CN105219839A - 一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其包括以下步骤：根据β-酪蛋白基因的碱基序列，设计出能够使A1型β-酪蛋白基因的扩增片段内含有TaqI酶切位点而不能使A2β-酪蛋白基因的扩增片段产生TaqI酶切位点的引物，利用该引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增，利用限制性内切酶TaqI对扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，含有A1β-酪蛋白的扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp的片段和一个35bp的小片段；A2β-酪蛋白基因的扩增产物不会产生TaqI酶切位点，则无法被TaqI切开，仍为253bp的条带。本发明提供的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为含有A2型β-酪蛋白的牛奶。

Description

一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法。

背景技术

牛奶中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两种。酪蛋白在牛奶蛋白中的含量约占80％左右，乳清蛋白约占14％。牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白，αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25～35％。

β-酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基酸组成，因此分为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G。目前大多数养殖奶牛生产的β-酪蛋白，主要为A1和A2两种类型。A1和A2型β-酪蛋白之间的主要区别是第67位氨基酸不同，A1β-酪蛋白的67位是组氨酸(密码子为CAT)，A2β-酪蛋白在同一位置是脯氨酸(密码子为CCT)。

在生物体内，β-酪蛋白会水解产生一类由4-11个氨基酸组成，起始氨基酸为酪氨酸的多肽β-酪啡肽，BCM7(Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-Ile)就是从这类多肽中分离出来的一种类似吗啡的活性肽，它能够刺激淋巴T细胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由A1-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下产生，这是由于A2-酪蛋白67位脯氨酸与其相邻的66位和68位的氨基酸有比较稳定的二级结构，而A1-酪蛋白67位组氨酸与邻近氨基酸的二级结构不稳定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症以及一些精神方面的疾病。

A1型β-酪蛋白的摄入与人类疾病之间的关系主要基于流行病学研究，A1型β-酪蛋白与相关疾病的危险因素数据和死亡数据主要来源于世界卫生组织(WHO)。新西兰流行病学证据表明A2牛奶比A1牛奶更有益于人类健康。McLachlan对16个国家30-69岁的男性中A1牛奶与心脏病发病率进行了调查，统计结果表明，缺血性心脏病与A1牛奶的消耗有很强的关联性(s＝0.86)。Elliott比较了10个国家0-14岁儿童I型糖尿病的发病率，A1型β-酪蛋白与其有较大的关联性(s＝0.726)，在冰岛，由于当地的奶牛主要为A2奶牛，所以该地糖尿病和心脏病的发病率很低。动物学实验也表明表明，喂养A1牛奶的兔子与喂养A2牛奶的兔子相比，胆固醇和血脂水平更高。

因此，需要找到一种能够有效区分A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法，从而使得养殖场只繁育A2奶牛，保证我们喝的牛奶为A2牛奶。但目前的检测方法无法检测出β-酪蛋白不同的基因型，不能保证人们喝的牛奶为A2牛奶。

发明内容

鉴于目前还没有一种有效检测奶牛β-酪蛋白基因型的方法存在，本发明提供一种检测出β-酪蛋白不同的基因型的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：

根据β-酪蛋白的碱基序列，设计可以扩增出TaqI酶切位点的引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’CCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATCG3’；

下游引物：5’CATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGCCT3’

利用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增，扩增出的A1型β-酪蛋白基因片段中产生一个TaqI酶切位点；

利用限制性内切酶TaqI对扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，含有A1型β-酪蛋白基因的扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp的片段和一个35bp的小片段，共两条基因条带；含有A2β-酪蛋白的扩增产物则无法被TaqI切开，仍为一条253bp的基因条带。

作为优选方案，所述PCR扩增具体包括如下操作：所述PCR扩增具体包括如下操作：取DNA模板1ul(45～55ng/ul)，加入0.1U/ul的热启动TaqDNA聚合酶0.5～1.0ul、2.5uM的dNTP0.5～1.5ul、10uM的上、下游引物各0.5～1.5ul、2×PCRBuffer8～12ul、加双蒸水至20ul得PCR扩增体系，将所述扩增体系加热至92～95℃预变性5min，然后92～95℃变性15s、52～65℃退火25～35s、68～72℃延伸25～35s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行30～45次循环后，在68～72℃再延伸4～10min。所述2×PCRBuffer由pH为8.5的tris-HCl、氯化钾和氯化镁组成的缓冲液，所述缓冲液中，所述tris-HCl的浓度为20mM、氯化钾的浓度为100nM，氯化镁的浓度为3nM。

作为进一步优选方案，所述DNA模板的浓度为50ng/ul，加量为1ul，所述TaqDNA聚合酶的浓度为0.1U/ul，加量为0.5ul，上、下游引物的浓度为10uM，加量为1ul，所述2×PCRBuffer的加量为10ul，PCR扩增体系为20ul。所述预变性温度为95℃，时间为5min，所述变性温度为95℃，时间为15s，所述退火温度为61℃，时间为30s，所述延伸温度为72℃，时间为30s，所述循环次数为35次，所述再延伸温度为72℃，时间为7min。

作为优选方案，所述限制性内切酶TaqI的酶切包括如下操作：取PCR扩增产物5～13ul，加入限制性内切酶TaqI0.05～0.35ul，缓冲液0.5～1.5ul，加热至60～70℃孵育2～4h，升温至75～85℃热失活10～30min。

作为进一步优选方案，所述PCR扩增产物的加量为9ul，所述限制性内切酶TaqI的加量为0.2ul，所述缓冲液的加量为1ul，所述孵育的温度为65℃，时间为3h，所述热失活的温度为80℃，时间为20min。

本发明提供的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所得A1、A2及杂合型β-酪蛋白基因型扩增产物经酶切得到的基因条带的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

本发明中所用的奶牛基因组DNA样本采自黑白花奶牛的血液，用目录号为DP304的天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取步骤如下：

一、提取实验所需试剂和仪器

移液器和枪头、常温离心机、组织破碎仪、加热器或水浴、计时器、无水乙醇、2ml或1.5ml离心管。

二、准备工作

1)第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。

2)样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。

3)若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

4)将加热器或水浴调到所需温度(56℃，65℃，70℃)。

三、操作步骤

1、处理材料

血液：取200μl新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液于1.5ml离心管中，不足200μl可加缓冲液GA补足。(如需处理更大体积血液，如300μl-1ml，应在样品中加入3倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。)

2、加入20μlProteinaseK溶液，混匀。(若提取组织基因组，则加入ProteinaseK后，在56℃放置，每小时颠倒混合样品2-3次，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。)

3、加入200μl缓冲液GB，用手轻轻颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮(若没变清亮可适当延长加热时间)，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4、加入200μl无水乙醇，用手轻轻颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱CB3中(吸附柱预先放入2ml收集管中)，12000rpm离心30sec,弃废液，吸附柱放回收集管中。

6、向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃废液，吸附柱放回收集管中。

7、向吸附柱CB3中加入600μl缓冲液PW(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃废液，吸附柱放回收集管中。

8、重复第7步。

9、将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，弃废液。将吸附柱CB3于室温放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10、将吸附柱CB3转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱液TE(TE于65℃预热)，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

11、将上一步离心管中收集到的溶液重新滴加到吸附柱CB3吸附膜的中间部位，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

根据β-酪蛋白基因及其第67位氨基酸部位特殊的碱基序列，设计出能够使A1型β-酪蛋白基因扩增产物片段内含有TaqI酶切位点的引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’CCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATCG3’；

下游引物：5’CATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGCCT3’；备用

利用上述引物扩增出的A1型β-酪蛋白基因片段中产生一个TaqI限制性内切酶的酶切位点。

实施例1

利用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增：取DNA模板1ul(45ng/ul)，加入0.1U/ul的热启动TaqDNA聚合酶0.5ul、2.5uM的dNTP1ul、10uM的上、下游引物各0.5ul、2×PCRBuffer8ul、加双蒸水至20ul得PCR扩增体系，将所述扩增体系加热至95℃预变性5min，然后95℃变性15s、52℃退火35s、68℃延伸35s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行30次循环后，在68℃再延伸10min。

利用限制性内切酶TaqI对PCR扩增产物进行酶切：取PCR扩增产物5ul，加入限制性内切酶TaqI0.05ul，缓冲液0.5ul，在60℃孵育4h，在75℃热失活30min。

检测结果如图1所示，扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp片段和一个35bp小片段的为含有A1β-酪蛋白DNA的奶牛；扩增产物则无法被TaqI切开，仍为253bp条带的为含有A2β-酪蛋白DNA的奶牛。

实施例2

利用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增，取DNA模板1ul(50ng/ul)，加入0.1U/ul的热启动TaqDNA聚合酶1ul、2.5uM的dNTP1ul、10uM的上、下游引物各1ul、2×PCRBuffer10ul、加双蒸水至20ul得PCR扩增体系，将所述扩增体系加热至95℃预变性5min，然后95℃变性15s、61℃退火30s、72℃延伸30s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行35次循环后，在72℃再延伸7min。

利用限制性内切酶TaqI进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，取PCR扩增产物9ul，加入限制性内切酶TaqI0.2ul，缓冲液1ul，在65℃孵育3h，在80℃热失活20min。

检测结果如图1所示，扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp片段和一个35bp小片段的为含有A1β-酪蛋白DNA的奶牛；扩增产物则无法被TaqI切开，仍为253bp条带的为含有A2β-酪蛋白DNA的奶牛。

实施例3

利用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增，取DNA模板1ul(55ng/ul)，加入0.1U/ul的热启动TaqDNA聚合酶1.5ul、3uM的dNTP1.5ul、15uM/ul的上、下游引物各1.5ul、2×PCRBuffer12ul、加双蒸水至20ul得PCR扩增体系，将所述扩增体系加热至95℃预变性5min，然后92～95℃变性15s、65℃退火25s、72℃延伸25s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行45次循环后，在72℃延伸4min。

利用限制性内切酶TaqI进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，取PCR扩增产物13ul，加入限制性内切酶TaqI0.35ul，缓冲液1.5ul，在65℃孵育3h，在80℃热失活20min。

检测结果如图1所示，含有A1β-酪蛋白奶牛的DNA扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp片段和一个35bp小片段；含有A2β-酪蛋白奶牛的DNA扩增产物则无法被TaqI切开，仍为253bp条带；含有杂合型酪蛋白奶牛的DNA扩增产物在酶切之后会产生一个218bp片段和一个253bp条带，以及一个35bp小片段。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

根据β-酪蛋白基因的碱基序列，在β-酪蛋白基因第67位氨基酸编码序列附近设计可以扩增产生TaqI酶切位点的引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’CCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATCG3’；

下游引物：5’CATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGCCT3’；

利用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增，扩增出的A1型β-酪蛋白基因片段内部会产生一个TaqI酶切位点；扩增出的A2型β-酪蛋白基因片段内部不会产生TaqI酶切位点，则无法被TaqI切开，仍为253bp的条带。

利用限制性内切酶TaqI对扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，含有A1型β-酪蛋白基因的扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp的片段和一个35bp的小片段；含有A2型β-酪蛋白基因的扩增产物则无法被TaqI切开，仍为253bp的条带。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增具体包括如下操作：取DNA模板1ul，加入0.05～0.15U/ul的热启动TaqDNA聚合酶0.5～1.0ul、2～3uM的dNTP0.5～1.5ul、5～15uM的上、下游引物各0.5～1.5ul、2×PCRBuffer5～15ul、加双蒸水至15～35ul得PCR扩增体系，将所述扩增体系加热至92～95℃预变性5min，然后92～95℃变性15s、52～65℃退火25～35s、68～72℃延伸25～35s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行30～45次循环后，在68～72℃再延伸4～10min。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶TaqI的酶切包括如下操作：取PCR扩增产物5～13ul，加入限制性内切酶TaqI0.15～0.35ul，缓冲液0.5～1.5ul，加热至60～70℃孵育2～4h，升温至75～85℃热失活10～30min。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述DNA模板的浓度为45～55ng/ul，所述TaqDNA聚合酶的浓度为0.1U/ul，加量为0.5ul，上、下游引物的浓度为10uM，加量为1ul，所述2×PCRBuffer的加量为10ul，所述预变性温度为95℃，时间为2min，所述变性温度为95℃，时间为15s，所述退火温度为61℃，时间为30s，所述延伸温度为72℃，时间为30s，所述循环次数为35次，所述再延伸温度为72℃，时间为7min。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增产物的加量为9ul，所述限制性内切酶TaqI的加量为0.2ul，所述缓冲液的加量为1ul，所述孵育的温度为65℃，时间为3h，所述热失活的温度为80℃，时间为20min。