TWI525193B

TWI525193B - 反式－肉桂醛之應用

Info

Publication number: TWI525193B
Application number: TW103143240A
Authority: TW
Inventors: 邱紫文; 韓鴻志; 林欣榮; 卡爾斯亞亞尼瑞家馬尼; 林怡均
Original assignee: 國璽幹細胞應用技術股份有限公司
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2016-03-11
Also published as: TW201615830A; CN111004779A; CN111019890A; JP6466484B2; CN111004779B; CN105779380B; WO2016061888A1; CN105779380A; CN111019890B; JP2017521406A

Description

反式-肉桂醛之應用

本發明係關於反式-肉桂醛之應用，尤其關於反式-肉桂醛於幹細胞之應用，包括抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化，以及幹細胞治療。

幹細胞依其自我更新(self-renew)及分化的能力，可分成全能(totipotent)幹細胞、多能(pluripotent)幹細胞、多潛能(multipotent)幹細胞、及單效性(unipotent)幹細胞。依幹細胞發育過程中出現的先後順序以及分布的情形，可將其大致分成胚胎幹細胞(embryonic stem cell，ES cells)及成體幹細胞(adult stem cell)二類。經研究證實，細胞的分化是可逆的，透過將特定基因送入已完全分化的成熟體細胞(somatic cells)，誘導成熟體細胞重新編程(reprogram)為多能細胞，表現出胚胎幹細胞的特性及功能，即為誘導型多能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)，這些誘導型多能幹細胞可分化成為身體的組織而可用於疾病的研究與治療。

在現今的醫學研究領域中，幹細胞療法為許多缺乏有效的治療方法的疾病帶來希望。此等疾病包括，例如：糖尿病、自體免疫排斥、中風、心肌梗塞、腎衰竭、白血病、肌肉萎縮症、重度貧血、阿茲海默症、帕金森氏症、癌症等，幹細胞所具有的多能性(pluripotency)於再生醫學上的應用，可能解決這些疾病在治療上長期面臨的困境。

將幹細胞移植至體內以進行幹細胞治療的成功與否，係取決於幹細胞的品質。其中，幹細胞品質的降低包括例如受到各種壓力訊息影響而引起的細胞老化(cellular senescence)，導致幹細胞的細胞週期停滯以及增生速率下降，造成組織修復、組織再生、及一般更新(turnover)所必須的幹細胞或祖細胞的缺乏，此乃造成幹細胞治療成效不彰的主要原因之一。因此，若能有效抗幹細胞老化，則可提升幹細胞治療的成功率。

本發明即係針對前述需求所為之研發成果，本案發明人研究發現，反式-肉桂醛(trans-cinnamaldehyde，TC)可有效抗幹細胞老化，甚至可使幹細胞年輕化，故可用於幹細胞治療，提升細胞治療效益。

本發明之一目的，在於提供一種抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化的方法，其係包含以反式-肉桂醛(trans-cinnamaldehyde，TC)處理該幹細胞。較佳地，係於幹細胞培養液中以約0.1至約50微克/毫升之反式-肉桂醛處理幹細胞。

本發明之另一目的，在於提供一種用於抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化的組合物，其係包含反式-肉桂醛。

本發明之另一目的，在於提供一種使用反式-肉桂醛於製造一製劑之用途，該製劑係用於抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化。較佳地，該製劑係一保健食品或藥劑。

本發明之又一目的，在於提供一種套組，其係用於幹細胞治療且包含：(1)一第一部分，包含一幹細胞；(2)一第二部分，包含反式-肉桂醛；以及(3)幹細胞培養液，存在於一第三部分及/或該第一部分及/或第二部分中。其中，於使用該套組時，係先於該幹細胞培養液中以反式-肉桂醛處理該幹細胞，再使用該經處理之幹細胞於幹細胞治療中。

本發明之再一目的，在於提供一種幹細胞治療方法，其中係對一有需要之個體投予一有效量之幹細胞，該幹細胞係經反式-肉桂醛預處理。

本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

第1A圖及第1B圖係顯示經不同處理後之脂肪幹細胞之表面抗原表現情形的流式細胞儀分析結果圖；第2A圖至第2C圖所示為利用成骨(osteogenic)分化試驗，分析經不同處理後，脂肪幹細胞的成骨分化能力；第2D圖至第2F圖所示為利用脂向(adipogenic)分化試驗，分析經不同處理後，脂肪幹細胞的脂向分化能力；第2G圖所示為經不同處理後成骨分化之脂肪幹細胞的相對細胞數，其中縱軸代表於450奈米波長之吸光值，橫軸代表經不同處理之各組脂肪幹細胞(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；第2H圖所示為經不同處理後脂向分化之脂肪幹細胞的相對細胞數，其中縱軸代表於510奈米波長之吸光值，橫軸代表經不同處理之各組脂肪幹細胞(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；第3A至3C圖係顯示經不同處理後，脂肪幹細胞之增生速率的Ki67染色照片圖；第4A圖所示為利用SA-β-gal活性試驗，分析經不同濃度之反式-肉桂醛處理後，脂肪幹細胞中SA-β-gal的活性，其中縱軸代表SA-β-gal活性百分比，橫軸代表經不同處理之各組脂肪幹細胞(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；第4B圖所示為利用SA-β-gal活性試驗，分析先以H₂O₂誘導老化再經不同處理後，脂肪幹細胞中SA-β-gal的活性，其中縱軸代表 SA-β-gal活性百分比，橫軸代表經不同處理之各組脂肪幹細胞(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；4C至4E圖係顯示經不同處理後，脂肪幹細胞中SA-β-gal的活性的照片圖；第5A所示為利用定量反轉錄聚合酶鍊鎖反應(quantative RT-PCR)，分析經不同濃度之反式-肉桂醛處理後，脂肪幹細胞中SIRT1基因的表現程度，其中縱軸代表SIRT1基因的表現倍數，橫軸代表經不同處理之各組脂肪幹細胞(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；第5B圖所示為利用定量反轉錄聚合酶鍊鎖反應，分析先以H₂O₂誘導老化再經不同濃度之反式-肉桂醛處理，脂肪幹細胞中SIRT1基因的表現程度，其中縱軸代表SIRT1基因的表現倍數，橫軸代表經不同處理之各組脂肪幹細胞(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；第5C圖所示為利用定量反轉錄聚合酶鍊鎖反應，分析經不同處理後，脂肪幹細胞中SIRT1基因的表現程度，其中縱軸代表SIRT1基因的表現倍數，橫軸代表經不同處理之各組脂肪幹細胞(ns表示：P value為0.417，不具顯著差異)；第6A圖及第6B圖分別係顯示分析經不同處理後，脂肪幹細胞中老化相關基因、細胞週期調控相關基因、及多能性相關基因之表現程度的半定量反轉錄聚合酶鍊鎖反應(semiquantative RT-PCR) 照片圖及統計直條圖；第7圖係顯示經不同處理後，脂肪幹細胞中端粒酶活性的統計直條圖，其中縱軸代表端粒酶活性，橫軸代表經不同處理之各組細胞(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；第8A至8C圖係顯示經不同處理後，人類骨髓間質幹細胞中SA-β-gal的活性的照片圖；第8D圖所示為利用SA-β-gal活性試驗，分析經不同處理後，人類骨髓間質幹細胞中SA-β-gal的活性，其中縱軸代表SA-β-gal活性百分比，橫軸代表經不同處理之各組人類骨髓間質幹細胞(***表示：P value小於0.05，具顯著差異)；第9A至9C圖係顯示經不同處理後，華頓氏凝膠幹細胞中SA-β-gal的活性的照片圖；第9D圖所示為利用SA-β-gal活性試驗，分析經不同處理後，華頓氏凝膠幹細胞中SA-β-gal的活性，其中縱軸代表SA-β-gal活性百分比，橫軸代表經不同處理之各組華頓氏凝膠幹細胞(***表示：P value小於0.05，具顯著差異)；第10A及第10B圖所示分別為利用定量反轉錄聚合酶鍊鎖反應，分析經不同處理後，人類骨髓間質幹細胞及華頓氏凝膠幹細胞中SIRT1基因的表現程度，其中縱軸代表SIRT1基因的表現倍數，橫軸代表經不同處理之各組幹細胞(***表示：P value小於0.05，具顯著差異)；第11A係顯示「TAA」大鼠(即，肝臟纖維化大鼠)之肝臟纖維化情形的梅生三色染色(Masson’s trichrome staining)照片圖；第11B圖係顯示「TAA」大鼠(即，肝臟纖維化大鼠)之肝臟發炎情形的蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin Staining，H&E Staining)照片圖；第12A至第12E圖所示為利用α-胎兒蛋白(α-feto protein，AFP)免疫組織染色法，分析經不同處理後第7天之大鼠的肝臟組織切片的照片圖；第12F至第12J圖所示為利用α-胎兒蛋白(α-feto protein，AFP)免疫組織染色，分析經不同處理後第14天之大鼠的肝臟組織切片的照片圖；第13A及第13B圖係顯示經不同處理後不同時間之大鼠的肝臟纖維化情形的梅生三色染色照片圖；第13C及第13D圖係顯示經不同處理後不同時間之大鼠的肝臟發炎情形的蘇木精-伊紅染色照片圖；第14A及第14B圖分別係顯示經不同處理後不同時間之大鼠的肝臟纖維化分數及活性分數的統計直條圖(***表示：P value小於0.01，具顯著差異)；以及第15A至15E圖分別係顯示經不同處理後不同時間之大鼠肝臟的GPT表現量、GOT表現量、白蛋白表現量、凝血酶原時間、及總膽紅素表現量的統計直條圖(***表示：P value小於0.01，具顯著差異；**表示：P value小於0.05，具顯著差異)。

以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之病情的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。

現代醫學已廣泛使用幹細胞，此等應用包括：治療自體免疫疾病(例如糖尿病、自體免疫排斥)、治療消化道疾病(例如肛門/消化道瘻管)、治療肝臟疾病(例如肝硬化、肝纖維化)、治療腎臟疾病(例如腎衰竭)、治療心血管疾病(例如中風、心肌梗塞)、治療神經系統疾病(例如阿茲海默氏症、帕金森氏症)、治療血液性疾病(例如白血病)、治療骨骼退化(例如退化性關節炎、膝軟骨退化)、治療牙周病、治療肌腱發炎、治療脊椎損傷、治療頭部創傷、整形手術(例如偏側萎縮、下陷型疤痕)、禿頭、皮膚美白、及/或去除皺紋。此可參見例如：Stem cells：innovations in clinical applications.Stem Cells int.Volume 2014,Article ID 516278,9 pages，該文獻全文併於此處以供參考。

然而，幹細胞經過數個世代的繼代培養及/或移植至體內後，因各種壓力訊息所導致的細胞老化會影響幹細胞治療的效益。此可參見例如：Replicative senescence-associated gene expression changes in mesenchymal stromal cells are similar under different culture conditions.Haematologica.95(6)：867-74(2010)，該文獻全文併於此處以供參考。經研究證實，幹細胞的老化會伴隨著以下幾種作用：幹細胞增生速率下降、幹細胞中老化相關β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal)的活性增加、幹細胞中SIRT1基因的表現減少、以及幹細胞中端粒酶的活性降低。亦經證實，若能逆轉及/或回復上述作用，即可有效抗幹細胞老化，有利於幹細胞於疾病治療之應用。前述可參見例如：Four faces of cellular senescence.J Cell Biol.192(4)：547-556(2011)、A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.92(20)：9363-9367(1995)、SIRT1 overexpression antagonizes cellular senescence with activated ERK/S6k1 signaling in human diploid fibroblasts.PLoS One.5；3(3)：e1710(2008)、Aging,tumor suppression and cancer：high wire-act！Mech Ageing Dev.126(1)：51-8(2005)、以及Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.Nature.345(6274)：458-460(1990)，該等文獻之全文併於此處以供參考。

本案發明人研究發現，對於已呈現增生速率下降、SA-β-gal的活性增加、SIRT1基因的表現減少、以及端粒酶的活性降低等現象的老化幹細胞，若以反式-肉桂醛處理該幹細胞，可有效逆轉及/或回復幹細胞中之前述作用。進一步研究發現，反式-肉桂醛甚至可以有效降低一般幹細胞(即，未老化之幹細胞)中的SA-β-gal活性、增加一般幹細胞中SIRT1基因的表現。

因此，本發明係關於抗幹細胞老化以及使幹細胞年輕化的發現及應用，包括提供抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化之組合物、製劑、及方法。其中，該製劑的製造係使用反式-肉桂醛，該組合物係包含反式-肉桂醛，該方法係包含以反式-肉桂醛處理該幹細胞。

本發明組合物、製劑、及方法可適用於任何合宜的幹細胞，包括例如：胚胎幹細胞、成體幹細胞、及誘導型多能幹細胞。其中，成體幹細胞包括例如：造血幹細胞、間質幹細胞(例如：脂肪幹細胞、骨髓間質幹細胞、及華頓氏凝膠(Wharton’s jelly)幹細胞)，依其來源分類則包括例如：臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、表皮幹細胞、肌肉幹細胞、脂肪幹細胞、胰幹細胞、眼角膜幹細胞、肝臟幹細胞、及腸上皮幹細胞等。

根據本發明方法，在進行幹細胞治療之前，先以反式-肉桂醛對幹細胞進行預處理，可提供以下至少一種效果：提升幹細胞之增生速率、降低幹細胞中SA-β-gal的活性、增加幹細胞中SIRT1基因的表現、及提升幹細胞中端粒酶的活性，可有效抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化，從而提升該幹細胞治療之效益。該反式-肉桂醛亦可以組合物或製劑的形式施用。

於根據本發明之抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化的方法中，可在任何合宜之條件下進行該反式-肉桂醛對幹細胞的處理，只要該條件無害於幹細胞存活。於本發明一實施態樣中，係於幹細胞培養液中進行該處理。其中，可將反式-肉桂醛及/或含有反式-肉桂醛之組合物及/或製劑添加至含有待處理之幹細胞的幹細胞培養液中，以進行處理；或者，例如將休眠凍存之待處理幹細胞解凍並添加至含有反式-肉桂醛的幹細胞培養液中，以進行該處理。

可使用任何合宜幹細胞培養液於本發明中，只要該培養液與所欲處理之幹細胞對應即可。該幹細胞培養液通常係包含可提供幹細胞生長、分化所需養分與條件(如酸鹼值)等必要成分。一般而言，幹細胞培養液係包含基礎培養液、動物血清(如胎牛血清)、生長因子(如人類重組表皮生長因子、纖維母細胞生長因子)、營養物質(如牛腦下垂體萃取物)、非必需胺基酸(如L-麩醯胺酸、N-乙醯基-L-半胱氨酸)、氧化還原劑(如L-抗壞血酸)、抗生素(如青黴素、鏈黴素)等。其中，可用於本發明方法之基礎培養液之例子包括，但不限於，K-SFM培養液 (keratinocyte-serum free medium)、DMEM培養液(Dulbecco's Modifled Eagle's Medium)、IMDM培養液(Iscove’s modified Dulbecco’s medium，IMDM，Invitrogen)、MEM培養液(Minimum Essential Medium)、α-MEM培養液、BME培養液(Basal Media Eagle)、MEM/F12培養液、Ham's F10培養液、Ham's F12培養液以及RPMI培養液(Rosewell Park Memorial Institute)。舉例言之，當使用本發明方法以抗脂肪幹細胞老化及/或使脂肪幹細胞年輕化時，可使用K-SFM培養液作為基礎培養液以進行反式-肉桂醛處理。

較佳地，係於幹細胞培養液中以約0.1至約50微克/毫升之反式-肉桂醛處理幹細胞；更佳地，係於幹細胞培養液中以約2微克至約20微克/毫升之反式-肉桂醛處理幹細胞以提供抗幹細胞老化之效益，或者於幹細胞培養液中以約4微克至約20微克/毫升之反式-肉桂醛處理幹細胞以提供使幹細胞年輕化之效益。

因此，本發明亦提供一種抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化之組合物，以及一種使用反式-肉桂醛於製造一製劑之用途，該組合物及該製劑即前述用於本發明方法之含反式-肉桂醛之組合物及製劑。該組合物及製劑可供活體外之幹細胞處理，以提升幹細胞之使用效益，亦可供例如人體之個體使用，以提供體內幹細胞之年輕化或抗老化效益。

當本發明之抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化之組合物或製劑係供活體外使用時，該組合物或製劑可包含一載劑，該載劑只要不會對所欲處理之幹細胞造成不利影響，且不會影響該反式-肉桂醛的處理效益即可。舉例言之，該載劑可以為二甲基亞楓、乙醇、或含0.5%甲基化纖維素之磷酸鹽緩衝溶液等。

當本發明之抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化之組合物或製劑係供施用於例如人體之個體時，該組合物或製劑可以呈任何合宜的形式，並無特殊的限制。舉例言之，但不以此為限，該組合物或製劑可呈供吞食或飲用的食品形式，例如食品添加劑、飲品添加劑、膳食補充劑、食品組成分、飲品組成分、保健食品、營養產品、醫藥食品、營養品，亦可以藥劑之形式提供。較佳地，係以保健食品或藥劑之形式提供該組合物或製劑。

當以藥劑提供本發明組合物及/或製劑時，該藥劑可視所欲之投藥形式而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該藥劑可以口服或非經口服(例如皮下、靜脈內、肌肉、腹腔、或鼻腔)等投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該藥劑。

以適於口服投藥之劑型為例，本發明所提供之藥劑可含有任何不會不利影響反式-肉桂醛之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：溶劑(水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、及前述之組合)、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑、固體載劑(例如澱粉、皂土(bentonite))等。可利用任何合宜之方法，以適於口服投藥的劑型提供該藥劑，例如：錠劑(包括糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。

至於適於皮下、靜脈內、肌肉、或腹腔注射之注射劑型或點滴劑型，則可於本發明所提供之藥劑中含有一或多種，例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。或者，將該藥劑製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至該有需要之個體前將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中、或將其乳化，提供所欲之注射劑。另外，適於經鼻腔或經皮膚投予之外用劑型，則例如乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如洗液、懸浮液)。

視需要地，可於本發明所提供之藥劑另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之載體、結合劑、緩衝劑、增黏劑、潤滑劑、崩散劑、安定劑、乳化劑、分散劑、懸浮化劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、或抗真菌劑等。此外，該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分或與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對反式-肉桂醛之所欲效益沒有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用本發明所提供之藥劑，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀而異。舉例言之，當以口服方式施用至一個體以抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化時，以反式-肉桂醛計，其用量為每天約10毫克/公斤體重至約500毫克/公斤體重，較佳為每天約60毫克/公斤體重至約240毫克/公斤體重，更佳為每天約100毫克/公斤體重至約160毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重個體所須之投藥量。惟，對幹細胞老化情形較嚴重之個體而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。

當本發明之組合物及/或製劑以保健食品之形式提供時，可包括例如乳製品類、肉類、麵包類、蔬菜類、飼料、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等形態，但不以此為限。其中，有關反式-肉桂醛之添加步驟可視保健食品之類型而異，只要該添加步驟之環境不會影響該反式-肉桂醛的處理效益即可，舉例言之，可於製造過程中的原料階段即添加反式-肉桂醛(即，作為保健食品的一部分)，或者可於完成製造後的成品階段再添加反式-肉桂醛(即，作為保健食品的添加物)。其中，有關該添加步驟中反式-肉桂醛的形式，可為反式-肉桂醛本身，或者可先將反式-肉桂醛與其他各種成分(例如蛋白質、糖類、脂肪、微量元素、或維生素等，但不以此為限)混合，製成錠狀、膠囊狀、顆粒狀、粉末狀、懸浮液狀、或乳化液狀之製劑後，再行添加與混合。

視需要地，可於本發明所提供之保健食品另含有合宜用量之賦形劑(例如乳糖、白糖、澱粉、或甘露醇)、崩散劑(例如碳酸鈣或羧甲基纖維素鈣)、結合劑(例如α化澱粉、阿拉伯膠、羧甲基纖維素、聚乙烯基呲咯啶酮、或羥丙基纖維素)、增黏劑(天然橡膠)、潤滑劑(例如滑石粉、硬脂酸鎂、或聚乙二醇6000)、及/或其他添加劑(例如可提高該保健食品於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該保健食品的穩定性及儲存性之載體、緩衝劑、安定劑、乳化劑、分散劑、懸浮化劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、或抗真菌劑等)。此外，該保健食品可視需要另含一或多種其他活性成分或與含該一或多種其他活性成分之保健食品併用，以進一步加強該保健食品之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對反式-肉桂醛之所欲效益沒有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用本發明所提供之保健食品，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀而異。亦可針對設定的族群調整本發明所提供之保健食品中反式-肉桂醛的含量，較佳為調整至每日應服用的量。舉例言之，若一個體之每日建議使用量為約500毫克，又該保健食品每份含250毫克之反式-肉桂醛，則該個體每日可食用大約二份該保健食品。可於本發明保健食品之外包裝標示建議使用量、特定族群(例如孕婦、病患)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。

根據本發明，在將幹細胞使用於幹細胞治療之前，先使用反式-肉桂醛對幹細胞進行預處理，可有效抗幹細胞老化，甚至可使幹細胞年輕化，故可提升細胞治療效益。因此，本發明亦關於反式-肉桂醛用於幹細胞治療的發現及應用，包括提供用於幹細胞治療之套組及方法。

關於本發明之用於幹細胞治療的套組，其係包含(1)一包含一幹細胞之第一部分、(2)一包含反式-肉桂醛之第二部分、以及(3)存在於一第三部分及/或該第一部分及/或第二部分中之幹細胞培養液。其中，於使用時，係先於該幹細胞培養液中以反式-肉桂醛處理該幹細胞，然後再使用該經處理之幹細胞於幹細胞治療中。有關幹細胞之選用、培養液之選用、以及反式-肉桂醛的使用條件與方法，均如上述。較佳地，反式-肉桂醛係以每毫升該培養液約0.1微克至約50微克之濃度使用。

根據本發明之套組，各成分通常係分開包裝且可各自儲存，且各成分可各自分開運送或銷售，亦可組合成套一起配送與銷售。該套組可另包含一使用說明書，以利使用者在使用時，可根據其中所擬定之程序與流程，於現場混合各成分以進行幹細胞培養、處理及施用。

舉例言之，當本發明套組之各成分分開包裝且各自儲存，且各成分各自分開運送或銷售時，將該幹細胞於-80℃之環境下保存於一凍存液中；將該反式-肉桂醛較佳於4℃以下之環境下避光保存於例如二甲基亞楓、乙醇、及含0.5%甲基化纖維素之磷酸鹽緩衝溶液等溶劑中；且將該幹細胞培養液於-20℃之環境下保存。又例如，當本發明套組之各成分係組合成套以配送與銷售時，可分別以一內部呈-80℃之容器(例如液態氮桶)、一內部低於4℃之容器、以及一內部呈-20℃之容器(例如冰盒)來分別盛裝前述該幹細胞、反式-肉桂醛、以及幹細胞培養液。各該容器之形狀、大小並無特殊限制，只要各該容器具有與外部之溫度隔絕的功能，使各該成分於一起配送與銷售時不會互相影響保存溫度即可。其中，可使用任何合宜凍存液於幹細胞之保存，只要凍存液之組成可有效維持幹細胞存活率、不影響其染色體組成、增殖、及分化能力即可。通常視所對應之幹細胞而調整凍存液之組成，一般而言，凍存液中的組成包括二甲基亞楓、葡萄糖等細胞營養成分、及pH調節劑等，但不包括含血清與動物蛋白。

根據本發明之幹細胞治療方法，係對一有需要之個體投予一有效量之幹細胞，其中該幹細胞係經反式-肉桂醛預處理。舉例言之，於本發明方法一具體實施態樣中，在將幹細胞使用於肝臟纖維化之幹細胞治療之前，先使用反式-肉桂醛對幹細胞進行預處理，可有效抗幹細胞老化，提升幹細胞於治療肝臟纖維化之效益。其中，有關幹細胞之處理與相關物料之選用、反式-肉桂醛之用量範圍、以及相關治療之應用，均如上述。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。

實施例

A. 細胞實驗

實施例1：幹細胞之準備

(1)脂肪幹細胞(adipose stem cell，ADSC)

於37℃、5%二氧化碳下，將脂肪幹細胞置於無血清角質細胞培養液(keratinocyte-serum free medium，K-SFM，購自Invitrogen-Gibco)中，進行繼代培養5至7次。該K-SFM培養液係添加有人類重組表皮生長因子(human recombinant epidermal growth factor，購自Gibco)、牛腦下垂體萃取物(bovine pituitary extract，購自Invitrogen-Gibco)、10%胎牛血清(FBS，購自Hyclone)、1%青黴素/鏈黴素(P/S，購自Biowest)、0.2毫莫耳濃度之L-抗壞血酸(L-ascorbic acid，購自Sigma)、以及2毫莫耳濃度之N-乙醯基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，購自Sigma)。

取四份等量體積之上述含有繼代培養之脂肪幹細胞的培養液，分別添加最終濃度為100微莫耳濃度之H₂O₂(購自Sigma-Aldrich)進行處理歷時2小時，以誘導幹細胞老化。其後，移除舊的培養液並加入新鮮的培養液，再分別添加最終濃度為0、2、4、及6微莫耳濃度之反式-肉桂醛(trans-cinnamaldehyde，TC，購自Sigma-Aldrich)進行處理歷時6小時，所得稱為「H₂O₂組(經H₂O₂處理2小時，但未以TC處理)」、「H₂O₂+TC2組(經H₂O₂處理2小時，再以2微莫耳濃度之TC處理6小時)」、「H₂O₂+TC4組(經H₂O₂處理2小時，再以4微莫耳濃度之TC處理6小時)」、及「H₂O₂+TC6組(經H₂O₂處理2小時，再以6微莫耳濃度之TC處理6小時)」脂肪幹細胞。

取五份等量體積之上述含有繼代培養之脂肪幹細胞的培養液，分別添加最終濃度為100微莫耳濃度之H₂O₂進行處理歷時2小時，以誘導幹細胞老化。其後，移除舊的培養液並加入新鮮的培養液，再於第1份添加最終濃度為6微莫耳濃度之TC進行處理歷時6小時，所得稱為「TC6H組」；於第2至5份各添加最終濃度為6微莫耳濃度之TC進行處理歷時6小時，其後將細胞移至於DMEM(Dulbecco’s modified essential medium)培養液中繼續培養，分別歷時12、24、48、及72小時，所得稱為「TC12H組」、「TC24H組」、「TC48H組」、及「TC72H組」脂肪幹細胞。

取四份等量體積之上述含有繼代培養之脂肪幹細胞的培養液，分別添加最終濃度為0、2、4、及6微莫耳濃度之TC進行處理歷時6小時，所得稱為「未處理組(未經任何處理)」、「TC2組(僅以2微莫耳濃度之TC處理6小時)」、「TC4組(僅以4微莫耳濃度之TC處理6小時)」、及「TC6組(僅以6微莫耳濃度之TC處理6小時)」脂肪幹細胞。

(2)華頓氏凝膠幹細胞(Wharton’s jelly stem cell，WJSC)

於37℃、5%二氧化碳下，將華頓氏凝膠幹細胞置於IMDM培養液(Iscove’s modified Dulbecco’s medium，IMDM，購自Invitrogen)中，進行繼代培養5至7次。該IMDM培養液係添加有10%胎牛血清(購自Hyclone)、10微克/毫升之鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，購自R&D system)、2毫莫耳濃度之L-麩醯胺酸(購自Invitrogen-Gibco)、及100單位/毫升之青黴素/鏈黴素(購自Invitrogen)。

取三份等量體積之上述含有繼代培養之華頓氏凝膠幹細胞的培養液，於第1、2份分別添加最終濃度為100微莫耳濃度之H₂O₂進行處理歷時2小時，以誘導幹細胞老化。其後，移除舊的培養液並加入新鮮的培養液，再分別添加最終濃度為0或6微莫耳濃度之TC進行處理歷時6小時，所得稱為「H₂O₂組(經H₂O₂處理2小時，但未以TC處理)」及「H₂O₂+TC6組(經H₂O₂處理2小時，再以6微莫耳濃度之TC處理6小時)」華頓氏凝膠幹細胞；第3份則為未經任何處理，稱為「未處理組」華頓氏凝膠幹細胞。

(3)人類骨髓間質幹細胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，hBMMSC)

於37℃、5%二氧化碳下，將人類骨髓間質幹細胞(hBMMSC)置於IMDM培養液(購自Invitrogen-Gibco)中，進行繼代培養5至7次。該IMDM培養液係添加有10%胎牛血清(購自Hyclone)、10微克/毫升之鹼性纖維母細胞生長因子(購自R&D system)、2毫莫耳濃度之L-麩醯胺酸(購自Invitrogen-Gibco)、及100單位/毫升之青黴素/鏈黴素(購自Invitrogen-Gibco)。

取三份等量體積之上述含有繼代培養之人類骨髓間質幹細胞的培養液，於第1、2份分別添加最終濃度為100微莫耳濃度之H₂O₂進行處理歷時2小時，以誘導幹細胞老化。其後，移除舊的培養液並加入新鮮的培養液，再分別添加最終濃度為0或6微莫耳濃度之TC進行處理歷時6小時，所得稱為「H₂O₂組(經H₂O₂處理2小時，但未以TC處理)」及「H₂O₂+TC6組(經H₂O₂處理2小時，再以6微莫耳濃度之TC處理6小時)」人類骨髓間質幹細胞；第3份則未經任何處理，稱為「未處理組」人類骨髓間質幹細胞。

實施例2：H ₂ O ₂ 及反式-肉桂醛對幹細胞之表面抗原表現的影響

分別使用不同抗體對實施例1(1)之「未處理組」、「H₂O₂組」、及「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞進行標定，該抗體包括購自Dako公司之抗人類白血球分化抗原14(human cluster of differentiation 14，CD14)之抗體、抗人類白血球分化抗原29(CD29)之抗體、抗人類白血球分化抗原44(CD44)之抗體、抗人類白血球分化抗原45(CD45)之抗體、以及抗人類白血球抗原-ABC(human leukocyte antigen-ABC，HLA-ABC)之抗體，與購自Becton Dickinson公司之抗人類白血球分化抗原34(CD34)之抗體、抗人類白血球分化抗原49b(CD49b)之抗體、抗人類白血球分化抗原73(CD73)之抗體、抗人類白血球分化抗原90(CD90)之抗體、以及抗人類白血球抗原-DR(HLA-DR)之抗體。其後以流式細胞儀(Beckman Coulter公司，型號：FC500)分析各組細胞之表面抗原的表現，結果示於第1A、1B圖。

由第1A、1B圖可知，相較於「未處理組」，「H₂O₂組」及「H₂O₂+TC6組」之表面抗原的表現類型並沒有明顯改變，此三組脂肪幹細胞皆會表現間質幹細胞之標識物(例如：CD29、CD44、CD73、CD90、及HLA-ABC)，但不會表現造血幹細胞之標識物(例如：CD34、CD45、及HLA-DR)。前述結果顯示，不論H₂O₂處理或是TC處理皆不會影響幹細胞之表面抗原的表現。

實施例3：反式-肉桂醛對幹細胞之分化能力的影響

(1)成骨分化試驗

於DMEM培養液中培養實施例1(1)之「未處理組」、「H₂O₂組」、及「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞，以誘導脂肪幹細胞走向成骨分化，該培養液係添加有10%胎牛血清、20毫微莫耳濃度之甲基脫氫皮質固醇(dexamethasone)、100單位/毫升之青黴素、100微克/毫升之鏈黴素、2.5微克/毫升之兩性黴素(amphotericin)、10毫莫耳濃度之b-甘油磷酸鹽(b-glycerophosphate)、及0.05毫莫耳濃度之L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(L-ascorbicacid 2-phosphate)。培養至第7天，以鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)偵測套組(購自EMD Millipore，型號：CSCR004)進行染色，其後以顯微鏡拍照，結果示於第2A至2C圖，其中，成骨分化後之細胞於顯微鏡下係呈紫色。拍照後，偵測各組於450奈米波長之吸光值(OD_450nm)(此吸光值係對應於紫色細胞的數目)，以了解H₂O₂及/或TC對於脂肪幹細胞之成骨分化能力的影響，結果示於第2G圖。

由第2A至2C、及2G圖可知，相較於「未處理組」，「H₂O₂組」之成骨分化後的細胞數目明顯減少，而「H₂O₂+TC6組」之成骨分化後的細胞數目則與「未處理組」相當。前述結果顯示，H₂O₂處理會降低幹細胞之成骨分化的能力，而TC處理則可抵銷H₂O₂之不利影響，使幹細胞之成骨分化的能力回復至正常。

(2)脂向分化試驗

於DMEM培養液中培養實施例1(1)之「未處理組」、「H₂O₂組」、及「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞，以誘導脂肪幹細胞走向脂向分化，該培養液係添加有10%胎牛血清、10微克/毫升之胰島素、1微莫耳濃度之甲基脫氫皮質固醇、0.5毫莫耳濃度之3- 異丁基-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、100微莫耳濃度之吲哚美辛(indomethacin)。培養至第7天，進行紅油O染色(Oil Red O staining)，並以顯微鏡拍照，結果示於第2D至2F圖。其中，幹細胞進行脂向分化時，細胞中會有油滴的產生，進行紅油O染色後，細胞中的油滴於顯微鏡下會呈橘紅色。紅油O染色之步驟可參見Coptis chinensis alkaloids exert anti-adipogenic activity on 3T3-L1 adipocytes by downregulating C/EBP-α and PPAR-γ.Fitoterapia.98：199-208(2014)，該文獻全文併於此處以供參考。

拍照後，以異丙醇(含有4%Nonidet P-40清潔劑)將各組細胞之油滴萃取出，偵測並計算各組於510奈米波長之吸光值(OD_510nm)(此吸光值係對應於橘紅色細胞，即，脂向分化後之細胞的數目)，結果示於第2H圖。

由第2D至2F、及2H圖可知，相較於「未處理組」，「H₂O₂組」之成骨分化後的細胞數目明顯減少，而「H₂O₂+TC6組」之脂向分化後的細胞數目則與「未處理組」相當。前述結果顯示，H₂O₂處理會降低幹細胞之脂向分化的能力，而TC處理則可抵銷H₂O₂之不利影響，使幹細胞之脂向分化的能力回復至正常。

實施例4：反式-肉桂醛使幹細胞年輕化及抗幹細胞老化之效益

(1)增生速率分析

分別以磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline，PBS)清洗實施例1(1)之「未處理組」、「H₂O₂組」、及「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞，重複二次。其後，先以3.7%之甲醛進行固定，再以10%之胎牛血清(稀釋於PBS中)進行阻斷(blocking)反應。其後，以PBS清洗細胞1次，於4℃下以Ki67抗體(購自Novus biological)與細胞進行反應至隔日，再以PBS清洗細胞1次，於室溫下以二級抗體(goat anti rabbit IgG，購自Merk Millpore)與細胞進行反應，歷時2小時。最後，以DAPI染劑(購自Invitrogen)避光染色，然後以螢光顯微鏡觀察，結果示於第3A至3C圖。由於Ki67抗體可以標示增生中的細胞於G1、S、G2及M期的核蛋白，但不能標示靜止G0期的細胞，因此，當Ki67標示的細胞越多，表示增生中的細胞越多(即，增生速率越高)。

由第3A至3C圖可知，相較於「未處理組」，「H₂O₂組」之Ki67標示的細胞明顯減少，而「H₂O₂+TC6組」之Ki67標示的細胞則明顯增加至與「未處理組」相當(箭頭所指處即為增生中的細胞)。前述結果顯示，H₂O₂處理會使幹細胞老化，而TC處理則可抵銷H₂O₂之不利影響，使老化之幹細胞的增生速率回復至正常(即，可抗幹細胞老化)。

(2)老化相關β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal)之活性測試

已知老化細胞於酸性條件下(例如pH6.0)會表現出 SA-β-gal的活性，因此，透過偵測細胞內此種活性物質的表現量，可反映出細胞的老化程度。

分別以PBS清洗實施例1(1)之各組脂肪幹細胞，重複二次。其後，先以3%之甲醛固定，再以PBS清洗一次。接著，於37℃且無CO₂之環境下，在新鮮配製之染色溶液中將各組細胞染色歷時12小時。該染色溶液係含有1毫克/毫升之5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactosidase，X-gal)、40毫莫耳濃度之檸檬酸/磷酸鈉(pH6.0)、5毫莫耳濃度之亞鐵氰化鉀、5毫莫耳濃度之鐵氰化鉀、150毫莫耳濃度之氯化鈉、以及2毫莫耳濃度之氯化鎂。

移除染色溶液，以PBS清洗各組細胞。最後，於顯微鏡下以10倍放大倍率進行觀察、拍照，並計算有表現SA-β-gal活性之細胞的百分比，結果示於第4A至4E圖。

第4A圖顯示，相較於「未處理組」，「TC2組」、TC4組」、及「TC6組」中有表現SA-β-gal活性的細胞數量皆明顯減少，且隨TC濃度增加而降低，此說明TC具有使幹細胞年輕化的能力。

由第4B至4E圖可知，相較於「未處理組」，「H₂O₂組」中有表現SA-β-gal活性的細胞數量明顯增加，顯示H₂O₂會使幹細胞老化；此外，相較於「H₂O₂組」，「H₂O₂+TC2組」、「H₂O₂+TC4組」、及「H₂O₂+TC6組」中有表現SA-β-gal活性的細胞數量皆明顯減少，此說明TC可以抵銷H₂O₂造成幹細胞老化之不利影響。

(3)基因表現分析

(3-1)cDNA之製備

以RNA純化套組(RNasy Mini kit，購自Qiagen)萃取實施例1(1)之各組脂肪幹細胞、骨髓間質幹細胞、及華頓氏凝膠幹細胞的全細胞RNA，其後以反轉錄套組(RT Pre Mix，購自iNtRON Biotechnology)，將所得之全細胞RNA反轉錄成cDNA。

(3-2)定量RT-PCR

取1微升上述(3-1)所得之各組脂肪幹細胞的cDNA，各加入0.6微升如表1所示SIRT1基因之對應引子(5微微莫耳/微升)、3.4微升之去離子水、以及10微升之SYBR Green PCR master mix(購自Thermo Scientific)，其後置於同步定量聚合酶連鎖反應器(ABI prism 7700sequence detection system)中反應，以定量基因表現量之強弱，反應條件如下：i)50℃，2分鐘，1個循環；ii)95℃，10分鐘，1個循環；iii)95℃，15秒、60℃，30秒、72℃，30秒，以上步驟進行40個循環；iv)72℃，10分鐘，1個循環；v)最後降至4℃以結束反應。結果示於第5A至5C圖。

由第5A圖可知，相較於「H₂O₂組」，「TC2組」、TC4組」、及「TC6組」之SIRT1(沉默交配型訊息調節2同源物，silent mating type information regulation 2 homolog)基因的表現皆明顯增加，且隨TC濃度的增加而上升，此再次說明，TC具有使幹細胞年輕化的能力。

由第5B圖可知，相較於「H₂O₂組」，「H₂O₂+TC2組」、「H₂O₂+TC4組」、及「H₂O₂+TC6組」之SIRT1基因的表現皆明顯增加，且隨TC濃度的增加而上升，此再次說明，TC具有抗幹細胞老化的能力。

由第5C圖可知，相較於「TC6H組」，「TC12H組」、「TC24H組」、「TC48H組」、「TC72H組」之SIRT1基因的表現皆沒有明顯差異。此顯示，TC於增加幹細胞中SIRT1基因表現的效益可維持至少72小時。

(3-3)半定量RT-PCR

取2.5微升上述(3-1)所得之「未處理組」、「H₂O₂組」、及「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞的cDNA，並加入2.5微升如表1所示各基因之對應引子(10微莫耳濃度)、7.5微升之去離子水、以及之12.5微升之EconoTaq^® PLUS GREEN 2X Master Mix(Lucigen，Middleton，Wisconsin，USA)，再將前述樣品置於聚合酶連鎖反應器中，並設定反應條件如下：i)94℃，30秒、55℃，30秒、94℃，60秒，以上步驟進行30個循環之反轉錄聚合酶鍊鎖反應(Revers transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)；ii)72℃，10分鐘；iii)最後降溫至4℃以結束反應。將所得之聚合酶連鎖反應(PCR)產物，以2%瓊脂膠體進行30分鐘電泳(電壓：100伏特)，接著將該膠體置於溴化乙錠(ethidium bromide，EtBr)中染色10分鐘，再利用照膠系統(DOC PRINT DP-001FDC，VilberLourmat France)拍攝影像，結果示於第6A圖，最後以軟體(Image J)定量各基因表現量之強弱，結果示於表6B。

由第6A、6B圖可知，相較於「未處理組」，「H₂O₂組」之SIRT1基因的表現明顯減少，而相較於「H₂O₂組」，「H₂O₂+TC6 組」之SIRT1基因的表現則明顯增加。相較於「未處理組」，「H₂O₂組」之p21、及p53基因的表現明顯增加，而相較於「H₂O₂組」，「H₂O₂+TC6組」之p21、p53基因的表現則明顯減少。相較於「H₂O₂組」，「H₂O₂+TC6組」之OCT4(octamer-binding transcription factor 4)、及NANOG基因的表現沒有明顯差異。

已知SIRT1基因的表現與老化相關，p21、及p53基因的表現與細胞週期的調控相關，而OCT4、及NANOG基因的表現則與幹細胞的多能性(pluripotency)相關。因此，上述結果說明，TC具有抗幹細胞老化及調節細胞週期的能力，且不會對幹細胞多能性造成影響。

(3-4)微陣列分析(Microarray Analysis)

以反轉錄套組(RT Pre Mix，購自iNtRON Biotechnology)及表2所示各基因之對應引子以及表1所示SIRT1基因、p53基因之對應引子，對上述(3-1)所提供之「H₂O₂組」、「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞的全細胞RNA進行約20或30個擴增循環之反轉錄聚合酶鍊鎖反應，所得產物即為各該基因之單股cDNA。

將上述cDNA與基因晶片(affymetrixGeneChip Human Genome U133 plus 2.0 Array，Affymetrix)進行雜交，其後以微陣列掃描器系統(Gene Chip® Scanner 3000)進行微陣列的掃描並分析數據。表3顯示，相較於「H₂O₂組」之基因表現(即，將「H₂O₂組」中的基因表現設定為1倍)，「H₂O₂+TC6組」之基因表現倍數。

由表3可知，相較於「H₂O₂組」，「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞中與增生作用相關之基因(即，NYFA、CCND1、EIF5、SIRT1、E2F6、POLR3H、hTERT、及PCNA)的表現皆明顯增加，與細胞凋亡(apoptosis)相關之基因(即，GADD45B、PIM1、p53、及p16)的表現則皆明顯減少。前述結果顯示，TC可透過增加細胞中轉錄、轉譯相關之基因的表現以及SIRT1基因的表現，而提升細胞的增生速率。

(4)端粒酶活性測試

端粒酶活性為細胞老化的關鍵控制因子，故以端粒酶重複序列擴增法(Telomeric Repeat Amplification Protocal，TRAP)分析實施例1(1)之「未處理組」、「H₂O₂組」、及「TC6H組」脂肪幹細胞中端粒酶的活性。其中，先以聚合酶鏈鎖反應(PCR)使端粒3'端之引子(即，Telo TAGGG)在端粒酶的催化下延伸，並擴增TTAGGG重複序列，其後以酵素免疫測定法(ELISA)偵測各組之產物訊號，結果示於第7圖，且以HEK293細胞(未經任何處理)中端粒酶的活性作為正向控制組。

由第7圖可知，相較於「未處理組」，「H₂O₂組」之端粒酶活性明顯降低，而相較於「H₂O₂組」，「TC6H組」之端粒酶活性則明顯提升。此結果顯示，H₂O₂處理會使幹細胞老化，而TC處理則可提升老化之幹細胞端粒酶的活性，此再次說明，TC具有抗幹細胞老化的能力。

(5)骨髓間質幹細胞及華頓氏凝膠幹細胞之試驗

(5-1)SA-β-gal之活性測試

重覆上述(2)之步驟，但使用實施例1之各組骨髓間質幹細胞以及華頓氏凝膠幹細胞，結果分別示於第8A至8D圖、以及第9A至9D圖。

由第8A至8D圖可知，相較於「未處理組」人類骨髓間質幹細胞，「H₂O₂組」人類骨髓間質幹細胞中有表現SA-β-gal活性的細胞數量明顯增加，而相較於「H₂O₂組」人類骨髓間質幹細胞，「H₂O₂+TC6組」人類骨髓間質幹細胞中有表現SA-β-gal活性的細胞數量則明顯減少。前述結果，與脂肪幹細胞之結果一致。

由第9A至9D圖可知，相較於「未處理組」華頓氏凝膠幹細胞，「H₂O₂組」華頓氏凝膠幹細胞中有表現SA-β-gal活性之華頓氏凝膠幹細胞數量明顯增加，而相較於「H₂O₂組」華頓氏凝膠幹細胞，「H₂O₂+TC6組」華頓氏凝膠幹細胞中有表現SA-β-gal活性的細胞則明顯減少。前述結果，亦與脂肪幹細胞之結果一致。

(5-2)SIRT1基因表現分析

重覆上述(3-2)步驟，但使用(3-1)所得之各組人類骨髓間質幹細胞以及華頓氏凝膠幹細胞的cDNA進行定量 RT-PCR。結果示於第10A、10B圖。

由第10A圖可知，相較於「未處理組」人類骨髓間質幹細胞，「H₂O₂組」人類骨髓間質幹細胞之SIRT1基因的表現明顯減少，此說明H₂O₂處理會使細胞老化；而相較於「H₂O₂組」人類骨髓間質幹細胞，「H₂O₂+TC6組」人類骨髓間質幹細胞中SIRT1基因的表現則明顯增加，此說明，TC具有抗幹細胞老化的能力。前述結果，與脂肪幹細胞之結果一致。

由第10B圖可知，相較於「未處理組」華頓氏凝膠幹細胞，「H₂O₂組」華頓氏凝膠幹細胞中SIRT1基因的表現明顯減少，此說明H₂O₂處理使細胞老化；而相較於「H₂O₂組」華頓氏凝膠幹細胞，「H₂O₂+TC6組」華頓氏凝膠幹細胞中SIRT1基因的表現則明顯增加，此說明，TC具有抗幹細胞老化的能力。前述結果，亦與脂肪幹細胞之結果一致。

B. 動物實驗

實施例5：肝臟纖維化大鼠模型的建立

以腹膜內注射的方式，將200毫克/公斤體重之硫代乙醯胺(thioacetamide，TAA)施用至8週之雄性Wister大鼠(共35隻)，每三天注射一次，共60天(即，總共注射20次)，以獲得肝臟纖維化之大鼠模型，稱為「TAA組」大鼠。另有未注射硫乙醯胺，但注射相同體積之普通食鹽水的正常「控制組」大鼠(共12隻)。於最後一次注射完成後第4天，以乙醚將4隻「控制組」大鼠及3隻「TAA組」大鼠犧牲，並進行以下分析：

(1)組織病理學分數評估

取「控制組」及「TAA組」大鼠之肝臟組織樣本，其後進行組織樣本之處理、切片、及染色，結果示於第11A、11B圖，以評估組織病理學的分數。其中，該染色方法包括蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin Staining，H&E Staining)以及梅生三色染色(Masson’s trichrome staining)，此可參見Adipose-derived stem cells can abrogate chemical-induced liver fibrosis and facilitate recovery of liver function.Cell Transplant.21(12)：2753-2764(2012)，該文獻全文併於此處以供參考。其後，以Metavir分級系統分析蘇木精-伊紅染色及梅生三色染色結果，分別以如下表5所示進行分級，得到活性分數(activity score)以及纖維化分數(fibrosis score)，其中，活性分數越高代表肝臟發炎的程度越嚴重，而纖維化分數越高代表纖維化程度越嚴重。

由第11A圖(即，梅生三色染色結果)可知，膠原蛋白聚積在「TAA」大鼠的肝臟組織中，且將二條血管連接起來，此為肝臟纖維化之特徵。另以Metavir分級系統分析第11A圖之結果得知，相較於「控制組」大鼠之纖維化分數為0，「TAA」大鼠之纖維化分數為4。前述結果說明，長期注射TAA會使大鼠肝臟產生嚴重的纖維化(甚至肝硬化)。

由第11B圖(即，蘇木精-伊紅染色結果)可知，「TAA」大鼠的肝臟組織明顯受到巨噬細胞浸潤。另以Metavir分級系統分析第11B圖之結果得知，相較於「控制組」大鼠之活性分數為0，「TAA」大鼠之活性分數為3。前述結果說明，長期的TAA注射確實會使大鼠肝臟產生重度的發炎反應。

(2)生化功能指數分析

收集「控制組」及「TAA組」大鼠之心臟血液，其後以生化分析儀(購自Roche，型號：Integra 800)進行測量，以分析肝臟的生化功能指數，藉此評估肝臟的傷害程度，其中該生化功能指數包括麩胺酸草醋酸轉胺酶(glutamate oxaloacetate transaminase，GOT)表現量、麩胺酸丙酮酸轉胺基酶(glutamate pyruvate transaminase，GPT)表現量、白蛋白(albimin)表現量、總膽紅素(total bilirubin)表現量、及凝血酶原時間(prothrombin time)，結果示於表4。

由表4可知，相較於「控制組」，「TAA」大鼠之GOT、GPT、及總膽紅素在血液中的表現量以及凝血酶原時間皆明顯增加，而白蛋白在血液中的表現量則明顯降低。此結果再次確認，長期注射TAA會使大鼠肝臟受到傷害。

實施例6：反式-肉桂醛於提升幹細胞之治療效果的效益

將實施例5剩餘之32隻「TAA組」大鼠分成「假性注射組」、「幹細胞組」、「H₂O₂組」、及「TC組」(每組8隻)，並進行不同處理(處理當日稱為處理後『第0天』)。其中，於「假性注射組」，僅注射300微升之普通食鹽水至肝臟纖維化大鼠的肝臟；於「幹細胞組」，注射300微升(含1×10⁶個細胞)之實施例1所提供之「未處理組」脂肪幹細胞至肝臟纖維化大鼠的肝臟(即，正向控制組)；於「H₂O₂組」，注射300微升(含1×10⁶個細胞)之實施例1所提供之「H₂O₂組」脂肪幹細胞至肝臟纖維化大鼠的肝臟(即，負向控制組)；於「TC組」，注射300微升(含1×10⁶個細胞)之實施例1所提供之「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞至肝臟纖維化大鼠的肝臟。

於各組大鼠經不同處理後的『第7天』，以乙醚將各組中4隻大鼠犧牲，於處理後『第14天』，再將各組剩餘之4隻大鼠犧牲。收集各組大鼠之心臟血液及取肝臟組織樣本後，進行以下分析：

(6-1)α-胎兒蛋白(α-feto protein，AFP)免疫組織染色

以抗人類α-胎兒蛋白抗體(Calbiochem公司，ST1673)對「控制組」、「假性注射組」、「幹細胞組」、「H₂O₂組」、及「TC組」大鼠之肝臟組織切片進行α-胎兒蛋白免疫組織染色分析。其中，幹細胞移植後『第7天』之結果示於第12A至12E圖，幹細胞移植後『第14天』之結果則示於第12F至12J圖。由於α-胎兒蛋白抗體為針對人類之α-胎兒蛋白，因此，帶有α-胎兒蛋白訊號的細胞(即，箭頭所指之褐色細胞)表示源自移植後的脂肪幹細胞，分化後成為似肝細胞(hepatocyte-like cell)。

由第12A至12J圖可知，於幹細胞移植後『第7天』及『第14天』，「幹細胞組」、「H₂O₂組」、及「TC組」之肝臟組織中皆有許多帶有α-胎兒蛋白訊號的細胞(即，箭頭所指處)。此結果顯示，各組幹細胞於移植至大鼠肝臟後皆能存活並且分化。以下進一步觀察各組幹細胞對肝臟纖維大鼠所提供之治療效益。

(6-2)組織病理學分數評估

對「控制組」、「假性注射組」、「幹細胞組」、「H₂O₂組」、及「TC組」大鼠之心臟血液進行實施例5(1)之組織病理學分數評估，結果示於第13A至13D圖及第14A、14B圖，其中，梅生三色染色之結果示於第13A、13B圖，蘇木精-伊紅染色之結果則示於第13C、13D圖；另外，將第14A、14B圖之結果數據化，如下表6所示。

由第13A至13D圖、第14A、14B圖、及表6可知，長期的TAA注射會使大鼠肝臟產生重度的發炎反應，肝臟組織受到巨噬細胞浸潤而產生嚴重的纖維化(甚至肝硬化)，而以「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞進行治療可降低肝臟纖維化大鼠肝臟的發炎反應，並且改善纖維化的狀況。

(6-3)生化功能指數分析

對「控制組」、「假性注射組」、「幹細胞組」、「H₂O₂組」、及「TC組」大鼠之心臟血液進行實施例5(2)之生化功能指數分析，結果示於第15A至15E圖。

由第15A圖可知，於治療後『第14天』，相較於「H₂O₂組」之GPT的表現量(93±13單位/升)，「幹細胞組」之GPT的表現量明顯降低(72±14單位/升)。相較於「幹細胞組」，「TC組」之GPT的表現量亦明顯降低(66±14單位/升)。此結果顯示，以「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞進行治療，可有效降低肝臟纖維化大鼠血液中GPT的表現量。

由第15B圖可知，於治療後『第14天』，相較於「假性注射組」之GOT的表現量(208±12單位/升)，「幹細胞組」之GOT的表現量明顯降低(162±60單位/升)。相較於「幹細胞組」，「TC組」之GOT的表現量亦明顯降低少(137±18單位/升)。此結果顯示，以「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞進行治療，可有效降低肝臟纖維化大鼠血液中GOT的表現量。

由第15C圖可知，於治療後『第14天』，相較於「幹細胞組」之白蛋白的表現量(3.52±0.28克/分升)，「假性注射組」之白蛋白的表現量(3.23±0.01克/分升)明顯降低。相較於「假性注射組」，「TC組」之白蛋白的表現量則明顯增加(3.48±0.03克/分升)。此結果顯示，以「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞進行治療，可有效增加肝臟纖維化大鼠血液中白蛋白表現量。

由第15D圖可知，於治療後『第14天』，「假性注射組」之凝血酶原時間(23.10±2.5秒)，「TC組」之凝血酶原時間(10.88±0.67秒)明顯減少。此結果顯示，以「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞進行治療，可有效減少肝臟纖維化大鼠之凝血酶原時間。

由第15E圖可知，於治療後『第14天』，相較於「幹細胞組」之總膽紅素的表現量(0.05±0.02毫克/分升)，「TC組」之總膽紅素的表現量(0.034±0.03毫克/分升)明顯降低，且趨近於「控制組」之總膽紅素的表現量(0.02±0.02毫克/分升)。此結果顯示，以「H₂O₂+TC6組」脂肪幹細胞進行治療，可有效降低肝臟纖維化大鼠血液中總膽紅素的表現量。

上述結果顯示，以反式-肉桂醛(TC)處理幹細胞可有效抗幹細胞老化，從而提升幹細胞之治療效益。

<110> 國璽幹細胞應用技術股份有限公司

<120> 反式-肉桂醛之應用

<130> 無

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRT1引子-順向序列

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRT1引子-反向序列

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p53引子-順向序列

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p53引子-反向序列

<400> 4

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p21引子-順向序列

<400> 5

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> p21引子-反向序列

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCT4引子-順向序列

<400> 7

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCT4引子-反向序列

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NANOG引子-順向序列

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NANOG引子-反向序列

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1引子-順向序列

<400> 11

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1引子-反向序列

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-Actin引子-順向序列

<400> 13

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-Actin引子-反向序列

<400> 14

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NYFA引子-順向序列

<400> 15

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NYFA引子-反向序列

<400> 16

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CCND1引子-順向序列

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CCND1引子-反向序列

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EIF5引子-順向序列

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EIF5引子-反向序列

<400> 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E2F6引子-順向序列

<400> 21

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E2F6引子-反向序列

<400> 22

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POLR3H引子-順向序列

<400> 23

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POLR3H引子-反向序列

<400> 24

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hTERT引子-順向序列

<400> 25

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hTERT引子-反向序列

<400> 26

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<211> 20

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<213> 人工序列

<220>

<223> PCNA引子-順向序列

<400> 27

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCNA引子-反向序列

<400> 28

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GADD45B引子-順向序列

<400> 29

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GADD45B引子-反向序列

<400> 30

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIM1引子-順向序列

<400> 31

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIM1引子-反向序列

<400> 32

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P16引子-順向序列

<400> 33

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P16引子-反向序列

<400> 34

Claims

一種抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化的方法，其係包含以反式-肉桂醛(trans-cinnamaldehyde，TC)處理該幹細胞，其中該幹細胞並非人類全能性幹細胞。
如請求項1之方法，其中該幹細胞係胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞。
如請求項1之方法，其中係於幹細胞培養液中以約0.1至約50微克/毫升之反式-肉桂醛處理幹細胞。
一種使用反式-肉桂醛於製造一製劑之用途，該製劑係用於抗幹細胞老化及/或使幹細胞年輕化，其中該幹細胞並非人類全能性幹細胞。
如請求項4之用途，其中該製劑係一保健食品或藥劑。
如請求項4之用途，其中該幹細胞係胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞。
一種用於幹細胞治療之套組，其係包含：(1)一第一部分，包含一幹細胞；(2)一第二部分，包含反式-肉桂醛；以及(3)幹細胞培養液，存在於一第三部分及/或該第一部分及/或第二部分中，其中，該幹細胞並非人類全能性幹細胞，且其中於使用該套組時，係先於該幹細胞培養液中以反式-肉桂醛處理該幹細胞，再使用該經處理之幹細胞於幹細胞治療中。
如請求項7之套組，其中該幹細胞係選自以下之至少一者：胚胎幹細胞、成體幹細胞、及誘導型多能幹細胞。
如請求項7之套組，其中該幹細胞係選自以下之至少一者：脂肪幹細胞、骨髓間質幹細胞、及華頓氏凝膠(Wharton’s jelly)幹細胞。
如請求項7之套組，其中反式-肉桂醛係以每毫升該培養液約0.1微克至約50微克之濃度使用。