , ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitol, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Los alcanolamidas y éteres no iónicos tales como etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilados y polímeros de bloques etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los integrantes más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula tensioactiva contiene una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, acil lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como alquil sulfatos y alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquilbenceno, acil isetionatos, acil tauratos y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos anióicos son los alquil sulfatos y los jabones.
Si la molécula tensioactiva contiene una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternarias y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternarias son los miembros más utilizados de esta clase.
Si la molécula tensioactiva tiene la capacidad para cargar ya sea una carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica como anfotero. Los tensioactivos anfoteros incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
El uso de tensioactivos en productos, formulaciones y emulsiones farmacéuticas ha sido reseñado (Rieger, en " Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, 1988, pág. 285) .
Micelas y otras formulaciones membranosas Los agentes de iARN de la invención también se pueden proporcionar como formulaciones de micelas. Las "micelas" se definen por la presente como un tipo particular de montaje molecular en el cual las moléculas anfipáticas se disponen en una estructura esférica, de forma que todas las porciones hidrófobas de las moléculas quedan dispuestas hacia adentro, con las porciones hidrófilas en contacto con la fase acuosa que lo rodea. Se produce un montaje inverso si el entorno es hidrófobo .
Se puede preparar una formulación de micelas mixta adecuada para administrarse a través de membranas transdérmicas al mezclar una solución acuosa de la composición de ARNip, un alquil sulfato de metal alcalino de C8 a C22 y un compuesto formador de micelas . Entre los ejemplos de compuestos formadores de micelas se incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de manzanilla, extracto de pepino, acido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monoleína, monoleatos, monolauratos, aceite de borrajas, aceite de onagra, mentol, trihidroxi oxo colanil glicina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleina, éteres de polioxietileno y análogos de los mismos, éteres de polidocanol alquilo y análogos, quenodesoxicolato, desoxicolato y sus mezclas . Los compuestos formadores de micelas se pueden agregar al mismo tiempo o después de agregar el alquilsulfato de metal alcalino. Las micelas mixtas se formarán básicamente con cualquier tipo de mezcla de ingredientes pero debe producirse un mezclado vigoroso para lograr micelas más pequeñas .
En un primer método se prepara una primera composición de micelas que contiene la composición de AR ip y al menos el alquilsulfato de metal alcalino. La primera composición de micelas se mezcla entonces con al menos tres compuestos formadores de micelas para formar una composición de micelas mixtas. En otro método, la composición de micelas se prepara al mezclar la composición de ARNip, el alquilsulfato de metal alcalino y al menos uno de los compuestos formadores de micelas, seguido de la incorporación del resto de los compuestos formadores de micelas, con un mezclado vigoroso.
Se puede agregar fenol y/o m-cresol a la composición de micelas mixta para estabilizar la formulación y protegerla contra el crecimiento de bacterias. Alternativamente, el fenol y/o el m-cresol se pueden agregar con los ingredientes formadores de micelas. Un agente isotónico tal como glicerina también se puede agregar luego de la formación de la composición de micelas mixta.
Para administrar la formulación de micelas como pulverización, la formulación se puede introducir en un dispensador de aerosol, y el dispensador se carga con propulsor. El propulsor, que está bajo presión, se encuentra en forma líquida en el dispensador. La relaciones entre los ingredientes se ajustan de forma que las fases acuosa y propulsora se conviertan en una, es decir, que haya una sola fase. Si hay dos fases, es necesario agitar el dispensador antes de dispensar una porción del contenido, por ejemplo, a través de una válvula medida. La dosis dispensada de agente farmacéutico es propulsada desde la válvula medida en una pulverización fina.
Los propulsores pueden incluir clorofluorocarbonos que contengan hidrógeno, fluorocarbonos que contengan hidrógeno, éter dimetílico y éter dietílico. En ciertas modalidades se puede utilizar HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetano) .
Las concentraciones específicas de los ingredientes esenciales se pueden determinar mediante experimentación relativamente sencilla. Para la absorción a través de las cavidades orales, suele ser deseable aumentar, por ejemplo, al menos duplicar o triplicar, la dosis que se utiliza para la inyección o administración a través del tracto intestinal.
Partículas En otra modalidad, un agente iAR de la invención se puede incorporar en una partícula, por ejemplo, una micropartícula . Las micropartículas se pueden producir mediante secado por pulverizado, pero se pueden producir también por otros métodos que incluyen la liofilización, evaporación, secado por lecho fluidizado, secado al vacío o una combinación de las técnicas.
IV. Métodos para inhibir la expresión de TTR La presente invención también proporciona métodos para inhibir la expresión de una transtiretina (TTR) en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto una célula con un agente de iAR , por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra, en una cantidad suficiente para inhibir la expresión de TTR en la célula y, por lo tanto, inhibir la expresión de TTR en la célula.
Poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble hebra, puede realizarse in vi ro o in vivo. Poner en contacto una célula in vivo con el agente de iARN comprende poner en contacto una célula o grupo de células dentro de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, con el agente de iARN. Las combinaciones de métodos in vitro e in vivo para poner en contacto una célula también son posibles. Poner en contacto una célula puede ser un proceso directo o indirecto, tal y como se describió anteriormente. Además, el contacto de una célula se puede lograr dirigiéndose a un ligando, incluido cualquier ligando descrito en la presente o conocido en la técnica. En modalidades preferidas, el ligando de direccionamiento es un resto de carbohidratos, por ejemplo un ligando GalNAc3 o cualquier otro ligando que dirija el agente de iARN al sitio de interés, por ejemplo, el hígado del sujeto.
El término "inhibir", tal como se utiliza en la presente, se utiliza indistintamente con "reducir", "silenciar", "regular por disminución", "eliminar" y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
La frase "inhibir la expresión de un TTR" se refiere a la inhibición de la expresión de cualquier gen de la TTR (tal como, por ejemplo, un gen TTR de ratón, un gen de la TTR de rata, un gen de la TTR de ratón o un gen de la TTR humana) , así como las variantes o mutantes de un gen de la TTR. Por lo tanto, el gen de la TTR puede ser un gen de la TTR natural, un gen de la TTR mutante (como ser un gen de la TTR mutante que dé lugar a una deposición amiloide) o un gen de la TTR transgénico en el contexto de una célula, grupo de células u organismo manipulado genéticamente.
"Expresión inhibidora de un gen de la TTR" incluye cualquier nivel de inhibición de un gen de la TTR, por ejemplo, al menos una eliminación parcial de la expresión de un gen de la TTR. La expresión del gen de la TTR se puede evaluar en relación al nivel o cambio en el nivel de cualquier variable asociada con la expresión genética de la TTR, por ejemplo, nivel de ARNm de la TTR, nivel proteico de la TTR o el número o extensión de los depósitos amiloides. Este nivel se puede evaluar en una célula individual o en un grupo de células, incluida, por ejemplo, una muestra extraída de un sujeto.
La inhibición se puede evaluar mediante un descenso en el nivel absoluto o relativo de una o más variables asociadas con la expresión de la TTR, comparado con un nivel de control El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utilice en la técnica, por ejemplo, nivel de base de referencia predosis o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula o muestra similar que no haya sido tratado o que haya sido tratado con un testigo (como ser, por ejemplo, testigo únicamente de amortiguador o testigo de agente inactivo) .
En algunas modalidades de los métodos de la invención, la expresión de un gen de la TTR es inhibida al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99%.
La inhibición de la expresión de un gen de la TTR se puede manifestar mediante una reducción de la cantidad de ARNm expresado por una primera célula o grupo de células (las células pueden estar presentes, por ejemplo, en una muestra extraída de un sujeto) en el cual un gen de la TTR se transcribe y que se trata o se ha tratado (por ejemplo, mediante el contacto de la célula o células con un agente de iAR de la invención, o mediante la administración de un agente de iARN de la invención a un sujeto en el que las células están o estuvieron presentes) de forma que la expresión de un gen de la TTR se vea inhibida, en comparación con un segundo grupo de células básicamente idénticas a la primera célula o grupo de células, pero que no ha o han sido tratados (célula (s) testigo). En modalidades preferidas, la inhibición se evalúa mediante la expresión del nivel de ARNm en células tratadas como porcentaje del nivel de ARNm en células testigo, mediante el uso de la siguiente fórmula: (ARNm en células testigo) - (ARNm en células Hatadas) — : · 100% (ARNm en células testigo) Alternativamente, la inhibición de la expresión de un gen de la TTR se puede evaluar en términos de una reducción de un parámetro ligado f ncionalmente a la expresión genética de la TTR, por ejemplo, expresión proteica de la TTR, nivel de proteína de unión de retinol, nivel de vitamina A o presencia de depósitos amiloides que comprendan TTR. El silenciamiento del gen de la TTR puede determinarse en cualquier célula que exprese TTR, ya sea constitutivamente o mediante ingeniería genómica, y por cualquier ensayo conocido en la técnica. El hígado es el mayor sitio de expresión de la TTR. Otros sitios significativos de expresión incluyen el plexo coroideo, la retina y el páncreas.
La inhibición de la expresión de una proteína TTR se puede manifestar mediante una reducción en el nivel de la proteína TTR que es expresada por una célula o grupo de células (por ejemplo, el nivel de proteína expresada en una muestra extraída de un sujeto) . Como se explicó anteriormente para la evaluación de la eliminación de AR m, la inhibición de los niveles de expresión proteica en una célula o grupo de células tratadas puede expresarse de forma similar al porcentaje del nivel de proteína en una célula o grupo de células testigo.
Se puede utilizar una célula o un grupo de células testigo para evaluar la inhibición de la expresión de un gen de la TTR, e incluye una célula o grupo de células que no se ha puesto en contacto aún con un agente de iARN de la invención. Por ejemplo, la célula o grupo de células testigo se puede extraer de un sujeto individual (por ejemplo, un sujeto humano o animal) previo al tratamiento del sujeto con un agente de iARN.
El nivel de ARNm de la TTR expresado por una célula o grupo de células, o el nivel de ARNm de la TTR en circulación se puede determinar mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica para evaluar la expresión de ARNm. En una modalidad, el nivel de expresión de la TTR en una muestra se determina mediante la detección de un polinucleótido transcrito, o una porción de él, por ejemplo, ARNm del gen de la TTR. Se puede extraer el ARN de las células mediante técnicas de extracción de ARN que incluyen, por ejemplo, el uso de extracción ácida por isotiocianato de fenol/guanidina (ARNzol B; Biogénesis) , kits de preparación de ARN RNeasy (Qiagen) o PAXgene (PreAnalytix, Suiza) . Los formatos típicos de ensayos que utilizan hibridación de ácido ribonucleico incluyen ensayos de ejecución nuclear (Melton et al., Muc . Acids Res. 12:7035), transferencia Northern, hibridación in situ y análisis de microarreglo . El ARNm de TTR en circulación se puede detectar mediante el uso de métodos descritos en PCT/US2012/043584 , cuyo contenido completo se incorpora a la presente a modo de referencia.
En una modalidad, el nivel de expresión de la TTR se determina mediante el uso de una sonda de ácido nucleico. El término "sonda", tal como se utiliza en la presente se refiere a cualquier molécula capaz de enlazarse selectivamente a una TTR específica. Un experto en la técnica puede sintetizar una sonda, o derivarla de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas se pueden diseñar específicamente para ser etiquetadas. Los ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas incluyen, a modo no taxativo, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas .
El ARNm aislado se puede utilizar en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, a modo no taxativo, análisis Southern y Northern, análisis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) y arreglos de sondas. Un método para la determinación de los niveles de ARNm involucra el contacto del ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se puede hibridar a ARNm de TTR. En una modalidad, el ARNm se inmoviliza en una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo al introducir el ARNm aislado en un gel de agarosa y transferir el ARNm del gel a una membrana, como ser nitrocelulosa . En una modalidad alternativa, la(s) sonda (s) se inmoviliza (n) en una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la(s) sonda (s), por ejemplo, en un arreglo de chip de genes Affymetrix. El experto en la materia puede adaptar fácilmente los métodos conocidos de detección de ARNm para su uso a la hora de determinar el nivel de ARNm de TTR.
Un método alternativo para determinar el nivel de expresión de la TTR en una muestra involucra el proceso de amplificación de ácido nucleico y/o trasncriptasa inversa (para preparar ADNc) o por ejemplo ARNm en la muestra, por ejemplo, mediante RT-PCR (la modalidad experimental presentada en Mullís, 1987, Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202), reacción en cadena de ligasa (Barany (1991) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88:189-193), autorreplicación de secuencia sostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi et al. (1988) Bio/'Technology 6:1197), replicación de círculo rodante (Lizardi et al., Pat . de los Estados Unidos No. 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas mediante el uso de técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si las moléculas están presentes en cantidades muy bajas. En aspectos particulares de la invención, el nivel de expresión de la TTR se determina mediante RT-PCR fluorogénica cuantitativa (es decir, el sistema TaqMan™) .
Los niveles de expresión de ARNm de la TTR se pueden monitorear mediante el uso de una transferencia de membrana (tal como la que se utiliza en análisis de hibridación tales como Northern, Southern, de punto y similares) o micropocillos , tubos de ensayo, geles, perlas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprende ácidos nucleicos unidos). Ver las Pat . de los Estados Unidos Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 y 5,445,934, que se incorporan a la presente a modo de referencia. La determinación de la expresión del nivel de la TTR también puede comprender el uso de sondas de ácido nucleico en solución .
En modalidades preferidas, el nivel de la expresión de ARNm se evalúa mediante el uso de ensayos de ADN ramificado o PCR en tiempo real (qPCR) . El uso de estos métodos se describe y ejemplifica en los Ejemplos presentados en la presente .
El nivel de expresión de la proteína TTR se puede determinar mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica para la medición de niveles de proteína. Los métodos incluyen, por ejemplo, electrofóresis , electrofóresis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) , cromatografía en capa fina (TLC) , cromatografía de hiperdifusión, reacciones de precipitación de fluido o gel, espectroscopia de absorción, ensayos colorimétricos , inmunoelectrofóresis , técnica de transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA) , ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) , ensayos inmunofluorescentes , ensayos de electroquimioluminiscencia y similares.
En algunas modalidades, la eficacia de los métodos de la invención se puede monitorear mediante la detección o monitoreo de una reducción en un depósito de TTR amiloide. Reducir un depósito de TTR amiloide, tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier reducción en el tamaño, número o gravedad de los depósitos de TTR, o a una prevención o reducción en la formación de depósitos de TTR, dentro de un órgano o área de un sujeto, tal y como se puede evaluar in vitro o in vivo mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, algunos métodos de evaluación de depósitos amiloides se describen en Gertz, M.A. & Rajukumar, S.V. (Editores) (2010), Amyloidosis : Diagnosis and Treatmen , Nueva York: Humana Press. Los métodos para evaluar los depósitos amiloides pueden incluir análisis bioquímicos, así como evaluaciones visuales o computarizadas de depósitos amiloides, tal como se hace visible, por ejemplo, mediante el uso de la tinción inmunohistoquimica, etiquetado fluorescente, microscopía óptica, microscopía electrónica, microscopía fluorescente u otros tipos de microscopía. Se pueden emplear modalidades de imagen invasivas o no invasivas, incluidas, por ejemplo, formación de imágenes mediante TC, PET o MR/MRI para evaluar los depósitos amiloides.
Los métodos de la invención pueden llegar a reducir los depósitos de TTR en cualquier cantidad de tejidos o regiones del cuerpo que incluyen, a modo no taxativo, corazón, hígado, bazo, esófago, estómago, intestino (íleon, duodeno y colon) , cerebro, nervio ciático, ganglio de la raíz dorsal, riñon y retina .
El término "muestra", tal como se usa en la presente, se refiere a una recolección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, de plasma, linfáticos, orina, fluido cerebroespinal, saliva, fluidos oculares y similares. Las muestras de tejidos pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras pueden derivar particularmente de órganos, partes de órganos o fluidos o células dentro de esos órganos. En ciertas modalidades, las muestras se pueden derivar del hígado (por ejemplo, el hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado, tal como, por ejemplo, hepatocitos) , la retina o partes de la retina (por ejemplo, epitelio pigmentario retinal) , el sistema nervioso central o partes del sistema nervioso central (por ejemplo, ventrículos o plexo coroideo) o el páncreas o ciertas células o partes del páncreas. En modalidades preferidas, una "muestra derivada de un sujeto" refiere a sangre o plasma extraídos del sujeto. En modalidades posteriores, una "muestra derivada de un sujeto" se refiere a tejido hepático o tejido de la retina derivado del sujeto.
En algunas modalidades de métodos de la invención, el agente de iAR se administra a un sujeto de forma que el agente de iARN se lleve a un lugar específico dentro del sujeto. La inhibición de la expresión de la TTR se puede evaluar mediante la medición del nivel o cambio en el nivel de ARNm de TTR o proteína TTR en una muestra derivada de un fluido o tejido del lugar específico dentro del sujeto. En modalidades preferidas, el lugar se selecciona del grupo que consiste en hígado, plexo coroideo, retina y páncreas. El lugar puede ser también una subsección o subgrupo de células de cualquiera de los lugares ya mencionados (por ejemplo, hepatocitos o epitelio pigmentario retinal) . El lugar también incluye células que expresan un tipo particular de receptor (por ejemplo, hepatocitos que expresan el receptor de asialoglicoproteínas) .
V. Métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR La presente invención también proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto. Los métodos incluyen la administración al sujeto de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un agente de iARN de la invención.
Tal como se utiliza en la presente, un "sujeto" incluye ya sea a un humano o a un animal no humano, preferiblemente un vertebrado, y más preferiblemente un mamífero. Un sujeto puede incluir un organismo transgénico. Más preferiblemente, el sujeto es un humano, tal como un humano que padece de o está predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a TTR En algunas modalidades, el sujeto sufre de una enfermedad asociada a TTR. En otras modalidades, el sujeto es un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a TTR, por ejemplo, un sujeto con una mutación del gen de la TTR asociada con el desarrollo de una enfermedad asociada a TTR, un sujeto con un historial familiar de enfermedades asociadas a TTR o un sujeto que presenta signos o síntomas que sugieren el desarrollo de una amiloidosis por TTR.
Una "enfermedad asociada a TTR", tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier enfermedad provocada por o asociada a la formación de depósitos amiloides en el que los precursores fibrilares consisten en proteínas de TTR variantes o tipo salvaje. Los TTR mutantes o tipo salvaje dan lugar a varias formas de deposición amiloide (amiloidosis) . La amiloidosis implica la formación y agregado de proteínas mal plegadas, que resulta en depósitos extracelulares que obstaculizan las funciones de los órganos. Los síndromes clínicos asociados con la aglomeración de TTR incluyen, por ejemplo, amiloidosis sistémica senil (ASS) ; amiloidosis sistémica familiar; polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) ; cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF) ; y amiloidosis leptomeníngea, también conocida como amiloidosis meningo cerebrovascular, amiloidosis del sistema nervioso central (CNS) o amiloidosis tipo VII.
En algunas modalidades de los métodos de la invención, los agentes de iAR de la invención se administran a sujetos que padecen cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF) y amiloidosis sistémica senil (ASS) . La TTR de secuencia normal provoca amiloidosis cardíaca en personas de edad avanzada, y se llama amiloidosis sistémica senil (ASS) (también llamada amiloidosis cardíaca senil (ACS) o amiloidosis cardíaca) . La ASS suele estar acompañada de depósitos microscópicos en muchos otros órganos. Las mutaciones de TTR aceleran el proceso de formación de amiloides de TTR y son el factor de riesgo más importante para el desarrollo de amiloidosis por TTR clínicamente significativa (también llamada ATTR (amiloidosis de tipo transtiretina) ) . Se sabe que hay más de 85 variantes amiloidogénicas de TTR que provocan amiloidosis familiar .
En algunas modalidades de los métodos de la invención, los agentes de iARN de la invención se administran a sujetos que sufren polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) asociada a la transtiretina (TTR) . Los sujetos pueden sufrir manifestaciones oculares, tales como opacidad vitrea y glaucoma. Los expertos en la materia saben que la transtiretina amiloidogénica (ATTR) sintetizada por el epitelio pigmentario retinal (EPR) tiene un papel importante en la evolución de la amiloidosis ocular. En estudios previos se ha demostrado que la fotocoagulación panretiniana con láser, que reduce las células de EPR, previene la evolución de la deposición amiloide en el vitreo, lo que indica que la supresión efectiva de la expresión de ATTR en EPR puede convertirse en una nueva terapia para la amiloidosis ocular (ver, por ejemplo, Kawaji, T., y otros, Ophtalmology . (2010) 117: 552-555) . Los métodos de la invención son útiles para el tratamiento de manifestaciones oculares de PAF relacionada con TTR, por ejemplo, amiloidosis ocular. El agente de iARN puede llevar de forma apropiada para dirigirse a un tejido en particular, tal como el ojo. Entre los modos de administración ocular se incluye la inyección en los párpados retrobulbar y subcutánea, subconjuntival , bajo la cápsula de Tenon, de la cámara anterior o intravítrea (o inyección o infusión interna) . Las formulaciones específicas para la administración ocular incluyen gotas para los ojos o pomadas.
Otra enfermedad asociada a TTR es la hipertiroxinemia, también conocida como "hipertiroxinemia distranstiretinémica" o "hipertiroxinemia disprealbuminémica" . Este tipo de hipertiroxinemia puede ser secundario a un aumento en la asociación de tiroxina con TTR debido a una molécula mutante de TTR con afinidad aumentada por la tiroxina. Ver, por ejemplo, Moses et al. (1982) J. Biol . Chem. 86, 2025-2033.
Los agentes de iARN de la invención se pueden administrar a un sujeto mediante cualquier modo de administración conocido en la técnica, que incluye pero no se limita al subcutáneo, intravenoso, intramuscular, intraocular, intrabronquial , intrapleural , intraperitoneal , intrarterial , linfático, cerebroespinal y cualquier combinación de los mismos. En modalidades preferidas, los agentes se administran de forma subcutánea.
En algunas modalidades, la administración se produce a través de una inyección en depósito. Una inyección en depósito puede liberar el agente de iARN de forma consistente en un período de tiempo prolongado. De esta forma, una inyección de depósito puede reducir la frecuencia de las dosis necesarias para obtener un efecto deseado, por ejemplo, una inhibición deseada de la TTR o un efecto terapéutico o profiláctico. Una inyección de depósito también puede proporcionar concentraciones de suero más consistentes. Las inyecciones de depósito pueden incluir inyecciones subcutáneas o inyecciones intramusculares. En las modalidades preferidas, la inyección de depósito es una inyección subcutánea.
En algunas modalidades, la administración se realiza a través de una bomba. La bomba puede ser una bomba exterior o una bomba implantada quirúrgicamente. En determinadas modalidades, la bomba es una bomba osmótica implantada subcutáneamente. En otras modalidades, la bomba es una bomba de infusión. Una bomba de infusión se puede utilizar para infusiones intravenosas, subcutáneas, arteriales o epidurales En modalidades preferidas, la bomba de infusión es una bomba de infusión subcutánea. En otras modalidades, la bomba es una bomba implantada quirúrgicamente que lleva el agente de iARN al hígado.
Otros modos de administración incluyen la administración epidural, intracerebral , intracerebroventricular, administración nasal, intrarterial , intracardíaca, infusión intraósea, intratecal, intravítrea y pulmonar. El modo de administración se puede elegir en base a si se desea un tratamiento local o sistémico y en base al área que se va a tratar. La vía y el sitio de administración se pueden elegir para mejorar la determinación del objetivo.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra a un sujeto en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en una célula dentro del sujeto. La cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en una célula dentro de un sujeto se puede evaluar mediante el uso de los métodos descritos anteriormente, incluidos los métodos que involucran la evaluación de la inhibición de ARNm de TTR, proteína de TTR o las variables relacionadas, tales como los depósitos amiloides.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra a un sujeto en una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva .
"Cantidad terapéuticamente efectiva", tal como se utiliza en la presente, incluye la cantidad de agente de iAR que, cuando es proporcionado a un paciente para tratar una enfermedad asociada a TTR, es suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, mediante disminución, mejora o mantenimiento de la enfermedad existente o uno o más síntomas de la enfermedad) . La "cantidad terapéuticamente efectiva" puede variar dependiendo del agente de iARN, cómo se administra el agente, la enfermedad y su gravedad y la historia, edad, peso, historia familiar, composición genética, etapa del proceso patológico mediado por la expresión de TTR, los tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si los hubiera, y otras características individuales del paciente a tratar.
"Cantidad profilácticamente efectiva", tal como se utiliza en la presente, incluye la cantidad de un agente de iARN que, cuando se administra a un sujeto que no ha experimentado o mostrado aún síntomas de una enfermedad asociada a TTR, pero que puede estar predispuesto a la enfermedad, es suficiente para prevenir o mejorar la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. Los síntomas que se pueden mejorar incluyen neuropatía sensorial (por ejemplo, parestesia, hipoestesia en extremidades distales) , neuropatía autonómica (por ejemplo disfunción gastrointestinal, como ser úlcera gástrica o hipotensión ortostática) , neuropatía motora, convulsiones, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, opacidades vitreas, insuficiencia renal, nefropatía, IMCm (índice de Masa Corporal modificado) considerablemente reducido, disfunción del nervio craneano y distrofia corneal reticular. La mejora de la enfermedad incluye la ralentización del curso de la enfermedad o la reducción de la gravedad de la enfermedad que se desarrolla posteriormente. La "cantidad profilácticamente efectiva" puede variar dependiendo del agente de iAR , de cómo se administra el agente, del grado o riesgo de la enfermedad y de la historia, edad, peso, historia familiar, composición genética, los tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si hubiera, y otras características individuales del paciente a tratar.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" también incluye una cantidad de agente de iARN que produce efectos locales o sistémicos deseados en un relación entre beneficio/riesgo razonable y aplicable a cualquier tratamiento. Los agentes de iARN aplicados en los métodos de la presente invención se pueden administrar en una cantidad suficiente para producir una relación entre beneficio/riesgo razonable aplicable a el tratamiento.
Tal como se utiliza en la presente, las frases "cantidad terapéuticamente efectiva" y "cantidad profilácticamente efectiva" también incluyen una cantidad que proporciona un beneficio en el tratamiento, la prevención o la gestión de los procesos patológicos o de los síntomas de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. Los síntomas de la amiloidosis por TTR incluyen neuropatía sensorial (por ejemplo, parestesia, hipoestesia en extremidades distales) , neuropatía autonómica (por ejemplo disfunción gastrointestinal, como ser úlcera gástrica o hipotensión ortostática) , neuropatía motora, convulsiones, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, opacidades vitreas, insuficiencia renal, nefropatía, IMCm (índice de Masa Corporal modificado) considerablemente reducido, disfunción del nervio craneano y distrofia corneal reticular.
La dosis de agente de iAR que se administra a un sujeto se puede adaptar para equilibrar los riesgos y beneficios de una dosis determinada, por ejemplo, para lograr un nivel deseado de supresión del gen TTR (como se evalúa, por ejemplo, en base a la supresión de AR m de TTR, expresión de proteína TTR, o una reducción en el depósito amiloide, tal y como se lo define anteriormente) o un efecto terapéutico o profiláctico deseado, mientras que al mismo tiempo se evitan los efectos secundarios no deseados.
En una modalidad, el agente de iARN se administra en una dosis de entre aproximadamente 0.25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 0.5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, entre aproximadamente 15 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, entre aproximadamente 20 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, entre aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg o entre aproximadamente 40 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra a una dosis de aproximadamente 0.25 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg. aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 16 mg/kg, aproximadamente 17 mg/kg, aproximadamente 18 mg/kg, aproximadamente 19 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 21 mg/kg, aproximadamente 22 mg/kg, aproximadamente 23 mg/kg, aproximadamente 24 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 26 mg/kg, aproximadamente 27 mg/kg, aproximadamente 28 mg/kg, aproximadamente 29 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 31 mg/kg. aproximadamente 32 mg/kg, aproximadamente 33 mg/kg, aproximadamente 34 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 36 mg/kg, aproximadamente 37 mg/kg, aproximadamente 38 mg/kg, aproximadamente 39 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 41 mg/kg. aproximadamente 42 mg/kg, aproximadamente 43 mg/kg, aproximadamente 44 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 46 mg/kg, aproximadamente 47 mg/kg, aproximadamente 48 mg/kg, aproximadamente 49 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg.
En algunas modalidades, el agente de iAR se administra en dos o más dosis. Si se desea facilitar las infusiones repetidas o frecuentes, se puede aconsejar la implantación de un dispositivo de administración, por ejemplo, una bomba, un stent semipermanente (por ejemplo, intravenoso, intraperitoneal , intracisternal o intracapsular) o un depósito. En algunas modalidades, el número o cantidad de las dosis posteriores depende de si se logra logro un efecto deseado, por ejemplo, la supresión de un gen TTR, o si se logra un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, la reducción de un depósito amiloide o la reducción de un síntoma de una enfermedad asociada a TTR. En algunas modalidades, el agente de iARN se administra de acuerdo con un esquema. Por ejemplo, se puede administrar el agente de iARN dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana o cinco veces por semana. En algunas modalidades, el esquema involucra administraciones espaciadas regularmente, por ejemplo, cada hora, cada cuatro horas, cada seis horas, cada ocho horas, cada doce horas, cada día, cada dos días, cada tres días cada cuatro días cada cinco días, semanalmente , cada dos semanas o mensualmente . En otras modalidades, el esquema involucra administraciones cada intervalos de tiempo muy cortos, seguidos de un período más largo de tiempo durante el cual el agente no se administra. Por ejemplo, el programa puede involucrar un conjunto inicial de dosis que se administran en un período relativamente corto de tiempo (por ejemplo, cada 6 horas aproximadamente, cada 12 horas aproximadamente, cada 24 horas aproximadamente, cada 48 horas aproximadamente o cada 72 horas aproximadamente) seguido de un período de tiempo más largo (por ejemplo, una semana aproximadamente, dos semanas aproximadamente, tres semanas aproximadamente, cuatro semanas aproximadamente, cinco semanas aproximadamente, seis semanas aproximadamente, siete semanas aproximadamente u ocho semanas aproximadamente) durante el cual el agente de iARN no se administra. En una modalidad, el agente de iARN se administra a cada hora inicialmente y luego se administra cada intervalos más largos de tiempo {por ejemplo, a diario, semanalmente , cada dos semanas o mensualmente) . En otra modalidad, el agente de iARN se administra a diario y luego se administra cada intervalos más largos de tiempo (por ejemplo, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente). En algunas modalidades, el intervalo más largo aumenta con el tiempo o se determina en base al logro de un efecto deseado. En otra modalidad específica, el agente de iARN se administra una vez, a diario, durante una primera semana, seguido de dosis semanales que comienzan en el octavo día de la administración. En otra modalidad específica, el agente de iARN se administra cada dos días durante una primera semana, seguido de dosis semanales que comienzan en el octavo día de la administración.
Cualquiera de estos esquemas puede repetirse opcionalmente para una o más iteraciones. El número de iteraciones puede depender del logro de un efecto deseado, por ejemplo, la eliminación de un gen de la TTR, el nivel de proteína de unión de retinol, el nivel de vitamina A y/o si se logra un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, la reducción de un depósito amiloide o la reducción de un síntoma asociado a TTR.
En algunas modalidades, el agente de iARN se administra con otros agentes terapéuticos u otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, otros agentes u otros regímenes terapéuticos apropiados para el tratamiento de una enfermedad asociada a TTR pueden incluir trasplante de hígado, que puede reducir los niveles de TTR mutante en el cuerpo; Tafamidis (Vyndaqel) , que estabiliza cinéticamente el tetrámero de TTR, mediante la prevención de la disociación del tetrámero necesaria para la amiloidogénesis de TTR; y los diuréticos, que pueden emplearse, por ejemplo, para reducir edemas en amiloidosis por TTR con compromiso cardíaco .
En una modalidad, se le administra a un sujeto una dosis inicial y una o más dosis de mantenimiento de un agente de iARN. Las dosis de mantenimiento pueden ser iguales o más bajas que la dosis inicial, por ejemplo, la mitad de la dosis inicial. Un régimen de mantenimiento puede incluir tratar el sujeto con una o más dosis que están en el intervalo de 0.01 yg a 15 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo, 10 mg/kg, 1 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.001 mg/kg o 0.00001 mg/kg de peso corporal por día. Las dosis de mantenimiento se administran, por ejemplo, no más de una vez cada dos días, una vez cada cinco días, una vez cada siete días, una vez cada diez días, una vez cada catorce días, una vez cada veintiún días o una vez cada treinta días. Además, el régimen de tratamiento puede durar por un período de tiempo que variará de acuerdo con la naturaleza de la enfermedad específica, su gravedad y la condición general del paciente. En algunas modalidades la dosis se puede administrar no más de una vez por día, por ejemplo, no más de una vez cada 24, 36, 48 o más horas, por ejemplo, no más de una vez cada 5 u 8 días. Luego del tratamiento, se puede monitorear al paciente para evaluar los cambios en su condición. La dosis de agente de iARN puede aumentar en el caso de que el paciente no responda significativamente a esos niveles de dosis, o reducirse si se observa un alivio en los síntomas del estado de enfermedad, si el estado de enfermedad ha sido eliminado o si se observan efectos secundarios no deseados .
VI. Kits La presente invención proporciona también kits para poner en práctica cualquiera de los métodos de la invención. Los kits incluyen uno o más agentes de iARN e instrucciones para su uso, por ejemplo, instrucciones para inhibir la expresión de una TTR en una célula al poner en contacto la célula con el o los agente (s) de iARN en una cantidad efectiva para inhibir la expresión del TTR. Los kits pueden además comprender medios para poner en contacto la célula con el agente de iARN (por ejemplo, un dispositivo de inyección) o medios para medir la inhibición de TTR (por ejemplo, medios para medir la inhibición de ARNm de TTR o proteína de TTR) . Los medios para medir la inhibición de TTR pueden comprender un medio para obtener una muestra de un sujeto, tal como, por ejemplo, una muestra de plasma. Los kits de la invención pueden además, opcionalmente , comprender medios para administrar los agentes de iARN a un sujeto o medios para determinar la cantidad terapéuticamente efectiva o profilácticamente efectiva.
Se ilustra la invención además a través de los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como restrictivos. El contenido de todas las referencias y patentes publicadas y solicitudes de patentes citadas en toda la solicitud se incorpora a la presente a modo de referencia.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Inhibición de TTR con conjugados de TTR- GalNAc Se administró por vía subcutánea a los ratones una sola dosis del agente de iARN de la TTR AD-43527 y los niveles del ARNm de la TTR se determinaron 72 horas después de la administración.
El conjugado con GalNAc de reacción cruzada de ratón/rata, AD-43527, se eligió para evaluación in vivo en ratones C57BL/6 tipo salvaje para silenciar el ARNm de la TTR en el hígado. La secuencia de cada hebra de AD-43527 se muestra a continuación.
Hebra: s= sentido; as=antisentido El ligando utilizado fue GalNAc3 : Este ligando GalNAc3 se conjugó con el extremo 3' de la hebra sentido usando el enlazante y enlace tal como se muestra a continuación: La estructura de la hebra sentido conjugada de GalNAc3 resultante se muestra en el siguiente esquema: Se sintetizaron y ensayaron agentes de iARN adiciónale que se dirigen a la TTR y tienen las siguientes secuencias modificaciones .
Agentes de iARN de la TTR de reacción cruzada ratón/rata Agentes de iARN de la TTR de reacción cruzada de humano/cynomolgus ; el dúplex base es AD-18328 [que tiene una secuencia 5 '-3' de hebra sentido de GuAAccAAGAGuAuuccAudTdT (SEQ ID NO: 12) y secuencia 5' a 3' de hebra antisentido de AUGGAAuACUCUUGGUuACdTdT (SEQ ID NO: 13) con las siguientes modificaciones: 2'F/2'OMe w/2 PS en AS alternas.
L96 = GalNAc3 ; nts en minúscula (a,u,g,c) son nucleótidos 2'-O-metilo, Nf (es decir, Af) es un nucleótido 2'-fluoro; Qll es colesterol; s es fosforotioato .
AD-43527 se administró a ratones hembra C57BL/6 (6-10 semanas, 5 por grupo) por inyección subcutánea a un volumen de dosis de ??µ?/g a una dosis de 30, 15, 7.5, 3.5, 1.75 o 0.5 mg/kg de AD-43527. Los animales testigo recibieron PBS por inyección subcutánea al mismo volumen de dosis.
Después de aproximadamente setenta y dos horas, los ratones se anestesiaron con 200 µ? de cetamina, y luego se desangraron al cortarse la arteria caudal derecha. Se recolectó el tejido del hígado, se congeló rápidamente y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento.
La eficacia del tratamiento se evaluó mediante medición del ARNm de la TTR en el hígado a las 72 horas post-dosis. Los niveles de ARNm de TTR en el hígado se ensayaron utilizando los ensayos de ADN Ramificado- QuantiGene 1.0 (Panomics) . En resumen, las muestras de hígado de ratón se molieron y se prepararon lisados de tejido. La mezcla de lisis de hígado (una mezcla de 1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua libre de nucleasa y ??µ? de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 20mg/ml) se incubó a 65°C durante 35 minutos. 5µ1 de lisado de hígado y 95µ1 de un conjunto de sonda funcional (sonda de TTR para direccionamiento de genes y GAPDH para control endógeno) se agregaron a la Placa de Captura. Las Placas de Captura se incubaron a 53 °C ± 1°C (aprox. 16-20hrs) . Al día siguiente, las Placas de Captura se lavaron 3 veces con IX de Amortiguador de Lavado (agua libre de nucleasa, Componente de Amortiguador 1 y Componente de Amortiguador de Lavado 2) , luego se secaron mediante centrifugado durante 1 minuto a 240g. Se agregaron ???µ? de mezcla de Sonda Amplificadora por pocilio a la Placa de Captura, que se selló con una lámina de aluminio y se incubó durante 1 hora a 46°C + 1°C. Luego de 1 1 4 hora de incubación, se repitió la etapa de lavado, luego se agregaron ???µ? de la mezcla de Sonda de Etiqueta por pocilio Las Placas de Captura se incubaron a 46 °C ± 1°C durante 1 hora. Luego se lavaron las placas con IX de Amortiguador de Lavado, se secaron y se agregaron ???µ? de sustrato por pocilio a las Placas de Captura. Las Placas de Captura se incubaron durante 30 minutos a 46°C seguida por incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se leyeron usando el Luminómetro SpectraMax luego de la incubación. Se analizaron los datos del ADNb restando el fondo promedio de cada muestra por duplicado, promediando los valores resultantes de GAPDH por duplicado (sonda testigo) y la TTR (sonda experimental) y luego se computó la relación: (sonda experimental -fondo) / (sonda testigo- fondo) . El nivel de ARNm de la TTR promedio se calculó para cada grupo y se normalizó al grupo de PBS promedio para proporcionar el ARNm de la TTR relativo como un % del grupo testigo de PBS.
Los resultados se muestran en la Figura 1. El agente de iARN conjugado con GalNAc que se dirige a la TTR tuvo una DE50 de aproximadamente 5 mg/kg para la desactivación del ARNm de la TTR. Estos resultados demuestran que los agentes de iARN conjugados de GalNAc que se dirigen a la TTR son efectivos para inhibir la expresión del ARNm de la TTR.
Ejemplo 2: La inhibición de TTR con conjugados de TTR-GalNAc es durable Se les administró a los ratones una dosis subcutánea (7.5 o 30.0 mg/kg) de AD-43527, un agente de iARN conjugado con GalNAc que se dirige a la TTR. Los niveles de ARNm de la TTR en el hígado se evaluaron 1, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 19, 26, 33 y 41 días después del tratamiento mediante el uso del método que se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Figura 2. El día 19, la administración de 30.0 mg/kg de agentes de iARN conjugados con GalNAc aún demostraba aproximadamente 50% de silenciamiento . La recuperación total de la expresión ocurrió el día 41.
Estos resultados demostraron que la inhibición proporcionada por el ARNip conjugado con GalNAc que se dirige a la TTR es durable, con una duración de hasta 3, 5, 7, 10, 13, 15, 19, 26 o 33 días después del tratamiento.
Ejemplo 3. Síntesis de ARN y apareamiento de dúplex 1. Síntesis de oligonucleótidos Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador AKTAoligopilot o un sintetizador ABI 394. Se utilizó para la síntesis de oligonucleótidos un soporte sólido de vidrio de poro controlado disponible en el mercado (dT-CPG, 500Á, Síntesis de Cebador) y fosforamiditas de ARN con grupos protectores estándar, 5'-O-dimetoxitritil N6-benzoil-21 - t-butildimetilsilil -adenosina-31 - O-N, ' -diisopropil - 2 -cianoet ilfosforamidita , 5 ' -O-dimetoxitritil -N4 -acetil-2 ' - -butildimetilsilil-citidina-3 ' -?-?,?' -diisopropil -2 -cianoetilfosforamidita, 51 - O-dimetoxitritil -N2 - - isobutril - 2 ' - t-butildimetilsilil -guanosina-31 -?-?,?' -diisopropil-2 -cianoetilfosforamidita y 5 ' -O-dimetoxitritil-21 - t-butildimetilsilil -uridina- 31 -0- N, 1 -diisopropil -2 -cianoetilfosforamidita (Pierce Nucleic Acids Technologies) , a menos que se especifique lo contrario. Las 2'-F fosforamiditas , 5 ' - O-dimetoxitritil-N4-acetil-2 ' -f luro-citidina-31 -?-?,?' -diisopropil-2-cianoetil-fosforamidita y 51 - O-dimetoxit itil - 2 '-fluro-uridina-3 ' -?-?,?' -diisopropil-2-cianoetil-fosforamidita se adquirieron en (Promega) . Todas las fosforoamiditas se utilizaron a una concentración de 0.2M en acetonitrilo (CH3CN) , excepto la guanosina que se utilizó a una concentración de 0.2M en 10% de THF/ANC (v/v) . Se utilizó un tiempo de acoplamiento/reciclaj e de 16 minutos. El activador fue 5-etil tiotetrazol (0.75M, American International Chemicals) ; para la oxidación de PO se utiliza Yodo/Agua/Piridina y para la oxidación de PS se utilizó PADS en 2 , 6-lutidina/ACN (1:1 v/v).
Las hebras conjugadas con ligandos se sintetizaron usando un soporte sólido que contenía el ligando correspondiente. Por ejemplo, la introducción de un resto de carbohidrato/ligando (por ejemplo, GalNAc) en el extremo 3' de una secuencia se logró comenzando la síntesis con el soporte sólido de carbohidrato correspondiente. De manera similar, se introdujo un resto de colesterol en el extremo 31 comenzando la síntesis sobre el soporte de colesterol. En general, el resto de ligando se tituló en trans-4 -hidroxiprol inol por medio de un enlace de elección tal como se describe en los ejemplos precedentes para obtener un resto de hidroxiprolinol -ligando. El resto de hidroxiprolinol -ligando se acopló luego con un soporte sólido por medio de un enlazante de succinato o se convirtió en fosforamidita por medio de las condiciones de fosfitilación estándar para obtener los bloques de construcción de conjugados de carbohidratos deseados. Los ARNip etiquetados con fluoróforos se sintetizaron a partir de la fosforamidita correspondiente o soporte sólido, que se adquirió en Biosearch Technologies. El soporte de polímero oleil litocólico (GalNAc)3 se realizó internamente a una carga de 38.6 µt???/gramo. El soporte de polímero de Mañosa (Man) 3 se realizó internamente a una carga de 42.0 mol/gramo.
La conjugación del ligando de elección en la posición deseada, por ejemplo, en el extremo 5' de la secuencia, se logró acoplando la fosforamidita correspondiente a la cadena creciente en condiciones de acoplamiento de fosforamidita estándar a menos que se especifique lo contrario. Un acoplamiento de 15 min extendido de 0.1M de solución de fosforamidita en CH3CN anhidro en presencia del activador de 5- (etiltio) -lH-tetrazol a un oligonucleótido unido sólido. La oxidación de la fosfita de internucleótidos al fosfato se realizó usando yodo-agua estándar, tal como se informó en Beaucage, S.L. (2008) Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discov. Devel . , 11, 203-216; Mueller, S., Wolf, J. e Ivanov, S.A. (2004) Current Strategies for the Synthesis of RNA. Curr. Org. Synth., 1, 293-307; Xia, J., Noronha, A., Toudjarska, I., Li, F., Akinc, A., Braich, R. , Frank-Kamenetsky, M . , Rajeev, K.G., Egli, M. y Manoharan, M . (2006) Gene Silencing Activity of siRNAs with a Ribo-difluorotoluyl Nucleotide. ACS Chem. Biol . , 1, 176-183, o mediante tratamiento con terc-butil hidroperóxido/acetonitrilo/agua (10:87:3) con un oligonucleót ido conjugado a un tiempo de espera de oxidación de 10 minutos. El fosforot ioato se introduce mediante oxidación de fosfito a fosforotioato usando un reactivo de la transferencia de azufre tal como DDTT (adquirido en AM Chemicals), PADS y/o reactivo Beaucage. La fosforamidita de colesterol se sinterizó internamente y se utilizó a una concentración de 0.1 M en diclorometano . El tiempo de acoplamiento para la fosforamidita de colesterol fue 16 minutos . 2. Desprotección- I (Desprotección de nucleobases) Después de completarse la síntesis, el soporte se transfirió a una botella de vidrio de 100 mL (VWR) . El oligonucleótido se escindió del soporte con desprotección simultánea de los grupos base y de fosfato con 80 mL de una mezcla de amoníaco [amoníaco: etanol (3:1] durante 6.5h a 55°C. La botella se enfrió brevemente sobre hielo y luego la mezcla de amoníaco etanólico se filtró en una nueva botella de 250 mi. EL CPG se lavó con porciones de 2 x 40 mL de etanol/agua (1:1 v/v) . El volumen de la mezcla se redujo luego a ~ 30 mL por evaporador rotativo. La mezcla se congeló luego sobre hielo seco y se seca al vacío sobre un Speed Vac . 3. Desprotección- II (Eliminación del grupo 2'-TBDMS) El residuo seco se resuspendió en 26 mL de trietilamina, trihidrofluoruro de trietilamina (TEA*3HF) o piridina-HF y DMSO (3:4:6) y se calentó a 60°C durante 90 minutos para quitar los grupos de terc-butildimetilsililo (TBDMS) en la posición 2'. Luego se aplacó la reacción con 50 mi de acetato de sodio 2mM y pH ajustado a 6.5, y se almacenó en congelador hasta su purificación. 4. Análisis Los oligonucleót idos se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) antes de la purificación y la selección de amortiguador y columna depende de la naturaleza de la secuencia y/o ligando conj ugado . 5. Purificación por HPLC Los oligonucleótidos conjugados con ligandos se purificaron por HPLC preparativa de fase inversa. Los oligonucleótidos no conjugados se purificaron por HPLC de intercambio de aniones sobre una columna de gel de TSK cargada en el lugar. Los amortiguadores fueron fosfato de sodio 20 mM (pH 8.5) en 10% de CH3CN (amortiguador A) y fosfato de sodio 20 mM (pH 8.5) en 10% de CH3CN, NaBr 1M (amortiguador B) . Las fracciones que contienen los oligonucleótidos de longitud completa se agruparon, desalinizaron y liofilizaron. Aproximadamente 0.15 OD de oligonucleótidos desalinizados se diluyeron en agua hasta 150 µL y luego se colocaron en pipetas en viales especiales para CGE y análisis de LC/MS . Los compuestos se analizaron finalmente mediante LC-ESMS y CGE. 6. Preparación del agente de iARN Para la preparación de una iARN, cantidades equimolares de hebras sentido y antisentido se calentaron en lxPBS a 95°C durante 5 minutos y se enfriaron lentamente hasta temperatura ambiente. La integridad del dúplex se confirmó mediante análisis por HPLC. La Tabla 1 a continuación refleja los agentes de iARN que se dirigen a ARNm de la TTR de humano o roedor.
Tabla 1: Agentes de iARN y resultados de detección sistemática in vitro 5 15 5 15 5 15 10 Los nucleótidos en minúscula (a, u, g, c) son nucleótidos de 2 ' -O-metilo; Nf (por ejemplo, Af) es un nucleótido 2'-fluoro; s es una conexión de fosfotiorato ; L96 indica un ligando de GalNAc3.
Ejemplo 4: Detección in vitro de agentes de iARN Cultivo celular y transfecciones Se cultivaron células Hep3B humanas o células H.II.4.E de rata (ATCC, Manassas, VA) casi hasta la confluencia a 37 °C en una atmósfera de 5% de C02 en RPMI (ATCC) complementado con 10% de FBS , estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de liberarse de la placa por tripsinizacion. La transfección se llevó a cabo agregando 1 .8ml de Opti-MEM más 0.2 mi de Lipofectamina RNAiMax por pocilio (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. No. 13778-150) hasta 5ml de dúplex de ARNip por pocilio en una placa de 96 pocilios y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. 80 µ? de medios de cultivo completos sin antibióticos que contenían ~2 xlO4 células Hep3B se agregaron luego a la mezcla de ARNip. Las células se incubaron durante 24 o 120 horas antes de la purificación del ARN. Se realizaron experimentos de una sola dosis a ???? y 0. In de concentración de dúplex final y se llevaron a cabo experimentos de respuesta a dosis usando diluciones en serie de 8 , 4 veces con una dosis máxima de ???? de concentración de dúplex final.
Aislamiento de ARN total usando el Kit de Aislamiento de ARNm DYNABEADS (Invitrogen, parte No. : 610-12) : Las células se cultivaron y se lisaron en 150ml de Lisis/Amortiguador de Unión y luego se mezclaron durante 5 minutos a 850rpm usando un Termomixer Eppendorf ® (la velocidad de mezclado fue la misma a lo largo de todo el proceso) . Diez microlitros de perlas magnéticas y 80ml de mezcla de Lisis/Amortiguador de Unión se agregaron a una placa de fondo redondo y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas magnéticas se capturaron usando un soporte magnético y el sobrenadante se retiró sin alterar las perlas. Después de quitar el sobrenadante, las células lisadas se agregaron a las perlas restantes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, las perlas magnéticas se lavaron 2 veces con 150ml de Amortiguador de Lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas se capturaron nuevamente y se quitó el sobrenadante. Las perlas se lavaron luego con 150ml de Amortiguador de Lavado B, se capturaron y se retiró el sobrenadante. Las perlas se lavaron luego con 150 mi de Amortiguador de Elución, se capturaron y se retiró el sobrenadante. Las perlas se dejaron secar durante 2 minutos. Después de secarse, se agregaron 50 mi de Amortiguador de Elución y se mezcló durante 5 minutos a 70°C. Las perlas se capturaron sobre un imán durante 5 minutos. Se retiraron 40ml de sobrenadante y se agregaron a otra placa de 96 pocilios.
Síntesis de ADNc usando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat No. 4368813) Una mezcla principal de 1 µ? de Amortiguador 10X, 0.4µ1 de d TP 25X, ?µ? de cebadores aleatorios, 0.5 µ? de Transcriptasa Inversa, 0.5 µ? de inhibidor de R asa y 1.6µ1 de H20 por reacción se agregaron a 5 µ? de ARN total. Se generó ADNc usando un Bio-Rad C-1000 o ciclador térmico S-1000 (Hercules, CA) a través de las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 seg, 4°C de espera.
PC en tiempo real Se agregaron 2µ1 de ADNc a una mezcla principal que contenía 0.5µ1 de Sonda GAPDH TaqMan (Applied Biosystems Cat No. 4326317E (humana)), Cat No. 4308313 (roedor)), 0.5µ1 de sonda de TTR TaqMan (Applied Biosystems cat No. HS00174914 _ml (humana) cat No. Rn00562124_ml (rata)) y 5µ1 de una mezcla principal de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat No. 04887301001) por pocilio en una placa de 384 pocilios (Roche cat No. 04887301001) . La PCR en tiempo real se realizó en una máquina de PCR en Tiempo Real Roche LC 480 (Roche) . Cada dúplex se evaluó en al menos dos transfecciones independientes y cada transfección se ensayó por duplicado, a menos que se indique lo contrario.
Para calcular el cambio múltiplo relativo, los datos en tiempo real se analizaron usando el método de AACt y se normalizaron a ensayos realizados con células transfectadas con ???? AD-1955 o células transfectadas simuladas. Las CI50 se calcularon usando un modelo de ajuste de 4 parámetros usando XLFit y se normalizaron a células transfectadas con AD-1955 (secuencia sentido: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 2202); secuencia antisentido: UCGAAGuCUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 2203)) o células sin tratamiento previo en el mismo intervalo de dosis, o a su dosis más baja. Las CI5o se calcularon para cada transfección individual, así como en combinación, donde una sola CI50 se ajustó a los datos de ambas transfecciones.
Los resultados del silenciamiento del dúplex de ARNip ejemplar con varias modificaciones de motivos de la invención se muestran en la Tabla 1 anterior.
Ejemplo 5: Actividad de silenciamiento in vítro de agentes de iAR modificados químicamente que se dirigen a TTR Los siguientes experimentos demostraron los efectos beneficiosos de las modificaciones químicas, incluida la introducción de motivos de repetición en triplete, junto con un ligando GalNAc3, en la actividad de silenciamiento de los agentes de iARN que se dirigen a TTR. Las secuencias de los agentes investigados se proporcionan en la Tabla 2 a continuación. Las regiones de complementariedad del ARNm de TTR son las siguientes: la región de complementariedad de los agentes de iARN AD-45165, AD-51546 y AD-51547 es GGATGGGATTTCATGTAACCAAGA (SEQ ID NO: 2204) y la región o complementariedad de los agentes de iARN AD-45163, AD-51544 y AD-51545 es TTCATGTAACCAAGAGTATTCCAT (SEQ ID NO: 2205) .
Protocolo para evaluación de CI50 en células Hep3B La CI50 para cada ARNip modificado se determinó en las células Hep3B (una línea celular de hepatoma humano) mediante transfección inversa estándar usando Lipofectamina RNAiMAX . Brevemente, la transfección inversa se llevó a cabo agregando 5 uL de Opti-MEM a 5 ]ih de dúplex de ARNip por pocilio en una placa de 96 pocilios con 10 \iL de Opti-MEM más 0.5 \ih de Lipofectamina RNAiMax por pocilio (Invitrogen, Carlsbad CA. cat No. 13778-150) e incubando a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Luego de la incubación, se agregaron 100 il¡ de medios de cultivo completos sin antibiótico que contenían 12,000-15,000 de células Hep3B a cada pocilio. Las células se incubaron durante 24 horas a 37°C en una atmósfera con 5% de C02 antes de lisis y análisis de TTR y ARNm de GAPDH por ADNb (Quantigene) . Se evaluaron siete concentraciones de ARNip diferentes en el intervalo de ???? a 0.6pM para determinar la CI50 y TTR/GAPDH para células transíectadas de ARNip se normalizó a las células transfectadas con ???? de L c ARNip. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Protocolo para evaluación de CI50 de libre captación El silenciamiento de libre captación en hepatocitos de cynomolgus primarios se evaluó luego de la incubación con ARNip de TTR durante 4 horas o 24 horas. El silenciamiento se midió a las 24 horas desde la exposición inicial. En resumen, se recubrieron 96 pocilios con 0.05%- 0.1% de colágeno (Sigma C3867-1VL) a temperatura ambiente, 24 horas antes del comienzo del experimento. El día del ensayo, los ARNip se diluyeron en Medios de Placas precalentadas que consisten en DMEM complementado con Kit de Medios de Mantenimiento de GIBCO (Serum-Free, Life Technologies CM4000) y se agregaron a las placas de cultivo de 96 pocilios recubiertas de colágeno. Los hepatocitos de cynomolgus primarios criopreservados se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37°C, e inmediatamente se diluyeron en Medios de Placas a una concentración de 360,000 células/mL. Un volumen de suspensión celular se colocó en pipetas cuidadosamente sobre los ARNip pre-emplacados de forma tal que el conteo celular final fue 18,000 células/pocilio. La placa se agitó suavemente para mezclar y propagar las células de manera uniforme en los pocilios y se colocó en una incubadora de 5% de C02 a 37 °C durante 24 horas antes de la lisis y análisis de ARNm de TTR y GAPDH mediante ADNb (Quantigene, Affymetrix) . En el caso de la incubación de 4 h con ARNip, los medios se decantaron después de 4 horas de exposición a las células, y se reemplazaron con Medios de Placas nuevos durante las 20 horas restantes de incubación. El análisis corriente abajo para ARNm de TTR y GAPDH fue el mismo que se describió anteriormente. Para una curva de respuesta a la dosis típica, los ARNip se titularon de 1 um a 0.24nM mediante una dilución en serie de 4 veces.
Tabla 2: Resumen de actividad in vifcro para TTR-GalNAc alternadas y variantes con motivos en triplete Los nucleótidos en minúscula (a, u, g, c) indican nucleótidos de 2 ' -O-metilo; Nf (por ejemplo, Af) indican un nucleótido 2'-fluoro; s indica una conexión de fosfotiorato; L96 indica un ligando de GalNAc3; los nucleótidos en negrita indican cambios con respecto al agente base correspondiente. Cada nucleótido en negrita se encuentra en el centro de un motivo en triplete.
Los resultados se proporcionan en la Tabla 2 y demuestran que los agentes de iAR modificados que se dirigen a TTR proporcionan una actividad de silenciamiento mejorada.
Resultados: Actividad mejorada de agentes de iARN modificados Los agentes de iARN base con modificaciones químicas alternadas y un ligando GalNAc3 proporcionaron una CI50 en células Hep3B de aproximadamente 0.01 nM. Tal como se muestra en las Figuras 4-5 y en la Tabla 2, los agentes modificados con respecto a los agentes base, por ejemplo, mediante la adición de uno o más tripletes de repetición de modificaciones 2'-fluoro y 2'-0-metilo, mostraron una actividad de silenciamiento inesperadamente mejorada, alcanzando valores de CI50 en células Hep3B que fueron 5-8 veces mejores que el agente base correspondiente.
Resultados: CI50 de captación libre en células Hep3B Tal como se muestra en la Tabla 2 y las Figuras 6-7, los agentes de iARN modificados con respecto al AD-45163 base también mostraron un silenciamiento de captación libre mejorado. Los agentes modificados mostraron más del doble de actividad de silenciamiento de la base después de un período de incubación de 24 horas y casi 10 veces la actividad de silenciamiento de la base después de un período de incubación de 4 horas .
Tal como se muestra en la Tabla 2 y las Figuras 8-9, los agentes de iARN modificados con respecto al AD-45165 base también mostraron un silenciamiento de captación libre mejorado. Los agentes modificados mostraron 2-3 veces la actividad de silenciamiento de la base después de un período de incubación de 24 horas y 5-8 veces la actividad de silenciamiento de la base después de un período de incubación de 4 horas .
Tomados colectivamente, estos resultados demuestran que los agentes de iARN modificados presentados en la presente, por ejemplo, AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547, mostraron inesperadamente una buena inhibición del ARNm de TTR en experimentos de silenciamiento in vitro.
Ejemplo 6: Silenciamiento de ARNm de TTR y supresión de proteína TTR en ratones transgénicos Para evaluar la eficacia de los agentes de iARN AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD45165, AD-51546 y AD-51547, estos agentes se administraron a ratones transgénicos que expresan transtiretina humana con la mutación V30 (ver Santos, SD., Fernaandes, R. , y Saraiva, MJ. (2010) Neurobiology of Aging, 31, 280-289) . Se sabe que la mutación V30M provoca polineuropatía amiloide familiar tipo I en humanos. Ver, por ejemplo, Lobato, L. (2003) J Nephrol . , 16 (3 ) : 438 -42.
Los agentes de iARN (en amortiguador de PBS) o testigo de PBS se administraron a ratones (2 machos y 2 hembras) de 18-24 meses de edad en una sola dosis subcutánea de 5 mg/kg o 1 mg/kg. Después de aproximadamente 48 horas, los ratones se anestesiaron con 200 µ? de cetamina, y luego se desangraron cortando la arteria caudal correcta. Se aisló sangre entera y plasma y se almacenó -80°C hasta el ensayo. Se recogió el tejido del hígado, se congeló instantáneamente y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento .
La eficacia del tratamiento se evaluó mediante (i) medición de ARNm de TTR en el hígado 48 horas post-dosis, y (ii) medición de proteína TTR en plasma antes del sangrado y 48 horas post-dosis. Los niveles de ARNm hepático de TTR se ensayaron utilizando los ensayos de ADN ramificado - QuantiGene 2.0 (Panomics cat No.: QS0011) . Brevemente, se molieron las muestras de hígado de ratón y se prepararon lisados de tejido. La mezcla de lisis de hígado (una mezcla de 1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua libre de nucleasa y lOul de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 20mg/ml) se incubó a 65 °C durante 35 minutos. 20µ1 del conjunto de sonda de trabajo (sonda TTR para direccionamiento a genes y GAPDH para control endógeno) y 80ul de lisado de tejido se agregaron entonces en la placa de captura. Las placas de captura se incubaron a 55°C ± 1°C (aproximadamente 16-20hrs) . Al día siguiente, las placas de captura se lavaron 3 veces con IX Amortiguador de Lavado (agua libre de nucleasa, Componente de Amortiguador 1 y Componente de Amortiguador de Lavado 2), y luego se secaron mediante la centrifugación durante 1 minuto a 240g. Se agregaron ???µ? de un reactivo de trabajo pre-amplificador en la placa de captura, que se selló con una lámina de aluminio y se incubó durante 1 hora a 55 °C ± 1°C. Después de 1 hora de incubación, se repitió la etapa de lavado, luego se agregaron ???µ? de reactivo de trabajo amplificador. Después de 1 hora, las etapas de lavado y secado se repitieron, y se agregaron ???µ? de sonda de etiqueta. Las placas de captura se incubaron 50 °C ± 1°C durante 1 hora. La placa se lavó entonces con IX de Amortiguador de Lavado, se secó y se agregaron ???µ? de sustrato en la placa de captura. Las placas de captura se leyeron utilizando el Luminómetro SpectraMax seguido por 5 a 15 minutos de incubación. Los datos de bADN se analizaron sustrayendo del antecedente promedio de cada muestra por triplicado, promediando el GAPDH por triplicado resultante (sonda testigo) y valores TTR (sonda experimental) y luego computando la relación: (sonda experimental -antecedente)/ (sonda testigo-antecedente) .
Los niveles de TTR en plasma se ensayaron utilizando el kit disponible comercialmente "AssayMax Human Prealbumin ELISA Kit" (AssayPro, St . Charles, O, No. de catálogo EP3010-1) de acuerdo con las pautas del fabricante. Brevemente, se diluyó plasma de ratón 1:10,000 en IX de diluyentes de mezcla y se agregó a placas previamente recubiertas junto con estándares del kit y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de 5 lavados con amortiguador de lavado del kit. Se agregaron cincuenta microlitros de anticuerpo de prealbúmina biotinilado a cada pocilio y se incubó durante 1 hr a temperatura ambiente, seguido de 5 lavados con amortiguador de lavado. Se agregaron cincuenta microlitros de conjugado de estreptavidina-peroxidasa a cada pocilio y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con posterior lavado como se describió anteriormente. La reacción se desarrolló mediante la adición de 50 µ?/pocillo de sustrato de cromógeno e incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con detención de la reacción mediante la adición de 50 µ?/pocillo de solución de detención. Se leyó la absorbancia a 450 nm en una lectora de placas Versamax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los datos se analizaron utilizando el paquete informático Softmax 4.6 (Molecular Devices) .
Los resultados se muestran en las Figuras 10-12. La Figura 10 muestra que los agentes de iARN, modificados con respecto a los agentes AD-45163 y AD-45165 base, mostraron una actividad de silenciamiento de ARN que fue similar o 2 más potente que la de los agentes base. La Figura 11 muestra que los agentes AD-51544 y AD-51545 mostraron actividad de silenciamiento dependiente de la dosis y que la actividad de silenciamiento de estos agentes a una dosis de 5mg/kg fue similar a la del correspondiente AD-45163 base. La Figura 12 muestra que los agentes AD-51546 y AD-51547 también mostraron actividad de silenciamiento dependiente de la dosis. Más aun, la actividad de silenciamiento de AD-51546 y AD-51547 a una dosis de 5mg/kg fue superior a la del correspondiente AD-45165 base.
Ejemplo 7: Perfiles farmacocinéticos en suero e hígado de agentes de iARN que se dirigen a la TTR en ratones Para evaluar los perfiles farmacocinéticos de los agentes de iARN AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547, estos agentes, en amortiguador de PBS, se administraron a ratones C57BL/6 usando un solo bolo IV o administración subcutánea (SC) . Las concentraciones en plasma y concentraciones en hígado de los agentes se evaluaron en distintos momentos después de la administración.
Los parámetros farmacocinéticos en plasma se presentan en las Tablas 3 y 4 a continuación. El tiempo de permanencia medio (MRT) en plasma fue de aproximadamente 0.2 horas después de la dosificación IV y aproximadamente i después de la dosificación SC. A una dosis de 25 mg/kg, los agentes AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547 mostraron propiedades farmacocinét icas similares. Cada uno de estos agentes tuvo más de 75% biodisponibilidad del espacio subcutáneo. Su biodisponibilidad fue superior a la del agente AD-45163 base, que se administró a una dosis más alta de 30 mg/kg. La biodisponibilidad subcutánea de AD-51544 y AD-51547 fue de aproximadamente 100%, mientras que la de AD-51545 fue 90% y la de AD-51546 fue de 76%. Tabla 3: Resumen de estimaciones de parámetros farmacocinéticos en plasma después de la adminis ración SC de ARNip de TTR-GalNAc en ratones Tabla 4 : Parámetros farmacocinéticos de ARNip en plasma después de un bolo IV o dosis SC de AD-51544, 51545, 51546 o 51547 a 25 mg/kg Los resultados también indicaron que los agentes de iARN AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547 lograron concentraciones similares o mayores en el hígado cuando se administraron subcutáneamente que cuando se administraron mediante bolo IV. Los parámetros farmacoc inét icos hepáticos se presentan en las Tablas 5 y 6 a continuación. La concentr ción pico (Cmáx) y el área bajo la curva (AUC0-úit) en el hígado fueron dos a tres veces más altas después de la administración subcutánea en comparación con la administración IV del mismo agente a la misma dosis. La exposiciones en el hígado fueron más altas para AD-51547 y más bajas para AD-51545. El tiempo de permanencia medio (MRT) y la semivida de eliminación fueron mayores para AD-51546 y AD-51547 en comparación con AD-51544 y AD-51545. Luego de la administración subcutánea, MRT aproximados fueron 40 horas para AD-51546 y 25 horas para AD-51547, mientras que los MRT para AD-51544 y AD-51545 fueron menores (aproximadamente 6-9 horas) . La semivida de eliminación de AD-51546 y AD-51547 también fue más alta (41-53 horas) que la semivida de eliminación de AD-51544 y AD-51545 (6-10 horas) .
Tabla 5: Resumen de estimaciones de parámetros f armacocinét icos en hígado después de la administración SC de ARNip de TTR-GalNAc en ratones Tabla 6 : Parámetros farmacocinéticos de ARNip en hígado en ratones después de un bolo IV o dosis SC de AD- 51544, 51545, 51546 o 51547 a 25 mg/kg Ejemplo 8: Estabilidad in vitro de agentes de iARN en suero de mono La estabilidad en suero de los agentes de iARN AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547 también se evaluó en monos. Los resultados demostraron que las hebras antisentido y sentido de AD-51544, AD-51545 y AD-51547 mostraron estabilidad en suero en un período de aproximadamente 24 horas (datos no se muestran) .
Ejemplo 9: Agentes de iARN Producen supresión duradera de proteína TTR en primates no humanos La actividad de silenciamiento de ARN de agentes de iARN AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547 se evaluó midiendo la supresión de proteína TTR en suero de monos cynomolgus luego de la administración subcutánea de cinco dosis de 5 mg/kg (una dosis cada día durante 5 días) o una sola dosis de 25 mg/kg. Los niveles de proteína TTR pre-dosis en suero se evaluaron promediando los niveles a los 11 días antes de la primera dosis, 7 días antes de la primera dosis y 1 día antes de la primera dosis. Los niveles post-dosis en suero de proteína TTR se evaluaron determinando el nivel en suero a partir de 1 día después de la dosis final (es decir, el día 5 del estudio en el grupo de 5x5 mg/kg y el día 1 del estudio en el grupo de 1x25 mg/kg) hasta 49 días después de la última dosis (es decir, día 53 del estudio en el grupo de 5x5 mg/kg y día 49 del estudio en el grupo de 1x25 mg/kg) . Ver la Figura 13.
Los niveles de proteína TT se evaluaron como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Figura 14 y en las Tablas 7 y 8.
Se alcanzó una supresión de proteína TTR de hasta aproximadamente 50% en los grupos que recibieron 25 mg/kg de AD-45163, AD-51544, AD-51546 y AD-51547 (ver la Tabla 8) . Se alcanzó una mayor supresión de proteína TTR máxima de aproximadamente 70% en los grupos que recibieron 5x5 mg/kg de AD-45163, AD-51544, AD-51546 y AD-51547 (ver la Tabla 7) . El agente AD-51545 produjo un menor grado de supresión en ambos protocolos de administración. Una supresión significativa de aproximadamente 20% o más persistió por hasta 49 días después de la última dosis de AD-51546 y AD-51547 en ambos protocolos de 1x25 mg/kg y 5x5 mg/kg. En general, se logró una mejor supresión en el protocolo de 5x5 mg/kg que en el protocolo de 1x25 mg/kg.
Tabla 7. Transtlretina en suero de fracciones con relación a la pre-dosis en monos cynomolgus (5 mg/kg por día durante 5 días) 5 10 15 Tabla 8 Transtiretina en suero de fracciones con relación a la pre-dosis en monos cynomolgus (25 mg/kg) 5 10 15 Ejemplo 10: Tolerabilidad de agentes de iARN que se dirigen a TTR Evaluación en citoquina en ensayo de sangre entera Para evaluar la tolerabilidad de agentes de iARN que se dirigen a TTR (incluidos AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547) , cada agente se evaluó en un ensayo de sangre entera usando sangre de tres donantes humanos . Los agentes son reactivo transfectado DOTAP 300 nM o 1 µ? sin transfección (ARNip libre) . Se produjo un cambio menor que 2x para las siguientes citoquinas/quimioquinas : G-CSF, IFN-?, IL-10, IL-12 (p70), IL1 , IL-lra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, ???-?a, ???-?ß, TNF . (Los resultados no se muestran).
Evaluación in vivo Para evaluar la tolerabilidad in vivo se inyectaron agentes de iARN subcutáneamente en ratones CDl a una dosis de 125 mg/kg. No se observó inducción de citoquina a las 2, 4, 6, 24 o 48 horas después de la inyección subcutánea de AD-45163. No se observó una inducción de citoquina significativa a las 6 o 24 horas después de la inyección subcutánea de AD-51544, AD-51545, AD-51546 o AD-51547.
Para evaluar adicionalmente in vivo la tolerabilidad, múltiples agentes de iARN (incluidos AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547) se evaluaron mediante inyección subcutánea de 5 y 25 mg en primates no humanos (monos cynomolgus) con volúmenes de dosis entre 1-2 mi por sitio. No se observaron eritremas ni edemas en los sitios de inyección.
Estudio de tolerabilidad en ratas con dosis única SC Para evaluar la toxicidad se inyectaron ratas con una sola dosis subcutánea de 100, 250, 500 o 750 mg/kg de AD-45163 (ver la Tabla 9) . Se realizaron las siguientes evaluaciones: signos clínicos de toxicidad, peso corporal, hematología, química clínica y coagulación, peso de órganos (hígado y baso) ; evaluación a grandes rasgos y microscópica (riñon, hígado, pulmón, nodo linfático, bazo, testículos, timo, aorta, corazón, intestinos (delgado y grueso) .
Tabla 9: Estudio de tolerabilidad en ratas con dosis única SC: 100, 250, 500 y 750 mg/kg de AD-45163 in ratas Sprague Dawley Los resultados no mostraron ningún signo clínico de toxicidad, efecto en el peso corporal, peso de órganos o química clínica relacionados con el artículo de prueba. No se observó histopatología en corazón, ríñones, testículos, bazo, hígado y timo. Se produjo un leve aumento en el recuento de glóbulos blancos no adverso relacionado con el artículo de prueba (†68%, principalmente atribuido al aumento en NEUT y MONO) con 750 mg/kg. Estos resultados indican que una dosis única de hasta 750 mg/kg es bien tolerada en ratas.
Tolerabilidad de administraciones subcutáneas repetidas en ratas Para evaluar la tolerabilidad de administraciones subcutáneas repetidas de AD-45163 se administraron inyecciones subcutáneas de 300 mg/kg durante 5 días y se realizó una necropsia en el día 6. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 10.
Tabla 10: Estudio de tolerabilidad de dosis repetidas en rata Se evaluaron las siguientes variables resultantes: signos clínicos, pesos corporales, hematología, química clínica y coagulación, peso de órganos, evaluación a grandes rasgos y microscópica (hígado, bazo, riñon, corazón, tracto GI y primer y último sitio de inyección) . Los resultados no mostraron signos clínicos ni efectos en el peso corporal o en el peso de los órganos relacionados con el artículo de prueba y tampoco hallazgos relacionados con el artículo de prueba en la hematología o química clínica. Se produjo una posible prolongación leve del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) el día 6 (20.4 vs . 17.4 seg) . La histopatología no reveló ningún hallazgo relacionado con el artículo de prueba en el hígado, bazo, corazón y tracto GI . En el riñon, se observó una hipertrofia mínima a leve del epitelio tubular (no adversa) . En el último sitio de inyección hubo una infiltración mononuclear multifocal mínima no adversa. Estos resultados indican que cinco dosis diarias de 300 mg/kg del agente de iAR base AD-45163 fueron bien toleradas en ratas .
Ejemplo 11: Agentes de iARN producen supresión duradera de proteína TTR en primates no humanos La actividad de silenciamiento de ARN del agente de iARN AD-51547 se evaluó midiendo la supresión de proteína TTR en suero de monos cynomolgus luego de la administración subcutánea de una "fase de carga" del agente de iARN: cinco dosis diarias de 2.5 mg/kg, 5 mg/kg o 10 mg/kg (una dosis cada día durante 5 días) seguida de una "fase de mantenimiento" del agente de iARN: dosificación semanal de 2.5 mg/kg, 5 mg/kg o 10 mg/kg durante 4 semanas. Los niveles de proteína TTR en suero pre-dosis se evaluaron promediando los niveles a los 11 días antes de la primera dosis, 7 días antes de la primera dosis y 1 día antes de la primera dosis. Los niveles de proteína TTR en suero post-dosis se evaluaron determinando el nivel en suero con relación a la pre-dosis comenzando el día 1 después de que la fase de carga se había completado hasta el día 40 después de la última dosis de la fase de mantenimiento (es decir, el día 70 del estudio) .
Los niveles de proteína TTR se evaluaron como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Figura 15.
Se alcanzó una supresión de proteína TTR de hasta aproximadamente 80% en todos los grupos que recibieron 2.5 mg/kg, 5 mg/kg o 10 mg/kg de AD-51547. Se alcanzó el silenciamiento en el nadir en todos los grupos aproximadamente el día 14, la supresión experimentada en niveles de silenciamiento en el nadir con una dosis de mantenimiento semanal de 2.5 mg/kg, 5 mg/kg o 10 mg/kg de AD-51547. Los niveles de TTR no habían vuelto al valor del inicio más de 40 días después de la administración de la última dosis de mantenimiento para los niveles de dosis de 5 y 2.5 mg/kg.
Equivalentes : Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando simplemente experimentación rutinaria, numerosos equivalentes de las modalidades y los métodos específicos descritos en la presente. Se pretende que los equivalentes queden comprendidos por el alcance de las siguientes reivindicaciones.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (114)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un agente de iARN de doble hebra, caracterizado porque comprende una hebra sentido complementaria a una hebra antisentido, en donde la hebra antisentido comprende una región complementaria a una parte de una transtiretina que codifica AR m (TTR) , en donde cada hebra tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleotidos, en donde el agente de iARN de doble hebra se representa mediante la fórmula (III) : sentido: 5· np -Na -(X X X) ±-Nb -Y Y Y -Nb - (Z Z Z)-¡ -Na -nq 3 ' antisentido: 3' np ' -Na ' - (X 'X 'X ' ) k-Nb ' -Y ' Y ? ' -Nb ' - (Z'Z'Zr)i-Na'- nq' 5' (III) en donde : i/ j/ k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; P' P' / q y q' son cada uno independientemente 0-6; cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleotidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleotidos modificados de diferente forma; cada Nb y b' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos; cada np, np ' , nq y nq' independientemente representa un nucleótido saliente; cada XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y ' Y ' Y ' y Z'Z'Z' independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos; las modificaciones en b difieren de la modificación en Y y modificaciones en Nb' difieren de la modificación en Y'; y en donde la hebra sentido se conjuga con al menos un ligando.
2. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque i es 1; j es 1; o tanto i como j son 1.
3. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque k es 1; 1 es 1; o tanto k como 1 son 1.
. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque XXX es complementario a X'X'X', YYY es complementario a Y'Y'Y' y ZZZ es complementario a Z'Z'Z'.
5. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el motivo YYY se encuentra en o cerca del sitio de escisión de la hebra sentido .
6. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el motivo Y'Y'Y' se encuentra en las posiciones 11, 12 y 13 de la hebra antisentido del extremo 5' .
7. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el Y' es 2'-0-metilo.
8. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fórmula (III) se representa como la fórmula (Illa) : sentido: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3' antisentido: 3' np ' -Na ' -Y ? ? ' -Nb ' -Z ' Z ' Z ' -Na ' nq ' 5' (Illa) en donde cada Nb y Nb ' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados .
9. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fórmula (III) se representa como la fórmula (Illb) : sentido: 5· np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Na-nq 3' antisentido: 3' np ' -Na ' -X 'X 'X ' -Nb ' -Y ' Y 'Y ' -Na ' -nq ' 5' (Illb) en donde cada Nb y Nb ' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados .
10. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fórmula (III) se representa como la fórmula (lile) : sentido: 5' np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Nb-Z Z Z -Na-nq 3' antisentido: 3' np ' -Na ' -X 'X 'X ' -Nb ' -Y ? 'Y ' -Nb ' -Z ' Z ' Z ' -Na ' -nq ' 5 ' (Ule) en donde cada N y N ' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados y cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-10 nucleótidos modificados .
11. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las regiones dúplex tienen 15-30 pares de nucleótidos de longitud.
12. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las regiones dúplex tienen 17-23 pares de nucleótidos de longitud.
13. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las regiones dúplex tienen 17-25 pares de nucleótidos de longitud.
1 . El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las regiones dúplex tienen 23-27 pares de nucleótidos de longitud.
15. El agente de iAR de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las regiones dúplex tienen 19-21 pares de nucleótidos de longitud.
16. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las regiones dúplex tienen 21-23 pares de nucleótidos de longitud.
17. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada hebra tiene 15-30 nucleótidos.
18. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las modificaciones en los nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-0-alquilo, 2'-0-alilo, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo y combinaciones de los mismos.
19. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las modificaciones en los nucleótidos son 2'-0-metilo, 2'-fluoro o ambos.
20. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazante ramificado bivalente o trivalente.
21. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando es
22. El agente de iAR de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando está unido al extremo 3' de la hebra sentido.
23. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el agente de iARN se conjuga con el ligando tal como se muestra en el siguiente esquema en donde X es 0 o S .
24. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente de iARN se conjuga con el ligando tal como se muestra en el siguiente esquema
25. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque adicionalmente comprende al menos una conexión internucleotidos de fosforotioato o metilfosfonato .
26. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la conexión internucleotidos de fosforotioato o metilfosfonato está en el extremo terminal 3' de una hebra.
27. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la hebra es la hebra an isentido .
28. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la hebra es la hebra sentido .
29. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el par de bases en la posición 1 del extremo 5' de la hebra antisentido del dúplex es un par de bases AU.
30. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los nucleótidos Y contienen una modificación 2'-fluoro.
31. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los nucleótidos Y' contienen una modificación 2'-0-metilo.
32. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque p'>0.
33. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque p'=2.
34. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque q'=0, p=0, q=0 y los nucleótidos salientes p' son complementarios al ARNm objetivo.
35. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque q'=0, p=0, q=0 y los nucleótidos salientes p' no son complementarios al ARNm obj etivo .
36. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la hebra sentido tiene un total de 21 nucleótidos y la hebra antisentido tiene un total de 23 nucleótidos.
37. El agente de iARN de cualquiera de las reivindicaciones 32-36, caracterizado porque al menos un np ' está unido a un nucleótido cercano mediante una conexión de fosforotioato .
38. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque todos los n ' están unidos a nucleótidos cercanos mediante conexiones de fosforotioato .
39. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo de agentes de iARN que figuran en la Tabla 1.
40. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547
41. El agente de iARN de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el agente de iARN es AD-51547.
42. Una célula caracterizada porque contiene el agente de iARN de doble hebra de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41.
43. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un agente de iARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41.
44. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el agente de iARN se administra en una solución sin amortiguar.
45. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la solución sin amortiguar es solución salina o agua.
46. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el ARNip se administra con una solución amortiguadora.
47. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la solución amortiguadora comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos.
48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la solución amortiguadora es solución salina amortiguada con fosfato (PBS) .
49. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición farmacéutica es un liposoma.
50. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición farmacéutica es una formulación lipídica.
51. Un método para inhibir la expresión de una transtiretina (TTR) en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un agente de iARN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, o con una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 43 a 50, en una cantidad efectiva para la expresión de la transtiretina (TTR) en la célula.
52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la expresión de la TTR se inhibe al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90%.
53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la célula se pone en contacto in vitro con el agente de iARN.
54. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la célula está presente dentro de un sujeto.
55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el sujeto es un humano.
56. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el sujeto padece una enfermedad asociada a TTR y la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva.
57. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el sujeto es un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a TTR y la cantidad efectiva es una cantidad profilácticamente efectiva.
58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el sujeto porta una mutación del gen de TTR que se asocia con el desarrollo de una enfermedad asociada a TTR.
59. El método de conformidad con la reivindicación 56 o 57, caracterizado porque la enfermedad asociada a TTR se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis sistémica senil (ASS) , amiloidosis familiar sistémica, polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) , cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF) , amiloidosis leptomeníngea/del Sistema Nervioso Central (SNC) e hipertiroxinemia .
60. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el sujeto tiene una amiloidosis asociada a TTR y el método reduce un depósito de TTR amiloide en el suj eto .
61. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el agente de iAR se administra a el sujeto mediante un medio de administración que se selecciona del grupo que consiste en subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrabronquial , intrapleural , intraperitoneal , intraarterial , linfática, cerebroespinal y cualquier combinación de las mismas.
62. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el agente de iARN se administra a el sujeto mediante administración subcutánea, intramuscular o intravenosa.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la administración subcutánea comprende administración mediante bomba subcutánea o depósito subcutáneo .
64. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el agente de iARN se administra a el sujeto, de forma tal que el agente de iARN se libera en un sitio específico dentro de el sujeto.
65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el sitio se selecciona del grupo que consiste en hígado, plexo coroideo, retina y páncreas.
66. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el sitio es el hígado.
67. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la liberación de el agente de iARN es mediada por un receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) presente en hepatocitos.
68. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el agente de iARN se administra a una dosis de 0.05-50 mg/kg.
69. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el agente de iARN se administra en dos o más dosis.
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el agente de iARN se administra a intervalos que se seleccionan del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas y una vez cada aproximadamente 96 horas.
71. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque adicionalmente comprende evaluar el nivel de expresión de ARNm de TTR o expresión de proteína TTR en una muestra derivada del sujeto.
72. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la administración de el agente de iARN no resulta en una respuesta inflamatoria en el sujeto tal como se evalúa en base al nivel de una citoquina o quimioquina seleccionada del grupo que consiste en G-CSF, IFN-?, IL-10, IL-12 (p70) , ILi , IL-lra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, ???-?a, ???-?ß, TNFa y cualquier combinación de las mismas, en una muestra de el sujeto.
73. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el agente de iARN se administra utilizando una composición farmacéutica.
74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el ARNip se administra en una solución sin amortiguar .
75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque la solución sin amortiguar es solución caracterizado porque la solución sin amortiguar es solución salina o agua.
76. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el ARNip se administra con una solución amortiguadora.
77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la solución amortiguadora comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos.
78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la solución amortiguadora es solución salina amortiguada con fosfato (PBS) .
79. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la composición farmacéutica es un liposoma.
80. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a el sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un agente de iARN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, o una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 43 a 50, tratando o previniendo así la enfermedad asociada a TTR en el sujeto.
81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la expresión de TTR en una muestra al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90%.
82. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el sujeto es un humano.
83. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el sujeto es un sujeto que padece una enfermedad asociada a TTR.
84. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el sujeto es un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a TTR.
85. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el sujeto porta un gen de la mutación de TTR que se asocia con el desarrollo de una enfermedad asociada a TTR.
86. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la enfermedad asociada a TTR se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis sistétnica senil (ASS) , amiloidosis familiar sistémica, polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) , cardiomiopatía amiloidótica familiar (CAF) , amiloidosis leptomeníngea/del Sistema Nervioso Central (SNC) e hipertiroxinemia .
87. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el sujeto tiene una amiloidosis asociada a TTR y el método reduce un depósito de TTR amiloide en el sujeto.
88. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente de iAR se administra a el sujeto mediante un medio de administración que se selecciona del grupo que consiste en subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrabronquial , intrapleural , intraperitoneal , intraarterial , linfática, cerebroespinal y cualquier combinación de las mismas.
89. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente de iARN se administra a el sujeto mediante administración subcutánea, intramuscular o intravenosa .
90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la administración subcutánea comprende administración mediante bomba subcutánea o depósito subcutáneo .
91. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente de iARN se administra a el sujeto, de forma tal que el agente de iARN se libera en un sitio específico dentro de el sujeto.
92. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque el sitio se selecciona del grupo que consiste en hígado, plexo coroideo, retina y páncreas. 93. El método de conformidad con la reivindicación 91,
93. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque el sitio es el hígado.
94. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque la liberación de el agente de iARN es mediada por un receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) presente en hepatocitos.
95. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente de iARN se administra a una dosis de 0.05-50 mg/kg.
96. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente de iARN se administra en dos o más dosis
97. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque el agente de iARN se administra a intervalos que se seleccionan del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas y una vez cada aproximadamente 96 horas.
98. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque adicionalmente comprende evaluar el nivel de expresión de ARNm de TTR o expresión de proteína TTR en una muestra derivada del sujeto.
99. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la administración de el agente de iARN no resulta en una respuesta inflamatoria en el sujeto tal como se evalúa en base al nivel de una citoquina o quimioquina seleccionada del grupo que consiste en G-CSF, IFN-?, IL-10, IL-12 (p70), ILip, IL-lra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, ???-? , ???-?ß, TNFa y cualquier combinación de las mismas, en una muestra de el sujeto.
100. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente de iARN se administra utilizando una composición farmacéutica.
101. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el ARNip se administra en una solución sin amortiguar.
102. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la solución sin amortiguar es solución salina o agua.
103. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el ARNip se administra con una solución amortiguadora .
104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la solución amortiguadora comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos.
105. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la solución amortiguadora es solución salina amortiguada con fosfato (PBS) .
106. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la composición farmacéutica es un liposoma .
107. Un método para inhibir la expresión de transtiretina (TTR) en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un agente de iARN de doble hebra en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en la célula, caracterizado porque el agente de iARN de doble hebra se selecciona del grupo de agentes de iARN que figuran en la Tabla 1, inhibiendo así la expresión de transtiretina (TTR) en la célula.
108. Un método para inhibir la expresión de transtiretina (TTR) en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un agente de iARN de doble hebra en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en la célula, caracterizado porque el agente de iARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547, inhibiendo así la expresión de transtiretina (TTR) en la célula.
109. Un método para inhibir la expresión de transtiretina (TTR) en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un agente de iARN de doble hebra en una cantidad efectiva para inhibir la expresión de TTR en la célula, en donde el agente de iARN de doble hebra es AD-51547, inhibiendo así la expresión de transtiretina (TTR) en la célula.
110. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a el sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un agente de iARN de doble hebra donde el agente de iARN de doble hebra se selecciona del grupo de agentes que figuran en la Tabla 1, tratando o previniendo así una enfermedad asociada a TTR en el sujeto.
111. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a el sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un agente de iARN de doble hebra, en donde el agente de iARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en AD-51544, AD-51545, AD-51546 y AD-51547, tratando o previniendo así una enfermedad asociada a TTR en el sujeto.
112. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a TTR en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a el sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un agente de iARN de doble hebra, en donde el agente de iARN de doble hebra es AD-51547, tratando o previniendo así una enfermedad asociada a TTR en el sujeto.
113. Un kit para llevar a cabo el método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende a) el agente de iARN, e b) instrucciones para su uso.
114. Un kit para llevar a cabo el método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque comprende a) el agente de iARN, b) instrucciones para su uso, y c) opcionalmente , medios para administrar el agente de iARN a el sujeto.
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