CN116479108A - Mettl3在调控braf介导的炎症反应中的应用 - Google Patents

Mettl3在调控braf介导的炎症反应中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及METTL3在调控BRAF介导的炎症反应中的应用。本发明首次发现巨噬细胞特异性Mettl3敲除抑制了动脉粥样硬化的进展和体内炎症反应。在体外，发现METTL3升高了ox‑LDL诱导的腹腔巨噬细胞中的炎症因子水平。在机制上，证明METTL3靶向Braf mRNA，促进了它的m6A修饰。进一步的研究发现，YTHDF1可以识别修饰的Braf mRNA，促进其蛋白的表达水平。本发明揭示了METTL3在巨噬细胞中调节BRAF的新机制，并为动脉粥样硬化性心血管疾病的预防和治疗提供了潜在的靶点，因此具有良好的潜在实际应用价值。

Description

METTL3在调控BRAF介导的炎症反应中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及METTL3在调控BRAF介导的炎症反应中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
动脉粥样硬化是一种多种细胞参与的慢性炎症性疾病，其中巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块的进展中起着重要作用。在动脉粥样硬化的形成中，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可以激活巨噬细胞的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。MAPK信号通路的活化会引起巨噬细胞释放大量的炎症因子，促进动脉粥样硬化的形成。临床研究证实IL-1β中和抗体在治疗心血管疾病中有效。因此，探索MAPK信号通路的新调控机制具有重要的科学意义和临床价值。
m6A修饰是真核细胞中最常见的RNA修饰类型。m6A修饰是一种可逆的修饰，由m6A甲基转移酶催化，m6A结合蛋白识别，m6A去甲基化酶去除。甲基转移酶样3(METTL3)是研究最广泛的m6A甲基转移酶，具有催化活性。m6A结合蛋白有多种，其中包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3。YTHDF1通过与翻译起始因子和核糖体相互作用促进mRNA翻译。YTHDF2通过识别编码区、终止密码子区和3′非翻译区(UTR)中m6A修饰的腺嘌呤位点促进靶RNA降解。YTHDF3调节靶RNA降解和翻译。
许多研究表明METTL3参与心血管生物学和疾病。然而，关于METTL3在动脉粥样硬化中作用的研究仍然有限。同时，METTL3在巨噬细胞中的作用尚未完全阐明。BRAF是MAPK信号通路中的重要分子，可以诱导MEK1/2和ERK1/2的磷酸化。BRAF在肿瘤细胞的增殖中起着重要的作用，是许多疾病的关键治疗靶点。因此，已有许多关于BRAF表达调节的研究。磷酸化、泛素化和乙酰化是调节BRAF功能的重要翻译后修饰。m6A甲基化是RNA命运的重要调节因子。然而，它是否调节Braf mRNA尚未报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供METTL3在调控BRAF介导的炎症反应中的应用。本发明通过研究发现，巨噬细胞中的METTL3在炎症反应和动脉粥样硬化中起重要作用。METTL3通过靶向Braf mRNA来调节RAS/RAF/MEK/ERK通路激活。YTHDF1蛋白结合被m6A修饰的Braf mRNA促进其翻译。上述研究揭示了METTL3在巨噬细胞中调节BRAF的新机制，并为动脉粥样硬化性心血管疾病的预防和治疗提供了潜在的靶点。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供检测METTL3编码基因和/或METTL3编码基因表达产物表达水平的物质在制备筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预测MAPK相关炎症疾病进展产品中的应用。
其中，所述METTL3来源于巨噬细胞，具体的，本发明研究发现，在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞随着斑块进展，其蛋白水平显著上调；进一步基于ox-LDL刺激巨噬细胞，结果其中的METTL3以时间依赖的方式增加，表明METTL3参与巨噬细胞功能和动脉粥样硬化的发展，因此其可用于动脉粥样硬化等相关炎症疾病的筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预后评估。也因此，本发明中，MAPK相关炎症疾病包括动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的心血管相关疾病(如冠心病、心肌梗塞、脑梗死、脑出血等)。
本发明的第二个方面，提供一种用于筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预测炎症相关疾病进展的产品，其包含基于基因测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于原位杂交方法检测受试者METTL3编码基因的转录；或基于免疫检测方法检测受试者METTL3表达情况的物质。
所述产品可以为试剂盒。
本发明的第三个方面，提供抑制METTL3编码基因及其表达产物表达和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a6)至少一种中的应用：
a1)降低炎症因子表达或制备降低炎症因子表达的产品；
a2)抑制炎症反应或制备抑制炎症反应的产品；
a3)抑制BRAF蛋白的表达或制备抑制BRAF蛋白的表达的产品；
a4)抑制Braf mRNA的m6A修饰或者制备抑制Braf mRNA的m6A修饰的产品；
a5)抑制YTHDF1的表达或制备抑制YTHDF1表达的产品；
a6)制备治疗MAPK相关炎症疾病的产品。
其中，
所述a1)中，所述炎症因子包括但不限于IL-1β、IL-6和TNF-α；所述炎症因子具体源自动脉粥样硬化斑块；更具体为动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞。
所述a2-a3)中，本发明通过研究发现，METTL3可通过激活ERK途径加剧腹腔巨噬细胞的炎症反应，进一步研究确定，METTL3实际通过调节BRAF蛋白的表达促进巨噬细胞炎症。
所述a4)中，所述Braf mRNA的m6A修饰位点具体为Braf mRNA CDS区的39725126(6号染色体)处的腺嘌呤。
所述a5)中，本发明通过研究发现，YTHDF1参与炎症调节，YTHDF1结合Braf mRNA，METTL3通过YTHDF1促进Braf mRNA翻译。
所述a6)中，MAPK相关炎症疾病包括动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的心血管相关疾病(如冠心病、心肌梗塞、脑梗死、脑出血等)。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。诸如该产品用于构建MAPK炎症相关细胞、组织或动物模型，通过调控METTL3的表达研究BRAF介导的炎症相关反应等，从而具有良好的实际应用价值。
也因此，上述产品开发为药物，其可能是未来改善动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的其他心血管疾病的重要策略。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案构建了Apoe-/-背景下的巨噬细胞特异性Mettl3敲除小鼠。上述技术方案首次发现巨噬细胞特异性Mettl3缺失抑制了动脉粥样硬化的进展和体内炎症反应。在体外，发现METTL3升高了ox-LDL诱导的腹腔巨噬细胞中的炎症因子水平。在机制上，通过甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)和甲基化RNA的免疫沉淀定量聚合酶链反应(MeRIP-qPCR)，证明METTL3靶向Braf mRNA，促进了它的m6A修饰。进一步的研究发现，YTHDF1可以识别修饰的Braf mRNA，促进其蛋白的表达水平。
总之，上述技术方案揭示了METTL3在巨噬细胞中调节BRAF的新机制，并为动脉粥样硬化性心血管疾病的预防和治疗提供了潜在的靶点，因此具有良好的潜在实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例中巨噬细胞中的METTL3在ox-LDL刺激和动脉粥样硬化进展的过程中上调。
A、不同时间点动脉粥样硬化斑块Mo_Ma中Mettl3的表达水平。B、不同时间点动脉粥样硬化斑块中Mettl3+巨噬细胞的数量和比例。C、在不同时期高脂饮食的Apoe-/-小鼠的主动脉根部冷冻切片中巨噬细胞中METTL3的表达(n＝5)。比例尺＝100μm。D、在75μg/mlox-LDL刺激的腹腔巨噬细胞中m6A修饰的斑点印记实验。亚甲蓝染色作为对照。H、METTL3在氧化密度不同刺激时间的巨噬细胞中的表达(n＝5)。E、METTL3在氧化低密度不同刺激时间的RAW细胞中的表达(n＝5)。K、METTL3在氧化低密度不同刺激时间的腹腔巨噬细胞中表达的免疫荧光图像。比例尺＝100μm。
图2是本发明实施例中巨噬细胞特异性METTL3缺失减少动脉粥样硬化斑块形成。
Mettl3fl/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl Apoe-/-小鼠从8周龄开始进行高脂饮食,共14周。A、Mettl3fl/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠和同窝对照Mettl3f1/flApoe-/-小鼠腹腔巨噬细胞中METTL3蛋白水平(n＝3)。B、两组小鼠的体重(n＝8)。C、两组小鼠的血清中TG、CHO、HDL和LDL水平(n＝8)。D、两组小鼠主动脉弓及其分支中动脉粥样硬化斑块的代表性照片(n＝8)。E和F，两组小鼠的主动脉根部动脉粥样硬化病变区域的代表性HE染色图像和定量(n＝8)。比例尺＝100μm。G和H，两组小鼠的主动脉根部油红O染色代表性图像和定量(n＝8)。比例尺＝100μm。I和J，两组小鼠的整个主动脉动脉粥样硬化病变的油红O染色代表性图像和定量(n＝8)。K至M，masson染色的代表性图像以及两组主动脉根部胶原含量和坏死面积比率的量化。比例尺＝100μm。N和O，两组小鼠的主动脉根部MOMA2表达的代表性免疫荧光图像和定量(n＝7)。比例尺＝100μm。
图3是本发明实施例中METTL3在体内外加重巨噬细胞介导的炎症反应。
A和B，两组小鼠的主动脉根部切片中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平的代表性免疫组织化学染色图像和分析(n＝8)。比例尺＝100μm。C、用ox-LDL刺激Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠的腹腔巨噬细胞24小时后进行斑点印迹分析。亚甲蓝染色作为对照(n＝3)。D、ELISA检测Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠的腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平(n＝5)。E、用ox-LDL刺激两组的腹腔巨噬细胞中Il-1β、Il-6和Tnf-αmRNA水平的RT-qPCR分析。F、用ox-LDL刺激(24小时)的两组腹腔巨噬细胞中的m6A的斑点印迹分析。亚甲蓝染色作为对照(n＝3)。G、ELISA检测ox-LDL刺激指定时间的两组腹腔巨噬细胞的上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平(n＝5)。H、RT-qPCR分析用ox-LDL刺激指定时间的两组腹腔巨噬细胞中的Il-1β、Il-6和Tnf-αmRNA水平(n＝5)。
图4是本发明实施例中METTL3促进ox-LDL诱导的ERK通路活化。
A和B，ox-LDL刺激Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠的腹腔巨噬细胞中ERK、JNK和P38磷酸化水平的代表性的Western印迹图像以及定量(n＝5)。C、用ox-LDL刺激Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠的腹腔巨噬细胞中Mek1和Mek2mRNA水平的RT-qPCR分析(n＝5)。D和E、Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠的腹腔巨噬细胞中的MEK1和MEK2磷酸化水平(n＝5)。F和G、用Ad-GFP、Ad-Mettl3或Ad-Mett3-MDT预处理24小时后用ox-LDL刺激腹腔巨噬细胞中的ERK、MEK1和MEK2磷酸化水平(n＝5)。H、用Ad-GFP和Ad-Mettl3预处理24小时后用ox-LDL刺激的腹腔巨噬细胞中Il-1β、Il-6和Tnf-αmRNA水平的RT-qPCR分析(n＝5)。
图5是本发明实施例中METTL3通过调节BRAF蛋白表达影响炎症反应。
A和B，ox-LDL刺激Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠的腹腔巨噬细胞中ARAF、BRAF、CRAF、HRAS、KRAS和NRAS水平的代表性Western印迹图像和定量。(n＝5)C、ox-LDL刺激的Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠腹腔巨噬细胞中BrafmRNA水平的RT-qPCR分析(n＝5)。D和E，感染Ad-GFP、Ad-Mettl3或Ad-Mett3-MDT的腹腔巨噬细胞中BRAF水平(n＝5)。F和G，感染Ad-GFP的Mettl3fl/fl小鼠的腹腔巨噬细胞和感染Ad-GFP、Ad-Mettl3或Ad-Mett3-MDT的Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠的巨噬细胞中BRAF水平的代表性蛋白质印迹图像和定量(n＝5)。H，Mettl3fl/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠和同窝对照Mettl3f1/flApoe-/-小鼠的主动脉根部切片中巨噬细胞BRAF蛋白水平的代表性免疫荧光图像和定量(n＝8)。比例尺＝100μm。I，RT-qPCR分析感染Ad-GFP的Mettl3fl/fl小鼠的ox-LDL刺激的腹腔巨噬细胞以及感染Ad-GFP或Ad-Braf-WT的Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠的巨噬细胞的Il-1β、Il-6和Tnf-αmRNA水平，(n＝5)。
图6是本发明实施例中METTL3介导Braf mRNA的甲基化。
A、通过巨噬细胞中m6A测序鉴定的m6A修饰位置的碱基序列。B、两组中不同m6A峰的位置百分比。C、MeRIP-seq对腹腔巨噬细胞的GO富集分析。D、腹腔巨噬细胞中m6A-seq结果中的Braf mRNA中m6A修饰的丰度和位置。E、用siNC或siMettl3处理的腹腔巨噬细胞中Braf mRNA的MeRIP-qPCR分析(n＝4)。F、MeRIP-qPCR扩增产物的代表性琼脂糖凝胶电泳图像(n＝4)。G、Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠腹腔巨噬细胞中BrafmRNA的MeRIP-qPCR分析(n＝4)。H、MeRIP-qPCR扩增产物的代表性琼脂糖凝胶电泳图像(n＝4)。H、Braf-MUT1和Braf-MUT2 mRNA碱基序列示意图。J和K，用Flag-Mettl3或对照载体质粒预处理后用GFP-Braf-WT、GFP-Braf-MUT1或GFP-Braf-MUT2感染的HEK293T细胞中GFP蛋白水平的代表性蛋白质印迹图像和定量(n＝5)。L、Ad-GFP或Ad-Braf-MUT1感染的腹腔巨噬细胞中Braf mRNA水平的RT-qPCR分析(n＝5)。M、GFP-Braf WT或GFP-Braf-MUT1感染的腹腔巨噬细胞中Il-1β、Il-6和Tnf-αmRNA水平的RT-qPCR分析(n＝5)。
图7是本发明实施例中METTL3通过YTHDF1增强Braf mRNA的翻译。
A、Mettl3fl/fl Lyz2Cre小鼠和同窝对照Mettl3f1/fl小鼠的腹腔巨噬细胞细胞核和细胞质中Braf mRNA水平比率的RT-qPCR分析(n＝6)。B、用放线菌素D(10μg/ml)处理的两组细胞的Braf mRNA的表达分析(n＝3)。C、用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺CHX(5μg/ml)处理后BRAF的降解的代表性图片及分析。D、用NC siRNA或Ythdf1 siRNA处理的巨噬细胞中BrafmRNA水平的RT-qPCR分析(n＝6)。E、用NC-siRNA或Ythdf2-siRNA处理的腹腔巨噬细胞中Braf mRNA水平的RT-qPCR分析(n＝6)。F、用NC siRNA或Ythdf3 siRNA处理的腹腔巨噬细胞中Braf mRNA水平的RT-qPCR分析(n＝6)。G和H，用NC siRNA或Ythdf1 siRNA处理的腹腔巨噬细胞中BRAF蛋白水平的代表性蛋白质印迹图像和定量(n＝5)。I和J，用NC siRNA或Ythdf2 siRNA处理的腹腔巨噬细胞中BRAF蛋白水平的代表性蛋白质印迹图像和定量(n＝5)。K和L，用NC siRNA或Ythdf3 siRNA处理的腹腔巨噬细胞中BRAF蛋白水平的代表性蛋白质印迹图像和定量(n＝5)。M和N，用NC siRNA或Ythdf1 siRNA预处理后用75μg/ml ox-LDL刺激腹腔巨噬细胞后的ERK磷酸化水平的蛋白印记图片及分析(n＝5)。O、Braf mRNA与YTHDF1抗体或对照IgG的免疫沉淀实验。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，检测METTL3编码基因和/或METTL3编码基因表达产物表达水平的物质在制备筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预测MAPK相关炎症疾病进展产品中的应用。
其中，所述METTL3来源于巨噬细胞，具体的，本发明研究发现，在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞随着斑块进展，其蛋白水平显著上调；进一步基于ox-LDL刺激巨噬细胞，结果其中的METTL3以时间依赖的方式增加，表明METTL3参与巨噬细胞功能和动脉粥样硬化的发展，因此其可用于动脉粥样硬化等相关炎症疾病的筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预后评估。也因此，本发明中，MAPK相关炎症疾病包括动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的心血管相关疾病(如冠心病、心肌梗塞、脑梗死、脑出血等)。
所述METTL3编码基因及其表达产物可以为人源和非人哺乳动物(如小鼠等)源；METTL3编码基因的表达产物显然可以是甲基转移酶样蛋白3。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预测炎症相关疾病进展的产品，其包含基于基因测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于原位杂交方法检测受试者METTL3编码基因的转录；或基于免疫检测方法检测受试者METTL3表达情况的物质。
所述受试者可以为人和非人哺乳动物(如小鼠)。
所述产品可以为试剂盒。
本发明的又一具体实施方式中，提供制METTL3编码基因及其表达产物表达和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a6)至少一种中的应用：
a1)降低炎症因子表达或制备降低炎症因子表达的产品；
a2)抑制炎症反应或制备抑制炎症反应的产品；
a3)抑制BRAF蛋白的表达或制备抑制BRAF蛋白的表达的产品；
a4)抑制Braf mRNA的m6A修饰或者制备抑制Braf mRNA的m6A修饰的产品；
a5)抑制YTHDF1的表达或制备抑制YTHDF1表达的产品；
a6)制备治疗MAPK相关炎症疾病的产品。
其中，抑制METTL3编码基因及其表达产物表达和/或使其活性降低的物质包括但不限于针对METTL3并基于RNAi(包括shRNA、siRNA)、TALEN、CRISPR(包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas13)的方法所需的物质，以及针对METTL3本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗METTL3抗体。
所述a1)中，所述炎症因子包括但不限于IL-1β、IL-6和TNF-α；所述炎症因子具体源自动脉粥样硬化斑块；更具体为动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞。
所述a2-a3)中，本发明通过研究发现，METTL3可通过激活ERK途径加剧腹腔巨噬细胞的炎症反应，进一步研究确定，METTL3实际通过调节BRAF蛋白的表达促进巨噬细胞炎症。
所述a4)中，所述Braf mRNA的m6A修饰位点具体为Braf mRNA CDS区的39725126(6号染色体)处的腺嘌呤。
所述a5)中，本发明通过研究发现，YTHDF1参与炎症调节，YTHDF1结合Braf mRNA，METTL3通过YTHDF1促进Braf mRNA翻译。
所述a6)中，MAPK相关炎症疾病包括动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的心血管相关疾病(如冠心病、心肌梗塞、脑梗死、脑出血等)。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。诸如该产品用于构建MAPK炎症相关细胞、组织或动物模型，通过调控METTL3的表达研究BRAF介导的炎症相关反应等，从而具有良好的实际应用价值。
也因此，上述产品开发为药物，其可能是未来改善动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的其他心血管疾病的重要策略。
需要特别指出的是，本发明研究证实抑制巨噬细胞中METTL3表达能够抑制动脉粥样硬化的进展和体内炎症反应，从而应用于相关疾病治疗，因此，关于METTL3抑制剂的开发以及METTL3抑制剂在MAPK相关炎症疾病包括动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的心血管相关疾病(如冠心病、心肌梗塞、脑梗死、脑出血等)中的防治应用亦在本申请的保护范围之内。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，可药用载体为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(包括腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等)、噬菌体、黏粒或质粒载体。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法(如骨髓移植等)进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.材料与方法
动物模型
将所有小鼠置于特定的无病原体条件下，并随意喂食含有20％蛋白质、4％脂肪的标准实验室饮食(SPF Biotechnology，中国北京)或含有40％脂肪、1.25％胆固醇的随意高脂肪饮食(HFD)(中国南通泰罗飞)。考虑到雌激素对动脉粥样硬化的影响，我们只研究了雄性小鼠。使用8周的C57BL/6J小鼠(GemPharmatech，中国南京)提取腹腔巨噬细胞。通过HFD喂养不同周(0、8、16周)的Apoe-/-小鼠(雄性)(GemPharmatech)建立动脉粥样硬化模型。购买Mettl3-floxed(Mettl3f1/fl)小鼠(CKOCMP-04437-Mettl3，Cyagen，中国)和纯合Lyz2-Cre(Lyz2Cre)小鼠(C001003，Cyagen)。将Mettl3f1/fl小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交以获得Mettl3fl /fl Lyz2Cre小鼠，并将出生在同一窝中的Mettl3fl/fl小鼠用作对照小鼠。将Mettl3fl/flLyz2Cre小鼠与Apoe-/-小鼠进一步杂交，获得Mettl3fl/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠。将出生在同一窝中的Mettl3fl/fl Apoe-/-小鼠用作对照小鼠。两组小鼠从8周龄开始，喂食HFD 14周，然后使用单剂量戊巴比妥(150mg/kg，i.p.)对小鼠实施安乐死。首先暴露小鼠的心脏并在心尖部位抽血。用2000g离心20分钟的血液中获得血清，并在-80℃下储存。分离主动脉并对斑块组织成像。将组织固定在4％多聚甲醛中24小时，后冲洗过夜，用蔗糖溶液脱水，并使用OCT包埋。所有小鼠实验均经山东大学齐鲁医院(中国山东省济南市)实验动物委员会批准。许可编号：KYLL-2020(KS)-032。
HE染色和损伤大小定量
使用冷冻切片机切割OCT包埋的组织并放置在载玻片上。根据AHA声明，我们在从主动脉瓣起点到升主动脉的地方收集了多张6μm厚度的横截面的斑块组织片子。我们连续编号每张片子，并将主动脉瓣的消失的组织片子标记为“1”。“1”、“11”和“21”切片用苏木精染色5分钟，用自来水冲洗直至细胞核变蓝，并用伊红染色3分钟。冷冻切片用不同浓度的乙醇脱水，用环境透明剂处理，并用中性胶密封。使用病理切片扫描仪(Pannoramic Scan，DHistech公司，匈牙利)拍摄图像。斑块面积由Image Pro Plus 6.0软件确定。计算每个主动脉三段的平均面积作为损伤大小。
组织化学染色
将冷冻切片与一抗孵育12小时，洗涤三次，并与二抗孵育30分钟。将冷冻切片在DAB溶液中染色，然后置于双蒸馏水中。切片用不同浓度的乙醇脱水，用透明剂处理，并用中性胶密封。我们使用Image pro plus软件为获得的图像设置阳性区域的参数，然后将整个斑块的光密度值之和除以相应的斑块面积以获得该值。
油红O染色
将整个动脉分离并在油红O(Sigma，USA)溶液中孵育30分钟，然后用水洗涤，然后用相机拍摄图片。将室温干燥的冷冻切片置于油红色O中15分钟，然后用自来水冲洗2分钟。将切片放入苏木精染色溶液中染色细胞核2分钟，然后使用甘油明胶密封。
细胞和组织的免疫荧光染色
用4％多聚甲醛固定细胞和冷冻切片，在室温下用5％ BSA(BioFrox)封闭30分钟，并在4℃下与一抗孵育12小时，然后将细胞和切片与荧光二抗在37℃避光孵育30分钟，用DAPI复染(Ab104139，Abcam，UK)。在荧光显微镜(DS-Ri2，日本尼康)下观察细胞和切片，并获取图像。
Masson染色
根据masson三色染色试剂盒(G1340，Solarbio，中国)的实验步骤，对室温下干燥的冷冻切片进行染色。切片用不同浓度的乙醇脱水，用透明剂处理，并用中性胶密封。
细胞培养
RAW264.7和HEK293T细胞由ATCC(Manassas，VA，USA)提供。在注射6％淀粉溶液3天后，使用单剂量戊巴比妥(150mg/kg，i.p.)对小鼠进行安乐死。然后，从小鼠中收获腹腔巨噬细胞。所有细胞在37℃、5％ CO2的环境中并用Dulbecco改良Eagle且含有10％胎牛血清(Sigma，USA)培养基(Gibco，USA)中培养。细胞受到75μg/ml ox-LDL(Unionbil，中国北京)刺激。
Western印记
简言之，将细胞裂解物进行凝胶电泳，转移到0.45μm聚偏氟乙烯膜(Millipore，美国)上，在室温下使用5％牛血清白蛋白(BSA)(BioFrox，德国)封闭1.5小时，并在4℃下与一级抗体孵育12小时。将膜与二抗孵育1小时，并使用ECL试剂盒(Millipore，USA)进行发光。
m6A斑点印记
使用RNeasy Mini Kit(74106，Qiagen，Hilden，Germany)分离巨噬细胞的总RNA，并稀释至100ng/μl。将RNA在95℃下加热3分钟，然后在冰上冷却，并点在硝化纤维素膜(GEHealthcare，Amersham，USA)上。膜经紫外线交联5min后烘干，用5％ BSA封闭，在4℃下与m6A特异性抗体(202003，1:1000，Synaptic Systems)孵育过夜，然后与二抗孵育1小时，并使用ECL试剂盒(Millipore)进行发光。另一个膜用亚甲基蓝染色作为对照。
RT-PCR
使用RNeasy Mini Kit(220010，Fastagen，中国)提取总RNA，并使用PrimeScriptRT试剂盒(RR047A，TaKaRa，日本)进行逆转录。根据说明书使用SYBR Green PCR MasterMix(Roche，Switzerland)在LightCycler 480仪器(瑞士罗氏)中运行qPCR。循环条件为：95℃5分钟，然后95℃15秒，55℃15秒和72℃2 0秒循环45次。β-Actin基因作为内参。ΔCt方法用于计算相对表达水平。
ELISA试验
用试剂盒上的说明书测量巨噬细胞上清液中小鼠IL-1β(SMLB00C，R&D Systems，USA)、IL-6(SM6000B，R&D Systems)和TNF-α(SMTA00B，R&D System)的浓度。
siRNA干扰、质粒转染、腺病毒感染
Lipofectamine RNAiMAX试剂(13778150，Invitrogen，USA)用于将siRNA(RiboBio，中国)转染巨噬细胞。所用siRNA的靶序列如下：小鼠Mettl3 siRNA：GCTACCGTATGGGACATTA，SEQ ID NO.1；小鼠Ythdf1 siRNA：CAGTCCAATC CGAGTAACA，SEQ IDNO.2；小鼠Ythdf2-siRNA:GCCGAATAATGCATATACT，SEQ ID NO.3。Mettl3被克隆到pCMV2-Flag质粒(Weizhenbio，中国)中。使用KOD Plus突变试剂盒(SMK-101，Toyobo，Japan)构建的质粒产生缺失突变。所有构建体均通过DNA测序进行测试。Lipofectamine3000转染试剂(Invitrogen，USA)用于将质粒转染HEK293T细胞。所有的腺病毒都是在维真生物生产的。简言之，构建了腺病毒穿梭质粒，并通过序列进行了验证。然后将腺病毒转染HEK293细胞，大量扩增并收集用于纯化和浓缩。腺病毒滴度通过腺病毒感染性滴度快速测试试剂盒(AD-01，莱博生物科技，中国)测量。用腺病毒以6μg/ml转染试剂及MOI＝500的病毒量感染巨噬细胞12小时。然后，用新鲜培养基替换上清液，然后培养细胞24小时。
RNA免疫沉淀实验
Magna-RIP试剂盒(#17-701，Millipore)用于该实验。简言之，用5μg抗YTHDF1抗体或5μg兔的IgG抗体预处理磁性蛋白A/G珠然后添加到细胞裂解物中，并将样品在4℃下旋转培养过夜。然后，将珠子洗涤六次，并用蛋白酶K缓冲液孵育。从免疫沉淀物中提取RNA并逆转录。将RT-qPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
MeRIP-seq和MeRIP-qPCR
从注射6％淀粉3天后的小鼠中提取腹腔巨噬细胞，并接种在六个培养皿中。三个皿用ox-LDL处理12小时，三个皿作为对照。样品在LC-BIO技术(中国)进行分析。MeRIP-seq实验由LC-BIO Technology(中国)提供。简言之，没有核糖体RNA的RNA被片段化。将RNA片段与m6A特异性抗体(202003，Synaptic Systems，德国)在4℃下孵育2小时。将IP RNA逆转录为cDNA。经过一些处理后，使用以下条件对产物进行PCR扩增：95℃的初始变性C持续3分钟；98℃变性8个周期C 15秒，60℃退火C下15秒，72℃下延伸30秒；最终在72℃下延伸5分钟。最终cDNA文库中的平均插入长度为300±50bp。最后，在Illumina NovaSeq上进行了2×150bp配对末端测序。
使用Magna MeRIP m6A试剂盒(17-1-499，Millipore，USA)进行MeRIP-qPCR，但由于引物设计问题，RNA没有碎裂。简言之，将用m6A抗体或小鼠IgG抗体预处理的磁性蛋白A/G珠添加到细胞裂解物中，并将样品在4℃下旋转培养过夜。然后，将磁珠洗涤三次，并用洗脱缓冲液孵育2小时。使用RNeasy Mini Kit(74106，Qiagen)纯化RNA，逆转录，并通过qPCR分析。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
RNA衰变实验
用10μg/ml放线菌素D处理腹腔巨噬细胞。提取RNA用于RT-qPCR分析。将数据归一化至t＝0h时间点。
琼脂糖凝胶电泳
将琼脂糖添加到稀释的TAE溶液(cw0663s，Cwbio，中国)中，煮沸后GelsteinRed(S2009L，Uelandy，中国)，倒入凝胶托盘中，并冷却30分钟。在qPCR产物中加入DNA缓冲液(GH101，Transgen，中国)，然后加到琼脂糖凝胶上，在TAE中电泳并在仪器上成像。
血脂测量和血常规测定
使用自动生化分析仪(Chemray 240和Chemray 800，Rayto，中国)测定甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白的血清浓度。使用自动血细胞分析仪(BC-2800vet，中国)测定全血细胞计数。
统计分析
GraphPad Prism 9(GraphPad，CA，USA)用于所有分析。数据以平均值M±SD表示，数据分布采用Shapiro-Wilk方法进行评估。为了比较n>5两组数据，双尾非配对Student t检验用于正态分布的数据；n<＝5或者非正态分布的两组数据，用Mann-Whitney检验。为了比较多组数据，采用了Kruskal-Wallis检验。P<0.05被认为是显著的。
2.实验结果
动脉粥样硬化进展条件下斑块中的巨噬细胞和ox-LDL刺激下的巨噬细胞中的METTL3表达上调
为了观察METTL3在动脉粥样硬化中的表达，我们给予Apoe-/-小鼠不同时间的高脂饮食，并对主动脉根部切片进行免疫荧光染色，以检测巨噬细胞中的METTL3的表达水平。结果显示随着斑块进展，巨噬细胞中METTL3蛋白水平显著上调(图1A)。由于ox-LDL在动脉粥样硬化中起着至关重要的作用，我们接下来用ox-LDL刺激了巨噬细胞。斑点印迹分析显示，受刺激的腹腔巨噬细胞中的总体m6A水平显著高于对照细胞(图1B)。与此一致，METTL3蛋白水平在腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞中以时间依赖的方式增加(图1C，1D和1E)。总之，这些数据表明METTL3可能参与动脉粥样硬化的发展和巨噬细胞功能。
巨噬细胞特异性METTL3缺失可减轻动脉粥样硬化斑块的形成
为了证实METTL3与动脉粥样硬化之间的关系，通过将Mettl3-floxed小鼠(Mettl3f1/fl)与Lyz2-Cre(Lyz2Cre)小鼠杂交来产生巨噬细胞特异性METTL3敲除小鼠(Mettl3f1/fl Lyz2Cre)。通过western blot分析，我们确认Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠巨噬细胞中METTL3表达缺失(图2A)。接下来，我们通过将Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠与Apoe-/-小鼠交配，产生Mettl3f1/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠，并将Mettl3f1/fl Apoe-/-同窝小鼠做对照。两组小鼠从8周龄开始接受HFD喂养，共喂养14周。实验结果表明两组小鼠的体重和血清甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白的水平没有显著差异(图2B和2C)。然而，两组小鼠在主动脉弓中显示的动脉粥样硬化斑块大小存在差异(图2D)。苏木精和伊红(HE)染色和油红O染色显示，Mettl3f1/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠的主动脉根部斑块比Mettl3f1/fl Apoe-/-小鼠的少(图2E至2H)。同样，我们发现在Mettl3f1/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠的整个主动脉的动脉粥样硬化进展显著减慢(图2I和2J)。此外，masson染色显示METTL3缺失增加了胶原含量，并降低了坏死区域的比例(图2K至2M)。使用抗MOMA2抗体的免疫荧光染色显示METTL3缺失减少了斑块中巨噬细胞的含量(图2N和2O)。
METTL3加重巨噬细胞介导的炎症反应
由于巨噬细胞介导的炎症反应在动脉粥样硬化中起着至关重要的作用，我们评估了病变中炎症因子的水平。结果表明细胞中METTL3缺乏降低了斑块中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达(图3A和3B)。为了证实METTL3在巨噬细胞炎症中的作用，我们用ox-LDL刺激腹腔中的巨噬细胞。Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中的整体m6A水平显著降低，这表明METTL3在腹腔巨噬细胞中m6A修饰中起着重要作用(图3C)。酶联免疫吸附试验(ELISA)显示，Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平减低(图3D)。此外，Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中的Il-1β、Il-6、Tnf-α和Mcp-1mRNA水平降低(图3E)。这些发现表明Mettl3基因敲除抑制ox-LDL诱导的促炎反应。
我们进一步证实，使用小干扰RNA(siMettl3)对Mettl3进行了有效敲除(图S2E和S2F)。与用siRNA(siNC)转染的对照细胞相比，用siMettl3转染的腹腔巨噬细胞中RNA的整体的m6A水平显著降低(图3F)。与此一致，用siMettl3转染的腹腔巨噬细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平以及IL-1β、IL-6、TNF-α和Mcp-1mRNA水平显著低于siNC转染的细胞(图3G和3H)。这些结果表明，siMettl3诱导的METTL3缺乏会减弱ox-LDL诱导的炎症反应。总之，METTL3缺失抑制了ox-LDL诱导的腹腔巨噬细胞炎症反应。
METTL3促进ox-LDL诱导的ERK信号通路激活
由于MAPK信号通路在动脉粥样硬化炎症中起着重要作用，并且在Mettl3敲除后炎症因子表达下降，我们假设Mettl3通过调节MAPK通路促进炎症反应。结果和我们的假设一致，Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中ERK、MEK1和MEK2的磷酸化水平降低，而JNK和P38的磷酸化没有受到影响(图4A、4B、4D和4E)。类似地，Mettl3敲除不影响Mek1和Mek2mRNA水平以及MEK1和MEK2蛋白水平(图4C和4D)。
接下来，我们构建了Mettl3腺病毒(Ad-Mettl3)和Mettl3截断体腺病毒(Ad-Mettl3-MDT)。正如预期的，与感染对照绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒(Ad-GFP)或Ad-Mettl3-MDT的腹腔巨噬细胞相比，感染Ad-Mett13的腹腔巨噬细胞中ERK、MEK1和MEK2蛋白的磷酸化水平更高(图4F和4G)。通过Ad-METTL3的过度表达METTL3提高了腹腔巨噬细胞中的炎症因子水平，证实METTL3加重了炎症(图4H)。总之，数据表明METTL3通过激活ERK途径加剧腹腔巨噬细胞的炎症反应。
METTL3通过调节BRAF蛋白表达影响炎症反应
由于METTL3促进MEK1和MEK2的磷酸化，但不影响MEK1和MEK2的表达，我们推断METTL3的靶点可能位于MEK1和MEB2的上游。因此，我们使用蛋白质印迹法检测了上游分子的蛋白质水平，包括ARAF、BRAF、CRAF、HRAS、KRAS和NRAS。我们发现，BRAF蛋白是Mettl3f1/flLyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中唯一表达减少的上游分子(图5A和5B)。Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中mRNA水平并没有改变(图5C)。相反，与Ad-GFP或Ad-Mettl3-MDT感染的细胞相比，Ad-Mettl3感染的腹腔巨噬细胞中BRAF蛋白水平更高(图5D和5E)。Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中过表达METTL3后，BRAF蛋白水平回升(图5F和5G)。主动脉根部的免疫荧光图像证实METTL3缺乏降低了巨噬细胞中BRAF蛋白的表达(图5H)。为了研究BRAF是否参与METTL3介导的腹腔巨噬细胞的炎症反应，我们构建了Ad-Braf-WT腺病毒(Ad-Braf-WT)。正如预期的那样，通过Ad-Braf-WT的BRAF过表达t提高了Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中的Il-1β、Il-6、Tnf-α和Mcp-1mRNA水平(图5I)。因此，METTL3通过调节BRAF蛋白的表达促进巨噬细胞炎症。
METTL3介导Braf mRNA的特定位点的腺嘌呤的甲基化
为了研究METTL3调节BRAF蛋白表达的潜在机制，我们做了m6A-seq。m6A-seq分析表明，m6A峰在RRACH基序中显著富集(图6A)，m6A峰主要位于5′UTR、3′UTR和第1外显子中(图6B)。基因(GO)富集分析表明，m6A修饰与炎症反应密切相关(图6C)。重要的是，m6A-seq数据表明，m6A修饰存在于Braf mRNA的5′端(第1外显子)附近(图6D)。接下来，我们进行了MeRIP-qPCR以验证m6A-seq数据。正如预期的那样，siMettl3转染细胞中的腹腔巨噬细胞m6A修饰比例低于siNC转染细胞(图6E)。MeRIP-qPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳进一步支持了这一点(图6F)。与此一致，Mettl3f1/fl Lyz2Cre小鼠腹腔巨噬细胞中m6A修饰的比率低(图6G)。此外，MeRIP-qPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果支持了这一点(图6H)。此外，基于m6A-seq数据，我们推断出m6A修饰位点(6号染色体中的39725126)，并用鸟嘌呤取代腺嘌呤(Braf-MUT1)(图6I)。此外，6号染色体39725174位点的腺嘌呤被鸟嘌呤取代(Braf-MUT2)(图6I)。为了验证这一推断，我们用Flag-Mettl3、对照载体、GFP-Braf-WT、GFP-Braf-MUT1和GFP-Braf-MUT2的质粒感染HEK293T细胞。METTL3过表达不影响GFP-BRAF-MUT1蛋白水平，而促进GFP-BRRAF-WT和GFP-BRAB-MUT2蛋白表达(图6J和6K)。因此，39725126(6号染色体)处的腺嘌呤被鉴定为特异性修饰位点。我们接下来构建了Ad-Braf-MUT1腺病毒，并通过RT-qPCR测试其在感染的腹腔巨噬细胞中的表达(图6L)。更重要的是，与Braf-WT腺病毒感染的腹腔巨噬细胞相比，感染Braf-MUT1腺病毒的腹腔巨噬细胞中的Il-1β、Il-6、Tnf-α和Mcp-1mRNA水平更低(图6M)。总之，METTL3通过介导Braf mRNA的腺嘌呤(39725126)的甲基化来调节腹腔巨噬细胞的炎症。
METTL3通过YTHDF1促进Braf mRNA翻译
m6A修饰在许多方面调节RNA，包括RNA转运、RNA衰变、RNA翻译。为了探究METTL3是否影响Braf mRNA的出入核，我们分别提取了细胞质和细胞核RNA。结果表明，Mettl3敲除不影响细胞质和细胞核中Braf mRNA的分布(图7A)。其次，为了研究METTL3是否参与BrafmRNA的衰变，用放线菌素D(10μg/ml)处理了巨噬细胞。结果表明，Braf mRNA稳态性不受Mettl3敲除的影响(图7B)。环己酰亚胺(CHX)抑制mRNA翻译，这可以用来探讨METTL3是否影响BRAF的降解速率。我们用它(5μg/ml)处理了腹腔巨噬细胞。结果表明METTL3缺失不会影响CHX刺激的腹腔巨噬细胞中BRAF的降解率(图7C)。这些结果表明METTL3通过调节BrafmRNA的翻译来增加BRAF蛋白水平。
m6A修饰的RNA与影响RNA命运的特定m6A阅读蛋白结合。我们假设METTL3通过YTHDF1影响BRAF蛋白表达。因此，我们使用siRNA敲除巨噬细胞中编码这些蛋白的基因。RT-qPCR结果显示，腹腔巨噬细胞中的Ythdf1、Ythdf2和Ythdf3缺乏不会降低Braf mRNA水平(图7D至7F)。然而，Western印迹表明，siYthdf1转染的细胞中BRAF蛋白水平低于siNC转染的细胞(图7G和7H)。Ythdf2和Ythdf3缺乏并未降低BRAF蛋白水平(图7I至7L)。此外，siYthdf1细胞中的ERK磷酸化水平低于siNC细胞(图7M和7N)，这证实了YTHDF1参与炎症调节。重要的是，RNA免疫沉淀试验(RIP)证明YTHDF1与Braf mRNA结合(图7O)。这些发现表明YTHDF1结合Braf mRNA并促进其翻译。
METTL3是研究最广泛的m6A甲基化修饰蛋白，具有m6A修饰的催化活性，在许多疾病中发挥核心作用。然而，巨噬细胞中Mettl3的条件性缺失如何调节体内动脉粥样硬化的研究较少。在我们的研究中，我们发现，随着斑块的进展，METTL3蛋白水平显著上调。重要的是，我们繁育了Mettl3f1/fl Lyz2Cre Apoe-/-小鼠和同窝的Mettl3f1/fl Apoe-/-小鼠。我们首次发现，巨噬细胞中METTL3的缺失减缓了HFD诱导的动脉粥样硬化斑块形成。
最近的研究表明，动脉粥样硬化斑块组织可以被视为一种区域免疫组织。巨噬细胞介导的炎症反应是动脉粥样硬化斑块形成的重要原因。因此，探索巨噬细胞介导炎症反应的调节机制将有助于推进抗炎治疗研究。在动脉粥样硬化过程中，ox-LDL是最重要的危险因素。MAPK家族激活在巨噬细胞炎症反应中发挥了关键作用，但METTL3在ox-LDL诱导的信号通路中的作用仍不清楚。
在我们的研究中，我们首次表明，体内巨噬细胞特异性Mettl3敲除可以减轻动脉粥样硬化炎症。此外，Mettl3敲除减轻了ox-LDL诱导的腹腔巨噬细胞炎症反应。相反，过度表达METTL3提高了巨噬细胞中的炎症因子水平。ERK1/2、JNK和P38是MAPK信号蛋白的三个重要分支。我们的研究首次证明Mettl3敲除减轻了ox-LDL诱导的ERK磷酸化，而不是JNK或P38磷酸化。目前，METTL3的特异性抑制剂研究已成为一个热点，一些METTL3抑制剂已被报道。我们的研究可能为该药物在炎症性疾病中的应用提供基础。
RAS/RAF/MEK/ERK信号通路激活涉及复杂的级联，ERK1/2激活需要上游MEK1/2、RAF和RAS。BRAF是MEK1/2和ERK1/2的关键上游因子。BRAF可以通过激活ERK信号来调节细胞增殖和炎症，这使得BRAF成为许多疾病的重要治疗靶点。关于BRAF功能的调节已有许多研究。然而，没有研究报告Mettl3是否调节Braf mRNA的命运。
我们的结果表明Mettl3敲除抑制BRAF蛋白表达。BRAF过表达提高了Mettl3敲除巨噬细胞中ox-LDL诱导的Il-1β、Il-6和Tnf-αmRNA水平。此外，使用MeRIP-qPCR，我们发现METTL3促进Braf mRNA的m6A修饰。重要的是，通过MeRIP-seq和点突变构建实验，我们鉴定出了5′端附近Braf mRNA编码区中的腺嘌呤是m6A修饰的特异性位点。重要的是，Braf mRNA中特异性m6A修饰的腺嘌呤可能是未来治疗Braf相关疾病的靶点。
m6A修饰通常影响mRNA剪接、转运、衰变、和翻译，这由不同的m6A阅读蛋白决定。例如，阅读蛋白YTHDF1通过与翻译起始因子和核糖体相互作用来增强mRNA翻译，而阅读蛋白YTHDF2特异性识别编码区、终止密码子区和3′UTR中的m6A修饰的腺嘌呤位点，以促进靶RNA降解。YTHDF3促进RNA衰变和翻译。我们的结果表明，METTL3不影响Braf mRNA的运输和衰变以及Braf蛋白的降解速率，但仅调节其翻译。使用RIP分析，我们发现YTHDF1可以与BrafmRNA结合并增强Braf mRNA翻译，而YTHDF2和YTDDF3不影响BRAF蛋白表达。此外，我们发现Ythdf1敲低降低了ERK磷酸化水平。我们的发现为BRAF蛋白翻译提供了一种新的机制。
总之，本发明表明巨噬细胞中的METTL3在炎症反应和动脉粥样硬化中起重要作用。METTL3通过靶向Braf mRNA来调节RAS/RAF/MEK/ERK通路。YTHDF1蛋白结合被m6A修饰的Braf mRNA促进其翻译。我们的发现为动脉粥样硬化的发病机制提供了一个新的视角。METTL3和BRAF也是动脉粥样硬化性心血管疾病的潜在治疗靶点。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测METTL3编码基因和/或METTL3编码基因表达产物表达水平的物质在制备筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预测MAPK相关炎症疾病进展产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述METTL3编码基因及其表达产物为人源和非人哺乳动物源；所述METTL3编码基因的表达产物为甲基转移酶样蛋白3。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述MAPK相关炎症疾病包括动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的心血管相关疾病，进一步包括冠心病、心肌梗塞、脑梗死和脑出血。
4.一种用于筛查、诊断(辅助诊断)、监测或预测MAPK炎症相关疾病进展的产品，其包含基于基因测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于原位杂交方法检测受试者METTL3编码基因的转录；或基于免疫检测方法检测受试者METTL3表达情况的物质。
5.如权利要求4所述产品，其特征在于，
所述受试者为人和非人哺乳动物(包括小鼠)；
所述产品为试剂盒。
6.METTL3编码基因及其表达产物表达和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a6)至少一种中的应用：
a1)降低炎症因子表达或制备降低炎症因子表达的产品；
a2)抑制炎症反应或制备抑制炎症反应的产品；
a3)抑制BRAF蛋白的表达或制备抑制BRAF蛋白的表达的产品；
a4)抑制Braf mRNA的m6A修饰或者制备抑制Braf mRNA的m6A修饰的产品；
a5)抑制YTHDF1的表达或制备抑制YTHDF1表达的产品；
a6)制备治疗MAPK相关炎症疾病的产品。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，抑制METTL3编码基因及其表达产物表达和/或使其活性降低的物质包括但不限于针对METTL3并基于RNAi(包括shRNA、siRNA)、TALEN、CRISPR(包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas13)的方法所需的物质，以及针对METTL3本身或其上下游分子的特异性抗体，包括抗METTL3抗体。
8.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述a1)中，所述炎症因子包括但不限于IL-1β、IL-6和TNF-α；所述炎症因子具体源自动脉粥样硬化斑块；更具体为动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞；
所述a4)中，所述Braf mRNA的m6A修饰位点具体为Braf mRNA CDS区的39725126(6号染色体)处的腺嘌呤；
所述a6)中，MAPK相关炎症疾病包括动脉粥样硬化以及由动脉粥样硬化介导的心血管相关疾病；进一步包括冠心病、心肌梗塞、脑梗死和脑出血。
9.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
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CN117165631A (zh) * 2023-11-01 2023-12-05 潍坊医学院 一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法
CN117165631B (zh) * 2023-11-01 2024-02-13 潍坊医学院 一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法

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