CN104910254B - 二肽Pro-Asp在促进动物肝细胞分泌IGF-1方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二肽Pro‑Asp在促进动物肝细胞分泌IGF‑1方面的应用。本发明公开的是二肽Pro‑Asp,而非Pro+Asp,能够促进动物肝细胞分泌IGF‑1,Pro‑Asp不仅能够在体外促进HepG2细胞和仔猪原代肝细胞分泌IGF‑1,还能够在体内促进小鼠肝细胞分泌IGF‑1。另外,本发明发现二肽Pro‑Asp在促进IGF‑1分泌方面,具有类似生长激素(GH)的作用,对于动物生长有一定的促进作用,可用作动物生长促进剂或饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明属于动物生长和代谢技术领域,具体涉及Pro-Asp对动物肝细胞分泌IGF-1的促进作用及其在动物生长和代谢中的应用。
背景技术
动物生长受到生长轴(GHRH-GH-IGF-1)的调控,如何促进肝脏IGF-1的分泌对于动物生长和代谢具有重要的意义。研究发现,日粮中不同营养物质对肝脏IGF-1的分泌有重要的影响。日粮蛋白经过消化后会形成一些含有2个氨基酸残基的肽,称为二肽。二肽不仅能为蛋白质合成提高氮骨架,发挥其营养性作用,还可参与动物的些生理活动,如促进矿物质元素的吸收利用、提高动物机体的免疫能力和促进瘤胃微生物的生长等,发挥其功能性作用,在动物生产实践中广泛应用。除了活体层面研究小肽功能外,小肽作为添加物处理细胞的试验也有报道。细胞培养基中添加肌肽和环二肽cyclo-[His-Pro] (CHP)均可以减缓缺血培养下PC12细胞的凋亡。
日粮经小肠消化进入肠道时,由于小肠的首过代谢作用和胞液中的肽水解酶分解作用,二肽进入肝脏中的种类和浓度会有所改变,有报道(LIU et al., 2014),二肽中连有脯氨酸(Pro)时,其稳定性升高,可以以一定浓度在血液中存在。另有报道,肝细胞凋亡的发生可能主要依赖于肝组织半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)活性的改变,抑制caspase-3能明显减轻肝损伤。Caspase-3为天冬氨酸(Asp)特异性半胱氨酸蛋白酶,其活性与天冬氨酸的浓度有关。L-谷氨酰胺(Gln)作为 DNA 和谷胱甘肽等合成的氮前体,在肝组织再生,肝细胞增殖的过程中扮演着极其重要的角色。但是,目前有关二肽Pro-Asp对动物肝细胞IGF-1分泌的影响尚未见研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供二肽Pro-Asp的一种新的生理功能,即二肽Pro-Asp(而非单体氨基酸Pro+Asp)能够促进动物肝细胞分泌IGF-1。另外,Pro-Asp在促进IGF-1分泌方面,具有类似生长激素(GH)的作用,因此可以应用于动物生长促进剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明公开了二肽Pro-Asp在促进动物肝细胞分泌IGF-1方面的应用,主要包括以下方面:
二肽Pro-Asp在作为或制备动物肝细胞分泌IGF-1的分泌促进剂方面的应用。
二肽Pro-Asp在作为或制备体外HepG2细胞或仔猪原代肝细胞分泌IGF-1的分泌促进剂方面的应用。
二肽Pro-Asp在作为或制备体内小鼠肝细胞分泌IGF-1的分泌促进剂方面的应用。
二肽Pro-Asp作为或制备HepG2细胞或仔猪原代肝细胞IGF-1 mRNA和蛋白的表达促进剂方面的应用。
二肽Pro-Asp在作为或制备JAK2-STAT5信号通路激活剂方面的应用,具体地,二肽Pro-Asp是作为或制备小鼠肝脏细胞p-JAK2和p-STAT5蛋白表达促进剂方面的应用。
二肽Pro-Asp在作为或制备促进动物肝细胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促进剂方面的应用,以及二肽Pro-Asp和生长激素GH联用在作为或制备促进动物肝细胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促进剂方面的应用;具体地,所述动物肝细胞为HepG2细胞。
二肽Pro-Asp在作为或制备动物生长促进剂或饲料添加剂方面的应用,优选地,所述动物为猪。
本发明经过大量实验研究发现,二肽Pro-Asp,而非Pro+Asp,能够促进动物肝细胞分泌IGF-1。Pro-Asp不仅能够在体外促进HepG2细胞和仔猪原代肝细胞分泌IGF-1,还能够在体内促进小鼠肝细胞分泌IGF-1。另外,本发明还发现二肽Pro-Asp在促进IGF-1分泌方面,具有类似生长激素(GH)的作用,对于动物生长有一定的促进作用,因此,可用作动物生长促进剂或饲料添加剂使用。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明提供了Pro-Asp的一种重要的新生理功能,首次公开了二肽Pro-Asp能够在体外促进HepG2细胞和仔猪原代肝细胞分泌IGF-1,同时能够在体内促进小鼠肝细胞分泌IGF-1。
(2)本发明提供了二肽Pro-Asp在促进动物肝细胞IGF-1分泌方面,具有类似生长激素(GH)的作用,可用作动物生长促进剂,具有很好的推广应用前景。
附图说明
图1为二肽Pro-Asp对HepG2细胞IGF-I分泌的影响。
图2为二肽Pro-Asp对仔猪肝原代细胞IGF-I分泌的影响。
图3为二肽Pro-Asp对HepG2细胞IGF-I mRNA表达的影响。
图4为二肽Pro-Asp对仔猪肝原代细胞IGF-I mRNA表达的影响。
图5为二肽Pro-Asp对HepG2细胞IGF-I mRNA表达及蛋白的影响。
图6为单体氨基酸Pro+Asp对HepG2细胞IGF-I mRNA表达的影响。
图7为二肽Pro-Asp对小鼠肝脏组织IGFs相关蛋白表达的影响。
图8为二肽Pro-Asp与生长激素(GH)对IGF-1表达的作用比较。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1二肽Pro-Asp(而非氨基酸单体Pro+Asp)促进动物肝细胞分泌IGF-1
1、实验方法
(1)采用含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养HepG2细胞,Hepato ZYME-SFM 无血清培养基培养仔猪原代肝细胞。
(2)分别用Pro-Asp(50、200、500 μM)和Pro+Asp(500 μM)处理上述HepG2细胞和仔猪原代肝细胞24h。
(3)收集细胞,提取RNA和蛋白,分别利用qPCR和western blot方法检测IGF-1mRNA和蛋白表达。
收集细胞上清,RIA或ELSIA方法检测细胞上清中IGF-1分泌量。
2、结果如附图1~6所示。结果表明,500 μM的Pro-Asp可显著提高HepG2细胞(图1)和仔猪原代肝细胞(图2)分泌IGF-1,同时显著促进HepG2细胞(图3)和仔猪原代肝细胞(图4)IGF-1 mRNA的表达,显著促进HepG2细胞(图5)IGF-1蛋白的表达。而单体氨基酸Pro+Asp则不具备Pro-Asp对肝细胞IGF-1分泌的促进作用(图6)。
实施例2 尾静脉注射二肽Pro-Asp对小鼠肝脏细胞IGF-1表达及信号通路的影响
1、实验方法
(1)动物饲养条件:1只/箱,单养;饲养温度与湿度:20~26 ℃,40~70% ;采用10h:14 h昼夜间断照明;饲养室条件始终保持稳定,以保证试验结果的可靠性。自由进食饮水,饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供;检疫:对购入SPF级C57BL BKS-DB小鼠预饲7 d。期间每日检查动物一次。
(2)动物分组及处理:将4周龄大的小鼠随机分为正常对照组、T1组和T2组,每组6只,共3组。正常对照组小鼠尾静脉注射生理盐水,T1组小鼠尾静脉注射纯度95%的 Pro-Asp100 mg/kg,T2组小鼠尾静脉注射Pro+Asp(45+51)mg/kg。小鼠处理30 min时开始采样。
(3)血液样品的采集:将处理后的小鼠迅速摘掉眼球取血,用2 mL离心管收集血液,静置待血液凝固后,3000 rpm/min离心15 min,收集血清,-80℃冰箱保存备用。血液中IGF-I含量采用试剂盒检测,具体方法参见试剂说明书。
(4)组织样品的采集:试验结束当天,采血完毕后颈椎脱臼处死小鼠,摘取肝脏、滤纸吸干,每只小鼠于固定位置剪一块组织样,放入2 mL离心管,迅速投入装有液氮的容器中,采样结束后转移样品至 -80 ℃冰箱中,保存备用。组织样品经总蛋白提取后,采用Western Blot方法检测IGF-I等相关基因蛋白水平的表达变化,综合分析Pro-Asp对小鼠肝脏分泌IGF-I的影响。
2、结果如附图7所示。由图7可知,小鼠尾静脉注射100 mg/kg Pro-Asp 30 min,Pro-Asp可以显著上调小鼠肝脏组织IGF-I的表达,同时显著提高p-JAK2和p-STAT5的蛋白表达,而单体氨基酸则无此促进作用。结果提示Pro-Asp通过激活JAK2-STAT5信号通路促进IGF-1蛋白的表达。
实施例3 Pro-Asp具有类似GH促进IGF-1分泌的作用
1、采用含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养HepG2细胞,分别用Pro-Asp(500 μM)或/和GH(20 nM)处理细胞24h,收集细胞,提取细胞蛋白, western blot方法分别进行IGF-1蛋白和相关信号通路蛋白的表达。
2、结果如附图8所示。图8表明,单独添加GH和Pro-Asp均能够显著促进JAK2和STAT5的磷酸化水平和IGF-1蛋白表达水平;与单独添加GH和Pro-Asp相比,同时添加二者同时能够显著促进JAK2和STAT5的磷酸化水平,但并不能显著升高IGF-1蛋白表达水平,提示Pro-Asp具有类似GH的作用。
综上所述,试验表明,二肽Pro-Asp(而非单体氨基酸Pro+Asp)能够促进动物肝细胞分泌IGF-1,且在促进IGF-1分泌方面,Pro-Asp具有类似生长激素(GH)的作用。
Claims (7)
1.二肽Pro-Asp在制备动物肝细胞分泌IGF-1的分泌促进剂方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述动物肝细胞是指体外HepG2细胞、仔猪原代肝细胞或体内小鼠肝细胞。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用是指二肽Pro-Asp在制备HepG2细胞或仔猪原代肝细胞IGF-1 mRNA和蛋白的表达促进剂方面的应用。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用是指二肽Pro-Asp在制备JAK2-STAT5信号通路激活剂方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述应用是指二肽Pro-Asp在制备小鼠肝脏细胞p-JAK2和p-STAT5蛋白表达促进剂方面的应用。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用是指二肽Pro-Asp在制备促进动物肝细胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促进剂方面的应用。
7.二肽Pro-Asp在作为或制备动物生长促进剂方面的应用。
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