JPH11123094A - スカベンジャー受容体様タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト由来の新規なスカベンジャー受容体を同
定・単離し、生体内に侵入あるいは生じた異物及び変性
タンパクの該受容体を介した排除機構並びに細胞及び生
体の防御機構の解明し、該受容体をターゲットとして動
脈硬化症、糖尿病性血管障害あるいは細菌感染症などの
種々の疾患に対する全く新しい治療薬を開発する。 【解決手段】 腫瘍抑制タンパクｐ５３に結合性（反応
性）を有するヒトゲノムＤＮＡをプローブとして、ヒト
胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、ＣＳＲ１、Ｃ
ＳＲ２及びＣＳＲ３と命名した３つの新規なスカベンジ
ャー受容体をコードするｃＤＮＡを得た。該新規スカベ
ンジャー受容体は、マクロファージスカベンジャー受容
体に特有なタンパク２次構造を有し、種々の細胞内スト
レスに依存して発現が誘導され、さらに該細胞内ストレ
スにより誘導される細胞死に対して抑制的に働くことを
見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規スカベンジャ
ー受容体様タンパク及びその断片、該タンパクをコード
するＤＮＡ及びその断片、該ＤＮＡを含む発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された形質転換細胞、該
タンパク若しくはその断片に反応性を有する抗体、並び
に該抗体を産生する細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体おあらゆる組織及び血漿中には、遊
離型、長鎖脂肪酸型及びエステル型のコレステロールが
存在し、前者の２つは細胞膜の構成において重要な役割
を果たし、エステル型は生理的に不活性な貯蔵形態とし
ての性質を有する。生体中のコレステロールは、食物接
種による小腸からの取込みあるいは種々組織、特に肝臓
での生合成に由来する。肝臓で生合成され分泌された遊
離コレステロールは、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）に
取り込まれ、血中でリポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）及び肝
性トリグリセリドリパーゼ（ＨＴＧＬ）の作用を受け、
中間比重リポ蛋白（ＩＤＬ）を経て、低比重リポ蛋白
（ＬＤＬ）へと代謝される。このようにして形成された
ＬＤＬは血流に乗り末梢へ運搬され、末梢のＬＤＬ受容
体を介して血管内皮細胞等の末梢細胞に取り込まれ、末
梢細胞の構成に必要な量のコレステロールが供給される
こととなる。

【０００３】ＬＤＬ受容体は、ＬＤＬの取込みにより細
胞内のコレステロールが増加すると、過剰のコレステロ
ールの蓄積が起こらないようにダウンレギュレーション
（down regulation）される。一方、そのようなＬＤＬ
受容体を介した正常ＬＤＬの細胞内への取込みとは別
に、Ｆｅ³⁺や熱などの物理・化学的な種々変化により生
じた変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、サク
シニル化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）ＬＤＬ
など）の細胞内への取込みの経路が存在する。一つは、
マクロファージスカベンジャー受容体（Scavenger rece
ptor）を介した取込みであり、さらなる一つは、血管内
皮細胞酸化ＬＤＬ受容体（Oxidized LDL receptor、Nat
ure, Vol.386, 73-77, 1997）である。

【０００４】末梢マクロファージは、通常ＬＤＬ受容体
をほとんど発現していないが、酸化ＬＤＬなどの変性Ｌ
ＤＬ認識するスカベンジャー受容体を発現しており、こ
の受容体を介して変性ＬＤＬを取り込むことが明らかに
されている（Nature, Vol.343, 531-535, 1990、Natre,
Vol.343, 570-572, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci.US
A, Vol.87, 9133-9137, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol.87, 8810-8814, 1990、Curr. Opin. Lipodo
l., Vol.2, 295-300, 1991、J. Clin. Invest.,Vol.90,
1450-1457, 1991）。このスカベンジャー受容体は前記
ＬＤＬ受容体とは異なり、細胞内のコレステロールの増
加によるダウンレギュレーションを受けないため過剰の
変性ＬＤＬ（コレステロール）を取込み、マクロファー
ジを泡沫細胞化させる。この泡沫化マクロファージの血
管内皮下、血管壁での蓄積が、動脈硬化症の主たる原因
の一つとされている。事実、最近の報告で、このマクロ
ファージスカベンジャー受容体を遺伝子操作で不活性化
したノックアウトマウスでは、動脈硬化病巣は対照マウ
スに比べ縮小していることが確認されており、動脈硬化
の発症にスカベンジャー受容体が深く関与していること
が実証されている。さらに、このスカベンジャー受容体
が、細菌感染防御や糖尿病性の血管障害惹起の原因であ
る糖化産物（ＡＧＥ、Advanced Glycation End Produc
t）の取込みにも関与していることが明らかにされてい
る（Nature, Vol.386, 292-296, 1997）。

【０００５】マクロファージスカベンジャー受容体に
は、Ｉ型とII型が存在し、ともに６個のドメインで構成
され、Ｃ末端のみが異なる構造を有している。また、膜
蛋白としては珍しいinside-out型の三量体膜型糖蛋白質
である。ヒト、マウス、ウシ及びウサギの種間では、Ｉ
型とII型ともに高いアミノ酸配列相同性を有する（Ｉ
型：64-81%、II型：60-81%）。該ドメインは、Ｃ末端か
ら、Ｃ末端特異ドメイン、コラーゲン様ドメイン、
αヘリカルコイルドコイルドメイン（α-helicalcoil
ed-coil domain）、スペーサードメイン、膜貫通ド
メイン、及び細胞質ドメインからなる。

【０００６】Ｉ型の「Ｃ末端特異ドメイン」は、システ
インに富み、また補体因子１（complement factor
1）、ＣＤ５及びＣＤ６などと高い相同性を有してい
る。「コラーゲン様ドメイン」は、コラーゲンに特有な
グリシン(Gly)-X-Yの繰返し構造を有している。また、
Ｃ末端側には、負に架電したリガンドの結合に適した正
に架電したアミノ酸が多く集まっている。コラーゲン様
ドメインのＣ末端側２２個のアミノ酸を欠失した変異体
は、リガンド結合性を失うことが確認されている。ま
た、種々欠失変異体の作製による実験から、リガンドと
の結合には、リジン残基（Ｋ337）が重要であることが
解明されている。

【０００７】「αヘリカルコイルドコイルドメイン」
は、蛋白一次構造としてのスカベンジャー受容体ポリペ
プチドの３本を会合させて活性受容体を形成させる役割
だけでなく、変性ＬＤＬなどのリガンドを結合して細胞
内に入り、エンドゾーム内でのｐＨの低下に依存して受
容体の高次構造を変化させてリガンドを解離させる役割
を有する。このドメインは、７アミノ酸毎に２回転する
右巻のヘプテッドリピート、即ちαヘリカルコイルドコ
イル構造を取り、３本のポリペプチドは７アミノ酸毎に
存在するロイシンやイソロイシンなどの疎水性アミノ酸
を内側に向け、極性アミノ酸や糖鎖結合部位を外側にし
て、３量体を形成している。

【０００８】該ヘプテッドリピートのコラーゲン様ドメ
イン側に存在するヒスチジンが、細胞内でのリガンドの
解離において機能していることが実験的に証明されてい
る。さらに、このコイルドコイルドメインのヒスチジン
を中心とする１５アミノ酸領域を認識する抗体が、マク
ロファージのカルシウム非依存性の細胞接着を阻害する
ことから、このマクロファージスカベンジャー受容体が
細胞接着分子としての機能も有していることが示唆され
ている。

【０００９】「細胞質ドメイン」は、ＬＤＬ受容体やイ
ンスリン受容体に見られるＮＰＸＹ配列並びにトランス
フェリン受容体に見られるＹＸＲＦ配列と同様のエンド
サイトーシスシグナルに見られる特徴的なタイトターン
構造を有し、これらの配列を欠失させるとエンドサイト
ーシスが抑制されることが証明されている。特に、スカ
ベンジャー受容体のリガンド結合部位であるコラーゲン
様ドメインは、コラーゲンなどの細胞外マトリックスに
結合、沈着する変性ＬＤＬなどの異物や老廃物を除去す
るのに適した構造であることが明らかにされている。

【００１０】マクロファージスカベンジャー受容体に関
するこれまでの研究結果から、マクロファージスカベン
ジャー受容体は、生体内の「掃除屋」であり、生体内の
異物や変性タンパク（例えば、変性ＬＤＬ、糖化産物、
感染細菌由来の異物など）を取り込むことが主たる役割
であり、生体内からそのような異物や変性蛋白質を除去
することにより細胞、生体を防御する生体防御機構の一
つとしての役割を担うものであると考えられている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、既知のマク
ロファージスカベンジャー受容体に特有な構造と同様な
構造有し、細胞内に発生した種々ストレスに対して防御
的に働く新規なスカベンジャー受容体を同定することに
より、生体内に生じた細胞内ストレス、異物あるは変性
蛋白に起因する病的症状や疾患の予防並びに治療に有用
な医薬及び方法を提供するものである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、既知のＬ
ＤＬ受容体、酸化ＬＤＬ受容体及びマクロファージスカ
ベンジャー受容体とは異なる技術分野に属する遺伝子で
ある腫瘍抑制タンパクｐ５３によって転写制御される種
々のヒト遺伝子の解析に関して鋭意研究した結果、ヒト
マクロファージスカベンジャ受容体に特有の蛋白二次構
造に極めて類似の構造をする一方、該受容体とのアミノ
酸配列相同性を有さず、各々がオールタナティブスプラ
イシング変異体(alternative splicing variant）をコ
ードする新規な３つのヒトｃＤＮＡ（「ＣＳＲ遺伝子」
(Cellular Sensor-Related Gene；Cellular Stress Res
ponse Gene）と総称。各々のｃＤＮＡ及び該ｃＤＮＡが
コードするタンパクを「ＣＳＲ１」、「ＣＳＲ２」及び
「ＣＳＲ３」と略称。）を見出し本発明を完成するに到
った。

【００１３】本発明の新規な遺伝子／タンパクは、下記
のような特徴を有し、細胞内に発生した種々ストレスに
対して防御的に働く新規なスカベンジャー受容体である
と考えられる。 （１）マクロファージスカベンジャー受容体Ｉ型及びII
型（GenBankアクセッション番号：S08278；Rohrer, L.
ら、Nature, Vol.343, 570-572, 1990）及び／またはセ
ンサー（Sensor）タンパク（GenBankアクセッション番
号：P30844；Nagasawa, S.ら、J. Biochem., Vol.114,
350-357, 1993）と高い構造的類似性を有する。

【００１４】（２）図２に模式的に示されるような２次
構造を有し、ロイシン単位が４回繰り返されるロイシ
ンジッパー構造を含むトランスメンブレンドメイン（tr
ansmembrane domain）、αヘリカルコイルドコイルド
メイン（α-helical coiled coil domain）、及びＧ
ｌｙ−Ｘ−Ｙの配列単位が４９回繰り返されるコラーゲ
ン様ドメイン（collagen-like domain）から構成され
る。 （３）前記特徴的構造を有する３分子が、コイルドコイ
ルドメインでαヘリックスを、またコラーゲン様ドメイ
ンでトリプルヘリックスを形成することにより３量体を
形成する。 （４）コラーゲン様ドメインは、生理学的ｐＨで正の実
効電荷（net charge）を帯びている。 （５）多くのリン酸化部位及び糖鎖結合部位を有してい
る。リン酸化部位については、具体的には、casein kin
ase2、protein kinase C、及びtyrosine kinase2による
リン酸化部位を有している。

【００１５】（６）ＣＳＲ遺伝子の３’末端の非翻訳領
域には、３’末端poly(A)部位の近傍に、ポリアデニレ
ーションシグナルの供与に深く関連していると思われる
各々AGTAAA及びAATAAAなる６塩基配列を含んでいる。 （７）ＣＳＲの発現は、紫外線照射、過酸化水素及び熱
ショックなどの細胞内ストレスにより誘導される。ま
た、細胞に酸化ストレスを与える多くの試薬（DEM,PMA,
Sodium azide, Sodium arsenite, GSNO, SNP, Heminな
ど）によるストレスによっても発現が誘導される。

【００１６】（８）前記の紫外線照射、過酸化水素及び
熱ショックなどの細胞内ストレスによるＣＳＲの発現
は、抗酸化剤存在下では抑制される。 （９）ＣＳＲは、紫外線照射、過酸化水素及び熱ショッ
クなどの細胞内ストレスにより起こる細胞死を抑制す
る。 （１０）ヘム結合部位、及びミクロボディー（ペルオキ
シソーム）Ｃ末端ターゲティングシグナル部位を有して
いる。

【００１７】従って、本発明のＣＳＲをコードする遺伝
子、タンパク若しくはその断片は、該遺伝子あるいはタ
ンパク分子をターゲットとして、生体内に生じた細胞内
ストレス、異物あるいは変性蛋白に起因する病的症状や
疾患（例えば、動脈硬化症、糖尿病性血管障害、細菌感
染など）の予防並びに治療のための医薬品開発において
極めて有用である。

【００１８】また、該ＤＮＡは、それ自体ＣＳＲに機能
を遺伝子レベルで制御するアンチセンス医薬品として、
また遺伝子治療での使用において有用である。該タンパ
クの断片（例えば、細胞外領域、各ドメイン）は、例え
ば可溶性蛋白医薬品として有用である。

【００１９】さらに本発明のＣＳＲタンパクに反応性を
有する抗体またはその一部は、ＣＳＲの機能を制御する
ことによる抗体医薬品として極めて有用である。さら
に、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）、タンパク、及び抗体
は、本発明のタンパクと相互作用を有するタンパク（リ
ガンド）の探索、該リガンドの機能の解明、並びに該リ
ガンドをターゲットとした治療薬を開発するための試薬
として有用である。

【００２０】また、本発明のＤＮＡの態様の一つである
哺乳動物（マウスなど）由来のＣＳＲの遺伝子情報をも
とに、それらの遺伝子を破壊（不活性化）することによ
りモデル動物を作成することが可能である。このモデル
動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的特徴
を分析することにより、本発明に係る遺伝子及びタンパ
クの機能を解明することが可能となる。さらに、そのよ
うにして内在性遺伝子が破壊された該モデル動物、本発
明のヒト由来のＣＳＲ遺伝子を導入することにより、本
発明のヒト由来遺伝子のみを有するモデル動物を作成す
ることが可能である。このモデル動物に、該導入された
ヒト遺伝子をターゲットとした薬剤（化合物、抗体等）
を投与することにより、その薬剤の治療学的効果を評価
することが可能となる。

【００２１】本発明は、即ち、下記のＤＮＡ、タンパ
ク、発現ベクター、形質転換体、抗体医薬組成物、及び
細胞を初めて提供するものである。 （１） 配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を有す
るタンパクをコードするＤＮＡ及びその断片。 （２） 配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を有す
るタンパクをコードするＤＮＡ及びその断片。 （３） 配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む
タンパクをコードするＤＮＡ及びその断片。 （４） 配列番号９に記載される塩基配列の塩基番号２
７６乃至２０９６の塩基配列を有するＤＮＡ及びその断
片。

【００２２】（５） 配列番号１１に記載される塩基配
列の塩基番号２７６乃至１６７６の塩基配列を有するＤ
ＮＡ及びその断片。 （６） 配列番号１３に記載される塩基配列の塩基番号
３６４乃至１９７１の塩基配列を含むＤＮＡ及びその断
片。 （７） 配列番号９、１１または１３のいずれかに記載
される塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡ。 （８） 配列番号１０に記載されるアミノ酸配列若しく
は該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有す
るタンパク並びにそれらの断片。

【００２３】（９） 配列番号１２に記載されるアミノ
酸配列若しくは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を有するタンパク並びにそれらの断片。 （１０） 配列番号１４に記載されるアミノ酸配列若し
くは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含
むタンパク並びにそれらの断片。 （１１） 前記（１）乃至（７）記載のＤＮＡを含む発
現ベクター。 （１２） 前記（１１）記載の発現ベクターで形質転換
された形質転換細胞。

【００２４】（１３） 前記（８）乃至（１０）記載の
タンパクまたはその断片に反応性を有する抗体または該
抗体の一部。 （１４） 該抗体が、モノクローナル抗体であることを
特徴とする前記（１３）記載の抗体または該抗体の一
部。 （１５） 前記（１３）または（１４）記載の抗体若し
くは該抗体の一部及び薬学的に許容され得る担体を含ん
でなる医薬組成物。 （１６） 前記（８）乃至前記（１０）のいずれかに記
載のタンパクまたはその断片に反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を産生する細胞。 （１７） 該細胞が、モノクローナル抗体を産生する能
力を有する非ヒト哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来
のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞である
ことを特徴とする前記（１６）に記載の細胞。 （１８） 該細胞が、該モノクローナル抗体の重鎖をコ
ードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤＮＡの
いずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細胞内に
導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞
であることを特徴とする前記（１６）に記載の細胞。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下、本発明で用いる語句の意
味、並びに本発明のタンパク、ＤＮＡ、抗体及び細胞の
一般的製造方法を明らかにすることにより、本発明を詳
細に説明する。本発明の「タンパクまたはその断片」と
は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラッ
ト、ハムスター、モルモット、及びマウスなどの哺乳動
物由来のタンパク及びその断片（フラグメント）であ
り、好ましくはヒト、ウサギ、ラットまたはマウス由来
のタンパク若しくはその断片であり、特に好ましくはヒ
ト由来のタンパク及びその断片（フラグメント）であ
る。

【００２６】特に好ましい態様としては、（１）配列番
号１０に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク及びそ
の断片、（２）配列番号１２に記載されるアミノ酸配列
または該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列有
するタンパク及びその断片、及び（３）配列番号１４に
記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列を含むタンパク及びその断片を挙
げることができる。

【００２７】ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有
する」とは、配列番号１０、１２または１４に示される
アミノ酸配列を含むタンパクと実質的に同等の生物学的
性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ
酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましく
は１乃至５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または修飾
されているアミノ酸配列を有するタンパク、並びに該ア
ミノ酸配列に、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１
０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸
が付加されたアミノ酸配列を有するタンパクをも包含す
ることを意味する。

【００２８】また「タンパクの断片」とは、上述した本
発明のＣＳＲタンパクが有するアミノ酸配列中の任意の
部分配列（フラグメント）を意味し、例えば、その細胞
外領域（extracellular region）、膜貫通領域（transm
embrane region）あるいは細胞内領域（cytoplasmic re
gion）といった各ドメイン、あるいは該各領域が他のタ
ンパク分子や低分子リガンドと結合（相互作用）する部
位等を挙げることができる。さらには、該細胞外領域と
他の分子（例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領
域（Ｆｃ、constant region）またはその一部との融合
タンパクも本発明のタンパクの断片の範囲に包含され
る。

【００２９】ここで「細胞外領域」とは以下のような意
味を有するものである。即ち、本発明のＣＳＲタンパ
ク、種々のＧ蛋白質共役型受容体あるいは細胞膜表面分
子のような細胞膜貫性通タンパクは、膜の脂質二重層を
１回または数回貫通する疎水性ペプチド領域により膜と
連結し、全体として細胞外領域(extracellular regio
n)、膜貫通領域(transmembrane region)及び細胞質領域
(cytoplasmic region)の３つの主領域から構成される構
造をとっている。さらにそのような膜貫通性タンパク
は、モノマ−(monomer）として、または、同一のアミノ
酸配列を有するもう１本の鎖あるいは異なるアミノ酸配
列を有する鎖とともにそれぞれホモダイマ−(homodime
r) 、ヘテロダイマ−(heterodimer) あるいはオリゴマ
−(origomer)を形成して存在する。

【００３０】本発明において用いられる「細胞外領域」
とは、前述のような膜貫通性タンパクの全体構造のう
ち、該膜タンパクが保持されている膜の外界側に存在す
る部分構造（部分配列）を意味し、換言すれば、膜内に
取り込まれている領域（膜貫通領域）及び該膜内の領域
に引き続いて細胞質内に存在する領域（細胞内領域）以
外の領域が細胞外領域に該当する。また、本発明におけ
る細胞外領域は、所望応じそのＮ末端及び／またはＣ末
端に、膜貫通領域及び／または細胞内を構成するアミノ
酸配列に由来する１乃至５のアミノ酸が付加されていて
もよい。

【００３１】また、「ヒトの免疫グロブリンの重鎖の定
常領域またはその一部」とは、ヒト由来の免疫グロブリ
ンの重鎖（Heavy Chain，Ｈ鎖）の 定常領域（Constant
region）、Ｆｃ領域またはそれらの一部を意味する。
該免 疫グロブリンは、どのようなクラス及びサブクラ
スに属する免疫グロブリンであってもよく、具体的に
は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ
４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、Ｉｇ
Ｄ及びＩｇＥを挙げることができる。好ましくは、Ｉｇ
Ｇ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４）
またはＩｇＭである。本発明における特に好ましい例と
しては、ヒト由来のＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、Ｉｇ
Ｇ３若しくはＩｇＧ４）に属する免疫グロブリンであ
る。

【００３２】免疫グロブリンは、２つの相同な軽鎖（Li
ght Chain，Ｌ鎖）と２つの相同な重鎖（Heavy Chai
n，Ｈ鎖）の４つの鎖が、 ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結
合）で結合したＹ字形の構造単位を有する。軽鎖は、軽
鎖可変領域（ＶL）及び軽鎖定常領域（ＣL）から構成さ
れる。重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）と重鎖定常領域
（ＣH）から構成される。重鎖定常領域は、クラス（Ｉ
ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）並びにサブ
クラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、Ｉ
ｇＡ１及びＩｇＡ２）毎に各々固有のアミノ酸配列を有
するいくつかのドメインから構成される。

【００３３】ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及
びＩｇＧ４）の重鎖は、Ｎ末端から順に、ＶH、ＣH１ド
メイン、ヒンジ領域、ＣH２ドメイン及びＣH３ドメイン
から構成される。同様にＩｇＧ１の重鎖は、Ｎ末端から
順に、ＶH、Ｃγ₁１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃγ₁２ド
メイン及びＣγ₁３ドメインから構成される。ＩｇＧ２
の重鎖は、Ｎ末端から順に、ＶH、Ｃγ₂１ドメイン、ヒ
ンジ領域、Ｃγ₂２ドメイン及びＣγ₂３ドメインから構
成される。ＩｇＧ３の重鎖は、Ｎ末端から順に、ＶH、
Ｃγ₃１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃγ₃２ドメイン及びＣ
γ₃３ドメインから構成される。ＩｇＧ４の重鎖は、Ｎ
末端から順に、ＶH、Ｃγ₄１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃ
γ₄２ドメイン及びＣγ₄３ドメインから構成される。

【００３４】ＩｇＡの重鎖は、Ｎ末端から順に、ＶH、
Ｃα１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃα２ドメイン及びＣα
３ドメインから構成される。同様にＩｇＡ１の重鎖は、
Ｎ末端から順に、ＶH、Ｃα₁１ドメイン、ヒンジ領域、
Ｃα₁２ドメイン及びＣα₁３ドメインから構成される。
ＩｇＡ２の重鎖は、Ｎ末端から順に、ＶH、Ｃα₂１ドメ
イン、ヒンジ領域、Ｃα₂２ドメイン及びＣα₂３ドメイ
ンから構成される。ＩｇＤの重鎖は、Ｎ末端から順に、
ＶH、Ｃδ１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃδ２ドメイン及
びＣδ３ドメインから構成される。ＩｇＭの重鎖は、Ｎ
末端から順に、ＶH、Ｃμ１ドメイン、Ｃμ２ドメイ
ン、Ｃμ３ドメイン及びＣμ４ドメインから構成され、
ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤに見られるようなヒンジ領域
を有しない。ＩｇＥの重鎖は、Ｎ末端から順に、ＶH、
Ｃε１ドメイン、Ｃε２ドメイン、Ｃε３ドメイン及び
Ｃε４ドメインから構成され、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇ
Ｄに見られるようなヒンジ領域を有しない。

【００３５】さらに、ＩｇＧを例に挙げるならば、Ｉｇ
Ｇをパパインで処理すると、２つの重鎖を連結させてい
るヒンジ領域中に存在するジスルフィド結合のややＮ末
端側で切断されて、ＶH及びＣH１からなる重鎖断片と１
つの軽鎖がジスルフィド結合で連結した２つの相同なＦ
ａｂ、並びにヒンジ領域、ＣH２ドメイン及びＣH３ドメ
インからなる２つの相同な重鎖断片がジスルフィド結合
で連結した１つのＦｃを生ずる（以上、「免疫学イラス
トレイテッド」、原書第２版、第65〜75頁、１９９２
年、南江堂発行、及び「最新医科学の焦点「免疫系の認
識機構」」、第4〜7頁、１９９１年、南江堂発行など参
照）。

【００３６】即ち、本発明における「免疫グロブリンの
重鎖の定常領域の一部」とは、上述のような構造的特徴
を有する免疫グロブリンの重鎖の定常領域の一部を意味
し、好ましくは、Ｃ１ドメインを欠く定常領域またはＦ
ｃ領域である。具体的には、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇ
Ｄの場合には、各々のヒンジ領域、Ｃ２ドメイン及びＣ
３ドメインからなる領域が挙げられ、ＩｇＭまたはＩｇ
Ｅの場合には、各々のＣ２ドメイン、Ｃ３ドメイン及び
Ｃ４ドメインからなる領域が挙げられる。とりわけ好ま
しい例としては、ヒト由来のＩｇＧ１のＦｃ領域を挙げ
ることができる。

【００３７】本発明の「タンパクの断片」に包含される
融合タンパクの好適な例としては、前記の定義されると
おりの本発明のタンパクの細胞外領域と該「ヒトの免疫
グロブリンの重鎖の定常領域または定常領域の一部」と
からなる融合ポリペプチドを挙げることができる。好ま
しくは本発明のタンパクの細胞外領域とヒトＩｇＧの重
鎖の定常領域の一部との融合ポリペプチドであり、特に
好ましくは本発明のタンパクの細胞外領域とヒトＩｇＧ
の重鎖のヒンジ領域、ＣH２ドメイン及びＣH３ドメイン
からなる領域（Ｆｃ）との融合ポリペプチドである。な
お、ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１が好ましい。また、本発
明のタンパクとしては、ヒト、マウスまたはラット（好
ましくはヒト）に由来するタンパクが好ましい。

【００３８】本願明細書または図面においてアミノ酸を
表記するために用いられるアルファベットの三文字ある
いは一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。（Gl
y／G）グリシン、（Ala／A）アラニン、（Val／V）バリ
ン、（Leu／L）ロイシン、（Ile／I）イソロイシン、
（Ser／S）セリン、（Thr／T）スレオニン、（Asp／D）
アスパラギン酸、（Glu／E）グルタミン酸、（Asn／N）
アスパラギン、（Glu／Q）グルタミン、（Lys／K）リジ
ン、（Arg／R）アルギニン、（Cys／C）システイン、
（Met／M）メチオニン、（Phe／F）フェニルアラニン、
（Tyr／Y）チロシン、（Trp／W）トリプトファン、（Hi
s／H）ヒスチジン、（Pro／P）プロリン。

【００３９】本発明のタンパク、タンパクフラグメント
及び融合タンパクは、後述するような遺伝子組換え技術
のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技
術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾
方法を適宜用いることにより製造することができる。ま
た、上述した本発明の融合タンパクは、前述のようなＩ
ｇＧ等の免疫グロリンの定常領域の一部（例えば、Ｆ
ｃ）を融合パートナーとして有することから、該免疫グ
ロブリン断片に特異的に結合するというプロテインＡの
性質を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー
を用いることにより該融合タンパクを極めて容易に精製
することが可能であるという点で利点を有する。さら
に、種々の免疫グロブリンのＦｃに対する種々の抗体が
提供されていることから、該Ｆｃに対する抗体を用い
て、該融合ポリペプチドのイムノアッセイを簡便に行う
ことができる。

【００４０】本発明のＤＮＡは、前述の本発明のタンパ
クまたはその断片をコードするＤＮＡであって、本発明
のタンパクをコードし得るいかなる塩基配列をも包含
し、ゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれをも包含
する。また、該ＤＮＡは、同一のアミノ酸をコードする
コドンであればどのようなコドンから構成されるＤＮＡ
を含む。また、本発明においては、同一のアミノ酸をコ
ードするコドンであればどのようなコドンから構成され
るＤＮＡを含む。また、本発明におけるＤＮＡの好まし
い態様としては、ヒト由来のタンパクをコードするＤＮ
Ａを挙げることができる。

【００４１】具体的な態様としては、下記が挙げられ
る。 （１）配列番号１０、１２または１４で示されるアミノ
酸配列を含むタンパクあるいは断片のアミノ酸配列中に
複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ
酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸を置換、欠失
及び／または修飾するか、若しくは該アミノ酸配列に複
数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、
特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸を挿入することに
よって得られる生物学的同等物をコードするＤＮＡであ
る。 （２）配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の
いずれかに記載される塩基配列を有するＤＮＡまたはそ
の断片にハイブリダイズするＤＮＡ。

【００４２】より具体的には、下記のようなＤＮＡが挙
げられる。 （１）配列番号９に記載される塩基配列の塩基番号２７
６乃至２０９６の塩基配列を有するＤＮＡ及びその断
片。 （２）配列番号１１に記載される塩基配列の塩基番号２
７６乃至１６７６の塩基配列を有するＤＮＡ及びその断
片。 （３）配列番号１３に記載される塩基配列の塩基番号３
６４乃至１９７１の塩基配列を含むＤＮＡ及びその断
片。

【００４３】ここで「ストリンジェントな条件下」とし
ては、例えば、次のような条件を挙げることができる。
例えば、５０塩基以上のプローブを用い、0.9％NaCl下
でハイブリダイゼーションを行う場合には、、50％の解
離を生ずる温度（Ｔｍ）の目安を下記計算式から求め、
ハイブリダイゼーションの温度を下記計算式のように設
定することができる。 Ｔｍ＝82.3℃＋0.41×（G+C）％−500／ｎ−0.61×（フ
ォルムアミド）％（ｎはプローブの塩基数を示す。） 温度＝Ｔｍ−25℃ また、100塩基以上のプローブ（G+C=40〜50%の場合）を
用いる場合には、Ｔｍが下記（１）及び（２）のように
変化することを目安する。 （１）１％ミスマッチ毎に、Ｔｍが約１℃下がる。 （２）フォルムアミド１％毎に、Ｔｍが0.6〜0.7℃下が
る。 従って、完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件は下
記のようにすることができる。 （Ａ）65〜75℃（フォルムアミド無添加） （Ｂ）35〜45℃（50％フォルムアミド存在下） また、不完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件は下
記のようにすることができる。 （Ａ）45〜55℃（フォルムアミド無添加） （Ｂ）35〜42℃（30％フォルムアミド存在下） また、23塩基以下のプローブを用いる場合の温度条件
は、３７℃とすることもできるし、また下記計算式を目
安とすることもできる。 温度＝２℃×（A+Tの数）＋４℃×（C+Gの数）−５℃

【００４４】また、本発明のＤＮＡは、いかなる方法で
得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製
される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製
されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得ら
れるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構
築されるＤＮＡをも全て包含するものである。本発明の
タンパクをコードするＤＮＡは、常法に従って本発明の
タンパクのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方
法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方
法、化学合成する方法等により取得することができる。

【００４５】（１） 例えば、本発明のタンパクのｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法としては、以下
の方法が例示される。まず、本発明のタンパクを発現・
産生する前述のような組織あるいは細胞から該本発明の
タンパクをコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの
調製は、例えばグアニジンチオシアネート法（チャーグ
ウィン（Chirgwin）ら、バイオケミストリー（Biochemi
stry）、第１８巻、第５２９４頁、１９７９年）、熱フ
ェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて
調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ
−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィ
ーにかけることによって行うことができる。

【００４６】次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例
えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤ
マらの方法（モレキュラーセルバイオロジー（Mol.Cel
l.Biol.）、第２巻、第１６１頁、１９８２年及び同誌
第３巻、第２８０頁、１９８３年）やホフマン（Hoffma
n）らの方法（ジーン（Gene）、第２５巻、第２６３
頁、１９８３年）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮ
Ａの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプ
ラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベ
クターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはイ
ンビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トラン
スフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作
製する。

【００４７】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてｐＵＣ１９、λｇｔ１０、
λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的ス
クリーニングに供する場合は、宿主内で本発明のタンパ
クをコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有
したベクターであることが好ましい。

【００４８】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えばマニアティス（Maniatis）らの方法（モレ
キュラークローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル
（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second e
dition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、第1.53頁、１９
８９年） に記載の方法などが挙げられる。また、ファ
ージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、ヒュ
ン（Hyunh） らの方法（ＤＮＡクローニング、プラクテ
ィカルアプローチ（DNA Cloning, a practical approac
h）、第1巻、第49頁、１９８５年）などが挙げられる。
簡便には、市販のクローニングキット（例えば、宝酒造
製等）を用いることもできる。このようにして得られる
組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＨＢ１０１、ＤＨ５αまたはＭＣ
１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。

【００４９】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、（モレキュラークローニング、ア・ラボラトリー・
マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, second edition）、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー（Cold Spring HarborLaboratory）、第1.74
頁、１９８９年）に記載の塩化カルシウム法または塩化
カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーショ
ン法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に
導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッ
ケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が
例示される。インビトロパッケージングは、市販のイン
ビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン
製、アマシャム製等）を用いることによって簡便に行う
ことができる。

【００５０】上記の方法によって作製されたｃＤＮＡラ
イブラリーから、本発明のタンパクをコードするｃＤＮ
Ａを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング
法を組み合わせることによって行うことができる。例え
ば、別個に本発明のタンパクのアミノ酸配列に対応する
と考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、
これを³²Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニ
ーハイブリダイゼーション法（クランシュタイン（Crun
stein）ら、プロシーディングスオブナショナルアカデ
ミーオブサイエンス（Proc. Natl.Acid. Sci. USA）、
第７２巻、第３９６１頁、１９７５年）またはプラーク
ハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, second edition , Cold Spring Harbo
r Laboratory、第2.108 頁、１９８９年）により、目的
のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方
法、ＰＣＲプライマーを作製し本発明のタンパクの特定
領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮ
Ａ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられ
る。

【００５１】また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例
えば、λｇｔ１１ファージベクター）を用いて作製した
ｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、本発明のタン
パクに反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用
して、目的のクローンを選択することができる。大量に
クローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスク
リーニング法を用いることが好ましい。この様にして得
られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マ
キサム（Maxam）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第
７４巻、第５６０頁、１９７７年）あるいはファージＭ
１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法
（サンガー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A.、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁、１９７７年）
によって決定することができる。本発明のタンパクをコ
ードする遺伝子は、その全部または一部を上記のように
して得られるクローンから制限酵素等により切り出すこ
とにより取得できる。

【００５２】（２）また、前述のような本発明のタンパ
クを発現する細胞に由来するゲノムＤＮＡから本発明の
タンパクをコードするＤＮＡを単離することによる調製
方法としては、例えば以下の方法が例示される。該細胞
を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶
解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白
質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより
消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分
消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコ
スミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の
配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮ
Ａプローブを用いる方法等により検出し、該クローンか
ら本発明のタンパクをコードする遺伝子の全部または一
部を制限酵素等により切り出し取得する。ヒト由来タン
パクをコードするｃＤＮＡを取得する場合には、さらに
ヒトゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）が導入されたコスミ
ドライスラリーを作製（「ラボマニュアルヒトゲノムマ
ッピング」、堀雅明及び中村祐輔 編、丸善 出版）
し、該コスミドライブラリーをスクリーニングすること
により、目的タンパクのコーディング領域のＤＮＡを含
む陽性クローンを得、該陽性クローンから切り出したコ
ーディングＤＮＡをプローブとして用い、前述のｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングすることにより調製す
ることもできる。

【００５３】（３） また、化学的合成による本発明の
ＤＮＡの製造は、配列番号９、１１または１３に記載さ
れる塩基配列をもとにして、常法に従って行うことがで
きる。 さらに本発明は、上述の本発明のタンパクをコ
ードするＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。本
発明の組換えベクターとしては、原核細胞及び／または
真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖でき
るものであれば特に制限されず、プラスミドベクターお
よびファージベクターが包含される。

【００５４】当該組換えベクターは、簡便には当業界に
おいて入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡ
およびバクテリアファージＤＮＡ）に本発明のタンパク
をコードするＤＮＡを常法により連結することによって
調製することができる。用いられる組換え用ベクターと
して具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えば
pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など、酵母由来
プラスミドとして例えばpSH19、pSH15など、枯草菌由来
プラスミドとして例えばpUB110、pTP5、pC194などが例
示される。また、ファージとしては、λファージなどの
バクテリ オファージが、さらにレトロウイルス、ワク
シニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫の
ウイルス（pVL1393、インビトロゲン製）が例示され
る。

【００５５】本発明のタンパクをコードするＤＮＡを発
現させ本発明のタンパクを生産させる目的においては、
発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原
核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本
発明のタンパクをコードする遺伝子を発現し、これら蛋
白質を生産する機能を有するものであれば特に制限され
ない。例えば、pMAL C2 、pEF-BOS（ヌクレイックアシ
ッドリサーチ（NucleicAcid Research）、第１８巻、第
５３２２頁、１９９０年等）あるいはpME18S（実験医学
別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を
挙げることができる。

【００５６】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる
場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−
オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域およ
び複製可能単位から構成される。宿主として酵母、動物
細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少な
くともプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクを
コードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ま
しい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エン
ハンサー配列、本発明のタンパクをコードする遺伝子の
５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合
部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域また
は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に
応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を
含んでいてもよい。

【００５７】細菌中で本発明のタンパクを発現させるた
めのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモータ
ー、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列（例
えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主が
エシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ
Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモー
ターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明のタ
ンパクを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ
０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモ
ーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチル
ス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロ
モーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。ま
た、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ
４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好
ましくは、ＳＶ−４０、レトロウイルスである。しか
し、特にこれらに限定されるものではない。また、発現
にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。

【００５８】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。終止コドンとしては、常
用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）が
例示される。ターミネーター領域としては、通常用いら
れる天然または合成のターミネーターを用いることがで
きる。

【００５９】複製可能単位とは、宿主細胞中でその全Ｄ
ＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言
い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド
（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメン
ト）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラス
ミドとしては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、
もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限
酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母
では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡ
が、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 371
98、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV
-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149等
があげられる。

【００６０】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例えば
それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。選択マーカー
としては、通常使用されるものを常法により用いること
ができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、ま
たはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示され
る。

【００６１】遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺
伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素
遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデ
カルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカ
ルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。本発明
の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、
開始コドン、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ、終
止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に
適当な複製可能単位に連結することによって調製するこ
とができる。またこの際、所望により制限酵素での消化
やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法
により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、
他のリストリクションサイトなど）を用いることができ
る。

【００６２】本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベク
ターを宿主細胞に導入することにより調製することがで
きる。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発
現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特
に限定されず、本発明の技術分野において通常使用され
る天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種
々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス
属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、
動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。

【００６３】好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であ
り、具体的には大腸菌（ＤＨ５α、ＴＢ１、ＨＢ１０１
等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２
／０、ＮＳ−１またはＮＩＨ3 Ｔ3等）、ラット由来細
胞、ハムスター由来細胞（ＢＨＫおよびＣＨＯ等）、サ
ル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１お
よびＶｅｌｏ等）およびヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍
体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびＮ
ａｍａｌｗａ等）などが例示される。

【００６４】発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転
換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことが
できる。例えば、細菌（E.coli、Bacillus subtilis
等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA.、第６９巻、第２１１０頁、１９７２年
）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet.、 第１６８
巻、第１１１頁、１９７ ９年）やコンピテント法（ジ
ャーナルオブモレキュラーバイオロジー（J. Mol. Bio
l.）、第５６巻、第２０９頁、１９７１年）によって、
Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばハイネン
（Hinnen）らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、
第７５巻、第１９２７頁、１９７８年）やリチウム法
（J. Bacteriol.、第１５３巻、第１６３頁、１９８３
年）によって、動物細胞の場合は、例えばグラハム（Gr
aham）の方法（バイロロジー（Virology）、第５２巻、
第４５６頁、１９７３年）、昆虫細胞の場合は、例えば
サマーズ（Summers）らの方法（Mol. Cell. Biol.、第
３巻、第２１５６〜第２１６５頁、１９８３年）によっ
てそれぞれ形質転換することができる。

【００６５】本発明のタンパクは、上記の如く調製され
る発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体
を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養するこ
とによって製造することができる。栄養培地は、宿主細
胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源も
しくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源と
しては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デン
プン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源と
しては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ
酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉
エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。
また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩
化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシ
ウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリ
ン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）な
ど）を含んでいてもよい。培養は当業界において知られ
ている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培
地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパクが大量に
生産されるように適宜選択される。

【００６６】なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる
具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれら
に限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵
母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液
体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である
培地である。宿主がE. coli の場合、好ましい培地とし
てＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、 Exp. Mo
l. Genet、Cold Spring Harbor Laboratory、第４３１
頁、１９７２年）等が例示される。かかる場合、培養
は、必要により通気、攪拌しながら、通常１４〜４３
℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がBacillus
属菌の場合、必要により通気、攪拌をしながら、通常３
０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。

【００６７】宿主が酵母である場合、培地として、例え
ばBurkholder最小培（ボスチアン（Bostian）、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA、第７７巻、第４５０５頁、１９
８ ０年）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ま
しい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間
行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％
の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（サイエンス（Scienc
e）、第１２２巻、第５０１頁、１９５２年）、ＤＭＥ
Ｍ培地（バイロロジー（Virology）、第８巻、 第３９
６頁、１９５９ 年）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. Am.
Med. Assoc.、第１９９巻、第５１９頁、１９６７
年）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Biol. Med.、第７
３巻、第１頁、１９５０年）等を用いることができる。
培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常
約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要によ
り通気や攪拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場
合、例えば胎児牛血清を含むGrace's 培地（Proc. Nat
l.Acad. Sci. USA、第８２巻、第８４０４頁、１９８５
年）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行
なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

【００６８】本発明の受容体は、上述のような形質転換
細胞、特に動物細胞を培養することにより、その細胞表
面に目的分子を高発現させることが可能である。一方、
本発明のタンパクを、細胞外領域タンパクフラグメント
のような可溶性タンパクとして製造する場合には、当該
細胞外領域あるいは各ドメインをコードするＤＮＡを用
いて上述のように形質転換体を調製し、外形質転換体を
培養することにより培養上清中に分泌させることにより
製造することができる。

【００６９】すなわち、得られた培養物を濾過または遠
心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液か
ら天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一
般に用いられる常法に従って該本発明のタンパクを精
製、単離する。単離、精製方法としては、例えば塩析、
溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾
過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイト
クロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィ
ニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用
する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水
性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の
差を利用する方法などが挙げられる。

【００７０】一方、本発明のタンパクが培養された形質
転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合
は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌
体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば
超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の
細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や
ろ過などの方法で本発明のタンパクを含有する膜画分を
得る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤
を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液
を先に例示したような常法を用いることにより、単離、
精製することができる。

【００７１】上述のように取得、調製される本発明のタ
ンパクに包含されるヒト由来のタンパクをコードするＤ
ＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ）を用いれば、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物、即ち、該ヒト由来
のＤＮＡが、非ヒト哺乳動物（例えばマウス）の内在性
遺伝子座上にインテグレート（integrate）されてお
り、体内に該ＤＮＡによりコードされる本発明の タン
パクを発現、分泌するヒト以外のトランスジェニック哺
乳動物を作製することができる。このトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物も本願の発明に属する。該トランスジ
ェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の
製造において通常使用されるような常法（例えば、最新
動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７
章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年を参照）に従っ
て作製することができる。

【００７２】具体的には、例えば、トランスジェニック
マウスの場合には、正常マウス胚盤胞（blastcyst）の
か ら取得した胚性幹細胞（Embryonic Stem Cell, ES C
ell）を、本発明のヒト由来のタンパクをコードする遺
伝子及びマーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺
伝子）が発現可能なように挿入された発現ベクターで形
質転換する。該本発明のヒト由来のタンパクをコードす
る遺伝子が内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ
細胞を、マーカー遺伝子の発現の有無に基づいて常法に
より選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常
マウスから取得した受精卵（肺盤胞）にマイクロインジ
ェクションする（Proc. Natl. Acad. Sci.USA, Vol.77,
No.12, pp.7380-7384, 1980；米国特許第4,873,191号
公報）。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮
に移植する。そうして該仮親マウスから、ファウンダー
マウス（子マウス）が生まれる。該ファウンダーマウス
を正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジ
ェニックマウスを得る。該ヘテロ（heterogeneic）トラ
ンスジェニックマウス同士を交配することにより、メン
デルの法則に従って、ホモ（homogeneic）トランスジェ
ニックマウスが得られる。

【００７３】また、本発明に包含されるマウスに由来す
るタンパクをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて、
いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができ
る。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発
明のマウス由来のタンパクをコードする内在性遺伝子が
ノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば
相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクショ
ン法（米国特許第5,464,764号公報、同5,487,992号公
報、同5,627,059号公報 、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, Vol.86, 8932-8935, 1989、Nature, Vol.342, 435-4
38, 1989など）を用いて作製することができ、このよう
なノックアウトマウスも本発明の一態様である。

【００７４】本発明における「抗体」とは、ポリクロー
ナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体を意味
し、好ましくはモノクローナル抗体である。具体的に
は、前述の本発明のタンパクまたはそのフラグメントに
反応性を有する抗体である。本発明の「抗体」は、本発
明のタンパク（天然体、組換体、合成物、細胞等）若し
くはその断片あるいは前述のような遺伝子組換技術によ
り目的タンパクをその細胞表面に高発現させた形質転換
体を、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるい
はウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、
遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体及びヒ
ト型抗体（CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体産生ト
ランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体
も包含する。またモノクローナル抗体の場合には、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれ
のアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含す
る。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。

【００７５】本発明で言うポリクローナル抗体（抗血
清）あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般的な製
造方法によって製造することができる。即ち、例えば、
抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freun
d's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウ
ス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、
イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくは
マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギ
に免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物か
ら得た血清から取得することができる。またモノクロー
ナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と
自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）
からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクロ
ーン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的
親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを
選択することによって製造される。

【００７６】モノクローナル抗体は、具体的には下記の
ようにして製造することができる。即ち、前述のような
本発明のタンパク若しくはその断片あるいは該タンパク
を発現している細胞等を発現している等を免疫原とし
て、該免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント
（Freund's Adjuvant）とともに、マウス、ラット、ハ
ムスター、モルモ ットあるいはウサギ、好ましくはマ
ウス、ラットあるいはハムスター（ヒト抗体産生トラン
スジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生
するように作出されたトランスジェニック動物を含む）
の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹
腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することによ
り免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日
毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５
日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取
得される。

【００７７】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法
（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９
７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って
行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺
乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁
桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ま
しくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサ
ギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラ
ットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ
細胞との細胞融合させることにより調製される。

【００７８】細胞融合に用いられるミエローマ細胞とし
ては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（６
５３；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（ＮＳ−
１）、P3/X63-Ag8.U1（Ｐ３Ｕ１）、SP2/0-Ag14（Ｓｐ
２／Ｏ、Ｓｐ２）、PAI、F0あるいはBW5147、ラッ ト由
来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-2
66AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あ
るいはCEM-T15を使用することができる。モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニ
ングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープ
レート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の
前述のマウス免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性
を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によ
って測定することにより行なうことができる。

【００７９】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウ
ス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、
好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウス
の腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、ま
たは哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが
できる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞
種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に
合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、
培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用
いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地か
ら誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施するこ
とが可能である。

【００８０】基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１
２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥ
Ｍ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、
ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、
ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培
地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば
血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あ
るいは有機物質等を含有することができる。モノクロー
ナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水
を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カ
プロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラ
フィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブ
リンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィーに供すること等により行う
ことができる。

【００８１】また、当該ハイブリドーマからモノクロー
ナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、トラン
スジェニック動物作製技術を用いて当該抗体コーディン
グ遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニ
ックなウ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、当該トラ
ンスジェニック動物のミルク中から当該抗体遺伝子に由
来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能
である（日系サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至
８４頁）。

【００８２】本発明における「キメラ抗体」は、遺伝子
工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体
的には、例えば、その可変領域がマウスイムノグロブリ
ン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイム
ノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマ
ウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノク
ローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリン由来の
定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇ
Ｅ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有
するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体
の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノ
グログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒ
トＩｇＧの定常領域である。本発明におけるキメラモノ
クローナル抗体は、例えば以下のようにして製造するこ
とができる。しかしながら、そのような製造方法に限定
されるものでないことは言うまでもない。

【００８３】例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナ
ル抗体は、実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１
０号、１９８８年及び特公平３−７３２８０号公報等を
参照しながら作製することができる。即ち、マウスモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した
該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取
得した活性なＶH遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再
配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロム
リンをコードするＤＮＡから取得したＣH遺伝子（Ｈ鎖
定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリド
ーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードす
るＤＮＡから取得した活性なＶL遺伝子（Ｌ鎖可変領域
をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイ
ムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣL遺
伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発
現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに
挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形
質転換細胞を培養することにより作製することができ
る。

【００８４】具体的には、まず、マウスモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出
後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄIII等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例
えば０．７％アガロースゲル使用）サザンブロット法を
行う。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で
染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２
回水洗し、０．２５ＭＨＣｌ溶液に１５分間浸す。次い
で、０．４ＮのＮａＯＨ溶液に１０分間浸し、その間緩
やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４時
間後フィルターを回収して２×ＳＳＣで２回洗浄する。
フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５℃、３
時間）を行う。ベイキング終了後に、該フィルターを
０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に入れ、６５℃で
３０分間処理する。次いで、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤ
Ｓ溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイ
ゼーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４
時間処理する。

【００８５】次に、この中に³²Ｐ標識したプローブＤＮ
Ａ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２
時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、
適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×ＳＳ
Ｃ−０．１％ＳＤＳ溶液、室温、１０分間）のもとで、
フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、
２×ＳＳＣを少量加え、密封し、オートラジオグラフィ
ーを行う。

【００８６】上記サザンブロット法により、マウスモノ
クローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列
されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定し
たＤＮＡ断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画
し、ファージベクター（例えば、Charon 4A、Charon 2
8、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該フ
ァージベクターで大腸菌（例えば、LE392、NM539等) を
形質転換し、ゲノム ライブラリーを作製する。そのゲ
ノムライブラリーを適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ
鎖（κ）Ｊ遺伝子等）を用いて、例えばベントンデイビ
ス法（サイエンス(Science)、第１９６巻、第１８０〜
第１８２頁、１９７７年）に従って、プ ラークハイブ
リダイゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あ
るいはＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得
る。得られたクローンの制限酵素地図を作製し、塩基配
列を決定し、目的とする再配列されたＶH(VDJ)遺伝子あ
るいはＶL(VJ)遺伝子を含む遺伝子が得られていること
を確認する。

【００８７】一方、キメラ化に用いるヒトＣH遺伝子及
びヒトＣL遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ1
とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣH遺伝子である
Ｃγ1遺伝子とＣL遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。
これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免
疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用して
ヒトＣγ1遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウス
Ｃγ1遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用
い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって
得ることができる。

【００８８】具体的には、例えば、クローンＩｇ１４６
（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエ
ンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７５巻、第４７
０９〜第４７１３頁、１９７８年）からの３ｋｂのＨｉ
ｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片とクローンＭＥＰ１０（プロ
シーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７８巻、第４７４〜第
４７８頁、１９８１年）からの６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片をプローブとして用い、ヒトのラムダCharon 4A の
ＨａｅIII−ＡｌｕＩゲノムライブラリー（セル(Cel
l)、第１５巻、第１１５７〜第１１７４頁、１９７８
年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハンサー領域
を保持しているＤＮＡ断片を単離する。また、ヒトＣγ
1遺伝子は、例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡをＨｉｎｄIII
で切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、５．
９ｋｂのバンドをλ７８８に挿入し、前記のプローブを
用いて単離する。

【００８９】このようにして単離されたマウスＶH遺伝
子とマウスＶL遺伝子、及びヒトＣH遺伝子とヒトＣL遺
伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域
などを考慮しながらマウスＶH遺伝子の下流にヒトＣH遺
伝子を、またマウスＶL遺伝子の下流にヒトＣL遺伝子
を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例え
ばｐＳＶ２ｇｐｔあるいはｐＳＶ２ｎｅｏ等の発現ベク
ターに常法に従って組み込む。この際、マウスＶH遺伝
子／ヒトＣH遺伝子とマウスＶL遺伝子／ヒトＣL遺伝子
のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置さ
れてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置すること
もできる。

【００９０】このようにして作製したキメラ遺伝子挿入
発現ベクターを、例えばP3X63・Ag8・653細胞あるいはSP2
10細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫細
胞にプロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン
法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導
入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬
物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により
選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞
を取得する。このようにして選別された抗体産生細胞の
培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得
する。

【００９１】本発明における「ヒト型抗体（CDR-grafte
d抗体）」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナ
ル抗体であって、具体的には、例えば、その超可変領域
の相補性決定領域の一部または全部がマウスモノクロー
ナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であ
り、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由
来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒ
トイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴と
するヒト型モノクローナル抗体を意味する。

【００９２】ここで、超可変領域の相補性決定領域と
は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相
補的に直接結合する部位である３つの領域（Complement
arity-determining residue；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、Ｃ
ＤＲ３）を指し、また可変領域の枠組領域とは、該３つ
相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つ
の領域（Framework；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ
４）を指す。換言すれば、例えばマウスモノクローナル
抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以
外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と
置き代わったモノクローナル抗体を意味する。ヒトイム
ノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有
のアミノ酸配列を有するが、本発明におけるヒト型モノ
クローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属
するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。
好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒト
イムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域についても
限定されるものではない。

【００９３】本発明におけるヒト型モノクローナル抗体
は、例えば以下のようにして製造することができる。し
かしながら、そのような製造方法に限定されるものでな
いことは言うまでもない。例えば、マウスモノクローナ
ル抗体に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体は、特
表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６８
９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製すること
ができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤ
Ｒ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なく
とも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒト
イムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対
応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ
鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖Ｃ
ＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離す
る。

【００９４】単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒ
トＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに
導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖
遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクタ
ーに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒ
トＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝
子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入するこ
ともできる。このようにして作製された発現ベクターで
宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナ
ル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養す
ることにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナ
ル抗体を得る。

【００９５】本発明における「ヒト抗体」とは、イムノ
グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領
域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全て
の領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由
来するイムノグロブリンである。ヒト抗体は、常法に従
って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子
をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込む
ことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原
で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗
体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製
造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトラ
ンスジェニックマウスは、ネイチャージェネティックス
(Nature Genetics)、第１５巻、第１４６〜第１５６
頁、１９９７年；ネイチャージェネティックス、第７
巻、第１３〜第２１頁、１９９４年；特表平４−５０４
３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公
報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９
９５年；ネイチャー(Nature)、第３６８巻、第８５６〜
第８５９頁、１９９４年；及び特表平６−５００２３３
号公報に記載の方法に従って作製することができる。

【００９６】本発明における「抗体の一部」とは、前述
の本発明における抗体、好ましくはモノクローナル抗体
の一部分の領域を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）₂、
Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antib
ody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilised F
v）あるいはｄＡｂ（single domain antibody）である
（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティッ
ク・パテンツ(Exp. Opin. Ther. Patents)，第６巻，第
５号，第441〜456頁，1996年）。ここで、「Ｆ（ａ
ｂ’）₂」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロブリン
（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシ
ンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、
ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結
合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意
味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒン
ジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の
上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領域）とＣL（Ｌ鎖定常
領域）からなるＬ鎖、及びＶH（Ｈ鎖可変領域）とＣHγ
1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなるＨ鎖フラグメ
ントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相
同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。
これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ’と
いう。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域
中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で
切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながっ
たものよりやや大きい抗体フラグメントを製造すること
ができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）₂とい
う。

【００９７】本発明の「タンパクまたはその断片に反応
性を有するモノクローナル抗体を産生する細胞」とは、
前述した本発明のモノクローナル抗体を産生する任意の
細胞を意味する。具体的には、（１）前述したとおり
の、本発明のタンパク、その断片または該タンパクを産
生する細胞等で非ヒト哺乳動物を免疫して得られる本発
明のタンパクまたはその一部に反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を産生する該非ヒト哺乳動物由来のモノクロ
ーナル抗体産生Ｂ細胞、（２）そのようにして得られた
抗体産生Ｂ細胞を哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞
融合して得られる前述のハイブリドーマ（融合細胞）、
あるいは（３）該モノクローナル抗体産生Ｂ細胞または
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから単離される
該モノクローナル抗体をコードする遺伝子（重鎖をコー
ドする遺伝子若しくは軽鎖をコードする遺伝子のいずれ
か一方、または両方の遺伝子）により該Ｂ細胞及びハイ
ブリドーマ以外の細胞を形質転換して得られるモノクロ
ーナル抗体産生形質転換細胞のいずれかを意味する。こ
こで、前記（３）に記載のモノクローナル抗体産生形質
転換細胞は、即ち、前記（１）のＢ細胞または（２）の
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の遺伝子
組換え体を産生する遺伝子組換え細胞を意味する。この
組換えモノクローナル抗体産生細胞は、前述したキメラ
モノクローナル抗体及びヒト型抗体の製造において使用
される方法と同様にして製造することができる。

【００９８】本発明の「医薬組成物」とは、前記で定義
される本発明のタンパク若しくはその断片（フラグメン
ト）、抗体または該抗体の一部のいずれかと、薬学的に
許容され得る担体とからなる医薬組成物である。ここで
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、
増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳
香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あ
るいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体
の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆
粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシ
ル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬
組成物を調製することができる。これらの医薬組成物
は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非
経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそ
れ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液
剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含
まれる。

【００９９】投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症
状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組
成物に含有される活性成分（前記タンパクや抗体など）
の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回
につき10μgから1000mg （あるいは10μgから500mg）の
範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は
種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない
量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量
が必要な場合もある。とりわけ注射剤の場合には、例え
ば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の
薬学的に許容され得る担体中に0.1μg抗体／ml担体〜10
mg抗体／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁する
ことにより製造することができる。このようにして製造
された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１
回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μg〜100mgの割
合で、好ましくは50μg〜50mgの割合で、１日あたり１
回〜数回投与することができる。投与の形態としては、
静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは
腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示でき
る。好ましくは静脈内注射である。

【０１００】また、注射剤は、場合により、非水性の希
釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油のような植物油、エタノールのよう
なアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調
製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バ
クテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合
または照射により行うことができる。注射剤は、用時調
製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥
法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の
注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することが
できる。本発明の医薬組成物は、生体内に生じた細胞内
ストレス、異物あるいは変性蛋白に起因する病的症状や
疾患（例えば、動脈硬化症、糖尿病性血管障害、細菌感
染など）の予防並びに治療において極めて有用である。

【０１０１】

【実施例】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限
定されるものではないことは言うまでもない。

【０１０２】実施例１ 腫瘍抑制タンパクｐ５３と相互
作用（結合）するヒトゲノムＤＮＡ断片の取得 腫瘍抑制タンパクｐ５３が発現されると同時に、選択的
レポーター遺伝子の上流にクローン化されたヒトゲノム
ＤＮＡが発現される酵母発現系を用いて、ｐ５３と結合
するヒトゲノムＤＮＡ断片を取得した（Tokinoら、Huma
n Molecular Genetics, Vol.3, No.9, 1537-1542, 199
4）。

【０１０３】＜１−１＞ ＨＩＳ３レポーターベクター
の構築 天然体の腫瘍抑制遺伝子ｐ５３発現ベクターpRS314-SN
（Nigro, J.M.ら、Mol.Cell. Biol., Vol.12, 1357-136
5, 1992）中のＧＡＬ１プロモーターをＰＧＫプロモー
ターで置換してプラスミドpRS314-PGK-p53を構築した。
pRS314-SNから切出したｐ５３のｃＤＮＡを含むXhoI-Ba
mHI断片を、プラスミドｐＰＧＫ（Poon, D.ら、Mol. Ce
ll Biol., Vol.11, 4809-4821, 1991）のSalI及びBamHI
部位にサブクローニングし、プラスミドpPGK-SNを構築
した。ＰＧＫプロモーター／ｐ５３ｃＤＮＡ／ＰＧＫタ
ーミネーターからなるpPGK-SNのKpnI-SacI断片を、プラ
スミドｐＲＳ３１４（Sikorski, R.S.,ら、Genetics, V
ol.122, 19-27, 1989）に挿入し、プラスミドpRS314-PG
K-p53を構築した。

【０１０４】＜１−２＞ ヒトゲノムライブラリーの構
築 ヒトゲノムＤＮＡを制限酵素MboIで完全に消化し、ＨＩ
Ｓ３プロモータープラスミドｐＢＭ９４７（Wilson, T.
E., ら、Science, Vol.252, 1296-1300, 1991）のBamHI
部位にクローン化した。連結物を、エレクトロポレーシ
ョンにより大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（ＢＲＬ製）に導入した
後、該菌株を、アンピシリンを含む寒天培地プレート
（１８０枚）に蒔いた（1×10⁵コロニー／プレート）。
プレートから菌株を回収し、塩化セシウム超遠心によ
り、該プラスミドライブラリーからＤＮＡを精製した。
得られたＤＮＡを、ＰＥＧ／リチウムアセテート法（Gi
etz,D.,ら、Nucleic Acids Res., Vol.20, 1425, 199
2）による酵母の形質転換に用いた。

【０１０５】前記ｐ５３発現ベクターpRS314-PGK-p53を
含む酵母ＹＰＨ６８１を、SD-Trp培地（100ml）に蒔
き、一晩培養した（1×10⁷細胞／ml）。培養液を無菌水
で洗浄した後、無菌水（10ml）に再懸濁した。細胞を、
LiAc/TE（10 ml）（0.1 M LiAc(pH7.5)、10mMトリス塩
酸(pH7.5)、1mM EDTA）で洗浄した後、LiAc/TEに再懸濁
した（1×10⁹細胞／ml）。酵母細胞懸濁液（0.2ml）
を、形質転換に用いるＤＮＡ（２μｇ；１μｇ／μｌ(1
×TE)）、一本鎖サケ精子ＤＮＡ（100μｇ；10μｇ／μ
ｌ）及び４０％無菌PEG溶液（0.6ml）（40%ポリエチレ
ングリコ−ル4000／LiAc/TE）と混合した。得られた細
胞混合物を、強振しながら３０℃で３０分間培養した
後、４２℃で１５分間熱ショックを与え、遠心操作によ
ってペレット化した。細胞ペレットを１×ＴＥ（0.2m
l）に再懸濁し、SD-trp-uraプレートに蒔き、３０℃で
３日間培養した。レポータープラスミドライブラリー
（１ｍｇ）を形質転換し、プレート（５００枚）に蒔い
た。各プレートは、約2×10⁴クローンを含む。該酵母形
質転換体を、プレートから回収し、１０プレートずつプ
ール化し、65%グリセロール（v/v）、0.1M硫酸マグネシ
ウム及び25mMトリス塩酸（pH8）中に再懸濁し、−８０
℃で保存した。

【０１０６】＜１−３＞ ライブラリーのスクリーニン
グ 600nm吸光度で１０に希釈した酵母細胞（0.1ml）を、選
択的SD-trp-ura-hisプレート上に蒔き、３０℃で５日間
培養した。該形質形質転換体の少量を、非選択的SD-trp
-uraプレートに蒔くことにより、生酵母細胞数を決定し
た。ヒスチジン要求性（HIS+）となった各陽性細胞を、
SD-ura培地中で培養した後、抽出したＤＮＡをUra欠損
大腸菌株ＫＣ８に導入した。回収されたレポータープラ
スミドの酵母中でのＨＩＳ３活性を、ｐ５３発現ベクタ
ーの存在下及び非存在下各々について試験した。ｐ５３
依存性のクローンの配列解析は、クローニング部位に隣
接した２つのプライマー、（１）ＧＡＬ１プロモーター
（Johnston, M., Mol. Cell. Biol., Vol.4, 1440-144
8, 1984）由来（配列番号１）、及び（２）プラスミドp
BR322由来（配列番号２）を用いて行った。

【０１０７】＜１−４＞ βガラクトシダーゼアッセイ 本実施例において行ったβガラクトシダーゼアッセイは
下記のとおり。レポータープラスミド及び発現プラスミ
ドの各々を、酵母ＥＧＹ０４８細胞株（Gyuris, J.,
ら、Cell, Vol.75, 791-803, 1993）に導入し、酵母形
質転換体を得た。炭素源としてラフィノースを含む合成
培地中、３０℃で一晩培養した。培養液を、ラフィノー
ス（１％）及びガラクトース（１％）を含む培地で、６
００ｎｍ吸光度下で0.1に希釈し、１９時間培養した
後、βガラクトシダーゼアッセイを行った（Kern, S.E.
ら、Science, Vol.256, 827-830, 1992）。

【０１０８】＜１−５＞ ヒトライブラリーのスクリー
ニング 1.8×10⁷個のヒトゲノムＤＮＡクローンをＨＩＳ３レポ
ーターベクターに挿入しプラスミドライブラリーを調製
した。この初代クローンで酵母を形質転換して1×10⁷個
の酵母形質転換体を取得し、各々約2×10⁵個の別々のク
ローンを含む５０のプールに分けた。各プールからの約
5×105個の細胞を、ヒスチジンを含有しない培地に蒔
き、腫瘍抑制タンパクｐ５３に応答するＤＮＡを含むク
ローンを選別した。各プールには、２０乃至９３個（平
均では約５０個）のヒスチジン栄養性のクローンが確認
された。各プールにつき約２０個のクローンをランダム
に選択し、前述のレポーターＤＮＡの作製に用いた（詳
細には前記＜１−１＞及び＜１−２＞参照。）。

【０１０９】得られた各プラスミドで、ｐ５３発現ベク
ターまたはｐ５３遺伝子を含まない空のコントロールベ
クターを含む酵母細胞株を形質転換した。試験した９４
２クローンの内の２７３クローン（２９％）が、ｐ５３
依存性であった。該２７３個のｐ５３反応性プラスミド
を、制限酵素消化及び塩基配列解析により分析した。該
２７３個のクローンは、５７種類の異なるMboI消化断片
を含んでいた。各々のクローン中の挿入塩基配列を、ク
ローニング部位の外側（直前／直後）の配列をプライマ
ーとして用い決定した（さらに詳細には前記＜１−３＞
参照。）。配列解析した５７クローンの内の４６クロー
ンは、報告されているコンセンサスｐ５３結合配列（El
-Deiry, W.S.ら、Nature Genetics, Vol.1, 45-49, 199
2）と類似の１０ｂｐの配列の２コピーを含んでいた。

【０１１０】実施例２ ヒトゲノムＤＮＡ含有コスミド
ライブラリーの作製 本発明で用いたコスミドライブラリーは、「ラボマニュ
アルヒトゲノムマッピング」（堀雅明、中村祐輔 編、
丸善 出版、第41〜48頁）に従って作製した。以下その
方法を簡単に示す。コスミドベクターｐＷＥ１５（Wah
l, GM., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.84, 2160-
2164, 1987）のBamHI部位を、Klenow酵素を用いてフィ
ルイン（fillin）し、オリゴヌクレオチドリンカ−（5'
CCTCGAGG 3'）を用いてXhoIに変換し、改変コスミドベ
クターｐＷＥＸ１５を構築した。該ベクターを、XhoIで
消化した後、クレノウ酵素、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを用
いて部分的にフィルインした。

【０１１１】ヒト染色体ゲノムＤＮＡをSau3AIで消化し
た後、シュクロース濃度勾配遠心により画分し、ゲノム
ＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片を、クレノウ酵素、ｄ
ＡＴＰ及びｄＧＴＰを用いてフィルインした。該ベクタ
ーＤＮＡ（１μｇ）及び該ゲノムＤＮＡ（１μｇ）を、
10×ライゲーションバッファー（トリス塩酸（0.5M (pH
7.5)）、100mMの塩化マグネシウム、100mMジチオスレイ
ト−ル、500μg/mlウシ血清アルブミン）、20mMのＡＴ
Ｐ、50%ポリエチレングリコール8000、1M塩化ナトリウ
ム、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Boehringer製）及び蒸留水の
混合溶液中で連結させた。次いで、GIGAPACK II GOLD
（Stratagene製）を用いて、インビトロパッケージング
した。

【０１１２】実施例３ ヒトゲノムＤＮＡコスミドライ
ブラリーのスクリーニングによるエキソン配列を含むｐ
５３応答性ヒトゲノムＤＮＡ含有断片の取得 実施例１で取得し塩基配列解析を行ったｐ５３応答性の
ヒトゲノムＤＮＡ断片の１つのクローン（クローン番号
２４、ｐ５３結合性コンセンサス様配列：CAACTTGTCT、
前記Human Molecular Genetics, Vol.3, No.9, 1537-15
42, 1994参照）中の挿入ヒトゲノムＤＮＡ断片（配列番
号３）を放射性標識してハイブリダイゼーションプロー
ブとした。該プローブを用いて、常法に従って前記ヒト
ゲノムＤＮＡコスミドライブラリーをスクリーニング
し、２５個の陽性クローンを得た。

【０１１３】コスミドクローン中のエキソン（Exon）配
列を増幅するために、各々のクローンをBamHI及びBglII
で消化し、エキソントラッピングベクターｐＳＰＬ３
（GIBCO-BRL製）に連結した。次いで、マラソンｃＤＮ
Ａ増幅キット（Clontech製）を用いて、５’ＲＡＣＥ−
ＰＣＲ及び３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（Rapid Amplificatio
n Ends-PCR）（Proc. Natl. Aca. Sci. USA, Vol.85, 8
998-9002, 1988及び「遺伝子増幅ＰＣＲ法・基礎と新し
い展開」、共立出版株式会社発行、1992年）を行い、１
８個のコスミドクローン中に合計２９種類のエキソン様
配列の挿入が確認された。

【０１１４】実施例４ ヒトｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニングによるヒトＣＳＲタンパク（Cellular Sen
sor-Related protein，スカベンジャー受容体）をコー
ドするｃＤＮＡ断片の取得 エキソン様配列の挿入が確認されたコスミドクローンの
１つであるコスミド２（クローン番号２）の全ゲノムＤ
ＮＡ配列を、377ABI自動塩基配列装置（PerkinElmer
製）を用いて解析した。解析された１つのエキソン配列
を２Ｅ１と命名した（配列番号４）。また、コンピュー
ターソフトＧｒａｉｌ２及びＨｅｘｏｎを用いて、該ゲ
ノムＤＮＡ配列中のエキソン配列部位を推定した。

【０１１５】ＲＴ−ＰＣＲ法（Reverse Transcription-
PCR）（「実験医学・増刊」、「ＰＣＲとその応用」、
第８巻、第９号、１９９０年、及び「遺伝子増幅ＰＣＲ
法・基礎と新しい展開」、共立出版株式会社発行、1992
年）を用いて、推定された全てのエキソンｃＤＮＡ配列
が、ｍＲＮＡへ転写されて連結されることを確認した。
該エキソンｃＤＮＡ断片を放射性標識してハイブリダイ
ゼーションプローブとした。得られたｐ５３結合性部位
を含む該プローブを用いて、常法に従ってヒト胎児脳由
来ランダムプライムドｃＤＮＡライブラリー（Stratage
ne製）の5×10⁵個のプラークをスクリーニングし、陽性
クローンを得た。該陽性クローンから、ヒトｃＤＮＡ断
片を切りだし、塩基配列を解析した。該クローンは、本
願発明のＣＳＲタンパク（Cellular Sensor-Related
proteinの略称。スカベンジャー受容体とも呼ぶ。）を
コードするｃＤＮＡ断片を含む。

【０１１６】実施例５ ヒトＣＳＲタンパクをコードす
る完全長（または長鎖）ｃＤＮＡの取得 ヒト胎児脳由来の全ｍＲＮＡを、M-MuLV逆転写酵素（20
0ユニット／μｌ、GIBCO-BRL製）の存在下、ｄ（Ｎ）₁₀
（ベーリンガーマンハイム製）を用いてランダムプライ
ミングによりｃＤＮＡに変換し、ヒト長鎖ｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。前記の陽性クローンから切り出し
たヒトｃＤＮＡ断片をプローブとして用い、該ヒト長鎖
ｃＤＮＡライブラリーを常法に従ってスクリーニング
し、４つの陽性クローンを取得した。該陽性クローンか
らヒトＣＳＲタンパクをコードする複数の長鎖ｃＤＮＡ
を切りだし、塩基配列を解析した。次いで、プライマー
としてＥＣ１（配列番号５）ＥＣ２ａ（配列番号６）及
びＥＣ２ｂ（配列番号７）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法によ
り、ＣＳＲタンパクをコードするｃＤＮＡを増幅させ
た。

【０１１７】ＲＴ−ＰＣＲは、ｃＤＮＡ混合溶液（２５
μｌ）下で、サーモサイクラー（Thermocycler；Perkin
Elmer Cetus製）を用いて３０乃至４０サイクル行っ
た。該ｃＤＮＡ混合溶液は、40ngのｃＤＮＡ、１×ＰＣ
Ｒ緩衝液（6.7mMトリス(pH8.8)，16.6mMの硫酸アンモニ
ウム，6.7μMのEDTA及び10mMのβメルカプトエタノール
を含有）、25pmolのセンスプライマ−、25pmolのアンチ
センスプライマー、0.5UのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（TAKARA製）、250μMのデオキシヌクレオチド、10%のD
MSO、及び7.6mMの塩化マグネシウムからなる。各ＰＣＲ
サイクルは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７
２℃で１分の反応からなる。但し、最終のＰＣＲステッ
プでは、７２℃で５分間とした。得られたＰＣＲ産物
を、３％アガロースゲル電気泳動に付し、Ｎ+ナイロン
膜（PALL製）に移し、内部オリゴヌクレオチドプローブ
Ｆ１２（配列番号８）を用いてハイブリダイゼーション
させた。

【０１１８】次いで、該ｃＤＮＡをテンプレートとして
マラソンｃＤＮＡ増幅キット（Clonetech製）を用い
て、５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ及び３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲに
よりｃＤＮＡを増幅し、各々の長鎖ｃＤＮＡ配列の５’
末端及び３’末端を同定した。この結果、ヒトＣＳＲを
コードする２つの完全長ｃＤＮＡ（各々がコードするタ
ンパクを、ＣＳＲ１タンパク及びＣＳＲ２タンパクと命
名。以下単にＣＳＲ１及びＣＳＲ２とも呼ぶ。）、及び
完全長ｃＤＮＡと思われる１つの長鎖ｃＤＮＡ（コーデ
ィングタンパクをＣＳＲ３タンパクと命名。以下単にＣ
ＳＲ３とも呼ぶ。）が単離されたことが確認された。Ｃ
ＳＲ１のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を各々配列
番号９及び１０に、ＣＳＲ２のｃＤＮＡ配列及び推定ア
ミノ酸配列を各々配列番号１１及び１２に、並びにＣＳ
Ｒ３のｃＤＮＡ配列を各々配列番号１３及び１４に記載
した。

【０１１９】得られたＣＳＲ１のｃＤＮＡを含む遺伝子
及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の大きさ
は、各々約4.0kb及び約1.8kbであり、６０６のアミノ酸
をコードするものであった。また、ＣＳＲ２のｃＤＮＡ
を含む遺伝子及びＯＲＦの大きさは、各々約1.9kb及び
約1.4kbであり、４６６のアミノ酸をコードしていた。
塩基配列の比較分析から、これら３種類のＣＳＲは、各
々オールターナティブスプライシング（alternative sp
licing）による転写産物であることが確認された。例え
ば、ＣＳＲ２は、第１番目から第４５７番目のコドンま
での配列がＣＳＲ１と同一である。これら３つのスプラ
イシング変異体の構造的差異を図１に模式的に示した。

【０１２０】一方、ヒトＣＳＲのゲノム遺伝子は、６つ
以上のコーディングエキソンを含む約９０ｋｂの大きさ
を有しており、第２イントロン配列（図１のエキソンＡ
とエキソンＢの間）に存在する部分配列（配列番号２
０）が、既報告のｐ５３結合性配列（対照的な１０mer
の２コピーからなる塩基配列（5' RRRC(A/T)(T/A)GYYY
3' (Rはpurine、Yはpyrimidine）；EL-Deiry, W.S.ら、
Nature Genetics, Vol.1,45-49, 1992）とフィットする
ものと考えられた。

【０１２１】図１に模式的に示すように、ＣＳＲ１は
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＥ''の６つのエキソンから、Ｃ
ＳＲ２はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの６つのエキソンか
ら、またＣＳＲ３はＣ、Ｄ、Ｅ及びＥ''の少なくとも４
つのエキソンから構成されるものと推定された（ＣＳＲ
３のｃＤＮＡの５’末端配列中にはＢ及びＢ''に対応す
るコーディング配列が見出されることから、さらにＢ及
びＢ''をエキソンとして有する可能性がある）。図１７
にさらに詳細に示すように、ＣＳＲ１のゲノミックＤＮ
Ａは、エキソン１、２、３、４、５及び６’で表わされ
る６つのエキソンからなる。ＣＳＲ２のゲノミックＤＮ
Ａは、エキソン６’がスプライシングを受け、代りにエ
キソン６”が使用され、エキソン１、２、３、４、５及
び６”で表わされる６つのエキソンからなる。

【０１２２】種々コンピューターソフトを用いて、本願
発明のＣＳＲタンパクの既知タンパクとのアミノ酸配列
相同性を調べた結果、本願発明のＣＳＲタンパクとアミ
ノ酸配列相同性を有する既知タンパクは見いだされなか
った。一方、図１に示したエキソンＥはコラーゲンと６
１％のアミノ酸配列相同性を、エキソンＤは酵母染色体
分離タンパクｓｍｃ２ｐ（chromosome segregation pro
tein-smc2p）及びヒトミオシン重鎖とアミノ酸配列相同
性を、またエキソンＣは冬眠関連タンパク２５（hibern
ation related protein-25; HP25とアミノ酸配列相同性
を有していた。

【０１２３】次に、アミノ酸組成、電荷（ＣＳＲ１：PI
=6.4、ＣＳＲ２：PI=5.5）及び分子量（ＣＳＲ１：65K
d、ＣＳＲ２：52Kd）に基づいて、コンピューターソフ
トPROPSEARCHを用いて、本願発明の該ＣＳＲタンパクの
既知タンパクとの構造的類似性を調べた結果、ＣＳＲ１
タンパクはマクロファージスカベンジャー受容体Ｉ型及
びII型（GenBankアクセッション番号：S08278；Rohrer,
L.ら、Nature, Vol.343, 570-572, 1990）と、またＣ
ＳＲ２タンパクはセンサー（Sensor）タンパク（GenBan
kアクセッション番号：P30844；Nagasawa, S.ら、J. Bi
ochem., Vol.114,350-357, 1993）と８０％以上の信頼
性で最も高い構造的類似性を有していた。

【０１２４】また、コンピュータソフトPROSITE、COI
L、TMpred及びPSORT等を用い、ＣＳＲタンパクの２次構
造を解析した。この結果、ＣＳＲ１及びＣＳＲ２は、図
２に模式的に示されるような２次構造を有するものと考
えられた。ＣＳＲ１タンパクは、大きくわけて３つの異
なるドメイン、即ち、（１）ロイシン単位が４回繰り返
されるロイシンジッパー構造を含むトランスメンブレン
ドメイン（transmembrane domain）、（２）αヘリカル
コイルドコイルドメイン（α-helical coiled coil dom
ain），及び（３）Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの配列単位が４９回
繰り返されるコラーゲン様ドメイン（collagen-like do
main）から構成される。さらに、そのような特徴的構造
を有する３分子が、コイルドコイルドメインでαヘリッ
クスを、またコラーゲン様ドメインでトリプルヘリック
スを形成することにより３量体を形成する。

【０１２５】この構造は、前記マクロファージスカベン
ジャー受容体II型の構造と高い類似性を有するものであ
る（図３）（出典：「分子動脈硬化学」、第IV章「炎症
細胞１．スカベンジャー受容体（松本明世 著）」、第
251頁、1995年、森崎信尋ら編集、メディカルレビュー
社発行）。ＣＳＲ２タンパクは、ＣＳＲ１タンパクのコ
ラーゲン様ドメインを欠き、代りに１０個のアミノ酸か
らなるＣ末端を有する構造をとる。該コラーゲン様ドメ
インは、脂質、血漿成分（フィブロネクチン、ラミニ
ン、コラーゲン、フィブリノーゲンなど）及び多くの負
の電荷を帯びている分子などの幅広い分子と結合するこ
とができることが知られており、コンピューターソフト
DNASISを用いて分析した結果、ＣＳＲタンパクの該コラ
ーゲン様ドメインは、生理学的ｐＨで正の実効電荷（ne
t charge）を帯びていることが示唆された。

【０１２６】また、ＣＳＲタンパクは、多くのリン酸化
部位及び糖鎖結合部位、並びにヘム結合部位及びミクロ
ボディー（microbody；ペルオキシソーム（peroxisom
e））Ｃ末端ターゲティングシグナルを有していること
が確認された（図４及び図１６）。この結果は、ＣＳＲ
タンパクは翻訳後修飾を受けるタンパクであることを示
唆するものである。さらに、ＣＳＲ１遺伝子及びＣＳＲ
２遺伝子の３’末端の非翻訳領域には、３’末端poly
(A)部位の近傍に、各々AGTAAA及びAATAAAなる６塩基配
列を含んでいた。これまでの報告から、該配列がポリア
デニレーションシグナルの供与に深く関連していると思
われる。

【０１２７】実施例６ ＣＳＲ遺伝子の染色体上の局在 ＦＩＳＨ法（Fluorescence in situ hybridization；実
験医学・別冊、「遺伝子工学ハンドブック」、羊土社発
行、1992年、第271頁〜第277頁）を用いて、常法により
ヒトＣＳＲ遺伝子のヒト染色体上の局在を分析した。Ｃ
ＳＲ遺伝子のエキソン配列を含むことが確認された前述
のコスミドクローン２をプローブとして用いた。Ｇバン
ド法により染色体を分染するために、チミジンシンクロ
ナイゼーション法（thymidine synchronization）及び
ブロモデオキシウリジン放出法（bromodeoxyuridine re
lease）を用いて、ヒト細胞分裂中期染色体（metaphase
chromosome）を調製した。

【０１２８】ハイブリダイゼーションを行う前に、細胞
分裂中期ヒト細胞をHoechst-33258（１μｇ／ｍｌ）で
染色し、紫外線照射を施した。該プローブを、ニックト
ラスレーション法（nick translation）によりビオチン
-16-UTP（Boehringer製）で標識し、該変性中期細胞に
ハイブリダイズさせた。FITC-アビジン（fluoresceinis
othiocyanate-avidin；Boehringer製）を用いて、ハイ
ブリダイゼーションシグナルを検出した。該シグナルの
正確な測定は、複製したＧバンドを可視的に確認するこ
とにより行った。この結果、ＣＳＲ遺伝子は複製Ｇバン
ド染色体標本上の８ｐ２１にマッピングされた（図５
(a)）。なお、細胞分裂中期ヒト細胞の染色体標本はＲ
分染核型上にマッピングした（図５(b)）。

【０１２９】実施例７ ＣＳＲ遺伝子の各種組織での発
現 前記で得られたＣＳＲ１及びＣＳＲ２の各々のｃＤＮＡ
をプローブとして、Human Multiple Tissue Northern B
lot（Clonetech製）を用い、ＣＳＲ１及びＣＳＲ２のｍ
ＲＮＡの各種ヒト組織での発現を常法により調べた。結
果を図６に示す。ＣＳＲ遺伝子の発現は、末梢血白血球
以外の各組織で確認されたが、脾臓及び肝臓での発現は
相対的に低いものであった。本試験での実験操作は、詳
細には下記のようにして行った。ヒトの心臓、脳、胎
盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立
腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、及び末梢血白血球に由来
するpoly(A)⁺RNAブロッティング膜（各２μgのpoly(A)⁺
RNAがブロッティング されている。Clonetech製）に、
[α-³²P]dCTPで標識した前記ＣＳＲ１及びＣＳＲ２の各
々をハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせた膜
を、2xSSC/0.05%SDS（室温で15分）で２回、及び0.1xSS
C/0.1%SDS（50℃で10分）洗浄した後、BAS1000イメージ
ングプレート（富士製）を用いて、オートラジオグラフ
ィーに供した（12-24時間）。なお、ヒトβアクチンのR
NAの発現のレベルをコントロールとして用いた。

【０１３０】実施例８ ｐ５３タンパクによるＣＳＲ遺
伝子の発現調節 ＣＳＲ遺伝子の発現が腫瘍抑制タンパクｐ５３との相互
作用により制御されているか否かを下記のようにして分
析した。天然型ｐ５３遺伝子または変異型ｐ５３−２７
３遺伝子発現プラスミドを、変異型ｐ５３（２７３番目
及び３０９番目のコドンに変異を有する）を発現するヒ
ト結腸癌細胞SW480（Rodrigues, N.R.ら、Proc. NAtl.
Acad. Sci. USA, Vol.87, 7555-7559, 1990）に一過性
に遺伝子導入した（天然型遺伝子導入細胞をＷと、また
変異型遺伝子導入細胞をＭと称する。）。遺伝子導入
後、各々の導入細胞Ｗ及びＭから、ＲＮＡを経時的に取
得し、ＲＴ−ＰＣＲによりＣＳＲ遺伝子の発現状態を分
析した。結果を図７に示した。

【０１３１】さらに、（１）正常ヒト線維芽細胞NHDF40
42（Clonetics製）、（２）ヒト子宮頸癌由来上皮様細
胞Hela、（３）ヒト肺癌細胞H1299、（４）ヒト食道癌
細胞TE10、（５）ヒト神経グリア芽腫細胞T98G、（６）
ヒト神経グリア芽腫細胞U87MG、（７）ヒト腫瘍細胞SKB
R3、及び（８）前記ヒト結腸癌細胞SW480におけるＣＳ
Ｒ遺伝子の発現状況を前記と同様にRT-PCR法により分析
した。結果を図８に示す。なお、前記ＲＴ−ＰＣＲは下
記のように行った。

【０１３２】抽出した全ｍＲＮＡを、M-MuLV逆転写酵素
（200ユニット／μｌ、GIBCO-BRL製）の存在下、ｄ
（Ｎ）₁₀（ベーリンガーマンハイム製）を用いてランダ
ムプライミングによりｃＤＮＡに変換し、ｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。ＲＴ−ＰＣＲによるＣＳＲｃＤＮ
Ａの増幅には、プライマーとしてＥＣ１２（配列番号１
５）及びＥＣ２（配列番号１６）を用いた。

【０１３３】ＲＴ−ＰＣＲは、ｃＤＮＡ混合溶液（２５
μｌ）下で、サーモサイクラー（Thermocycler；Perkin
Elmer Cetus製）を用いて３０乃至４０サイクル行っ
た。該ｃＤＮＡ混合溶液は、40ngのｃＤＮＡ、１×ＰＣ
Ｒ緩衝液（6.7mMトリス(pH8.8)，16.6mMの硫酸アンモニ
ウム，6.7μMのEDTA及び10mMのβメルカプトエタノ−ル
を含有）、25pmolのセンスプライマ−、25pmolのアンチ
センスプライマー、0.5UのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（TAKARA製）、250μMのデオキシヌクレオチド、10%のD
MSO、及び7.6mMの塩化マグネシウムからなる。各ＰＣＲ
サイクルは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７
２℃で１分の反応からなる。但し、最終のＰＣＲステッ
プでは、７２℃で１分間とした。得られたＰＣＲ産物
を、３％アガロースゲル電気泳動に付し、Ｎ⁺ナイロン
膜（PALL製）に移し、内部オリゴヌクレオチドプローブ
Ｆ１２（配列番号８）を用いてサザンハイブリダイゼー
ションさせた。該ＲＴ−ＰＣＲでは、プライマーとして
ＨＧＳ（配列番号１７）及びＨＧＡ（配列番号１８）を
用いたＧＡＰＤＨ転写物の増幅をコントロールとした。
サザンハイブリダイゼーションでは、内部プローブ（配
列番号１９）を用いた。

【０１３４】ＣＳＲ遺伝子の発現は、天然型及び変異型
に拘わらず、ｐ５３タンパクの存在の有無に依存してア
ップレギュレートされるものではないことが確認され
た。このことは、ＣＳＲ遺伝子の発現のアップレギュレ
ーション（up-regulation）が他の未知因子により行わ
れている可能性を示唆するものである。

【０１３５】実施例８’ ｐ５３タンパクによるＣＳＲ
遺伝子の発現調節 実施例８の結果をさらに検証するために、ｐ５３タンパ
クがＣＳＲ遺伝子に結合するか否かをEMSA（electropho
retic mobility shift assay）法により解析した。元
々、ｐ５３タンパクを発現せず且つＣＳＲのmRNAの発現
が乏しい細胞であるヒト肺癌細胞H1299を、天然型ｐ５
３遺伝子または変異型ｐ５３−２７３遺伝子発現プラス
ミド（各15μg）で形質転換した（天然型遺伝子形質転
換細胞をＷと、また変異型遺伝子形質転換細胞をＭと称
する。）。形質転換から２４時間後、各々の形質転換細
胞Ｗ及びＭから、既報と同様の方法により核抽出物を調
製した（Mol. Cell. Biol., Vol.12, p.2866-2871, 199
2）。即ち、形質転換細胞（各１×１０⁶細胞以上）を、
５倍量の緩衝液Ａ（20mM HEPES (pH7.5)、20%グリセロ
ール、10mM NaCl、10mM MgCl₂、0.2mM EDTA、1mM DTT、
0.1% NP40、及び蛋白分解酵素阻害剤）に懸濁し氷上で1
0分間インキュベーションした後、４℃で10分間遠心し
た。次いで、得られた核ペレットを、２倍量の緩衝液Ｂ
（NaClの濃度を500mMとする以外は緩衝液Ａと同じ組
成）中に懸濁させ、氷上で30分間インキュベーションし
た後、遠心し（14,000rpmｍ，15分間）、遠心上澄を回
収した。この上澄を１〜５μg/mlの濃度に調製しEMSA試
験に用いた。

【０１３６】各々のEMSA試験は、核抽出物（８μl）、
緩衝液Ａ（９μl）、poly(dI-dC)（１μg、Boehringer
Mannheim製）、モノクローナル抗体PAb421（１μl、Onc
ogene Science製）、及び／または競合ＤＮＡ（competi
tor DNA）（非標識プローブの100倍以上の量）を用い
て、末端を標識した二重鎖オリゴヌクレオチド（約５n
g）上で行った。室温下で30分間インキュベーションし
た後、生成物をゲル（4%ポリアクリルアミド／0.5xTris
-borate-EDTA）に流し、200Vで３時間電気泳動し、−８
０℃でフィルムに転写した。陽性対照プローブとして、
ｐ５３ＤＮＡ結合コンセンサス配列（P53-CON、配列番
号２１）を用いた。ＣＳＲ遺伝子内に存在する推定ｐ５
３結合配列に対するプローブ（P53-CSR、配列番号２
２）は、アニーリングオリゴヌクレオチドによって構築
した。結果を図１８に示した。

【０１３７】形質転換細胞Ｗ由来のｐ５３及び形質転換
細胞Ｍ由来のｐ５３のいずれも、ｐ５３ＤＮＡ結合コン
センサス配列（P53-CON、配列番号２１）に同程度で結
合した。一方、推定ｐ５３結合配列に対するプローブ
（P53-CSR、配列番号２２）へは、ｐ５３ＤＮＡ結合コ
ンセンサス配列への結合に比べ弱いものの、形質転換細
胞Ｗ由来のｐ５３のみが結合した。この結果は、ＣＳＲ
遺伝子の転写が、ｐ５３タンパクのＣＳＲ遺伝子への結
合により部分的に誘導されることを示唆するものであ
る。

【０１３８】実施例８” 各種腫瘍細胞におけるＣＳＲ
遺伝子の発現とｐ５３タンパクの有無の相関 ｐ５３タンパクの有無が、ＣＳＲ遺伝子の発現に影響を
さらに解析するため、実施例８で用いた種々の腫瘍細胞
に加え、下記さらに多くの腫瘍細胞におけるＣＳＲ遺伝
子の発現をRT-PCR法によるサザーンハイブリダイゼーシ
ョンにより実施例８と同様にして分析した。但し、コン
トロールとしては、ヒトβアクチン転写物の増幅をコン
トロールとした。ヒトβアクチンに対するＲＴ−ＰＣＲ
では、フォーワードプライマー及びリバースプライマー
として、各々配列番号２３及び配列番号２４のオリゴヌ
クレオチドを用いた。また、サザンハイブリダイゼーシ
ョン用のプローブとして、配列番号２５の内部オリゴヌ
クレオチドを用いた。

【０１３９】本試験では下記の正常細胞及び腫瘍細胞を
用いた。 （１）天然型ｐ５３タンパクを発現する細胞：正常ヒト
線維芽細胞NHDF4042（Clonetics製）、ヒト神経グリア
芽腫細胞U87MG、ヒト乳癌アデノカルシノーマMCF7、cea
cumアデノカルシノーマSNU-C4、及びヒト結腸癌カルシ
ノーマHCT116。 （２）変異型ｐ５３タンパクを発現する細胞：ヒト子宮
頸癌由来上皮様細胞Hela、ヒト肺癌細胞H1299、ヒト食
道癌細胞（TE-3, TE10）、ヒト神経グリア芽腫細胞T98
G、ヒト腫瘍細胞SK-BR-3、及びヒト結腸癌細胞（SW480,
HCT-15, DLD-1）、ヒト転移性前立腺癌細胞LNCaP.FG
C、ヒトceacumアデノカルシノ−マ（H498, SNU-C2A）、
ヒト胃癌細胞（SNU-1, SNU-5, SNU-16）、及びヒト肺癌
細胞（ACC-LC174, ACC-LC176）。結果を図１９に示し
た。この結果は、ｐ５３遺伝子の状態（ｐ５３タンパク
の発現）とＣＳＲ遺伝子の発現が必ずしも相関するのも
ではないことを示している。即ち、ｐ５３タンパクの存
在の有無がＣＳＲ遺伝子の発現の誘導に部分的に関与す
る可能性とともに、ＣＳＲ遺伝子の発現の誘導が他の未
知因子によっても行われている可能性を示唆するもので
ある。

【０１４０】実施例９ 細胞内ストレスによるＣＳＲ遺
伝子の転写誘導 ＣＳＲの機能を解析するために、ＣＳＲの発現が、細胞
内で発生したストレスや傷害（血清飢餓（serum sarv
ation）、紫外線照射、過酸化水素、熱ショッ
ク）に依存するものであるか否かを下記のようにして調
べた。

【０１４１】＜９−１＞ 血清飢餓（serum sarvatio
n）によるストレス 前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（3×10⁴個）、ヒト結
腸癌細胞SW480（3×10⁵個）、ヒト神経グリア芽腫細胞T
98G（3×10⁵個）、ヒト食道癌細胞TE13（3×10⁵個）、
及びヒト子宮頸癌由来上皮様細胞Hela（3×10⁵個）の各
々を、100mm直径の培養皿を用いて、１０％ウシ胎児血
清（FBS, Fetal Bovine Serum；GIBCO-BRL製）含有完全
培地に蒔き、５％ＣＯ₂、３７℃条件下で培養した。１
乃至２日後、該培養液を0.1%ＦＢＳを含有する完全培地
と交換し、４日間培養した。次いで、各細胞からＲＮＡ
を抽出し、常法に従ってノーザンブロット法（Nothern
Blotting Assay）によりＣＳＲのｍＲＮＡの発現状態を
調べた。ノーザンブロットは下記のようにして行った。

【０１４２】TRIZOL（GIBCO-BRL製）を用いて、各細胞
からＲＮＡを抽出した。次いで、Oligotex-dT30<Super>
（JSR製，日本）を用いて、ｍＲＮＡを単離した。該ｍ
ＲＮＡ（0.51μｇ）を、20%ホルムアルデヒドとともに
1.5%アガロースゲル上に加えた後、Biodyne Aトランス
ファ−メンブレン（PALL製）上に移した。先に調製した
ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーから単離され、
[α-³²Ｐ]ｄＣＴＰで標識したヒトＣＳＲｃＤＮＡ（1×
10⁶cpm/ml）をプローブとして、50%（v/v）ホルムアミ
ド、5×SSPE、2×デンハ−ツ溶液（Denharts solutio
n）、及び1.25% (w/v）ＳＤＳを含む溶液中でハイブリ
ダイゼーションを行った。ＲＮＡの発現のレベルは、ア
クチンのＲＮＡの発現レベルをコントロールとして分析
した。

【０１４３】ハイブリダイゼーションさせたメンブレン
を、2×SSC/0.05%SDSを用いて２回（各々室温下で１５
分間）洗浄し、次いで0.1×SSC/0.1%SDSを用いて１回
（６５℃で１０分間）洗浄した。メンブレンをイメージ
ングプレートBAS1000（Fuji製、日本）上で２４乃至４
８時間曝した。電気泳動のサイズマーカーとして、0.24
乃至9.5kbのＲＮＡ（GIBCO-BRL製）を使用した。結果を
図９に示す。いずれの細胞においても、培養液から血清
を除くこと（血清飢餓状態）により、ＣＳＲのｍＲＮＡ
の発現が誘導されることが確認された。

【０１４４】＜９−２＞ 紫外線照射によるストレス 前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（培養液中で24乃至48
時間培養してサブコンフルエント（50〜70％）にしたも
の）に、5乃至120 J/m²の強さの紫外線を照射した後、
細胞からＲＮＡを抽出し、前記と同様にしてノーザンブ
ロット法によりＣＳＲのｍＲＮＡの発現状態を調べた。
ｍＲＮＡの発現のレベルは、アクチンのＲＮＡの発現レ
ベルをコントロールとして分析した。

【０１４５】紫外線照射は次のように行った。即ち、紫
外線照射する前に、培養液を除き、リン酸緩衝液で２回
洗浄した。紫外線は、４０Ｗのランプから50cm離して５
乃至１２０秒間照射した。紫外線の量は、Black Ray UV
メ−タ−を用いて測定した。結果を図１０に示した。Ｃ
ＳＲのｍＲＮＡの発現は、紫外線照射により誘導される
ことが確認された。本実験では、15J/m2の強さで照射し
た場合に最大の発現が観察された。さらに、紫外線照射
後のＣＳＲｍＲＮＡの経時的な発現状態を調べた。この
試験は、15J/m²の強さで紫外線照射した後の培養液の添
加直後から経時的にＲＮＡを抽出し、前記と同様にして
ノーザンブロット法を用いて測定した。その結果、紫外
線照射から20乃至24時間後に最大の発現誘導が観察され
た。

【０１４６】＜９−３＞ 過酸化水素によるストレス 前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（培養液中で24乃至48
時間培養してサブコンフルエント（50〜70％）にしたも
の）をリン酸緩衝液で２回洗浄した後、１％ウシ胎児血
清を含有する完全培地中に蒔き、5乃至800μMの濃度の3
0%過酸化水素溶液（和光純薬製）を加えて１時間培養し
た。次いで、培地を交換しさらに２４時間培養した。細
胞からＲＮＡを抽出し、前記と同様にしてノーザンブロ
ット法によりＣＳＲのｍＲＮＡの発現状態を調べた。な
お、ｍＲＮＡの発現のレベルは、アクチンのＲＮＡの発
現レベルをコントロールとして分析した。

【０１４７】結果を図１１に示した。本試験から、ＣＳ
ＲｍＲＮＡの発現が、過酸化水素により与えられる細胞
内ストレスにより誘導されることが確認された。また、
本試験においては、過酸化水素濃度が１０μMの時に最
大の発現誘導が観察された。過酸化水素は、生体内で反
応性酸素及びフリーラジカルを生成させることが知られ
ていることから、本試験で確認されたＣＳＲｍＲＮＡの
発現誘導は、過酸化水素により細胞に与えられた酸化ス
トレスに依存するものであると結論される。

【０１４８】＜９−４＞ 熱ショックによるストレス 前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（８０％コンフルエン
ト、完全培地（５ml））を、４３℃で４０分間培養した
後、さらに３７℃で培養した。細胞から経時的にＲＮＡ
を抽出し、前記と同様にしてノーザンブロット法により
ＣＳＲのｍＲＮＡの発現状態を調べた。なお、ｍＲＮＡ
の発現のレベルは、アクチンのＲＮＡの発現レベルをコ
ントロールとして分析した。結果を図１２に示した。Ｃ
ＳＲｍＲＮＡの発現誘導が、熱処理から２４乃至４８時
間後に確認された。本試験で観察された熱ショックによ
る発現誘導は、前記の紫外線照射及び過酸化水素による
ストレスにおける発現誘導の場合より遅いようであっ
た。このことは、紫外線照射及び過酸化水素による誘導
が、熱ショックによる誘導より直接的であり、また発現
誘導のパスウェイがさらに短絡的であることを示唆する
ものである。

【０１４９】実施例９’ 細胞内ストレスによるＣＳＲ
遺伝子の転写誘導 実施例９における紫外線照射及び過酸化水素の各々スト
レスに関する試験結果を下記のようにして再度検証し
た。

【０１５０】＜９’−１＞ 紫外線照射によるストレス 前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（３×１０⁴細胞）を
完全培地（10cm培養皿）に蒔き、24乃至48時間培養し
た。サブコンフルエント（50〜70％）に達した細胞培養
系から培養液を除き、細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し
た。この細胞に、5乃至120 J/m²の強さの紫外線を照射
した後、新しい培養液を加えた。紫外線は、４０Ｗのラ
ンプから50cm離して５乃至１２０秒間照射した。紫外線
の量は、ラジオメーター（モデル254、アット製）を用
いて測定した。24時間の培養後、細胞からＲＮＡを抽出
し、前記と同様にしてノーザンブロット法によりＣＳＲ
のｍＲＮＡの発現状態を調べた。ｍＲＮＡの発現のレベ
ルは、アクチンのＲＮＡの発現レベルをコントロールと
して分析した。結果を図２０(a)に示した。実施例９（<
9-2>）の結果と同じく、ＣＳＲのｍＲＮＡの発現は、紫
外線照射により誘導されることが確認された。本実験で
も、15J/m²の強さで照射した場合に最大の発現が観察さ
れた。

【０１５１】＜９’−２＞ 過酸化水素によるストレス 前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（３×１０⁴細胞）を
完全培地（10cm培養皿）に蒔き、24乃至48時間培養し
た。サブコンフルエント（50〜70％）に達した細胞培養
系から培養液を除き、細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し
た。この細胞に、5乃至400μMの濃度の30%過酸化水素溶
液（和光純薬製）を加えた１％ウシ胎児血清を含有する
完全培地を加え、１時間培養した。次いで、培地を新鮮
な完全培地に交換しさらに２４時間培養した。細胞から
ＲＮＡを抽出し、前記と同様にしてノーザンブロット法
によりＣＳＲのｍＲＮＡの発現状態を調べた。なお、ｍ
ＲＮＡの発現のレベルは、アクチンのＲＮＡの発現レベ
ルをコントロールとして分析した。結果を図２０(b)に
示した。 実施例９（<9-3>）の結果と同じく、ＣＳＲ
のｍＲＮＡの発現は、過酸化水素により与えられる細胞
内ストレスにより誘導されることが確認された。また、
本試験においても、過酸化水素濃度が10μMの時に最大
の発現誘導が観察された。

【０１５２】実施例９” ＤＮＡ傷害によるＣＳＲ遺伝
子の転写誘導 ２本鎖ＤＮＡにインターカレート（intercchalate）
し、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成を阻害することにより抗癌
作用を示す薬剤であるアドリアマイシンを用いて、該薬
剤のように遺伝子に対する毒性を示す試薬が、ＣＳＲ及
びｐ５３のmRNAの発現に影響を与えるか否かについて検
討した。前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（３×１０⁴
細胞）を完全培地（10cm培養皿）に蒔き、24乃至48時間
培養した。サブコンフルエント（50〜70％）に達した細
胞培養系に、0.02乃至１μg/mlの濃度のアドリアマイシ
ン（adriamycin, ADR）を加え培養した。24時間の培養
後、細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した後、新鮮な完全
培地を加え培養した。細胞からＲＮＡを抽出し、前記と
同様にしてノーザンブロット法によりＣＳＲのｍＲＮＡ
の発現状態を調べた。なお、ｍＲＮＡの発現のレベル
は、アクチンのＲＮＡの発現レベルをコントロールとし
て分析した。結果を図２１に示した。アドリアマイシン
は、ｐ５３mRNAの発現を誘導したが、ＣＳＲmRNAの発現
に何ら影響を与えなかった。この結果は、ＣＳＲ遺伝子
の発現の誘導は、アドリアマイシンのような遺伝子に対
する毒性を示す試薬ではなく、主に、血清飢餓、紫外線
照射、過酸化水素及び熱ショックのような細胞内ストレ
スによって起こることを示している。

【０１５３】実施例１０ 抗酸化剤によるＣＳＲ遺伝子
発現の抑制 ＣＳＲ遺伝子の発現誘導に酸化ストレスが関与するか否
かを実証するためには、下記のような実験を行う。前記
ヒト正常線維芽細胞NHDF4042を、抗酸化活性を有し、酸
化ストレスを消失させる活性を有するチオ化合物である
アセチルシステイン（NAC; Acetylcystein、40mM）を添
加した１０％ＦＢＳ含有完全培地で培養する。アセチル
システインが該細胞に対して無毒性であることは、トリ
パンブルー染色法（trypan blue staining）により常法
に従って確認する。次いで、前記と同様にして、紫外線
照射または過酸化水素によりストレスを与えた後、ＲＮ
Ａを抽出しノーザンブロッティングを行う。なお、ｍＲ
ＮＡの発現のレベルは、アクチンのＲＮＡの発現レベル
をコントロールとして分析する。紫外線照射及び過酸化
水素により与えられる細胞内ストレスによるＣＳＲｍＲ
ＮＡの発現誘導が、抗酸化剤による前処理によって抑制
されることを確認することにより、ＣＳＲ遺伝子の発現
に細胞内に発生する酸化ストレスが深く関与しているこ
と、及びｐ５３タンパクが細胞内の酸化ストレスに対す
るセンサーとして関与していることを知ることができ
る。

【０１５４】実施例１０’ 抗酸化剤によるＣＳＲ遺伝
子発現の抑制 ＣＳＲ遺伝子の発現誘導に酸化ストレスが関与するか否
かをさらに検証するために、実施例１０と同様の試験を
行った。前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042（３×１０⁴
細胞）を完全培地（10cm培養皿）に蒔き、24乃至48時間
培養した。サブコンフルエント（50〜70％）に達した細
胞を、抗酸化活性を有し酸化ストレスを消失させる活性
を有するチオ化合物であるアセチルシステイン（NAC; A
cetylcystein、３mM）とともに１時間培養した。なお、
アセチルシステインが該細胞に対して無毒性であること
は、トリパンブルー染色法（trypan blue staining）に
より常法に従って確認した。次いで、実施例９及び９’
と同様にして、紫外線照射または過酸化水素によるスト
レスを与えた後、ＲＮＡを抽出しノーザンブロッティン
グを行った。なお、ｍＲＮＡの発現のレベルは、アクチ
ンのＲＮＡの発現レベルをコントロールとして分析し
た。結果を図２２に示した。紫外線照射及び過酸化水素
により与えられる細胞内ストレスによるＣＳＲｍＲＮＡ
の発現誘導が、抗酸化剤による前処理によって抑制され
ることが確認された。

【０１５５】実施例１０” 種々の試薬によるＣＳＲ遺
伝子の発現誘導の分析 細胞内ストレスを与える下記のような種々の試薬を用い
て、各々の試薬がＣＳ遺伝子の発現を誘導するか否かを
検討した。また、同時に、酸化ストレスにより生成され
るAP-1複合体のコンポーネントであるc-fos遺伝子の発
現の状態を測定した。ＣＳＲ遺伝子の発現は、RT-PCR法
によるサザーンハイブリダイゼーションにより実施例８
と同様にして分析した。但し、コントロールとしては、
ヒトβアクチン転写物の増幅をコントロールとした。ヒ
トβアクチンに対するRT-PCRでは、フォーワードプライ
マー及びリバースプライマーとして、各々配列番号２３
及び配列番号２４のオリゴヌクレオチドを用いた。ま
た、サザンハイブリダイゼーション用のプローブとし
て、配列番号２５の内部オリゴヌクレオチドオを用い
た。c-fosに対するRT-PCRでは、フォーワードプライマ
ー及びリバースプライマーとして、各々配列番号２６及
び配列番号２７のオリゴヌクレオチドを用いた。また、
サザンハイブリダイゼーション用のプローブとして、配
列番号２８の内部オリゴヌクレオチドを用いた。

【０１５６】mRNAの取得の前に、前記ヒト正常線維芽細
胞NHDF4042に下記のような処理を施し、ストレスを与え
た。mRNAは、該処理から２時間以内に単離して、RT-PCR
を行った。 （１）0.001〜１％のDEM（diethylmaleate, Sigma製）
を加え１時間培養。DEMは、細胞内還元グルタチオンを
減少させることにより酸化ストレスを与える。 （２）300〜2400μg/mlのPMA（TPA）（4β-phorbol 12-
myristate 13-acetate; tetradecanoyl phorbol acetat
e, SIgma製）を加え１時間培養。PMAは、膜結合型NAPDH
オキシダーゼ及びプロテインキナーゼＣを活性化する。 （３）0.005〜0.2%のSodium azide （NaN₃, Sigma製）
を加え６時間培養。Sodium azideは、ミトコンドリアに
おいてチトクロームＣオキシダーゼとの干渉を通じて細
胞内呼吸を阻害する。 （４）50μMのSodium arsenite（NaAsO₃, Sigma製）を
加え０〜24時間培養。Sodium arseniteは、細胞内熱シ
ョック様応答反応及び引き続く酸化ストレスを強く誘導
する。 （５）0.5mMのGSNO（S-nitrosoglutathione, Sigma製）
を加え０〜42時間培養。GSNOは、一酸化窒素（NO）の産
生を増加させる。 （６）50〜1200μMのSNP（sodium nitroprusside, Sigm
a製）を加え2.5時間培養。SNPは、一酸化窒素（NO）の
産生を増加させる。 結果を図２３（図23(a)乃至図23(f)）に示した。

【０１５７】0.1%のDEM、600μg/mlのPMA、及び0.01%の
Sodium azideの各々により、ＣＳＲ遺伝子の発現が有意
に誘導された。また、50μMのSodium arseniteによって
も、ＣＳＲ遺伝子の発現が有意に誘導された。0.5mMのG
SNOについては、４時間の培養においてＣＳＲ遺伝子の
発現が有意に誘導された。SNPについては、50〜100μM
の濃度の場合にＣＳＲ遺伝子の発現が有意に誘導され
た。一酸化窒素は、中枢系、免疫系及び循環器系におけ
る重要な調節因子として機能するとともに、敗血症（se
ptic shock）、高血圧、梗塞、及び神経変性疾患（neur
odegenerative disorder）等の病因としても作用するこ
とが明かにされてきている（Annu. Rev. Biochem., Vo
l.63, p.175-195, 1994）。従って、SNPやGSNOによりＣ
ＳＲ遺伝子の発現が誘導されるという結果は、ＣＳＲタ
ンパクが、酸化ストレス応答性遺伝子であり、前記のよ
うな疾患の発症に関与することを示唆するものである。

【０１５８】実施例１０”−１ 酸化ストレスによる種
々遺伝子の発現誘導の分析 酸化ストレスによりＣＳＲ遺伝子以外の他の遺伝子の発
現が誘導されるかを、検討する目的で、過酸化水素及び
Hemin各々の酸化ストレスに対する、CSR、c-fos、p53、
waf-1、c-src、HO-1、catalase、SOD、及びbeta-actin
の経時的遺伝子発現を、RT-PCR法を用いて検討した。mR
NAの取得の前に、前記ヒト正常線維芽細胞NHDF4042を、
10μMのHeminまたは20μMの過酸化水素の存在下で１乃
至50時間培養し、経時的にRNAを単離して、RT-PCRを行
った。各遺伝子の発現は、RT-PCR法によるサザーンハイ
ブリダイゼーションにより実施例８と同様にして分析し
た。各々の遺伝子に対するRT-PCRに用いるフォーワード
プライマー及びリバースプライマー、並びにサザーンハ
イブリダイゼーションに用いる内部オリゴヌクレオチド
プローブは、各々下記のとおり。

【０１５９】（１）ＣＳＲ フォーワードプライマー ：配列番号１５ リバースプライマー ：配列番号１６ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号８ （２）c-fos フォーワードプライマー ：配列番号２６ リバースプライマー ：配列番号２７ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号２８ （３）p53 フォーワードプライマー ：配列番号２９ リバースプライマー ：配列番号３０ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号３１ （４）waf-1 フォーワードプライマー ：配列番号３２ リバースプライマー ：配列番号３３ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号３４

【０１６０】（５）c-src フォーワードプライマー ：配列番号３５ リバースプライマー ：配列番号３６ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号３７ （６）HO-1 フォーワードプライマー ：配列番号３８ リバースプライマー ：配列番号３９ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号４０ （７）catalase フォーワードプライマー ：配列番号４１ リバースプライマー ：配列番号４２ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号４３ （８）SOD フォーワードプライマー ：配列番号４４ リバースプライマー ：配列番号４５ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号４６ （９）beta-actin フォーワードプライマー ：配列番号２３ リバースプライマー ：配列番号２４ 内部オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号２５ 結果を図２４（図24(a)及び図24(b)）に示した。

【０１６１】実施例１１ ＣＳＲタンパクの細胞内での
分布 ＣＳＲタンパクの細胞内での分布を免疫細胞化学染色
（immunocytechemical staining）により下記のように
して調べた。前記のようにして得たＣＳＲの完全長ｃＤ
ＮＡを、0.25UのＴａｑポリメラーゼ（TAKARA製）及び
0.5UのｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene製）の混
合物を用いて常法に従ってＰＣＲにより増幅した後、哺
乳動物発現ベクターpCDNA3.1（Invitrogen製）にクロー
ン化した。ベクターへのｃＤＮＡの挿入は、塩基配列解
析することにより確認した。次いで、ヘマグルチニン
（Hemagglutinin，ＨＡ）エピトープ（YPYDVPDYA；Wils
on, I.A.ら、CELL, Vol.37, 767-778, 1984）の塩基配
列を用いて、ＣＳＲｃＤＮＡの５’末端及び３’末端に
タグ（tag）を付した。

【０１６２】該ｃＤＮＡを用いて、ヒト肺癌細胞H1299
及びヒト子宮頸癌細胞Helaの各々を形質転換した。細胞
をGeneticin（Ｇ４１８，GIBCO-BRL製）の存在下で１０
日間培養した。ＣＳＲを安定して発現する細胞を、ＲＴ
−ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング（Western blotti
ng）並びにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-P
AGE）により選別した。選別した細胞を、免疫細胞化学
染色する２４時間前に、２穴（well）のスライドチャン
バー（Falcon製）に蒔いた。培養後、細胞をリン酸緩衝
液で軽く洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固
定化した。リン酸緩衝液で洗浄した後、細胞を、２％ウ
シ血清アルブミン存在下、室温で３０分間培養した。次
いで、抗ＨＡエピトープポリクローナル抗体（MBL製）
とともに３７℃で１時間培養した。リン酸緩衝液で３回
洗浄した後、FITC標識第２抗体とともに３７℃で４０分
間培養し、蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）下
で観察した（図１３(a)）。また、核をDAPI（4',6'-Dia
mino-2-phenylindole、Sigma製）で染色し、蛍光顕微鏡
下で観察した（図１３(b)）。

【０１６３】図１３(a)では、ＤＡＰＩにより染色され
た核との位置（図１３(b)）と同じ位置に、染色された
核より広い範囲（核の周囲）の染色が確認されることか
ら、ＨＡタグが付された部位（Ｃ末端及びＮ末端）に拘
わらず、ＣＳＲタンパクが細胞質に存在することが確認
された。さらなる検討のためには、抗ゴルジ-58Kタンパ
ク（golgi-58K protein）抗体（Sigma製）を用いて、前
記と同様にして対照染色を行う。さらに、細胞内ストレ
ス（細胞傷害）を受けた場合のＣＳＲタンパクの細胞内
での局在を下記のように調べることができる。

【０１６４】前記のようにして得たＣＳＲを安定に発現
するスライドチャンバー上の細胞に、細胞傷害試薬とし
ての20μM過酸化水素を添加して１時間培養した後、培
地を交換してさらに２４時間培養する。次いで、抗ＨＡ
エピトープポリクローナル抗体を用いて前記と同様にし
て免疫細胞化学染色を施す。細胞内ストレス（細胞傷
害）を与えない場合と同様に、ＣＳＲタンパクが細胞質
内に分布し、その発現はストレスを与えない場合より強
いものであることが確認される場合には、細胞質内での
ＣＳＲタンパクの分泌が、ストレスによっても依存する
ものと考えることができる。

【０１６５】実施例１１’ ＣＳＲタンパクの細胞内で
の分布 実施例１１で得られた結果を、実施例１１の方法と同様
にしてさらに検証した。前記のようにして得たCSR1及び
CSR2の完全長ｃＤＮＡを、0.25UのＴａｑポリメラーゼ
（TAKARA製）及び0.5UのｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（St
ratagene製）の混合物を用いて常法に従ってＰＣＲによ
り増幅した後、哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1（Invitr
ogen製）にクローン化した。ベクターへのｃＤＮＡの挿
入は、塩基配列解析することにより確認した。次いで、
ヘマグルチニン（Hemagglutinin，ＨＡ）エピトープ（Y
PYDVPDYA；Wilson, I.A.ら、CELL, Vol.37, 767-778, 1
984）の塩基配列を用いて、ＣＳＲｃＤＮＡの５’末端
及び３’末端にタグ（tag）を付した。

【０１６６】該ｃＤＮＡを用いて、ヒト子宮頸癌細胞He
laを形質転換した。細胞をGeneticin（Ｇ４１８，GIBCO
-BRL製）の存在下で１０日間培養した。ＣＳＲを安定し
て発現する細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロッテ
ィング（Western blotting）並びにSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により選別した。選別し
た細胞を、免疫細胞化学染色する２４時間前に、２穴
（well）のスライドチャンバー（Falcon製）に蒔いた。
培養後、細胞をリン酸緩衝液で軽く洗浄し、冷メタノー
ルを用いて固定化した。リン酸緩衝液で洗浄した後、細
胞を、２％ウシ血清アルブミン存在下、室温で３０分間
培養した。次いで、抗ＨＡエピトープポリクローナル抗
体（MBL製）とともに３７℃で１時間培養した。リン酸
緩衝液で３回洗浄した後、FITC標識第２抗体（Cappel
製）とともに３７℃で４０分間培養し、蛍光顕微鏡（fl
uorescence microscope）下で観察した。また、核をDAP
I（4',6'-Diamino-2-phenylindole、Boeheringer Mannh
eim製）で染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。結果を図
２５（図25(a)〜図25(d)）に示した。

【０１６７】空のベクターで形質転換した細胞（ネガテ
ィブコントロール）では、全く染色されなかった（図25
(a)）。ＣＳＲの完全長cDNA発現ベクターで形質転換さ
れた細胞では、ＤＡＰＩにより染色された核との位置
（図25(d)）と同じ位置に、染色された核より広い範囲
（核の周囲）の染色が確認されることから、ＨＡタグが
付された部位（Ｃ末端及びＮ末端）に拘わらず、ＣＳＲ
タンパクが細胞質に存在することが確認された（図25
(c)）。ＣＳＲタンパクの細胞質での存在をさらに検討
のために、抗ゴルジ-58Kタンパク（golgi-58K protei
n）抗体（Sigma製）及びローダミンを接合させた二次抗
体（Leinco Tech.製）を用いて、前記と同様にして対照
染色を行った。結果を図２５（図25(e)及び図25(f)）に
示した。前記のＨＡタグを付したＣＳＲタンパクの試験
結果と同様に位置に、シグナルが検出された（図25
(e)）。

【０１６８】さらに、細胞内ストレス（細胞傷害）を受
けた場合のＣＳＲタンパクの細胞内での局在を下記のよ
うに調べた。前記のようにして得たＣＳＲを安定に発現
するスライドチャンバー上の細胞に、細胞傷害試薬とし
ての20μM過酸化水素を添加して１時間培養した後、培
地を交換してさらに２４時間培養した。次いで、抗ＨＡ
エピトープポリクローナル抗体を用いて前記と同様にし
て免疫細胞化学染色を施した。結果を図２５（図25(g)
及び図25(h)）に示した。細胞内ストレス（細胞傷害）
を与えない場合と同様に、ＣＳＲタンパクが細胞質内に
分布し、その発現はストレスを与えない場合より強いも
のであることが確認された。この結果は、細胞質内での
ＣＳＲタンパクの分泌が、ストレスによっても依存する
ことも示唆するものである。

【０１６９】実施例１２ 細胞内ストレスによる細胞死
に対するＣＳＲの役割 細胞が種々のストレスを受けた場合に発現するタンパク
は、該細胞の細胞死あるいは生存に深く関与することが
知られている。細胞が細胞内ストレス（細胞傷害）を受
けた場合におけるＣＳＲの機能・役割を解明するため、
下記細胞生存試験を行った。ＣＳＲ１及びＣＳＲ２各々
の完全長ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1（In
vitrogen製）にクローン化した後、ヒト肺癌細胞H1299
を形質転換した。Geneticin（GIBCO-BRL製）の存在下で
１０日間培養して、ＣＳＲを安定に発現する細胞を選別
した。ＣＳＲの過剰発現は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて確認
した。該過剰発現細胞（500個）を、直径60mmの培養皿
に蒔いた。１８時間の培養後、細胞への5乃至60J/m²の
強さの紫外線照射または培養液への50乃至200μMの過酸
化水素の添加を施し、１時間培養した。次いで、培地を
交換し、さらに１０乃至２０日培養した。得られたコロ
ニーを冷メタノールで固定し、ギムザ溶液（Giemsa's s
olution；Merck製）で染色した後、生細胞コロニー数を
計測した。

【０１７０】なお対照として、ＣＳＲ遺伝子を挿入して
いないpCDNA3.1ベクターで形質転換したH1299形質転換
体、及びいずれのベクターでの形質転換も施していない
H1299親細胞を用いて同様の試験を行った。結果を図１
４（紫外線照射）及び図１５（過酸化水素）に示した。
紫外線照射及び過酸化水素による細胞内ストレスのいず
れにおいても、ＣＳＲを発現する細胞の生存率は、対照
に比べ優位に高いものであることが確認された。この結
果から、ＣＳＲは、種々の細胞内ストレス（傷害）によ
り起こる細胞死に対して抑制的に働く機能を有するもの
であると考えられる。

【０１７１】実施例１２’ 細胞内ストレスによる細胞
死に対するＣＳＲの役割 実施例１２で得られた紫外線照射に係る試験の結果を、
実施例１２と同様の方法に従って、さらに検証した。但
し、本試験では、前記CSR1遺伝子発現ベクター及びCSR2
遺伝子発現ベクターの両方で共形質転換（co-transfect
ion）した細胞（「CSR1/CSR2」と略称）についても検討
した。結果を図２６に示した。CSR1遺伝子発現ベクター
による形質転換細胞（「H1299-CSR1」と略称）、CSR2遺
伝子発現ベクターによる形質転換細胞（「H1299-CSR2」
と略称）、及び該両方のベクターで共形質転換した細胞
（CSR1/CSR2）のいずれも、対照であるH1299親細胞
（「H1299」と略称）及びいずれのCSR遺伝子も有しない
空のベクターで形質転換した細胞（「H1299-vector」と
略称）に比べ、紫外線照射による細胞内ストレスによる
細胞死に耐性を示した。該耐性は、CSR1/CSR2、H1299-C
SR1、及びH1299-CSR2の順で高かった。この結果は、Ｃ
ＳＲタンパクが、種々の細胞内ストレス（傷害）により
起こる細胞死に対して抑制的に働く機能を有することを
示すものである。

【０１７２】実施例１２” 細胞内ストレスによる細胞
死に対するＣＳＲの役割 実施例１２及び実施例１２’で確認されたＣＳＲタンパ
クの酸化ストレスに対する耐性発現のメカニズムを下記
のようにして解析した。実施例１２’で用いた４種類の
細胞（H1299-vector、H1299-CSR1、H1299-CSR2、及びCS
R1/CSR2）（各２×１０⁵細胞）を、過酸化水素（20μ
M）の存在下で１時間培養した後、培地を新鮮な完全培
地に交換しさら24時間培養した。次いで、細胞を、５μ
MのDCFH-DA（2',7,-dichlorofluorescein diacetate, M
olecular Probes製）の存在下で３７℃で３０分間培養
した後、リン酸緩衝液中に懸濁させた。各々の細胞群で
細胞が産生する反応性酸素種（reactive oxygen spiece
s）の量をFACSCalibur（Becton Dickinson製）により測
定した。この方法は、細胞が産生する反応性酸素種（re
active oxygen spieces）の量を、細胞内におけるDCFH-
DAの酸化に従って増加する蛍光強度に基づいて求めるも
のである。結果を図２７（図27(a)乃至図27(d)）に示し
た。反応性酸素種の量は、対照であるH1299-vector群で
優位に増大した（図27(a)）。一方、H1299-CSR1群及びH
1299-CSR2群における反応性酸素種の産生量は、対照で
あるH1299-vector群に比べ、有意に減少していた（図27
(b)及び図27(c)）。驚くべきことに、CSR1/CSR2群で
は、反応性酸素種の産生がほとんど消失していた（図27
(d)）。

【０１７３】さらに、H1299-vector群及びCSR1/CSR2群
については、本試験における過酸化水素によるストレス
付加により誘導される細胞死（細胞の小粒化という形態
変化を経て細胞死に至る）に対する耐性の有無を、細胞
の形態の変化から分析した。H1299-vector群及びCSR1/C
SR2群の各々について、過酸化水素の添加時（０時
間）、過酸化水素存在下での１時間の培養後、及び３時
間の培養後の細胞の形態を常法により顕微鏡下にて観察
した。結果を図２８（図28(a)乃至図28(h)）に示した。
対照である、H1299-vector群では、過酸化水素による酸
化ストレス付加直後から細胞の形態が変化（小粒化）が
見られ、経時的に細胞死に向っていることが観察され
た。一方、CSR1/CSR2群については、過酸化水素による
酸化ストレス付加直後に一時的に細胞の形態が変化が見
られるが、経時的にもとの細胞形態に戻っていくことが
観察された。この結果からの、ＣＳＲタンパクが、種々
の酸化ストレスにより引き起こされる細胞死に対して抑
制的に働く分子であることが分かる。

【０１７４】実施例１３ ＣＳＲ遺伝子ノックアウトマ
ウスの作製 ヒトＣＳＲ遺伝子に対応するマウスの内在性のＣＳＲ遺
伝子が不活性化（ノックアウト）されたノックアウトマ
ウスを下記のようにして作製した。

【０１７５】（１）ターゲッティングベクターの構築 マウスCSRタンパクをコードする内在性遺伝子を相同組
換え（日経サイエンス、1994年５月号、第52-62頁）に
より不活性化（ノックアウト）するためのタ ーゲティ
ングベクターを下記のようにして構築した。前記実施例
でクローニングしたヒトCSRタンパクをコードするcDNA
を³²Pで標識して常法に従ってハイブリダイゼーション
用プローブを 作製した。このプローブを用いて、マウ
スゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）が導入されたコスミド
ライスラリー（「ラボマニュアルヒトゲノムマッピン
グ」、堀雅明及び中村祐輔 編、丸善出版の方法と同様
にして作製した。）をスクリーニングし、マウスCSRタ
ンパクをコードするエクソン（図１に示されるヒトCSR
遺伝子のエキソンA, B, C,D,及びEの一部に対応するマ
ウスエキソン）を含むマウスCSRゲノミックDNAクローン
を取得した。

【０１７６】プラスミドpBluescript II SK(-)をKpnI消
化した部位に、HindIII及びXhoIで消化して切り出した
チミジンキナーゼ遺伝子（「TK」、ネガティブセレクシ
ョンマーカーとして）を平滑末端で挿入、連結した。次
いで、このpBluescript II SK(-)のXbaI及びSalIで切断
し、該切断部位に、マウスCSRゲノミックDNAをHpaI及び
Acc65Iで消化して得られたDNA断片（エキソンA乃至D）
を平滑末端で挿入、連結した。次に、XbaI及びEcoRVで
処理して切り出したネオマイシン耐性遺伝子（「ne
o」、ポジティブセレクションマーカーとして）を、前
記マウスCSRゲノミックDNA中のエクソンＢのNciI切断部
位とエクソンＤのAor51HI切断部位との間に平滑末端で
挿入、連結した。得られたプラスミドをNotIで切断して
線状化してターゲティングベクターとした。作製したタ
ゲティングベクターの構造を模式的に示す図を図２９に
示す。

【０１７７】（２）ターゲティングベクターのＥＳ細胞
への導入 15%ウシ胎児血清を含有するDMEM培地中で培養したマウ
ス胚性幹細胞（ES細胞；embryonic stem cell、１×１
０8細胞）（Nature, Vol.362, p.255-258, 1993及びNat
ure, Vol.326, p.292-295, 1987）をトリプシンで処理
して単一細胞とした後、リン酸緩衝液で３回洗浄して細
胞濃度を１×１０⁷細胞／mlに調製した。細胞懸濁液１m
lあたり25μgの前記ターゲティングベクターを加え、35
0V/cm（25μF）の条件下で電気パルスを１回かけた。次
いで、シャーレ（10cm）に１×１０⁷細胞のES細胞を播
種し維持培地中で１日培養した後、培地を選択培地（G4
18(250μg/ml)及び2μMのガンシクロビルを含有する）
に交換した。以後２日毎に培地交換を行い培養した。タ
ーゲティングベクター導入から１０日目に、マイクロピ
ペットを用いて、顕微鏡下で数百個のネオマイシン耐性
ES細胞クローンを取得した。得られたES細胞クローン
を、Feeder細胞を敷いた24穴プレートで各々別々に培養
することにより、ネオマイシン耐性ES細胞のレプリカを
取得した 。

【０１７８】（３）ノックアウトＥＳ細胞のスクリーニ
ング 得られたネオマイシン耐性ES細胞の各々について、マウ
スCSRタンパクをコードする内在性遺伝子の相同組換え
による破壊（ノックアウト）が起こっているか否かをゲ
ノミックサザンブロッティングにより確認する。ゲノミ
ックサザンブロッティングは、各々のネオマイシン耐性
ES細胞から抽出したゲノミックDNAのEcoRIで切断断片に
ついて、マウスCSRゲノミックDNAの５’側及び３’側の
配列を有する２つのプローブを用いて常法により行う。
DNAの精製は、自動DNA精製ロボット（クボタ製）を用い
る。こうしてES細胞クローン中で、目的とするノックア
ウトが起こっていることが確認される。このES細胞クロ
ーンを下記に述べるノックアウトマウスの作製に用い
る。

【０１７９】（４）ノックアウトマウスの作製 前記で得たマウスCSRタンパクをコードする内在性遺伝
子が相同組換えにより不活性化（ノックアウト）された
ES細胞クローンの各々を、C57BL6マウス（日本チャール
ズリバー製）の雄雌を交配して得た胚盤胞に１胚あたり
１５個ずつ注入（マイクロインジェクション）する。注
入直後に、偽妊娠処理してから2.5日 目の仮親ICRマウ
ス（日本クレア製）の子宮に子宮の片側あたり約１０個
ずつの 胚盤胞を移植する。こうして、各々のES細胞ク
ローンについて、ノックアウトキメラマウスを得る。次
いで得られた各々のキメラマウスを正常C57BL6マウスと
交配し、ES細胞由来の毛色遺伝子によるアグーチ（agou
ti）色のマウスを得る。

【０１８０】

【発明の効果】本発明の新規な遺伝子／タンパクは、下
記のような特徴を有し、細胞内に発生した種々ストレス
に対して防御的に働く新規なスカベンジャー受容体であ
ると考えられることから、本発明のスカベンジャー受容
体（ＣＳＲ、Cellular Sensor-Related protein）をコ
ードする遺伝子あるいはタンパクをターゲットとして、
生体内に生じた細胞内ストレス、異物あるは変性蛋白に
起因する病的症状や疾患（例えば、動脈硬化症、糖尿病
性血管障害、細菌感染など）の予防並びに治療のための
医薬品開発するために極めて有用である。

【０１８１】該遺伝子は、アンチセンス医薬品として、
また遺伝子治療において利用することができ、該タンパ
クは、その可溶性断片（細胞外領域や各ドメイン）を作
製することにより可溶性蛋白医薬品として有用である。
さらに、該タンパクまたはその断片に反応性を有する抗
体及びその抗体の一部は、ＣＳＲの機能を制御する抗体
医薬品として極めて有用である。

【０１８２】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco, Inc. <120> Scavenger Like Protein <130> J98-0139<140> <141> <150> JP9-233396 <151> 1997-08-13 <160> 46 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 1 ctaatcgcat tatcatccta 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 2 gtatcacgag gccctttc 18 <210> 3 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(525) <220> <221> protein_bind <222> (504)..(513) <400> 3 tgcagcccgg ggtgggaaag ccccggactc acccagagag gccaacacag ccacggccac 60 caggagcagg gccaggaaga ggtaaagaat ccgcaccgat gtgtgcaaag ataggttctt 120 ctggcagcgg ctgcagcggg gccctggccg gcctgtgggg gacacaagga ggacaatggc 180 ttaggccagg ggccaggttg gagctgaagg gtcagttcca tgttcctgct ctggtctgtc 240 tcatcacatt caaaccaggc tcaganggag ctgttctcga ccctcattct ctacctgtcc 300 tactcctttc tctaggtgct ggtgctttct ggaatgcagg agaccgagtc aggacttcaa 360 agaacagccc ccagcactac catcatcctc tctccatggt gtcttcattc ggcccatggg 420 gaggggaaac acctcttccc tctccattgg tcctactgag gacccacagg atgagcagcc 480 agcctgaggc cccactgagt gaccaacttg tctgggcttg cccag 525 <210> 4 <211> 256 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(256) <400> 4 gtgagtccgg ggctttccca ccccgggctg caggggggtg tctgatcagg gatccagcac 60 caaaagttcc cctgcaaaga caaacacttg acatctgtat cccagggccc agagccagca 120 tcttcctggc taggggatct ctatgcctaa tgcaaactgc aaacactggc aactgacaaa 180 atctgtggcc ttaaggaagg cacctgcctc tggggacccc ttctttccca ttggtgtaat 240 gaaatgatac aaccag 256 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind＜２２２＞ （１）．．（１９） <400> 5 gaggccccag aggaagaga 19 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(23) <400> 6 acagccctcc tcagtagtag aag 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 7 gctggcttca tatcatatcc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesyzed primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 8 gactctctct ccgaagacat c 21 <210> 9 <211> 3810 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(275) <220> <221> CDS <222> (276)..(2096) <220> <221> 3'UTR <222> (2097)..(3810) <400> 9 gcggccgcgt cgaccgggat gcgcgctctg ggcggcgggg cgcggcgcta ggcgcccggc 60 ggggcttccc caggctgcga ccccgcggga ccctccactc ctcccgccgc ctccgcagcc 120 cgcgcgccgg agcatgagtc ccggccggag ccccacggcc gcgggcggcg cctaggacgg 180 cgatccgcgc cctggaggat ccgccggccg cccggctcca ctacagctcc agccgcctgc 240 agcggggccc tcctgaggcc ccagaggaag agacc atg aaa gtg agg tcg gcc 293 Met Lys Val Arg Ser Ala 1 5 ggc ggc gat gga gat gcc ttg tgc gtt aca gaa gag gac ctg gcg ggt 341 Gly Gly Asp Gly Asp Ala Leu Cys Val Thr Glu Glu Asp Leu Ala Gly 10 15 20 gac gac gag gac atg ccg acc ttc cca tgc acc cag aag ggc cgg cca 389 Asp Asp Glu Asp Met Pro Thr Phe Pro Cys Thr Gln Lys Gly Arg Pro 25 30 35 ggg ccc cgc tgc agc cgc tgc cag aag aac cta tct ttg cac aca tcg 437 Gly Pro Arg Cys Ser Arg Cys Gln Lys Asn Leu Ser Leu His Thr Ser 40 45 50 gtg cgg att ctt tac ctc ttc ctg gcc ctg ctc ctg gtg gcc gtg gct 485 Val Arg Ile Leu Tyr Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Val Ala 55 60 65 70 gtg ttg gcc tct ctg gtt ttc aga aaa gtg gac tct ctc tcc gaa gac 533 Val Leu Ala Ser Leu Val Phe Arg Lys Val Asp Ser Leu Ser Glu Asp 75 80 85 atc tcc ttg acc cag tct att tat gac aag aag ctt gtg tta atg cag 581 Ile Ser Leu Thr Gln Ser Ile Tyr Asp Lys Lys Leu Val Leu Met Gln 90 95 100 aaa aat ctc cag ggc ctg gat ccg aaa gcc ctg aac aac tgc tct ttc 629 Lys Asn Leu Gln Gly Leu Asp Pro Lys Ala Leu Asn Asn Cys Ser Phe 105 110 115 tgc cat gaa gct ggg cag ctg ggg cca gag atc cga aaa ctg cag gag 677 Cys His Glu Ala Gly Gln Leu Gly Pro Glu Ile Arg Lys Leu Gln Glu 120 125 130 gag ctg gag gga att cag aag ctg ctt ctg gcc cag gag gtg cag ctg 725 Glu Leu Glu Gly Ile Gln Lys Leu Leu Leu Ala Gln Glu Val Gln Leu 135 140 145 gac cag acc tta cag gcc cag gag gtg ctc tcc acc acc agc aga caa 773 Asp Gln Thr Leu Gln Ala Gln Glu Val Leu Ser Thr Thr Ser Arg Gln 155 160 165 atc tcc cag gag atg ggc agt tgc tcc ttc tcc atc cac cag gtt aac 821 Ile Ser Gln Glu Met Gly Ser Cys Ser Phe Ser Ile His Gln Val Asn 170 175 180 cag tct ctg ggg ctc ttc ctg gcc cag gtg aga ggc tgg cag gcc acc 869 Gln Ser Leu Gly Leu Phe Leu Ala Gln Val Arg Gly Trp Gln Ala Thr 185 190 195 aca gct ggc ctg gac ctc tct ctg aag gac ctc acc cag gag tgc tac 917 Thr Ala Gly Leu Asp Leu Ser Leu Lys Asp Leu Thr Gln Glu Cys Tyr 200 205 210 gat gtc aag gct gca gtg cac cag atc aac ttc acc gtg ggg cag act 965 Asp Val Lys Ala Ala Val His Gln Ile Asn Phe Thr Val Gly Gln Thr 215 220 225 230 tcc gag tgg atc cac ggg atc cag cgg aag aca gac gag gag acc ctg 1013 Ser Glu Trp Ile His Gly Ile Gln Arg Lys Thr Asp Glu Glu Thr Leu 235 240 245 acc ctc cag aag att gtc acc gac tgg cag aac tac aca cgg ctc ttc 1061 Thr Leu Gln Lys Ile Val Thr Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Arg Leu Phe 250 255 260 agc ggc ctg cgc acc acc tcc acc aag act gga gag gcg gtc aag aac 1109 Ser Gly Leu Arg Thr Thr Ser Thr Lys Thr Gly Glu Ala Val Lys Asn 265 270 275 atc cag gcc acc ctg ggg gcc tcc tca cag cgc atc agc cag aac tca 1157 Ile Gln Ala Thr Leu Gly Ala Ser Ser Gln Arg Ile Ser Gln Asn Ser 280 285 290 gag agc atg cac gac ctg gta ctc cag gtc atg ggc ttg cag ctg cag 1205 Glu Ser Met His Asp Leu Val Leu Gln Val Met Gly Leu Gln Leu Gln 295 300 305 310 ctg gat aac atc tcg tcc ttc ctg gat gac cac gaa gag aac atg cat 1253 Leu Asp Asn Ile Ser Ser Phe Leu Asp Asp His Glu Glu Asn Met His 315 320 325 gat ctt cag tac cat acc cac tac gcc cag aac cgc act gtg gag agg 1301 Asp Leu Gln Tyr His Thr His Tyr Ala Gln Asn Arg Thr Val Glu Arg 330 335 340 ttt gag tct ctg gaa gga cgc atg gct tct cac gag att gaa att ggc 1349 Phe Glu Ser Leu Glu Gly Arg Met Ala Ser His Glu Ile Glu Ile Gly 345 350 355 acc atc ttc acc aac atc aat gcc acc gac aac cac gtg cac agc atg 1397 Thr Ile Phe Thr Asn Ile Asn Ala Thr Asp Asn His Val His Ser Met 360 365 370 ctc aag tac ctg gat gac gtg cgg ctc tcc tgc acg ctg ggc ttc cac 1445 Leu Lys Tyr Leu Asp Asp Val Arg Leu Ser Cys Thr Leu Gly Phe His 375 380 385 390 acc cat gcc gag gag ctc tac tac ctg aac aag tct gtc tcc atc atg 1493 Thr His Ala Glu Glu Leu Tyr Tyr Leu Asn Lys Ser Val Ser Ile Met 395 400 405 ctg ggc acc aca gac ctg ctc cgg gag cgc ttc agc ctg ctc agt gcc 1541 Leu Gly Thr Thr Asp Leu Leu Arg Glu Arg Phe Ser Leu Leu Ser Ala 410 415 420 cgg ctg gac ctc aac gtc cgg aac ctc tcc atg atc gtg gag gag atg 1589 Arg Leu Asp Leu Asn Val Arg Asn Leu Ser Met Ile Val Glu Glu Met 425 430 435 aag gca gtg gac aca cag cat gga gaa atc ctt cgc aat gtc acc atc 1637 Lys Ala Val Asp Thr Gln His Gly Glu Ile Leu Arg Asn Val Thr Ile 440 445 450 cta cga ggt gcc ccc ggc cct cca gga cca aga gga ttc aaa gga gat 1685 Leu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Phe Lys Gly Asp 455 460 465 470 atg ggc gtg aaa ggg cct gtt ggc ggc aga ggc ccg aaa gga gac ccc 1733 Met Gly Val Lys Gly Pro Val Gly Gly Arg Gly Pro Lys Gly Asp Pro 475 480 485 ggc atc ttg ggc ccc ctg gga ccc cag ggt cct cag ggg caa cct gga 1781 Gly Ile Leu Gly Pro Leu Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Gln Pro Gly 490 495 500 gag gcc ggg cct gtg gga gaa agg ggc cct gtt ggc cct cga ggg ttc 1829 Glu Ala Gly Pro Val Gly Glu Arg Gly Pro Val Gly Pro Arg Gly Phe 505 510 515 cca ggc ctc aaa ggc tca aag ggc agc ttt gga act gga ggg ccg aga 1877 Pro Gly Leu Lys Gly Ser Lys Gly Ser Phe Gly Thr Gly Gly Pro Arg 520 525 530 gga cag cca ggc cca aaa ggg gac ata ggg ccc cca ggg cca gaa ggg 1925 Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ile Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly 535 540 545 550 ccc ccg ggg tct cca ggg ccc tca ggg cct cag gga aaa ccg gga att 1973 Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Lys Pro Gly Ile 555 560 565 gca ggg aag aca ggg tca cca ggc cag cgg ggg gcc atg ggg cct aag 2021 Ala Gly Lys Thr Gly Ser Pro Gly Gln Arg Gly Ala Met Gly Pro Lys 570 575 580 ggt gaa cca ggg atc cag ggt ccc cct ggt ctc ccg ggg cct cca ggt 2069 Gly Glu Pro Gly Ile Gln Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly 585 590 595 cca cca gga agc cag agc ttc tac tga ggagggctgt ggcagagcca 2116 Pro Pro Gly Ser Gln Ser Phe Tyr 600 605 ctgtcacaca gaatgccgga ggggcgcaga gcagatccag gccccagaaa gcctcaccta 2176 cagacagctg tggtcctctg attccaatga gggggctccc cagggctgac cctgcagctt 2236 tgggctcccc catagtgact gtgccatagg aaagcagccc ctcctcacac atacatgtgc 2296 acatgcacac acatgcatgc acacacatgc acacatacac gcacatgcac acatacacat 2356 gcatgcacac atacacaggc atacatgcat gcacacayac atatgcacgc acacacacat 2416 gcacacatac acgtgcacac atacacaggc acacatgcat gcacacatac acatgcacac 2476 acacatgcac acatatatgc acaggcacac acatgtatgc acacacacat gcaccgcaca 2536 catatccatg cacacaaaca catatataca catgcacata cacagatttt tctgctggcc 2596 aggtgggcca actgggtttc ccctggctgg gcaggaggag agggcagagg aagaccccct 2656 ctcctgtgac tgagcctgcc agggaggcag ctacctcggg aggaaggtct cacatctgtc 2716 tttgggcacc catgctggcc agcagtttcc cagggctccc tggggttgaa aagccccaag 2776 gaaacctttg cgggtggggc gttactgcca aaactccaga ggcaaagtgg acctggcaac 2836 cacaagaccc tccccataag caggggacca gcagacccgg gagctgtccc ctgtctgtca 2896 cagcacagtg gggccacgag gctgacattc tctggccttg cacacagtgc cccctgagaa 2956 gttcaacatt tatttcttca cgtgtccagg aaaattcctc aattcatcct tgcctctgcc 3016 cttcaggagc agcctggaag gaatccaagc aggagtttca tctgcatggg ggcactttgc 3076 aggccctgga acattgggcc tgagtggaga tgggagacag aggcaggcca gaaggttctc 3136 tctgcacagc tgcctccctt gctctccctg agggtggcct gccccattcc ccaagggggc 3196 tcctttggag tggtagggag gatcaggctg cagaagggcc aaccccttgc aacagggcag 3256 ctctcgcctc ccgcacacgg ctctcctgat cacagctgca tgccgacctt gtcccaccgg 3316 gacccacaat ggcccgagcc ctctttgcat gggcagccag ctggactagg agtgggaagg 3376 gcctggacac tcacagaggc cccctctgtc atcactcctt ggcacccacc aacttcctgc 3436 acacactggc agagaggggc gctgggaaat caccccacag ggtggaggtc tcctgttggc 3496 tacactctaa agctgctttg ccttcatgtt caaacagatt caggcaccac cccctccacc 3556 gcccgcaagg ttagggcata gatttgtctc cttcccaaca cggacccaga gagcagccct 3616 tccctgctca aagcctttcc gcaccctcct gactgtcctg gatgtgcaac tggtttgcac 3676 tgcacacccc acggccatgt aactctcctg tccacatatg ataataccat tctgcatagt 3736 attactgact cagtaaagaa ctatttccag gagtaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3796 aaaaaaaaaa aaaa 3810 <210> 10 <211> 606 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Lys Val Arg Ser Ala Gly Gly Asp Gly Asp Ala Leu Cys Val Thr 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Ala Gly Asp Asp Glu Asp Met Pro Thr Phe Pro Cys 20 25 30 Thr Gln Lys Gly Arg Pro Gly Pro Arg Cys Ser Arg Cys Gln Lys Asn 35 40 45 Leu Ser Leu His Thr Ser Val Arg Ile Leu Tyr Leu Phe Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Leu Val Ala Val Ala Val Leu Ala Ser Leu Val Phe Arg Lys Val 65 70 75 80 Asp Ser Leu Ser Glu Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Ile Tyr Asp Lys 85 90 95 Lys Leu Val Leu Met Gln Lys Asn Leu Gln Gly Leu Asp Pro Lys Ala 100 105 110 Leu Asn Asn Cys Ser 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His Asp Leu Gln Tyr His Thr His Tyr Ala Gln 325 330 335 Asn Arg Thr Val Glu Arg Phe Glu Ser Leu Glu Gly Arg Met Ala Ser 340 345 350 His Glu Ile Glu Ile Gly Thr Ile Phe Thr Asn Ile Asn Ala Thr Asp 355 360 365 Asn His Val His Ser Met Leu Lys Tyr Leu Asp Asp Val Arg Leu Ser 370 375 380 Cys Thr Leu Gly Phe His Thr His Ala Glu Glu Leu Tyr Tyr Leu Asn 385 390 395 400 Lys Ser Val Ser Ile Met Leu Gly Thr Thr Asp Leu Leu Arg Glu Arg 405 410 415 Phe Ser Leu Leu Ser Ala Arg Leu Asp Leu Asn Val Arg Asn Leu Ser 420 425 430 Met Ile Val Glu Glu Met Lys Ala Val Asp Thr Gln His Gly Glu Ile 435 440 445 Leu Arg Asn Val Thr Ile Leu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro 450 455 460 Arg Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly Val Lys Gly Pro Val Gly Gly Arg 465 470 475 480 Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Ile Leu Gly Pro Leu Gly Pro Gln Gly 485 490 495 Pro Gln Gly Gln Pro Gly Glu Ala Gly Pro Val Gly Glu Arg Gly Pro 500 505 510 Val Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Leu Lys Gly Ser Lys Gly Ser Phe 515 520 525 Gly Thr Gly Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ile Gly 530 535 540 Pro Pro Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ser Gly Pro 545 550 555 560 Gln Gly Lys Pro Gly Ile Ala Gly Lys Thr Gly Ser Pro Gly Gln Arg 565 570 575 Gly Ala Met Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ile Gln Gly Pro Pro Gly 580 585 590 Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Ser Phe Tyr 595 600 605 <210> 11 <211> 1877 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(275) <220> <221> CDS <222> (276)..(1676) <220> <221> 3'UTR <222> (1677)..(1877) <400> 11 gcggccgcgt cgaccgggat gcgcgctctg ggcggcgggg cgcggcgcta ggcgcccggc 60 ggggcttccc caggctgcga ccccgcggga ccctccactc ctcccgccgc ctccgcagcc 120 cgcgcgccgg agcatgagtc ccggccggag ccccacggcc gcgggcggcg cctaggacgg 180 cgatccgcgc cctggaggat ccgccggccg cccggctcca ctacagctcc agccgcctgc 240 agcggggccc tcctgaggcc ccagaggaag agacc atg aaa gtg agg tcg gcc 293 Met Lys Val Arg Ser Ala 1 5 ggc ggc gat gga gat gcc ttg tgc gtt aca gaa gag gac ctg gcg ggt 341 Gly Gly Asp Gly Asp Ala Leu Cys Val Thr Glu Glu Asp Leu Ala Gly 10 15 20 gac gac gag gac atg ccg acc ttc cca tgc acc cag aag ggc cgg cca 389 Asp Asp Glu Asp Met Pro Thr Phe Pro Cys Thr Gln Lys Gly Arg Pro 25 30 35 ggg ccc cgc tgc agc cgc tgc cag aag aac cta tct ttg cac aca tcg 437 Gly Pro Arg Cys Ser Arg Cys Gln Lys Asn Leu Ser Leu His Thr Ser 40 45 50 gtg cgg att ctt tac ctc ttc ctg gcc ctg ctc ctg gtg gcc gtg gct 485 Val Arg Ile Leu Tyr Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Val Ala 55 60 65 70 gtg ttg gcc tct ctg gtt ttc aga aaa gtg gac tct ctc tcc gaa gac 533 Val Leu Ala Ser Leu Val Phe Arg Lys Val Asp Ser Leu Ser Glu Asp 75 80 85 atc tcc ttg acc cag tct att tat gac aag aag ctt gtg tta atg cag 581 Ile Ser Leu Thr Gln Ser Ile Tyr Asp Lys Lys Leu Val Leu Met Gln 90 95 100 aaa aat ctc cag ggc ctg gat ccg aaa gcc ctg aac aac tgc tct ttc 629 Lys Asn Leu Gln Gly Leu Asp Pro Lys Ala Leu Asn Asn Cys Ser Phe 105 110 115 tgc cat gaa gct ggg cag ctg ggg cca gag atc cga aaa ctg cag gag 677 Cys His Glu Ala Gly Gln Leu Gly Pro Glu Ile Arg Lys Leu Gln Glu 120 125 130 gag ctg gag gga att cag aag ctg ctt ctg gcc cag gag gtg cag ctg 725 Glu Leu Glu Gly Ile Gln Lys Leu Leu Leu Ala Gln Glu Val Gln Leu 135 140 145 150 gac cag acc tta cag gcc cag gag gtg ctc tcc acc acc agc aga caa 773 Asp Gln Thr Leu Gln Ala Gln Glu Val Leu Ser Thr Thr Ser Arg Gln 155 160 165 atc tcc cag gag atg ggc agt tgc tcc ttc tcc atc cac cag gtt aac 821 Ile Ser Gln Glu Met Gly Ser Cys Ser Phe Ser Ile His Gln Val Asn 170 175 180 cag tct ctg ggg ctc ttc ctg gcc cag gtg aga ggc tgg cag gcc acc 869 Gln Ser Leu Gly Leu Phe Leu Ala Gln Val Arg Gly Trp Gln Ala Thr 185 190 195 aca gct ggc ctg gac ctc tct ctg aag gac ctc acc cag gag tgc tac 917 Thr Ala Gly Leu Asp Leu Ser Leu Lys Asp Leu Thr Gln Glu Cys Tyr 200 205 210 gat gtc aag gct gca gtg cac cag atc aac ttc acc gtg ggg cag act 965 Asp Val Lys Ala Ala Val His Gln Ile Asn Phe Thr Val Gly Gln Thr 215 220 225 230 tcc gag tgg atc cac ggg atc cag cgg aag aca gac gag gag acc ctg 1013 Ser Glu Trp Ile His Gly Ile Gln Arg Lys Thr Asp Glu Glu Thr Leu 235 240 245 acc ctc cag aag att gtc acc gac tgg cag aac tac aca cgg ctc ttc 1061 Thr Leu Gln Lys Ile Val Thr Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Arg Leu Phe 250 255 260 agc ggc ctg cgc acc acc tcc acc aag act gga gag gcg gtc aag aac 1109 Ser Gly Leu Arg Thr Thr Ser Thr Lys Thr Gly Glu Ala Val Lys Asn 265 270 275 atc cag gcc acc ctg ggg gcc tcc tca cag cgc atc agc cag aac tca 1157 Ile Gln Ala Thr Leu Gly Ala Ser Ser Gln Arg Ile Ser Gln Asn Ser 280 285 290 gag agc atg cac gac ctg gta ctc cag gtc atg ggc ttg cag ctg cag 1205 Glu Ser Met His Asp Leu Val Leu Gln Val Met Gly Leu Gln Leu Gln 295 300 305 310 ctg gat aac atc tcg tcc ttc ctg gat gac cac gaa gag aac atg cat 1253 Leu Asp Asn Ile Ser Ser Phe Leu Asp Asp His Glu Glu Asn Met His 315 320 325 gat ctt cag tac cat acc cac tac gcc cag aac cgc act gtg gag agg 1301 Asp Leu Gln Tyr His Thr His Tyr Ala Gln Asn Arg Thr Val Glu Arg 330 335 340 ttt gag tct ctg gaa gga cgc atg gct tct cac gag att gaa att ggc 1349 Phe Glu Ser Leu Glu Gly Arg Met Ala Ser His Glu Ile Glu Ile Gly 345 350 355 acc atc ttc acc aac atc aat gcc acc gac aac cac gtg cac agc atg 1397 Thr Ile Phe Thr Asn Ile Asn Ala Thr Asp Asn His Val His Ser Met 360 365 370 ctc aag tac ctg gat gac gtg cgg ctc tcc tgc acg ctg ggc ttc cac 1445 Leu Lys Tyr Leu Asp Asp Val Arg Leu Ser Cys Thr Leu Gly Phe His 375 380 385 390 acc cat gcc gag gag ctc tac tac ctg aac aag tct gtc tcc atc atg 1493 Thr His Ala Glu Glu Leu Tyr Tyr Leu Asn Lys Ser Val Ser Ile Met 395 400 405 ctg ggc acc aca gac ctg ctc cgg gag cgc ttc agc ctg ctc agt gcc 1541 Leu Gly Thr Thr Asp Leu Leu Arg Glu Arg Phe Ser Leu Leu Ser Ala 410 415 420 cgg ctg gac ctc aac gtc cgg aac ctc tcc atg atc gtg gag gag atg 1589 Arg Leu Asp Leu Asn Val Arg Asn Leu Ser Met Ile Val Glu Glu Met 425 430 435 aag gca gtg gac aca cag cat gga gaa atc ctt cgc aat gtc acc atc 1637 Lys Ala Val Asp Thr Gln His Gly Glu Ile Leu Arg Asn Val Thr Ile 440 445 450 cta cga ggt cac act ttg ttt tca cat aat cgg ata tga tatgaagcca 1686 Leu Arg Gly His Thr Leu Phe Ser His Asn Arg Ile 455 460 465 gccataaagc ccaggatgac caagaatata atttgaaaat gaatttgttt actatcctta 1746 atggtaagca tcaccttaag cacatattat gccttgagac actagccaat tgtggtacat 1806 gaaaataatt tataaataaa taaatttacc tatattagga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1866 aaaaaaaaaa a 1877 <210> 12 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Lys Val Arg Ser Ala Gly Gly Asp Gly Asp Ala Leu Cys Val Thr 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Ala Gly Asp Asp Glu Asp Met Pro Thr Phe Pro Cys 20 25 30 Thr Gln Lys Gly Arg Pro Gly Pro Arg Cys Ser Arg Cys Gln Lys Asn 35 40 45 Leu Ser Leu His Thr Ser Val Arg Ile Leu Tyr Leu Phe Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Leu Val Ala Val Ala Val Leu Ala Ser Leu Val Phe Arg Lys Val 65 70 75 80 Asp Ser Leu Ser Glu Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Ile Tyr Asp Lys 85 90 95 Lys Leu Val Leu Met Gln Lys Asn Leu Gln Gly Leu Asp Pro Lys Ala 100 105 110 Leu Asn Asn Cys Ser Phe Cys His Glu Ala Gly Gln Leu Gly Pro Glu 115 120 125 Ile Arg Lys Leu Gln Glu Glu Leu Glu Gly 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ggagggctgt ggcagagcca 1991 Pro Pro Gly Ser Gln Ser Phe Tyr 530 535 ctgtcacaca gaatgccgga ggggcgcaga gcagatccag gccccagaaa gcctcaccta 2051 cagacagctg tggtcctctg attccaatga gggggctccc cagggctgac cctgcagctt 2111 tgggctcccc catagtgact gtgccatagg aaagcagccc ctcctcacac atacatgtgc 2171 acatgcacac acatgcatgc acacacatgc acacatacac gcacatgcac acatacacat 2231 gcatgcacac atacacaggc atacatgcat gcacacayac atatgcacgc acacacacat 2291 gcacacatac acgtgcacac atacacaggc acacatgcat gcacacatac acatgcacac 2351 acacatgcac acatatatgc acaggcacac acatgtatgc acacacacat gcaccgcaca 2411 catatccatg cacacaaaca catatataca catgcacata cacagatttt tctgctggcc 2471 aggtgggcca actgggtttc ccctggctgg gcaggaggag agggcagagg aagaccccct 2531 ctcctgtgac tgagcctgcc agggaggcag ctacctcggg aggaaggtct cacatctgtc 2591 tttgggcacc catgctggcc agcagtttcc cagggctccc tggggttgaa aagccccaag 2651 gaaacctttg cgggtggggc gttactgcca aaactccaga ggcaaagtgg acctggcaac 2711 cacaagaccc tccccataag caggggacca gcagacccgg gagctgtccc ctgtctgtca 2771 cagcacagtg 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<210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 29 gccaagacct gccctgtg 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 30 gtgaggctcc cctttctt 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe sequence <400> 31 ccctatgagc cgcctgag 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 32 gttccttgtg gagccggagc 20 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 33 gggtacaaga tccaggtc 18 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe sequence <400> 34 ggcccgtgag cgatggaac 19 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 35 ctgtgactcg gggacgcc 18 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(19) <400> 36 aatcgcccag catcacgtc 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe sequence <400> 37 ctgaacatga aggagctgaa 20 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 38 acgaacgagc ccagcacc 18 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(19) <400> 39 gagctggatg ttgagcagg 19 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe sequence <400> 40 cgcagtcagg cagagggt 18 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(19) <400> 41 ctgcagtgtt ctgcacagc 19 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 42 cgaactgtgt cagctgaacc 20 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe sequence <400> 43 ccgcacgcta tggctgaca 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(19) <400> 44 cggctgcatc tgttggtgt 19 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 45 cttaacatac tcagcataac g 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe sequence <400> 46 tttgtaagtg tccccgttcc 20

【０１８３】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＣＳＲのスプライシング変異体であるＣＳ
Ｒ１、ＣＳＲ２及びＣＳＲ３のタンパク一次構造の差異
を模式的例示を示す図。Ａ、Ｂ、Ｂ''、Ｃ、Ｄ、Ｅ、
Ｅ''及びＦは、エキソンユニットを表し、各エキソンユ
ニットに付した数字は、当該エキソンをコードするＤＮ
Ａのおよその塩基数を示す。

【図２】ヒトＣＳＲ１及びＣＳＲ２のタンパク２次構造
を模式的に示す図。図中の数字は、Ｎ末端から計数した
場合のアミノ酸の番号を示す。

【図３】マクロファージスカベンジャー受容体のタンパ
ク２次構造を模式的に示す図。

【図４】ヒトＣＳＲ１のタンパク一次構造を示す図。ア
ミノ酸下段の記号（●、＊及び＃）は、各々、糖鎖結合
部位（●）、リン酸化部位（＊）、及びαヘリカルコイ
ルドコルドメイン（＃）の推定位置を示す。

【図５】図５（ａ）は、ＦＩＳＨ法により分析した、ヒ
トＣＳＲ遺伝子のヒト染色体上の位置を示す図。なお、
矢印の先の２つの白点（約0.3mm）部分がＣＳＲ遺伝子
が存在する８ｑ２１サイトを示す。図５（ｂ）は、細胞
分裂中期ヒト細胞の染色体のＲ分染核型上でのマッピン
グを示す図。

【図６】ノーザンブロッティングにより分析した、種々
ヒト組織でのヒトＣＳＲのｍＲＮＡの発現状態を示す
図。

【図７】ｐ５３タンパクによるＣＳＲ遺伝子の発現調節
の有無の分析試験における、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅した
ＣＳＲｃＤＮＡのゲル電気泳動状態を示す図。Ｗは、天
然型ｐ５３遺伝子で形質転換したヒト結腸癌細胞SW480
を用いた試験結果を、またＭは、変異型ｐ５３遺伝子で
形質転換した該SW480を用いた試験結果を示す。なお、
上段の数字は、ＲＮＡを取得した経時的時間を示す。

【図８】各種細胞でのＣＳＲ遺伝子の発現状態の分析に
おける、ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅によるＣＳＲｃＤＮ
Ａのゲル電気泳動状態を示す図。レーン１は、宿主細胞
として正常ヒト線維芽細胞NHDF4042を用いた試験結果
を、レーン２は宿主細胞としてヒト子宮頸癌由来上皮様
細胞Helaを用いた試験結果を、レーン３は宿主細胞とし
てヒト肺癌細胞H1299を用いた試験結果を、レーン４は
宿主細胞としてヒト食道癌細胞TE10を用いた試験結果
を、レーン５は宿主細胞としてヒト神経グリア芽腫細胞
T98Gを用いた試験結果を、レーン６は宿主細胞としてヒ
ト神経グリア芽腫細胞U87MGを用いた試験結果を、レー
ン７は宿主細胞としてヒト腫瘍細胞SKBR3を用いた試験
結果を、並びにレーン８はヒト結腸癌細胞SW480を用い
た試験結果を示す。また、Ｗは、天然型ｐ５３を発現す
る細胞であることを示し、またＭは、変異型ｐ５３遺伝
子を発現する細胞であることを示す。

【図９】血清飢餓ストレスによるＣＳＲ遺伝子の転写調
節の有無の分析試験における、ノーザンブロッティング
によるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を示す図。分図は、各
々ヒト正常線維芽細胞NHDF4042、ヒト結腸癌細胞SW48
0、ヒト神経グリア芽腫細胞T98G、及びヒト食道癌細胞T
E13を用いた試験結果を示す。なお、プラス（＋）及び
マイナス（−）は、各々血清飢餓ストレスを与えた場合
と与えなかった場合の結果を示す。

【図１０】紫外線照射ストレスによるＣＳＲ遺伝子の転
写調節の有無の分析試験における、ノーザンブロッティ
ングによるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を示す図。図上段
の数字は、紫外線照射の強さを示す。

【図１１】過酸化水素ストレスによるＣＳＲ遺伝子の転
写調節の有無の分析試験における、ノーザンブロッティ
ングによるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を示す図。図上段
の数字は、過酸化水素の濃度を示す。

【図１２】熱ショックストレスによるＣＳＲ遺伝子の転
写調節の有無の分析試験における、ノーザンブロッティ
ングによるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を示す図。図上段
の数字は、熱ショックを与えてからの経時的時間を示
す。

【図１３】図１３（ａ）は、抗ＨＡエピトープポリクロ
ーナル抗体を用いて免疫細胞化学染色法により分析し
た、ＣＳＲタンパクの細胞質での分布を示す図。図１３
（ｂ）は、ＤＡＰＩによる染色法による核の位置を示す
図。

【図１４】紫外線照射ストレスに起因する細胞死に対す
るＣＳＲの抑制効果を示す図。

【図１５】過酸化水素ストレスに起因する細胞死に対す
るＣＳＲの抑制効果を示す図。

【図１６】図16(a)は、ヒトCSR1のタンパク一次構造を
示す図。図16(b)は、ヒトCSR2のタンパク一次構造を示
す図。図16(b)に記載のアミノ酸配列の左端の数字（45
1）は、ヒトCSR2タンパクの451番目のアミノ酸であるこ
とを意味し、アミノ酸番号１乃至450番目のアミノ酸は
図16(b)のヒトCSR1タンパクのアミノ酸番号１乃至450番
目のアミノ酸配列と同一であることを示す。アミノ酸下
段の記号（●、△、＊、○、及び＃）は、各々、casein
kinase2によるリン酸化部位（●）、protein kinase C
によるリン酸化部位（△）、tyrosine kinase 2による
リン酸化部位（＊）、ヘム結合部位（○）、及びミクロ
ボディー（ペルオキシソーム）Ｃ末端ターゲティングシ
グナル部位（＃）の推定の位置を示す。薄黒い四角で囲
った領域は、αヘリカルコイルドコルドメインの推定位
置を示す。空欄四角で囲った領域は、Ｎ末端の膜貫通領
域の推定上の位置を示す。楕円類似の四角で囲った部分
は、Ｎ結合糖鎖結合部位を示す。二重下線部は、ロイシ
ンジッパー構造の位置を示す（繰返されるロイシンは、
少し大きい文字で表記されている。）。太線の四角で囲
った領域は、G-X-Y繰返し構造を有するコラーゲン様ド
メインを示す。

【図１７】ヒトＣＳＲタンパクをコードするゲノミック
ＤＮＡの構造、並びにスプライシング変異体であるＣＳ
Ｒ１タンパク及びＣＳＲ２タンパクの一次構造の差異を
模式的に示す図。黒い縦方向の領域１、２、３、４、
５、６’及び６”は、エキソンユニットを表す。また、
図中に示される塩基配列は、ｐ５３タンパク結合領域
が、第２イントロン中に存在することを示す。

【図１８】ｐ５３タンパクによるＣＳＲ遺伝子の発現調
節の有無の分析のためのEMSA試験における、各種条件で
の形質転換体の核抽出物のゲル電気泳動状態を示す図。

【図１９】各種細胞でのＣＳＲ遺伝子の発現状態の分析
における、ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅によるＣＳＲｃＤ
ＮＡのゲル電気泳動状態を示す図。

【図２０】図２０(a)は、紫外線照射ストレスによるＣ
ＳＲ遺伝子の転写調節の有無の分析試験における、ノー
ザンブロッティングによるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を
示す図。図上段の数字は、紫外線照射の強さを示す。図
２０(b)は、過酸化水素ストレスによるＣＳＲ遺伝子の
転写調節の有無の分析試験における、ノーザンブロッテ
ィングによるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を示す図。図上
段の数字は、過酸化水素の濃度を示す。

【図２１】アドリアマイシン（ADR）によるＣＳＲ遺伝
子の転写調節の有無の分析試験における、ノーザンブロ
ッティングによるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を示す図。
図上段の数字は、アドリアマイシンの濃度を示す。

【図２２】紫外線照射及び過酸化水素により与えられる
細胞内ストレスによるＣＳＲ遺伝子の転写誘導に対する
抗酸化剤の効果の分析試験における、ノーザンブロッテ
ィングによるＣＳＲｍＲＮＡの発現状態を示す図。図
中、「-NAC」はNAC存在下での前培養を行わない場合の
結果示し、また「+NAC」はNAC存在下での前培養を行っ
た場合の結果示す。また、「−」及び「ＵＶ」は、各
々、紫外線照射を行わなかった場合の結果、及び紫外線
照射を行った場合の結果を示す。同様に、「−」及び
「H₂O₂」は、各々、過酸化水素によるストレスを与えな
かった場合の結果、及び過酸化水素によるストレスを与
えた場合の結果を示す。

【図２３】種々の試薬によるＣＳＲ遺伝子の発現調節の
有無の分析試験における、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅したＣ
ＳＲｃＤＮＡのゲル電気泳動状態を示す図。図23(a)はD
EMを用いた場合の結果を、図23(b)はPMA(TPA)を用いた
場合の結果を、図3(c)はSodium azideを用いた場合の結
果を、図23(d)はSodium arseniteを用いた場合の結果
を、図23(e)はGSNOを用いた場合の結果を、及び図23(f)
はSNPを用いた場合の結果を示す。

【図２４】Hemin及び過酸化水素による種々の遺伝子の
発現調節の有無の分析における、ＲＴ−ＰＣＲ法による
増幅による種々ｃＤＮＡのゲル電気泳動状態を示す図。
図24(a)は、Heminによる遺伝子の経時的発現誘導の有無
を示す、また図24(b)は過酸化水素による遺伝子の経時
的発現誘導の有無を示す。なお、上段の数字は、ＲＮＡ
を取得した経時的時間を示す。

【図２５】図25(a)は、CSRcDNAを有しない空の発現ベク
ターで形質転換された細胞を、抗ＨＡエピトープポリク
ローナル抗体を用いて免疫細胞化学染色法により分析し
た、ＣＳＲタンパクの細胞質での分布を示す図。図25
(b)は、ＤＡＰＩによる染色法によるCSRcDNAを有しない
空の発現ベクターで形質転換された細胞の核の位置を示
す図。図25(c)は、CSRcDNAを発現する発現ベクターで形
質転換された細胞を、抗ＨＡエピトープポリクローナル
抗体を用いて免疫細胞化学染色法により分析した、ＣＳ
Ｒタンパクの細胞質での分布を示す図。図25(d)は、Ｄ
ＡＰＩによる染色法によるCSRcDNAを発現する発現ベク
ターで形質転換された細胞の核の位置を示す図。図25
(e)は、CSRcDNAを発現する発現ベクターで形質転換され
た細胞を、抗ゴルジ-58Kタンパク抗体を用いて免疫細胞
化学染色法により分析した、ＣＳＲタンパクの細胞質で
の分布を示す図。図25(f)は、ＤＡＰＩによる染色法に
よるCSRcDNAを発現する発現ベクターで形質転換された
細胞の核の位置を示す図。図25(g)は、過酸化水素によ
る酸化ストレスを与えたCSRcDNAを発現する発現ベクタ
ーで形質転換された細胞を抗ゴルジ-58Kタンパク抗体を
用いて免疫細胞化学染色法により分析した、ＣＳＲタン
パクの細胞質での分布を示す図。図25(h)は、ＤＡＰＩ
による染色法による過酸化水素による酸化ストレスを与
えたCSRcDNAを発現する発現ベクターで形質転換された
細胞の核の位置を示す図。

【図２６】紫外線照射ストレスに起因する細胞死に対す
るＣＳＲタンパクの抑制効果を示す図。

【図２７】フローサイトメーターにより測定した、細胞
内での反応性酸素種の量の変化を表わす図。図27(a)
は、対照であるH1299-vector群での反応性酸素種の量の
変化示す図。図27(b)は、H1299-CSR1群での反応性酸素
種の量の変化を示す図。図27(c)は、H1299-CSR2群での
反応性酸素種の量の変化を示す図。図27(d)は、CSR1/CS
R2群での反応性酸素種の量の変化を示す図。

【図２８】過酸化水素により誘導される細胞の形態の経
時的変化を示す図。図28(a)は、過酸化水素を加えない
場合のH1299-vector群の細胞の形態を示す図。図28(b)
は、過酸化水素を加えた直後のH1299-vector群の細胞の
形態を示す図。 図28(c)は、過酸化水素を加えて１時
間培養した後のH1299-vector群の細胞の形態を示す図。
図28(d)は、過酸化水素を加えて３時間培養した後のH12
99-vector群の細胞の形態を示す図。図28(e)は、過酸化
水素を加えない場合のCSR1/CSR2群の細胞の形態を示す
図。図28(f)は、過酸化水素を加えた直後のCSR1/CSR2群
の細胞の形態を示す図。図28(g)は、過酸化水素を加え
て１時間培養した後のCSR1/CSR2群の細胞の形態を示す
図。図28(h)は、過酸化水素を加えて３時間培養した後
のCSR1/CSR2群の細胞の形態を示す図。

【図２９】マウスCSR遺伝子ノックアウトマウス作製の
ためのターゲティングベクターの構造を模式的に示す
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１０に記載されるアミノ酸配列
   を有するタンパクをコードするＤＮＡ及びその断片。
2. 【請求項２】 配列番号１２に記載されるアミノ酸配列
   を有するタンパクをコードするＤＮＡ及びその断片。
3. 【請求項３】 配列番号１４に記載されるアミノ酸配列
   を含むタンパクをコードするＤＮＡ及びその断片。
4. 【請求項４】 配列番号９に記載される塩基配列の塩基
   番号２７６乃至２０９６の塩基配列を有するＤＮＡ及び
   その断片。
5. 【請求項５】 配列番号１１に記載される塩基配列の塩
   基番号２７６乃至１６７６の塩基配列を有するＤＮＡ及
   びその断片。
6. 【請求項６】 配列番号１３に記載される塩基配列の塩
   基番号３６４乃至１９７１の塩基配列を含むＤＮＡ及び
   その断片。
7. 【請求項７】 配列番号９、配列番号１１または配列番
   号１３のいずれかに記載される塩基配列を有するＤＮＡ
   にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
   Ａ。
8. 【請求項８】 配列番号１０に記載されるアミノ酸配列
   若しくは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
   を有するタンパク並びにそれらの断片。
9. 【請求項９】 配列番号１２に記載されるアミノ酸配列
   若しくは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
   を有するタンパク並びにそれらの断片。
10. 【請求項１０】 配列番号１４に記載されるアミノ酸配
    列若しくは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
    列を含むタンパク並びにそれらの断片。
11. 【請求項１１】 請求項１乃至請求項７のいずれかに記
    載のＤＮＡ若しくはその断片を含む発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の発現ベクターで形質
    転換された形質転換細胞。
13. 【請求項１３】 請求項８乃至請求項１０のいずれかに
    記載のタンパクまたはその断片に反応性を有する抗体ま
    たは該抗体の一部。
14. 【請求項１４】 抗体が、モノクローナル抗体であるこ
    とを特徴とする請求項１３記載の抗体または該抗体の一
    部。
15. 【請求項１５】 請求項１３または請求項１４記載の抗
    体若しくは該抗体の一部及び薬学的に許容され得る担体
    を含んでなる医薬組成物。
16. 【請求項１６】 請求項８乃至請求項１０のいずれかに
    記載のタンパクまたはその断片に反応性を有するモノク
    ローナル抗体を産生する細胞。
17. 【請求項１７】 該細胞が、モノクローナル抗体を産生
    する能力を有する非ヒト哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動
    物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞
    であることを特徴とする請求項１６に記載の細胞。
18. 【請求項１８】 該細胞が、該モノクローナル抗体の重
    鎖をコードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤ
    ＮＡのいずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細
    胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換
    え細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の細
    胞。