CN114990158B - Scara3基因敲除仓鼠模型的构建方法 - Google Patents

Scara3基因敲除仓鼠模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明适用于疾病动物模型构建领域，提供了SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，包括以下步骤：步骤A、sgRNA的制备；步骤B、CAS9mRNA的制备；步骤C、供卵鼠及代孕鼠准备；步骤D、受精卵的收集及培养；步骤E、显微注射及回输；步骤F、子代仓鼠突变检测；步骤G、基因工程仓鼠品系构建。本发明构建SRA3敲除动物模型对病毒感染、肿瘤、脂肪肝、动脉粥样硬化疾病等疾病的深入研究具有重要的现实意义。

Description

SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法
技术领域
本发明属于疾病动物模型构建领域，尤其涉及SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法。
背景技术
SRA3在许多其他组织及细胞中均有表达，是胞浆蛋白，表达于内质网-高尔基体核膜区域，在受到氧化应激后，更多弥散表达于胞浆中。
SRA3有三个可能的结构：跨膜区、a螺旋线圈样线圈结构域、类胶原结构，其中类胶原结构域能够和许多分子结合，包括脂质、血浆成分(纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原、纤维蛋白原等)，以及各种带负电的分子。
既往研究发现SRA3与病毒感染、肿瘤、脂肪肝、动脉粥样硬化疾病等疾病密切相关，但目前对SRA3的具体作用机制尚不明确。
因此，针对以上现状，迫切需要开发SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，以克服当前实际应用中的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，旨在解决上述背景中提到的问题。
本发明是这样实现的，SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤A、sgRNA的制备；
步骤B、CAS9mRNA的制备；
步骤C、供卵鼠及代孕鼠准备；
步骤D、受精卵的收集及培养；
步骤E、显微注射及回输；
步骤F、子代仓鼠突变检测；
步骤G、基因工程仓鼠品系构建。
进一步的技术方案，步骤A包括以下步骤：
a1)sgRNA靶点设计；
a2)sgRNA模板扩增；
a3)切胶回收纯化；
a4)蛋白酶K处理；
a5)酚仿醇抽提纯化；
a6)体外转录；
a7)质量检测；
a8)RNA纯化及保存。
进一步的技术方案，在步骤a1)中，利用NCBI网站获得仓鼠scara3基因组信息，选择其第二外显子；利用CRISPR设计网站选择适合位点，综合评价打靶效率及脱靶概率后，sgRNA的靶点序列确定为：GAGATCAGCTGGCGGTGACAG；在步骤a2)中，含有T7启动子、目的基因靶序列及sgRNA骨架结构的上下游模板链如下：F：TTAATACGACTCACTATAGGAGATCAGCTGGCGGTGACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT；R：TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT；利用PCR体系合成sgRNA模板；在步骤a3)中，配制2％琼脂糖凝胶；产物电泳，120V 30分钟；将100～110bp处胶切下并纯化其中产物；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；在步骤a4)中，配制消化体系；50℃孵育30分钟；在步骤a5)中，加入300μL ddH2O，混合均匀；加入400μL三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；吸取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；取上清，加入2.5倍体积在-20℃预冷的无水乙醇及1/10体积3mol/L醋酸钠溶液，混匀；-20℃静置20分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；弃去上清，500μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；室温晾干，加入10μL ddH2O溶解；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；在步骤a6)中，按照MEGAshortscriptTM T7kit说明书配制转录体系；37℃孵育4小时；加入1μLTURBO DNase，37℃孵育15分钟；在步骤a7)中，检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；配制2％琼脂糖凝胶，120V电泳产物30分钟，拍照；在步骤a8)中，使用MEGAclearTMkit试剂盒对产物进行纯化；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；将浓度调整至50ng/μL，分装保存于-80℃环境。
进一步的技术方案，步骤B包括以下步骤：
b1)质粒线性化；
b2)蛋白酶K处理；
b3)酚仿醇抽提纯化；
b4)体外转录；
b5)质量检测；
b6)RNA纯化及保存。
进一步的技术方案，在步骤b1)中，配制酶切体系；37℃孵育4小时；加入5μL终止液；加入138μL-20℃预冷后的无水乙醇；-20℃冷却30分钟；12000rpm，4℃离心12分钟；在步骤b2)中，配制消化体系；50℃孵育30分钟；在步骤b3)中，加入300μLddH2O，混合均匀；加入400μL三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；吸取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；取上清，加入2.5倍体积在-20℃预冷的无水乙醇及1/10体积3mol/L醋酸钠溶液，混匀；-20℃静置20分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；弃去上清，500μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；室温晾干，加入10μL ddH2O溶解；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；在步骤b4)中，按照mMESSAGEmMACHINE T7 kit说明书配制转录体系；37℃孵育2小时；加入1μL TURBO DNase，37℃孵育15分钟；在步骤b5)中，检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；配制0.8％琼脂糖凝胶，120V电泳产物30分钟，拍照；在步骤b6)中，加入15μL醋酸铵缓冲液及165μL无RNase水，混合均匀；加入等体积酚仿醇抽提液，垂直混悬器翻转2分钟；12000rpm，4℃离心10分钟；取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转2分钟；12000rpm，4℃离心10分钟；取上清，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀；-20℃静置15分钟；12000rpm，4℃离心10分钟；弃去上清，200μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；室温晾干，加入50μL无RNase水溶解；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；调整浓度至250ng/μL，分装保存于-80℃环境中。
进一步的技术方案，步骤C包括以下步骤：
c1)仓鼠动情周期为4天，其中第二天阴道分泌物为白色粘稠液体，可以此为标准判断其动情周期；
c2)在周期第二天中午11:00，及发情症状消失后，对供卵鼠腹腔注射20IU孕马血清促性腺激素(PMSG)，同时挑选同样处于周期第二天的代孕鼠；
c3)至下一动情周期的第一天晚7:00，即雌鼠开始发情后，将供卵鼠及代孕鼠分别与雄鼠合笼交配。
进一步的技术方案，步骤D包括以下步骤：
d1)雌鼠与雄鼠交配合笼后第二天，用生理盐水冲洗供卵鼠及代孕鼠阴道，显微镜下观察有无精子，检测交配是否成功；
d2)选择交配成功供卵鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，收集其输卵管；
d3)在解剖显微镜下，将输卵管置于M2培养基中，将其膨大的壶腹部撕开，挤出含受精卵的堆积物；
d4)分拣出受精卵，将受精卵治愈用石蜡油覆盖的HECM-10培养基中培养；培养温度为37.5℃，CO2浓度为10％。
进一步的技术方案，步骤E包括以下步骤：
e1)用无RNase水将CAS9 mRNA及sgRNA混合，其中CAS9 mRNA终浓度为100ng/μL，sgRNA终浓度为25ng/μL；
e2)在注射皿中，加入100μLM2培养基，用石蜡油覆盖；
e3)受精卵转移至注射皿中，将CAS9 mRNA及sgRNA注射入受精卵内；
e4)将注射后的受精卵转移回HECM-10培养基中，培养30分钟；
e5)选择交配成功代孕鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，背部开口暴露其输卵管；
e6)将状态较好的注射后受精卵回输入输卵管壶腹部，每侧输卵管回输约15个受精卵。
进一步的技术方案，步骤F包括以下步骤：
f1)仓鼠怀孕周期为17天，待幼鼠出生后一周，收集少量脚趾组织；
f2)仓鼠组织DNA提取；
f3)PCR扩增目的片段；
其中，在步骤f2)中，将仓鼠脚趾组织放入离心管中，加入300μL DNA消化缓冲液和20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)；55℃消化4小时；加入300μL双蒸水和600ul酚仿醇抽提液，涡旋10分钟；12000rpm，4℃离心30分钟；吸取400μL上清，加入400μL三氯甲烷，涡旋2分钟；12000rpm，4℃离心30分钟；吸取350μL上清，加入350μL异丙醇，上下颠倒混匀；室温静置10分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；70％乙醇洗涤沉淀两次；自然晾干，加入20μL双蒸水溶解DNA；在步骤f3)中，配制PCR反应体系；产物送测序确定具体序列；比对分析是否发生突变；由于突变仓鼠目的基因处往往发生多种突变，因此测序结果显示为双峰；选择scara3基因发生突变仓鼠，记为Founder。
进一步的技术方案，步骤G包括以下步骤：
g1)Founder鼠与WT鼠交配，其子代记为F1；
g2)检测F1是否出现基因突变；
g3)将F1杂合子仓鼠互相交配，其子代记为F2；
g4)检测F2是否出现基因突变纯合子个体；
g5)纯合子个体互相交配，扩大品系；
其中，在步骤g2)中，提取F1代组织DNA并PCR扩增目的片段(方法同步骤F)；配制4％琼脂糖凝胶，120V电泳产物1小时，检测有无杂合子。
本发明提供的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，是研究基因功能及其与疾病关系的重要工具，巨噬细胞A类清道夫受体3(SCARA3/SRA3)能清除氧自由基及其氧化应激副产物，对紫外线放射和氧化应激造成的细胞损伤具有保护作用，构建SRA3敲除动物模型对病毒感染、肿瘤、脂肪肝、动脉粥样硬化疾病等疾病的深入研究具有重要的现实意义。
附图说明
图1为Scara3基因敲除模型构建示意图；
图2为SRA3基因敲除仓鼠DNAPCR电泳基因型鉴定结果；
图3为SRA3基因敲除纯合子仓鼠血浆TG；
图4为SRA3基因敲除纯合子仓鼠血浆TC；
图5为SRA3基因敲除纯合子仓鼠体重；
图6为SRA3基因敲除仓鼠肝组织切片天狼星红染色照片；
图7为SRA3基因敲除仓鼠肝脏脂质成分测定结果；
图8为SRA3基因敲除oral fat load实验结果；
图9为SRA3基因敲除仓鼠血浆血糖实验结果；
图10为SRA3基因敲除仓鼠糖耐量实验结果；
图11为SRA3基因敲除仓鼠胰岛素耐量结果；
图12为SRA3基因敲除VLDL分泌结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
如图1-12所示，为本发明一个实施例提供的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤A、sgRNA的制备；
a1)sgRNA靶点设计；
利用NCBI网站获得仓鼠scara3基因组信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/NW_004801657.1？report＝genbank&from＝2484888&to＝2514120)，选择其第二外显子；
1)利用CRISPR设计网站(http://crispr.mit.edu/)选择适合位点，综合评价打靶效率及脱靶概率后，sgRNA的靶点序列确定为：GAGATCAGCTGGCGGTGACAG；
a2)sgRNA模板扩增；
1)含有T7启动子、目的基因靶序列及sgRNA骨架结构的上下游模板链如下：
F：TTAATACGACTCACTATAGGAGATCAGCTGGCGGTGACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT；
R：TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT；
2)利用PCR体系合成sgRNA模板：
Figure BDA0003652037040000071
Figure BDA0003652037040000081
3)PCR程序如下：
Figure BDA0003652037040000082
a3)切胶回收纯化；
1)配制2％琼脂糖凝胶；
2)产物电泳，120V 30分钟；
3)将100～110bp处胶切下并纯化其中产物；
4)检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
a4)蛋白酶K处理；
1)配制消化体系：
Figure BDA0003652037040000083
2)50℃孵育30分钟；
a5)酚仿醇抽提纯化；
1)加入300μL ddH2O，混合均匀；
2)加入400μL三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；
3)12000rpm，4℃离心15分钟；
4)吸取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；
5)12000rpm，4℃离心15分钟；
6)取上清，加入2.5倍体积在-20℃预冷的无水乙醇及1/10体积3mol/L醋酸钠溶液，混匀；
7)-20℃静置20分钟；
8)12000rpm，4℃离心15分钟；
9)弃去上清，500μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；
10)室温晾干，加入10μL ddH2O溶解；
11)检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
a6)体外转录；
1)按照MEGAshortscriptTM T7 kit说明书配制转录体系：
Figure BDA0003652037040000091
2)37℃孵育4小时；
3)加入1μL TURBO DNase，37℃孵育15分钟；
a7)质量检测；
1)检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
2)配制2％琼脂糖凝胶，120V电泳产物30分钟，拍照；
a8)RNA纯化及保存；
1)使用MEGAclearTM kit试剂盒对产物进行纯化；
2)检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
3)将浓度调整至50ng/μL，分装保存于-80℃环境。
步骤B、CAS9mRNA的制备；
本研究所用PXT7质粒上含有人源化CAS9 cDNA，可作为CAS9 mRNA模板；含有氨苄抗性位点，可用于质粒扩增；含有XbaI酶切位点，可用于质粒线性化。
b1)质粒线性化；
1)配制酶切体系：
Figure BDA0003652037040000101
2)37℃孵育4小时；
3)加入5μL终止液；
4)加入138μL-20℃预冷后的无水乙醇；
5)-20℃冷却30分钟；
6)12000rpm，4℃离心12分钟；
b2)蛋白酶K处理；
1)配制消化体系：
Figure BDA0003652037040000102
2)50℃孵育30分钟；
b3)酚仿醇抽提纯化；
1)加入300μLddH2O，混合均匀；
2)加入400μL三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；
3)12000rpm，4℃离心15分钟；
4)吸取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；
5)12000rpm，4℃离心15分钟；
6)取上清，加入2.5倍体积在-20℃预冷的无水乙醇及1/10体积3mol/L醋酸钠溶液，混匀；
7)-20℃静置20分钟；
8)12000rpm，4℃离心15分钟；
9)弃去上清，500μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；
10)室温晾干，加入10μL ddH2O溶解；
11)检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
b4)体外转录；
1)按照mMESSAGEmMACHINE T7 kit说明书配制转录体系：
Figure BDA0003652037040000111
2)37℃孵育2小时；
3)加入1μL TURBO DNase，37℃孵育15分钟；
b5)质量检测；
1)检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
2)配制0.8％琼脂糖凝胶，120V电泳产物30分钟，拍照；
b6)RNA纯化及保存；
1)加入15μL醋酸铵缓冲液及165μL无RNase水，混合均匀；
2)加入等体积酚仿醇抽提液，垂直混悬器翻转2分钟；
3)12000rpm，4℃离心10分钟；
4)取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转2分钟；
5)12000rpm，4℃离心10分钟；
6)取上清，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀；
7)-20℃静置15分钟；
8)12000rpm，4℃离心10分钟；
9)弃去上清，200μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；
10)室温晾干，加入50μL无RNase水溶解；
11)检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
12)调整浓度至250ng/μL，分装保存于-80℃环境中。
步骤C、供卵鼠及代孕鼠准备；
c1)仓鼠动情周期为4天，其中第二天阴道分泌物为白色粘稠液体，可以此为标准判断其动情周期；
c2)在周期第二天中午11:00，及发情症状消失后，对供卵鼠腹腔注射20IU孕马血清促性腺激素(PMSG)，同时挑选同样处于周期第二天的代孕鼠；
c3)至下一动情周期的第一天晚7:00，即雌鼠开始发情后，将供卵鼠及代孕鼠分别与雄鼠合笼交配。
步骤D、受精卵的收集及培养；
d1)雌鼠与雄鼠交配合笼后第二天，用生理盐水冲洗供卵鼠及代孕鼠阴道，显微镜下观察有无精子，检测交配是否成功；
d2)选择交配成功供卵鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，收集其输卵管；
d3)在解剖显微镜下，将输卵管置于M2培养基中，将其膨大的壶腹部撕开，挤出含受精卵的堆积物；
d4)分拣出受精卵，将受精卵治愈用石蜡油覆盖的HECM-10培养基中培养；培养温度为37.5℃，CO2浓度为10％。
步骤E、显微注射及回输；
e1)用无RNase水将CAS9 mRNA及sgRNA混合，其中CAS9 mRNA终浓度为100ng/μL，sgRNA终浓度为25ng/μL；
e2)在注射皿中，加入100μLM2培养基，用石蜡油覆盖；
e3)受精卵转移至注射皿中，将CAS9 mRNA及sgRNA注射入受精卵内；
e4)将注射后的受精卵转移回HECM-10培养基中，培养30分钟；
e5)选择交配成功代孕鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，背部开口暴露其输卵管；
e6)将状态较好的注射后受精卵回输入输卵管壶腹部，每侧输卵管回输约15个受精卵。
步骤F、子代仓鼠突变检测；
f1)仓鼠怀孕周期为17天，待幼鼠出生后一周，收集少量脚趾组织；
f2)仓鼠组织DNA提取；
1)将仓鼠脚趾组织放入离心管中，加入300μL DNA消化缓冲液和20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)；
2)55℃消化4小时；
3)加入300μL双蒸水和600ul酚仿醇抽提液，涡旋10分钟；
4)12000rpm，4℃离心30分钟；
5)吸取400μL上清，加入400μL三氯甲烷，涡旋2分钟；
6)12000rpm，4℃离心30分钟；
7)吸取350μL上清，加入350μL异丙醇，上下颠倒混匀；
8)室温静置10分钟；
9)12000rpm，4℃离心15分钟；
10)70％乙醇洗涤沉淀两次；
11)自然晾干，加入20μL双蒸水溶解DNA。
f3)PCR扩增目的片段；
1)配制PCR反应体系：
Figure BDA0003652037040000141
2)按照以下程序进行PCR：
Figure BDA0003652037040000142
3)产物送测序确定具体序列；
4)比对分析是否发生突变；由于突变仓鼠目的基因处往往发生多种突变，因此测序结果显示为双峰；
5)选择scara3基因发生突变仓鼠，记为Founder。
步骤G、基因工程仓鼠品系构建；
g1)Founder鼠与WT鼠交配，其子代记为F1；
g2)检测F1是否出现基因突变；
1)提取F1代组织DNA并PCR扩增目的片段(方法同步骤F)；
2)配制4％琼脂糖凝胶，120V电泳产物1小时，检测有无杂合子；
g3)将F1杂合子仓鼠互相交配，其子代记为F2；
g4)检测F2是否出现基因突变纯合子个体；
g5)纯合子个体互相交配，扩大品系。
本发明提出的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，是研究基因功能及其与疾病关系的重要工具，巨噬细胞A类清道夫受体3(SCARA3/SRA3)能清除氧自由基及其氧化应激副产物，对紫外线放射和氧化应激造成的细胞损伤具有保护作用，构建SRA3敲除动物模型对病毒感染、肿瘤、脂肪肝、动脉粥样硬化疾病等疾病的深入研究具有重要的现实意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A、sgRNA的制备；
步骤B、CAS9mRNA的制备；
步骤C、供卵鼠及代孕鼠准备；
步骤D、受精卵的收集及培养；
步骤E、显微注射及回输；
步骤F、子代仓鼠突变检测；
步骤G、基因工程仓鼠品系构建；
其中，步骤A包括以下步骤：
a1)sgRNA靶点设计；
a2)sgRNA模板扩增；
a3)切胶回收纯化；
a4)蛋白酶K处理；
a5)酚仿醇抽提纯化；
a6)体外转录；
a7)质量检测；
a8)RNA纯化及保存；
在步骤a1)中，利用NCBI网站获得仓鼠scara3基因组信息，选择其第二外显子；利用CRISPR设计网站选择适合位点，综合评价打靶效率及脱靶概率后，sgRNA的靶点序列确定为：GAGATCAGCTGGCGGTGACAG；
在步骤a2)中，含有T7启动子、目的基因靶序列及sgRNA骨架结构的上下游模板链如下：
F：TTAATACGACTCACTATAGGAGATCAGCTGGCGGTGACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT；R：TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT；利用PCR体系合成sgRNA模板；
在步骤a3)中，配制2％琼脂糖凝胶；产物电泳，120V 30分钟；将100～110bp处胶切下并纯化其中产物；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
在步骤a4)中，配制消化体系；50℃孵育30分钟；
在步骤a5)中，加入300μL ddH2O，混合均匀；加入400μL三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；吸取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；取上清，加入2.5倍体积在-20℃预冷的无水乙醇及1/10体积3mol/L醋酸钠溶液，混匀；-20℃静置20分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；弃去上清，500μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；室温晾干，加入10μL ddH2O溶解；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
在步骤a6)中，按照MEGAshortscriptTM T7 kit说明书配制转录体系；37℃孵育4小时；加入1μL TURBO DNase，37℃孵育15分钟；
在步骤a7)中，检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；配制2％琼脂糖凝胶，120V电泳产物30分钟，拍照；
在步骤a8)中，使用MEGAclearTM kit试剂盒对产物进行纯化；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；将浓度调整至50ng/μL，分装保存于-80℃环境。
2.根据权利要求1所述的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤B包括以下步骤：
b1)质粒线性化；
b2)蛋白酶K处理；
b3)酚仿醇抽提纯化；
b4)体外转录；
b5)质量检测；
b6)RNA纯化及保存。
3.根据权利要求2所述的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，在步骤b1)中，配制酶切体系；37℃孵育4小时；加入5μL终止液；加入138μL-20℃预冷后的无水乙醇；-20℃冷却30分钟；12000rpm，4℃离心12分钟；
在步骤b2)中，配制消化体系；50℃孵育30分钟；
在步骤b3)中，加入300μLddH2O，混合均匀；加入400μL三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；吸取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；取上清，加入2.5倍体积在-20℃预冷的无水乙醇及1/10体积3mol/L醋酸钠溶液，混匀；-20℃静置20分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；弃去上清，500μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；室温晾干，加入10μL ddH2O溶解；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；
在步骤b4)中，按照mMESSAGEmMACHINE T7 kit说明书配制转录体系；37℃孵育2小时；加入1μL TURBO DNase，37℃孵育15分钟；
在步骤b5)中，检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；配制0.8％琼脂糖凝胶，120V电泳产物30分钟，拍照；
在步骤b6)中，加入15μL醋酸铵缓冲液及165μL无RNase水，混合均匀；加入等体积酚仿醇抽提液，垂直混悬器翻转2分钟；12000rpm，4℃离心10分钟；取上清，加入等体积三氯甲烷，垂直混悬器翻转2分钟；12000rpm，4℃离心10分钟；取上清，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀；-20℃静置15分钟；12000rpm，4℃离心10分钟；弃去上清，200μL-20℃预冷的70％乙醇洗涤两遍；室温晾干，加入50μL无RNase水溶解；检测浓度及吸光度比值OD260/OD280，OD260/OD230；调整浓度至250ng/μL，分装保存于-80℃环境中。
4.根据权利要求1所述的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤C包括以下步骤：
c1)仓鼠动情周期为4天，其中第二天阴道分泌物为白色粘稠液体，可以此为标准判断其动情周期；
c2)在周期第二天中午11:00，及发情症状消失后，对供卵鼠腹腔注射20IU孕马血清促性腺激素，同时挑选同样处于周期第二天的代孕鼠；
c3)至下一动情周期的第一天晚7:00，即雌鼠开始发情后，将供卵鼠及代孕鼠分别与雄鼠合笼交配。
5.根据权利要求1所述的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤D包括以下步骤：
d1)雌鼠与雄鼠交配合笼后第二天，用生理盐水冲洗供卵鼠及代孕鼠阴道，显微镜下观察有无精子，检测交配是否成功；
d2)选择交配成功供卵鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，收集其输卵管；
d3)在解剖显微镜下，将输卵管置于M2培养基中，将其膨大的壶腹部撕开，挤出含受精卵的堆积物；
d4)分拣出受精卵，将受精卵治愈用石蜡油覆盖的HECM-10培养基中培养；培养温度为37.5℃，CO2浓度为10％。
6.根据权利要求1所述的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤E包括以下步骤：
e1)用无RNase水将CAS9 mRNA及sgRNA混合，其中CAS9 mRNA终浓度为100ng/μL，sgRNA终浓度为25ng/μL；
e2)在注射皿中，加入100μLM2培养基，用石蜡油覆盖；
e3)受精卵转移至注射皿中，将CAS9 mRNA及sgRNA注射入受精卵内；
e4)将注射后的受精卵转移回HECM-10培养基中，培养30分钟；
e5)选择交配成功代孕鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，背部开口暴露其输卵管；
e6)将状态较好的注射后受精卵回输入输卵管壶腹部，每侧输卵管回输约15个受精卵。
7.根据权利要求1所述的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤F包括以下步骤：
f1)仓鼠怀孕周期为17天，待幼鼠出生后一周，收集少量脚趾组织；
f2)仓鼠组织DNA提取；
f3)PCR扩增目的片段；
其中，在步骤f2)中，将仓鼠脚趾组织放入离心管中，加入300μL DNA消化缓冲液和20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液；55℃消化4小时；加入300μL双蒸水和600ul酚仿醇抽提液，涡旋10分钟；12000rpm，4℃离心30分钟；吸取400μL上清，加入400μL三氯甲烷，涡旋2分钟；12000rpm，4℃离心30分钟；吸取350μL上清，加入350μL异丙醇，上下颠倒混匀；室温静置10分钟；12000rpm，4℃离心15分钟；70％乙醇洗涤沉淀两次；自然晾干，加入20μL双蒸水溶解DNA；
在步骤f3)中，配制PCR反应体系；产物送测序确定具体序列；比对分析是否发生突变；由于突变仓鼠目的基因处往往发生多种突变，因此测序结果显示为双峰；选择scara3基因发生突变仓鼠，记为Founder。
8.根据权利要求1所述的SCARA3基因敲除仓鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤G包括以下步骤：
g1)Founder鼠与WT鼠交配，其子代记为F1；
g2)检测F1是否出现基因突变；
g3)将F1杂合子仓鼠互相交配，其子代记为F2；
g4)检测F2是否出现基因突变纯合子个体；
g5)纯合子个体互相交配，扩大品系；
其中，在步骤g2)中，提取F1代组织DNA并PCR扩增目的片段，方法同步骤F；配制4％琼脂糖凝胶，120V电泳产物1小时，检测有无杂合子。
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