JP2003052376A

JP2003052376A - Ｄｎａ修復促進活性を有するタンパク質

Info

Publication number: JP2003052376A
Application number: JP2001246260A
Authority: JP
Inventors: Kazunari Narumi; 一成鳴海; Katsuya Sato; 勝也佐藤; Sochin Sai; 素珍崔; Shigeru Kitayama; 滋北山; Hiroshi Watanabe; 宏渡辺
Original assignee: Japan Atomic Energy Research Institute
Current assignee: Japan Atomic Energy Agency
Priority date: 2001-08-14
Filing date: 2001-08-14
Publication date: 2003-02-25
Anticipated expiration: 2021-08-14
Also published as: JP4111369B2; US20030143707A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】放射線抵抗性細菌のDNA修復反応を促進する
活性を有するタンパク質、このタンパク質をコードする
DNA、このタンパク質を認識する抗体を提供する。【解決手段】本発明は、特定なアミノ酸配列、もしく
はこれの改変体であるアミノ酸配列からなるDNA修復反
応を促進する活性を有するタンパク質、当該DNA修復促
進活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、該塩
基配列をベクターDNAに挿入した組換え体DNA、当該組換
え体DNAを含む形質転換体、当該形質転換体を培地に培
養し培養物からDNA修復促進活性を有するタンパク質を
採取することからなるDNA修復促進活性を有するタンパ
ク質の製造法、および当該タンパク質に結合することを
特徴とする抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、DNA修復促進活性
を有するタンパク質遺伝子と、この遺伝子を含有する組
換えベクター、組換え体による形質転換体、並びにこの
形質転換体を用いたDNA修復促進活性を有するタンパク
質の製造法、DNA修復促進活性を有するタンパク質を認
識する抗体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生物の放射線耐性は、生物種によって大
きく異なるが、放射線に最も強い微生物群が存在してお
り、放射線抵抗性細菌と総称されている。放射線抵抗性
細菌の代表は、デイノコッカス・ラジオデュランス（De
inococcus radiodurans)であり、大腸菌（Escherichia
coli)の約100倍、ヒトの細胞の約1,000倍の放射線抵抗
性を示す。デイノコッカス・ラジオデュランスの高い放
射線抵抗性は、該細菌が有する効率的かつ正確なDNA二
本鎖切断修復能に起因することが知られている。したが
って、これに係わるDNA修復関連タンパク質を見いだ
し、その機能を明らかにすることによって、例えば、放
射線等で誘発される修復困難なDNA損傷を効率的に修復
する技術開発の進展を促し、DNAの傷が原因で起こるガ
ンや老化を予防する手だてを講じることができると考え
られる。また、該細菌由来の新規なDNA修復関連タンパ
ク質は、DNA操作技術に用いる研究用試薬、DNA診断等に
用いる臨床検査診断薬の新たな開発に資することができ
る。

【０００３】デイノコッカス・ラジオデュランスのゲノ
ムDNAの全塩基配列が決定され、該細菌が大腸菌等他の
微生物に広く存在する既知のDNA修復遺伝子のほとんど
を保持していることが知られている（White et al., Sc
ience, 286:1571-1577, 1999)。しかし、ゲノム配列の
検索からは既知修復酵素遺伝子の存在しか分からず、大
腸菌等の放射線に弱い細菌のDNA修復と同じ機構しか持
ち合わせていないのであれば、デイノコッカス・ラジオ
デュランスの著しく高い放射線抵抗性は説明できない。
したがって、デイノコッカス・ラジオデュランスに固有
の機能未知遺伝子の中に、該細菌の驚異的に高いDNA修
復能力に係わる原因遺伝子が存在していると考えられ
る。

【０００４】これまでに、デイノコッカス・ラジオデュ
ランスのDNA修復能欠損変異株の解析から、DNA修復遺伝
子が単離されている。例えば、変異株3021株からはヌク
レオチド除去修復系に係わるuvrA遺伝子が単離されてい
る（Narumi et al., Gene,198:115-126, 1997)。変異株
rec30株からは組換え修復系に係わるrecA遺伝子が単離
されている（Narumi et al., Mutat. Res., 435:233-24
3, 1999)。また、変異株KR4128株からは組換え修復系に
係わるrecN遺伝子（Funayama et al., Mutat. Res., 43
5:151-161, 1999）が単離されている。さらに、変異株K
H5861株から組換え修復系に係わるrecR遺伝子が単離さ
れている（Kitayama et al., Mutat.Res., 461:179-18
7, 2000）。しかし、これらの遺伝子は他の生物からも
見いだされている既知遺伝子であり、DNA修復能欠損変
異株の解析からDNA修復に係わる新規遺伝子は発見され
ていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、以上のとお
りの事情を鑑みてなされたものであり、放射線抵抗性細
菌の効率的かつ正確なDNA二本鎖切断修復能を促進する
活性を有する新規タンパク質を提供することを課題とす
る。さらに、その新規タンパク質の生産のための遺伝
子、該遺伝子を含む組換え体DNA、該組換え体DNAを用い
るDNA修復促進活性を有するタンパク質の製造法、DNA修
復促進活性を有するタンパク質を認識する抗体を提供す
ることも課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題について種々検討した結果、デイノコッカス・
ラジオデュランスの放射線高感受性変異株KH3111株の解
析から、新規のDNA修復促進活性を有するタンパク質遺
伝子を単離し、その遺伝子のDNA塩基配列を解明するこ
とにより、本発明に到達した。

【０００７】すなわち、第1の発明は、SEQ ID NO: 1で
示されるアミノ酸配列からなる、DNA修復促進活性を有
するタンパク質を要旨とする。別の観点からは、第1の
発明は、SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列において
1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
されたアミノ酸配列からなる、DNA修復促進活性を有す
るタンパク質を要旨とする。別の観点からは、第1の発
明は、SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列をコードす
る、SEQ ID NO: 2で代表される塩基配列と相補的な塩基
配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイ
ブリダイズ可能な塩基配列によりコードされるアミノ酸
配列からなる、DNA修復促進活性を有するタンパク質を
要旨とする。さらに別の観点からは、第1の発明は、SEQ
ID NO: 1で示されるアミノ酸配列との間で少なくとも6
0％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは
少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％のアミ
ノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列からなる、DNA修
復促進活性を有するタンパク質を要旨とする。

【０００８】また、第2の発明は、SEQ ID NO: 2で示さ
れる塩基配列またはこれと縮重の関係にある塩基配列を
含むDNAを有し、かつDNA修復促進活性を有するタンパク
質をコードする塩基配列を要旨とする。別の観点から
は、第2の発明は、SEQ ID NO:2で示される塩基配列にお
いて1もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加
された塩基配列を含むDNAを有し、かつDNA修復促進活性
を有するタンパク質をコードする塩基配列を要旨とす
る。別の観点からは、第2の発明は、SEQ ID NO: 2で示
される塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリン
ジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配
列を含むDNAを有し、かつDNA修復促進活性を有するタン
パク質をコードする塩基配列を要旨とする。さらに別の
観点からは、第2の発明は、SEQ ID NO: 2で示される塩
基配列との間で少なくとも60％、より好ましくは少なく
とも70％、より好ましくは少なくとも80％、最も好まし
くは少なくとも90％の塩基配列相同性を有する塩基配列
を含むDNAを有し、かつDNA修復促進活性を有するタンパ
ク質をコードする塩基配列を要旨とする。

【０００９】さらに、第3の発明は、第1の発明のDNA修
復促進活性を有するタンパク質のいずれかをコードする
遺伝子あるいは第2の発明の遺伝子のいずれかを含有す
る組換えベクターを要旨とするものである。

【００１０】第4の発明は、上記第3の発明の組換えベク
ターのいずれかを含む形質転換体を、第5の発明は、こ
の第4の発明の形質転換体のいずれかを培地中で培養
し、培養物からDNA修復促進活性を有するタンパク質を
採取することを特徴とするDNA修復促進活性を有するタ
ンパク質の製造方法、をそれぞれ要旨とするものであ
る。

【００１１】また、第6の発明は、上記第1の発明のタン
パク質のいずれかに結合する抗体を要旨とするものであ
る。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の発明者らは、SEQ ID NO:
1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が、ニッ
クを有する開環状二本鎖および直鎖状二本鎖DNAとの間
で、DNA結合活性を有することを見出し、さらにDNAリガ
ーゼによるDNA鎖骨格エステル結合反応およびRecAによ
るDNA鎖交換反応を増大することを見出した。これらの
結果から、本発明の上記タンパク質がDNAリガーゼ修復
反応を促進する活性およびRecA鎖交換反応を促進する活
性を増大させることを通じて、DNA修復酵素による修復
反応を促進するタンパク質であることを見出し、本発明
を完成させるに至った。本発明の以下において、SEQ ID
NO: 1のアミノ酸配列を有するDNA修復促進活性を有す
るタンパク質を、PprAタンパク質と、また、PprAタンパ
ク質（SEQ ID NO: 1）をコードするSEQ ID NO: 2の塩基
配列を有する遺伝子を、pprA遺伝子と呼ぶ。

【００１３】すなわち、本発明のPprAタンパク質は、ニ
ックを有する開環状二本鎖および直鎖状二本鎖DNAと結
合し、DNAリガーゼ修復反応を促進する活性およびRecA
鎖交換反応を促進する活性を増大させ、その結果DNA修
復酵素による修復反応を促進することができる、DNA修
復促進活性を有するタンパク質である。

【００１４】本発明のDNA修復促進活性を有するタンパ
ク質は、典型的にはSEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配
列を有するが、該タンパク質は、例えば、DNAとの親和
性を向上する目的、活性を向上する目的、生産量の増加
または精製の容易化の目的、細胞内器官脂質膜通過の促
進の目的、その他の目的に資するように改変されたもの
であって、DNA修復促進活性を有するタンパク質を含
む。したがって、本発明のDNA修復促進活性を有するタ
ンパク質には、SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列だ
けでなく、SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列におい
て1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
加されたアミノ酸配列からなるDNA修復促進活性を有す
るタンパク質；SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列を
コードする、SEQ ID NO: 2で代表される塩基配列と相補
的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下にお
いてハイブリダイズ可能な塩基配列によりコードされる
アミノ酸配列からなる、DNA修復促進活性を有するタン
パク質；およびSEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列と
の間で少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70
％、より好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少
なくとも90％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配
列；からなる、DNA修復促進活性を有するタンパク質も
含まれる。

【００１５】本発明のDNA修復促進活性を有するタンパ
ク質をコードする塩基配列は、典型的には、SEQ ID NO:
1のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝
子をいい、具体的な塩基配列としては、SEQ ID NO: 2で
示される塩基配列またはこれと縮重の関係にある塩基配
列が含まれる。しかしながら、上述したように、本発明
のDNA修復促進活性を有するタンパク質にはPprAタンパ
ク質の改変体も含まれる。したがって、本発明のDNA修
復促進活性を有するタンパク質をコードする塩基配列に
は、SEQ ID NO: 2で示される塩基配列またはこれと縮重
の関係にある塩基配列だけでなく、SEQ ID NO: 2で示さ
れる塩基配列において1もしくは複数個の塩基が欠失、
置換もしくは付加された塩基配列；SEQ ID NO: 2で示さ
れる塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジ
ェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配
列；およびSEQ ID NO: 2で示される塩基配列との間で少
なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好
ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90
％の塩基配列相同性を有する塩基配列；を含むDNAを有
し、かつDNA修復促進活性を有するタンパク質をコード
する塩基配列に代表される遺伝子が含まれる。

【００１６】このような遺伝子の単離、およびこの遺伝
子を含有する組換えベクターの作製、組換えベクターに
よる形質転換体の作製、並びに形質転換体の培養等は、
公知の方法、例えば、SambrookおよびRussel（Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (200
1)）に記載されている方法を組み合わせることで行うこ
とができる。例えば、遺伝子は、SEQ ID NO: 2で示され
る塩基配列の両端部分の合成DNAをプローブとし、染色
体DNAを鋳型とするPCR法によって目的遺伝子を増幅する
方法等によって取得することができる。また、複数個の
合成DNAを用いてde novo合成することで取得することも
可能である。

【００１７】本発明においてタンパク質の「改変体」と
いう場合には、目的とするタンパク質のアミノ酸配列に
おいて1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列；目的とするタンパク質のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列と
の間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダ
イズ可能な塩基配列によりコードされるアミノ酸配列；
または目的とするタンパク質のアミノ酸配列との間で少
なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好
ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90
％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列；からな
るタンパク質も含むことを意味する。

【００１８】本発明においてDNA分子の「変異体」とい
う場合には、目的とする塩基配列と縮重の関係にある塩
基配列；目的とする塩基配列において1もしくは複数個
の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；目的
とする塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリン
ジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配
列；目的とする塩基配列との間で少なくとも60％、より
好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも
80％、最も好ましくは少なくとも90％の塩基配列相同性
を有する塩基配列；およびこれらの塩基配列との間で縮
重の関係にある塩基配列；を含むDNAが含まれる。

【００１９】上述したように、本発明のDNA修復促進活
性を有するタンパク質には、PprAタンパク質のアミノ酸
配列（SEQ ID NO: 1）において1もしくは複数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なるDNA修復促進活性を有するタンパク質が含まれる。
本発明のDNA修復促進活性を有するタンパク質をコード
する塩基配列にはまた、pprA遺伝子の塩基配列（SEQ ID
NO: 2）において1もしくは複数個の塩基が欠失、置換
もしくは付加された塩基配列を含むDNAを有し、かつDNA
修復促進活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
も含まれる。

【００２０】ここにおいて、「1もしくは複数個」と
は、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、最も
好ましくは1〜5個のことをいう。また、ここにおいてタ
ンパク質の場合、「欠失」、「置換」、「付加」は、Pp
rAタンパク質（SEQ ID NO: 1）と同様の性質を有するよ
うに生じるものをいう。また塩基配列の場合、「欠
失」、「置換」、「付加」は、pprA遺伝子の塩基配列
（SEQ ID NO: 2）において生じ、かつPprAタンパク質と
同様の性質を有するようなタンパク質をコードする塩基
配列を生じるものをいう。例えば、アミノ酸の「置換」
の場合には、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換、
例えばある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への
置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への
置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置
換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ
酸への置換、などの置換が含まれる。

【００２１】このような「欠失」、「置換」、「付加」
を有するタンパク質、または上述のような「欠失」、
「置換」、「付加」を有する塩基配列を作成するために
は、部位特異的変異生成（Site Directed Mutagenesi
s）、変異原処理やPCR増幅ミスを用いたランダム変異生
成（Random Mutagenesis）、カセット導入変異生成（Ca
ssette Mutagenesis）など、本発明の技術分野において
既知の様々な方法を用いることができる。

【００２２】上述したように、本発明のDNA修復促進活
性を有するタンパク質には、PprAタンパク質のアミノ酸
配列（SEQ ID NO: 1）をコードする、pprA遺伝子（SEQ
ID NO: 2）で代表される塩基配列と相補的な塩基配列と
の間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダ
イズ可能な塩基配列によりコードされるアミノ酸配列か
らなる、DNA修復促進活性を有するタンパク質が含まれ
る。本発明のDNA修復促進活性を有するタンパク質をコ
ードする塩基配列にはまた、pprA遺伝子の塩基配列（SE
Q ID NO: 2）と相補的な塩基配列との間で、ストリンジ
ェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列
を含むDNAを有し、かつDNA修復促進活性を有するタンパ
ク質をコードする塩基配列も含まれる。

【００２３】本発明において、ストリンジェントな条件
とは、目的の塩基配列が、PprAタンパク質（SEQ ID NO:
1）をコードする塩基配列（例えば、SEQ ID NO: 2）も
しくはこれと縮重の関係にある塩基配列との間で、特異
的にハイブリダイズ可能である条件をいう。ハイブリダ
イズ条件は、温度、イオン濃度などの条件を考慮して決
定されるが、一般的には温度が高いほど、またイオン濃
度が低いほどストリンジェントな程度が高くなることが
知られている。このようなストリンジェントな条件の設
定は、当業者であれば、例えば、SambrookおよびRussel
（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edit
ion (2001)）の記載に基づいて行うことができる。これ
らのストリンジェントな条件の具体的な例としては、例
えば、6×SSC、5×Denhardt's、0.1％SDS、25℃ないし6
8℃などのハイブリダイゼーション条件を使用すること
が考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温
度としては、より好ましくは45℃ないし68℃（ホルムア
ミド無し）または25℃ないし50℃（50％ホルムアミド）
を挙げることができる。

【００２４】上述したように、本発明のDNA修復促進活
性を有するタンパク質には、PprAタンパク質のアミノ酸
配列（SEQ ID NO: 1）との間で少なくとも60％、より好
ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80
％、最も好ましくは少なくとも90％のアミノ酸配列相同
性を有するアミノ酸配列からなる、DNA修復促進活性を
有するタンパク質が含まれる。本発明のDNA修復促進活
性を有するタンパク質をコードする塩基配列にはまた、
pprA遺伝子の塩基配列（SEQ ID NO: 2）との間で少なく
とも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好まし
くは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％の
塩基配列相同性を有する塩基配列を含むDNAを有し、か
つDNA修復促進活性を有するタンパク質をコードする塩
基配列に代表される遺伝子が含まれる。

【００２５】本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列
の配列相同性は、視覚的検査及び数学的計算により決定
してもよい。あるいは、2つのタンパク質配列の配列相
同性は、NeedlemanおよびWunsch（J. Mol Biol., 48: 4
43−453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィ
スコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGC
G）より入手可能なGAPコンピュータープログラムを用い
配列情報を比較することにより、決定してもよい。GAP
プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：
（1）HenikoffおよびHenikoff（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるよう
な、スコアリング・マトリックス、blosum62；（2）12
のギャップ加重；（3）4のギャップ長加重；および
（4）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれ
る。

【００２６】本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列
の配列相同性解析には、当業者に用いられる、配列比較
の他のプログラムもまた、用いてもよい。例えばAltsch
ulら（Nucl. Acids. Res. 25., p. 3389-3402, 1997）
に記載されているBLASTプログラムを用いて配列情報と
比較し決定することが可能である。具体的には、塩基配
列解析の場合、Nucleotide BLAST（BLASTN）プログラム
で、Query塩基配列を入力して、GenBank、EMBL、DDBJな
どの塩基配列データベースと照合することができる。ま
た、アミノ酸配列解析の場合、Protein BLAST（BLAST
P）プログラムで、Queryアミノ酸配列を入力して、GenB
ank CDS、PDB、SwissProt、PIRなどのアミノ酸配列デー
タベースと照合することができる。当該プログラムは、
インターネット上でNational Center for Biotechnolog
y Information（NCBI）、あるいはDNA Data Bank of Ja
pan（DDBJ）のウェブサイトから利用することが可能で
ある。BLASTプログラムによる相同性検索の各種条件
（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、
一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は
通常デフォルト値を用いて行う。当業者に用いられる、
配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。

【００２７】本発明の上述したPprAタンパク質のアミノ
酸配列（SEQ ID NO: 1）およびそのタンパク質をコード
するpprA遺伝子の塩基配列（SEQ ID NO: 2）に関して、
上述したような配列比較に基づいて配列相同性を検索し
たところ、本発明ののPprAタンパク質およびpprA遺伝子
は、従来から知られていたタンパク質および遺伝子のい
ずれとも、有意な配列相同性を有しないことがわかっ
た。

【００２８】本発明のpprA遺伝子は、例えば、Narumiら
（Gene, 198: 115-126, 1997）、Funayamaら（Mutat. R
es., 435: 151-161, 1999）、Narumiら（Mutat. Res.,
435:233-243, 1999）などの記載に基づいて、デイノコ
ッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans)
の放射線高感受性変異株に、放射線耐性野生株由来のDN
Aを導入して、変異株を変異原性刺激耐性に復帰させる
ことのできるクローンを選別することにより、クローニ
ングすることができる。具体的には：（1）デイノコッカス・ラジオデュランスの放射線高感
受性変異株に、放射線耐性野生株由来のコスミドライブ
ラリーのDNAを導入することによって、変異株を変異原
性刺激耐性に復帰させることのできるコスミドクローン
を選別すること；（2）（1）で得たコスミドクローン中に存在する目的遺
伝子の存在部位をさらに絞り込むために、上述のコスミ
ドクローン中のインサートを制限酵素で消化したものを
適切なベクター中に挿入したベクターを用いて改めて変
異株を形質転換して、該菌株を変異原性刺激耐性に復帰
させることのできるクローンを選別すること；（3）（2）で得たサブクローン中に存在する目的遺伝子
をさらに絞り込むために、当該サブクローンのnested d
eletionプラスミドを作製し、さらに変異株の形質転換
実験に供し、変異原性刺激耐性に復帰させる活性を持つ
DNA領域を特定し、クローニングすること；（4）（3）でクローニングされたインサートDNAの配列
を決定すること；のようにしてpprA遺伝子をクローニン
グすることができる。

【００２９】本発明の組換えベクターは、上記のように
してクローニングされたpprA遺伝子を、例えばSambrook
およびRussel（Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al,3rd edition (2001)）に記載されているような常法
に従い、ベクターDNAに組み込むことによって得ること
ができる。用いられるベクターとしては、例えば、pUC1
9（Takara Shuzo社製）、pBluescript II KS（+）（Str
atagene社製）、pET3a（Novagen社製）等が挙げられる
が、これらのものには限定されない。具体的には、ベク
ターのマルチクローニングサイトを1または2種類の適し
た制限酵素で切断し、一方クローニングされたpprA遺伝
子の両端を、上述した1または2種類の適した制限酵素に
よる切断断片と同一の粘着末端または平滑末端を形成す
ることができる1または2種類の適した制限酵素により切
断し、これらの開環し、両端に粘着末端または平滑末端
を有するベクターと、上述したように調製したpprA遺伝
子断片とを連結することにより、本発明の組換えベクタ
ーを作成することができる。

【００３０】このようにして得られた組換えベクター
を、SambrookおよびRussel（Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual, 3rd edition (2001)）、Hardin（Clon
ing, Gene Expression and Protein Purification: Exp
erimental Procedures and Process Rationale (200
1)）、Brown（Essential Molecular Biology: A Practi
calApproach, Vol. 1, 2nd edition (2001)）などに詳
細に記載されている形質転換法（ただし、これらには限
定されない）により、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、
ほ乳動物細胞等に導入することにより、DNA修復促進活
性を有するタンパク質発現性の形質転換体を得ることが
できるが、宿主として使用する細胞はこれらだけには限
定されない。具体的には、形質転換体を作成するために
は、上述して得られた組換えベクターを、当該技術分野
において既知の形質転換手法を用いて、宿主細胞内に送
達することにより行う。当該技術分野において既知の具
体的な形質転換手法には、バクテリオファージを用いる
方法、リポソームを用いる方法、パーティクル・ガン
法、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法など
が含まれるが、これらのものには限定されない。

【００３１】このようにして得られた形質転換体を用い
てDNA修復促進活性を有するタンパク質を製造する方法
としては、Simon（Protein Purification Techniques:
A Practical Approach, The Practical Approach Serie
s, 244, 2nd edition (2001)）、Simon（Protein Purif
ication Applications: A Practical Approach, ThePra
ctical Approach Series, 245, 2nd edition (200
1)）、Hardin（Cloning, Gene Expression and Protein
Purification: Experimental Procedures and Process
Rationale (2001)）などに詳細に記載されている方法
などが知られているが、これらには限定されない。具体
的には例えば、形質転換体をDNA修復促進活性を有する
タンパク質の生産に適しかつそれぞれの宿主の生育に適
した培養条件で培養し、集菌した細胞を超音波処理等で
破砕し、遠心分離することによって製造することができ
る。さらに、遠心上清を、市販のイオン交換樹脂、ゲル
濾過担体、アフィニティー樹脂等を用いて精製すること
ができる。さらに、このようにして得られたDNA修復促
進活性を有するタンパク質は、公知の方法、例えば、該
タンパク質をトリプシン、ペプシン等で消化して、目的
とする活性を有するドメインペプチドとして使用するこ
とができる。

【００３２】更に本発明は、DNA修復促進活性を有する
タンパク質を認識する抗体に関する。本発明による抗体
は、上記のように精製したDNA修復促進活性を有するタ
ンパク質またはその断片を用いて、Delves（Antibody P
roduction: Essential Techniques (1997)）、Hawardお
よびBethell（Basic Methods in Antibody Production
and Characterization (2000)）、KontermannおよびDub
el（Antibody Engineering: Springer Lab Manual (200
1)）などに詳細に記載されている公知の方法にしたがっ
て取得することができる。本発明の抗体は、ポリクロー
ナル抗体であることもできるし、モノクローナル抗体と
して得ることもできる。ポリクローナル抗体は、適当な
免疫動物にDNA修復促進活性を有するタンパク質、ある
いはその断片を免疫し、回収された血清から得ることが
できる。免疫動物としては、一般的にウサギ、ヒツジ、
ヤギ、モルモット、あるいはマウス等が用いられるが、
これらのものには限定されない。モノクローナル抗体
は、上述したDNA修復促進活性を有するタンパク質、あ
るいはその断片により免疫した動物の抗体産生細胞を回
収し、これをミエローマ細胞等の適当な融合パートナー
と細胞融合させてハイブリドーマ細胞を得、必要な活性
を持った抗体を産生するクローンを生育に適した培地中
で培養・クローニングし、そのクローニングされたハイ
ブリドーマ細胞を適した条件下で培養することにより、
その培養上清から取得することができる。さらに、この
ようにして得られたハイブリドーマ細胞を哺乳動物の腹
腔内で増殖させることにより抗体を産生させることもで
きる。免疫動物としては、例えば、マウス、ヌードマウ
ス、ラット、または、ニワトリなどが好ましい。このよ
うにして得られた抗体は、遠心分離、透析、硫酸アンモ
ニウム等による塩析、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの一
般的な単離、精製方法を用いて精製することができる。

【００３３】上述したように得ることができる本発明の
抗体は、DNA修復促進活性を有するタンパク質の精製、
検出、活性阻害等に利用することができる。本発明の抗
体は、公知の方法により、F（ab'）₂フラグメントある
いはFab'フラグメント化して用いることができる。ま
た、本発明の抗体をDNA修復促進活性を有するタンパク
質の検出に利用する場合には、放射性同位元素（例え
ば、³⁵Sや³H）や酵素（例えば、ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ）、あるいは適当な親和性リガンド（例
えば、アビジン-ビオチン）によって標識しておくこと
ができる。

【００３４】本発明のPprAタンパク質は、開環状二本鎖
DNAおよび直鎖状二本鎖DNAに結合する活性を有する。こ
のPprAタンパク質の活性を利用することによって、DNA
あるいはmRNAの高純度精製を行うことが可能である。

【００３５】例えば、高純度の閉環状二本鎖プラスミド
DNAは、DNAシークエンシング、あるいは欠失ライブラリ
ー作成を効率的に行うためのテンプレートとして必要で
ある。しかし、大腸菌等から既存の方法で抽出したプラ
スミドDNA中には、抽出操作過程でDNA鎖に切断が起きて
開環状二本鎖DNAおよび直鎖状二本鎖DNA成分が混在する
ことがある。このような開環状二本鎖DNAおよび直鎖状
二本鎖DNAは、本発明のPprAタンパク質を固定化したカ
ラムに通すこと等により除去することが可能である。し
たがって、本発明のPprAタンパク質は、閉環状二本鎖プ
ラスミドDNA抽出のためのキット中に含めることができ
る。

【００３６】また、DNAに特異的に結合するという特徴
を利用して、RT-PCR反応に擬陽性をもたらす原因となる
mRNAに混在するゲノムDNAを上述したPprA固定化カラム
に通すことなどによって除去し、高純度のmRNAを取得す
ることもできる。したがって、本発明のPprAタンパク質
は、高純度mRNA抽出のためのキット中に含めることがで
きる。

【００３７】さらに、本発明のPprAに対する抗体を固定
化したカラムを作成して、抗体とPprAとの結合反応を利
用して、上述のような高純度の閉環状二本鎖プラスミド
DNAやmRNAを取得することも可能である。

【００３８】輸入牛肉や果物等で、放射線滅菌処理が行
われているが、このような照射された食品の簡便な鑑別
法の開発が重要視されている。このような分野にもPprA
タンパク質と抗PprA抗体を利用できる。例えば、照射食
品の検知法の一つとして使用されているコメットアッセ
イ法と組み合わせることにより、DNA鎖切断の量をより
厳密に評価することができる。また、免疫組織学的検査
法等を用いて、照射された食品中のDNA切断の量を非照
射コントロールと比較することにより、より簡便に照射
食品の鑑別をすることができる。したがって、本発明の
PprAタンパク質は、場合により抗PprA抗体と組み合わせ
て、DNA切断の検出および／またはDNA切断量の測定のた
めのキット中に含めることができる。

【００３９】本発明のPprAタンパク質は、DNAリガーゼ
のDNA鎖骨格エステル結合反応を促進する活性を有す
る。DNAリガーゼは、遺伝子操作技術に最も頻繁に使用
される酵素の一つである。したがって、DNAリガーゼとP
prAタンパク質を組み合わせれば、効率的なリガーゼ反
応を有する研究用試薬を提供することが可能になるであ
ろう。また、耐熱性DNAリガーゼは、ライゲーション依
存性PCR法によるSNP（単一ヌクレオチド多型）検出に用
いられている。したがって、DNAリガーゼ促進活性を有
し、かつ耐熱性を揺するPprAタンパク質改変体は、遺伝
子診断のための効率的なライゲーション依存性PCR法の
開発に有用である。

【００４０】本発明のPprAタンパク質は、RecAタンパク
質のDNA鎖交換反応、すなわち相同性組換え活性を促進
する活性を有する。RecAの相同性組換え活性は、Ferrin
およびCamerini-Otero（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95: 2152-2157, 1997）、Ferrin（DNA Repair Protocol
s: Procaryotic Systems, Methods in Molecular Biolo
gy, Vol. 152: 135-147, 2000）に記載されているよう
に、制限酵素消化からの特定DNA領域の保護、メチル化
反応阻害を利用した制限酵素によるRARE消化、あるいは
RecA-assistedクローニング等、分子生物学的DNA操作技
術に応用されている。また、米国特許第4,9888,274号に
記載されているように、RecAの相同性組換え反応は、プ
ラスミドcDNAライブラリーの中から標的クローンを捕捉
することにより、スクリーニングを簡便にする技術にも
応用されている。本発明のPprAタンパク質とRecAを組み
合わせることによって、RecAの相同配列間のペアリング
を介した上記のような反応の効率化が行える。

【００４１】

【実施例】続いて実施例に基づいて、本発明を更に具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００４２】実施例1：pprA遺伝子のクローニングデイノコッカス・ラジオデュランスの放射線高感受性変
異株KH3111（Kitayamaet al., J. Bacteriol., 155: 12
00-1207, 1983）に、放射線耐性野生株由来のコスミド
ライブラリーのDNA（Narumi et al., Mutat. Res., Gen
e, 198: 115-126, 1997）を導入することによって、変
異株KH3111をマイトマイシンC（協和メディックス）耐
性に復帰させることのできるクローンを選別し、そして
このクローンからpDC144（42 kb）を得た（図１）。上
述の放射線耐性野生株由来のコスミドライブラリーの作
成は、簡単に述べると、制限酵素Mbo I（Takara Shuzo
社製）で部分消化した野生株KD8301のゲノムDNAを、Sup
erCos 1コスミドベクター（Stratagene社製）とパッケ
ージングして、大腸菌XL1-Blue MR株（Stratagene社
製）に組み込むことによって行った（Narumi et al., M
utat. Res., Gene, 198: 115-126, 1997）。

【００４３】デイノコッカス・ラジオデュランスの自然
形質転換法は、Kitayamaらの方法（Kitayama et al.,
J. Bacteriol., 155: 1200-1207, 1983）に従って行っ
た。簡単に述べれば、液体培養した菌体を、塩化カルシ
ウム存在下でDNAと混合した後、液体培地で培養して、
その後マイトマイシンCを含む選択寒天培地に塗布する
ことで行った。

【００４４】pDC144のDNAがマイトマイシンC耐性を付与
することは、このクローンのインサート中に変異原因遺
伝子が存在することを示している。そこで、目的遺伝子
の存在部位を絞り込むために、pDC144のインサートを制
限酵素で消化したものをpUC19（Takara Shuzo社製）に
サブクローニングし、このサブクローンを用いて改めて
変異株KH3111を形質転換して、該菌株をマイトマイシン
C耐性に復帰させることのできるクローンを選別した。
その結果、pDC144由来のSalI-BlnI断片（2.9 kb）を含
むプラスミドを得て、pZA11と命名した（図1）。

【００４５】続いて、目的遺伝子のpZA11での存在部位
をさらに絞り込むために、キロシークエンス用ディレー
ションキット（Takara Shuzo社製）を用いて、pZA11のn
ested deletionプラスミドを作製し、変異株KH3111の形
質転換実験に供した。その結果、変異株KH3111をマイト
マイシンC耐性に復帰させる活性を持つDNA領域を169bp
に限定することができた（図1）。

【００４６】pZA11のインサートDNAの配列を377DNAシー
クエンシング・システム（AppliedBiosystems社製）を
用いて決定したところ、上記の169 bpを含むDNA領域に8
55 bpからなるオープンリーディングフレーム（SEQ ID
NO: 2）を見いだした。

【００４７】このオープンリーディングフレームの配列
から予想されるアミノ酸配列（SEQID NO: 1）は、配列
既知のいずれのタンパク質とも相同性がなく、新規のタ
ンパク質であった。そこで、変異株KH3111のDNA修復欠
損を復帰させる該遺伝子をpprAと命名し、この遺伝子が
コードする新規DNA修復関連タンパク質をPprAと命名し
た。

【００４８】実施例2： pprA遺伝子の検出本実施例においては、pprA遺伝子のサザンハイブリダイ
ゼーションによる検出を行った。pprA遺伝子を検出する
ために、本発明のpprA遺伝子を単離するために使用した
KD8301株の親株であり、5種類の色素成分をもつデイノ
コッカス・ラジオデュランスR₁株（ATCC 13939）、およ
びR₁株と同一の色素成分の1種類の他にR ₁株とは異なる5
種類の色素成分をもつという特徴を有するデイノコッカ
ス・ラジオデュランスSark株（ATCC 35073）を使用し
た。デイノコッカス・ラジオデュランスSark株は、R₁株
と同じ種に属するものの、異なる系統株として確立され
たものである。

【００４９】デイノコッカス・ラジオデュランスR₁株お
よびSark株から、Kikuchiら（FEMSMicrobiol. Lett., 1
74: 151-157, 1999）の方法にしたがって調製した制限
酵素消化ゲノムDNAを、パルスフィールドゲル電気泳動
に供し、続いてSambrookおよびRussel（Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)）に記
載されている方法に従うサザンブロット解析に供した。
具体的には、以下のように行った。

【００５０】1％低融点アガロースGB（Nippon Gene社
製）に包埋した菌体を、1 mg/mlリゾチーム（Sigma社
製）を含むバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、40 m
M EDTA、50 mMスクロース、0.1％Triton X-100）1 ml
中、37℃で24時間処理した。続いて1 mg/mlのProteinas
e K（Quiagen社製）を含む上記バッファー中、50℃で24
時間処理した。その後、100μlの制限酵素反応用バッフ
ァー（50 mM Tris-HCl、pH7.5、10 mM MgCl₂、1 mMジチ
オスレイトール、100 mM NaCl、0.01％ウシ胎児血清ア
ルブミン、0.01％Triton X-100）中、30 Uの制限酵素No
tI（Takara Shuzo社製）により、37℃にて24時間消化し
た。その後、Geneline I（Beckman社製）を用いて、150
mAの定電流および20秒のスイッチ時間という条件に
て、16時間かけて1％アガロースHS（Nippon Gene社製）
ゲルを用いてTAFEバッファー（10 mM Tris-HCl、0.5 mM
EDTA、4.4 mM酢酸）中でパルスフィールドゲル電気泳
動することにより、制限酵素消化されたゲノムDNAを分
画した。

【００５１】電気泳動が終了した後、ゲル中で分画した
制限酵素消化ゲノムDNAを、常法に従って、アルカリバ
ッファー（0.4 N NaOH、1 M NaCl）中で24時間、ナイロ
ンメンブレン（Roche Diagnostics社製）に転写した。
その後、メンブレンを80℃で2時間加熱処理して、メン
ブレン上に制限酵素消化ゲノムDNAを固定化した。

【００５２】実施例1にて単離したpprA遺伝子の構造遺
伝子配列（塩基配列1〜855）を有するDNA断片を、DIG D
NAラベリングキット（Roche Diagnostics社製）を用い
てジゴキシゲニン標識したものをプローブとして使用
し、制限酵素消化DNAを固定化したメンブレンとの間
で、ストリンジェントな条件下、ハイブリダイゼーショ
ン反応を行った。具体的には、ハイブリダイゼーション
反応は、ハイブリダイゼーション溶液（5×SSC、1％ブ
ロッキング溶液、0.1％N-ラウリルザルコシン、0.02％S
DS）を用いて、68℃、18時間かけて行った。その後、反
応させたメンブレンを高イオン強度バッファー（2×SS
C、0.1％SDS）を用いて室温で5分、2回洗浄し、さら
に、低イオン強度バッファー（0.1×SSC、0.1％SDS）を
用いて68℃で15分、2回洗浄し、その後使用したプロー
ブの標識をDIG DNA検出キット（Roche Diagnostics社
製）を用いて検出した。

【００５３】結果を図2に示す。各レーンには以下のも
のをロードした：レーン1：分子量マーカーレーン2：デイノコッカス・ラジオデュランスR₁株レーン3：デイノコッカス・ラジオデュランスSark株レーン4：分子量マーカーレーン5：デイノコッカス・ラジオデュランスR₁株レーン6：デイノコッカス・ラジオデュランスSark株。
レーン1〜3は、臭化エチジウム染色をした電気泳動ゲル
を、レーン4〜6は、サザンハイブリダイゼーションの結
果を示している。

【００５４】図2からも明らかなように、デイノコッカ
ス・ラジオデュランスR₁株とSark株のゲノムDNAをNotI
により消化した場合、DNA断片のパターンが全く異なっ
ていた。これは、R₁株とSark株が同じデイノコッカス属
に属する細菌であるが、本来は他の種あるいは他の亜種
に分類されるべき細菌であることがわかる。そして本発
明のpprA遺伝子は上記R₁株由来の菌株から単離されたも
のであるが、レーン6のSark株からも同じくpprA遺伝子
が検出された。

【００５５】実施例3：PprA過剰生産プラスミドの作製デイノコッカス・ラジオデュランスの新規DNA修復関連
タンパク質PprAの過剰生産を行うために、以下の2種類
のオリゴヌクレオチドを設計した。プライマー1 5'-GGGCATAATA AAGGCCATAT GGCAAGGGCT AAAGC-3' プライマー2 5'-TTTTGGATCC TCAGCTCTCG CGCAGGCCGT GC-3' pZA11を鋳型として、上記のセンス・プライマーとアン
チセンス・プライマーを用いてPCR反応を行い、得られ
たPCR産物を制限酵素NdeIおよびBamHIで消化し、大腸菌
発現ベクターpET3a（Novagen社製）のNdeI-BamHI部位に
サブクローニングし、これをpET3pprAwt（図3）と命名
した。

【００５６】実施例3：形質転換体の作製とタンパク質
粗精製物の製造野生型を得るために、pET3pprAwtプラスミド（図3）を
用いて大腸菌BL21（DE3）pLysS（Novagen社製）を形質
転換した。個々の形質転換体をアンピシリンおよびクロ
ラムフェニコールを含むLB培地（BD Bioscience社製）
で培養し、波長600nmでの吸光度が0.6に達した時点で、
終濃度0.4 mMのIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクト
ピラノシド、Takara Shuzo社製）を添加して、タンパク
質の誘導を行った。

【００５７】さらに３時間培養を続けたのち、遠心分離
により形質転換体の細胞ペレットを得た。細胞ペレット
を溶菌緩衝液（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM EDTA, 1
mM PMSF）に懸濁して、超音波破砕を行った。ついで、
8,000 rpmにおいて30分間遠心分離することにより上澄
を採取し、タンパク質粗精製物を得た。

【００５８】これをSDS-PAGEに供し、タンパク質の発現
を確認した（図4）。発現したタンパク質の分子量は31.
6 kDaであり、SEQ ID NO: 1に示した配列から予想され
る分子量と一致した。また、粗精製物と直鎖状二本鎖の
pUC19（Takara Shuzo社製）DNAを混合して、緩衝液（10
mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂）中で30分間イン
キュベートしたのち、アガロースゲル電気泳動に供した
ところ、野生型のタンパク質がDNA結合能を持つことが
わかった（図5）。

【００５９】実施例4：野生型PprAの精製上記粗精製で得られたタンパク質を、ポリアミン処理、
硫酸アンモニウムによる塩析、DEAEセファロースCL-6B
カラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biote
ch社製）、セファクリルS-300ゲル濾過（Amersham Phar
macia Biotech社製）、およびモノQカラムクロマトグラ
フィー（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いて精
製して、野生型のタンパク質を回収した（図6）。

【００６０】実施例5：PprAの性質の検討（1）N末端アミノ酸配列の確認実施例4の方法で精製したタンパク質を、SDS-PAGEに供
し、メンブランフィルター（Millipore社製）に転写
後、PSQ-1プロテインシーケンサー（Shimadzu社製）を
用いてN末端アミノ酸配列を決定した。その結果、分析
することができた12個のアミノ酸のすべてがSEQ ID NO:
1に示した配列と一致した。

【００６１】（2）DNA結合能の確認実施例4の方法で精製したタンパク質のDNA結合能の詳細
な検討を行った。まず、閉環状二本鎖、開環状二本鎖、
環状一本鎖、および直鎖状二本鎖のφX174DNA（New Eng
land Biolabs社製）を調製した。次に、これらのDNA
と、実施例4の方法で精製したタンパク質を緩衝液（10
mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂）中で10分間反応さ
せた後、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルシフト分
析を行った（図7）。ニックを有する開環状二本鎖およ
び直鎖状二本鎖DNAのみにPprAとの特異的な結合が見ら
れたことから、PprAはDNAの鎖切断損傷を認識して結合
することでDNA修復に関与することが示唆された。

【００６２】（3）DNAリガーゼ修復反応を促進する活性
の確認 DNAリガーゼによるDNA鎖骨格エステル結合反応に対する
PprAの効果を調べた。基質DNAには、（2）で調製した直
鎖状二本鎖φX174DNAを用いた。基質DNAと、T4DNAリガ
ーゼ（Promega社製）または大腸菌DNAリガーゼ（Takara
Shuzo社製）、および実施例４の方法で精製したタンパ
ク質を混合し、10分間インキュベートした後、DNAをフ
ェノール処理およびエタノール沈殿によって精製し、ア
ガロースゲル電気泳動に供した。その結果、PprAの添加
により最大55.3％のDNA結合産物の増加が見られ、PprA
のDNAリガーゼ修復反応促進活性が確認された（図8）。

【００６３】（4）DNAリガーゼ修復反応促進活性のpprA
濃度依存性（3）に記載する実験と同様の実験を行い、DNA結合産物
の割合を定量し、さらにPprAの濃度について検討した。

【００６４】T4 DNAリガーゼを使用した場合（A）およ
び大腸菌DNAリガーゼを使用した場合（B）のいずれにお
いても、7.5 ng/μlの基質DNAに対して、50 ng/μlのPp
rAタンパク質を添加したときに、最大促進効果がみられ
る（図9）。T4 DNAリガーゼの場合には、PprAタンパク
質無添加時の産物の割合32.9％に対して、50 ng/μlのP
prAタンパク質添加時には、88.2％に増加した。また、
大腸菌DNAリガーゼの場合には、PprA無添加時の産物の
割合4.3％に対して、50 ng/μlのPprA添加時には30.3％
に増加している（図9）。

【００６５】（5）RecA鎖交換反応を促進する活性の確
認組換えタンパク質RecAによるDNA鎖交換反応に対するPpr
Aの効果を調べた。RecAは、大腸菌RecA（Promega社製）
を用いた。基質DNAとして、閉環状二本鎖φX174DNAを制
限酵素HincII（Takara Shuzo社製）で消化したものおよ
び環状一本鎖φX174DNAを用いた。DNA鎖交換反応は、Mu
ller等の方法（Muller et al., Methodsin Mol. Biol.,
30, 413-423, 1994）に従って行った。その結果、PprA
の添加により最大20％の鎖交換産物の増加が見られ、Pp
rAのRecA鎖交換反応促進活性が確認された（図10）。以
上の結果から、PprAがDNA修復酵素による修復反応を促
進するタンパク質であるとの結論に至った。

【００６６】実施例６：DNA修復促進活性を有するタン
パク質PprAを認識するポリクローナル抗体の作製（1）ポリクローナル抗体の調製実施例4に示した方法で製造した精製タンパク質を抗原
としてフロイントの油性アジュバントとのエマルジョン
100μlをウサギ1羽に皮下免疫した。半月に一回、同量
の抗原とフロイントの油性アジュバントとのエマルジョ
ンを追加免疫した（計6回）。さらに1ヶ月後に全採血し
た。血液の遠心分離により血清を得、熱処理により非動
化した後、0.05％のNaN₃を加えて、-80℃にて保存し
た。

【００６７】（2）ポリクローナル抗体の特異性デイノコッカス・ラジオデュランスの細胞中に存在する
PprAを検出することで、抗体の特異性を検討した。ま
ず、Funayamaらの方法（Funayama et al., Mutat. Re
s., 435: 151-161, 1999）に従って、クロラムフェニコ
ール耐性遺伝子カセット導入法によるpprA遺伝子の破壊
株作製を行い、破壊株XN1を得た。

【００６８】次に、該細菌の野生株、変異株KH311、並
びに上記で作製した破壊株XN1を2 kGyのガンマ線で照射
後、2時間振とう培養を行った。その後、集菌した菌体
をガラスビーズを用いて破砕し、遠心操作により、タン
パク質抽出物を調製した。これをSDS-PAGEに供し、メン
ブランフィルター（Millipore社製）にタンパク質を転
写後、上記（1）で調製した抗体を用いてウエスタンブ
ロット分析を行った。その結果、野生株および変異株KH
3111ではPprAが検出されたが、pprA遺伝子破壊株では検
出されなかった（図11）。このことから、調製した抗体
の特異性が立証された。また、この抗体を用いること
で、PprAが放射線誘導性であることが分かった。

【００６９】

【発明の効果】本発明は、新規のDNA修復促進活性を有
するタンパク質を提供する。DNAリガーゼ、DNAポリメラ
ーゼ、ヌクレアーゼなどの既知修復酵素は研究用試薬と
して遺伝子操作技術に使用され、またDNAを被検対象と
する臨床検査診断薬としても用いられている。したがっ
て、既知の修復酵素の反応を促進する活性を有するタン
パク質は、さらに効率的な研究用試薬、臨床検査診断薬
等の開発に資することができる。また、本発明のDNA修
復促進活性を有するタンパク質がDNAの鎖切断を認識し
て特異的に結合することを利用すれば、DNA中の鎖切断
部位の検出や他のDNA操作技術に用いる試薬を新規に開
発することができる。さらに、本発明のDNA修復促進活
性を有するタンパク質認識抗体と組み合わせることによ
って、上記の研究用あるいは診断用試薬の反応系を制
御、あるいは検出感度を向上させることができる。また
この抗体は、DNA修復促進活性を有するタンパク質PprA
に結合するタンパク質を捕捉することにも使用でき、放
射線抵抗性細菌のDNA修復機構解明に資することができ
る。さらに、デイノコッカス・ラジオデュランス以外の
生物からDNA修復促進活性を有するタンパク質を検索す
ることにも用いることができる。

【００７０】

【配列表】 <110> 日本原子力研究所（Japan Atomic Energy Research Institute） <120> DNA repair promoting protein. <130> 011477 <160> 6 <200> 1 <211> 284 <212> PRT <213> Deinococcus radiodurans, strain KD8301 <220> <223> Amino acid sequence of DNA repair promoting protein of Deinococcu s radiodurans, strain KD8301. <400> 1 atg gca agg gct aaa gca aaa gac caa acg gac ggc atc tac gcc gcc 48 Met Ala Arg Ala Lys Ala Lys Asp Gln Thr Asp Gly Ile Tyr Ala Ala 1 5 10 15 ttc gac acc ttg atg agc acg gcg ggc gtg gac agc cag atc gcc gcc 96 Phe Asp Thr Leu Met Ser Thr Ala Gly Val Asp Ser Gln Ile Ala Ala 20 25 30 ctc gcc gcg agt gag gcc gac gcg ggc acg ctg gac gcg gcg ctc acg 144 Leu Ala Ala Ser Glu Ala Asp Ala Gly Thr Leu Asp Ala Ala Leu Thr 35 40 45 cag tcc ttg caa gaa gcg cag ggg cgc tgg ggg ctg ggg ctg cac cac 192 Gln Ser Leu Gln Glu Ala Gln Gly Arg Trp Gly Leu Gly Leu His His 50 55 60 ctg cgc cat gag gcg cgg ctg acc gac gac ggc gac atc gaa att ctg 240 Leu Arg His Glu Ala Arg Leu Thr Asp Asp Gly Asp Ile Glu Ile Leu 65 70 75 80 acc gat ggc cgc ccc agc gcc cgc gtg agc gag ggc ttc gga gca ctc 288 Thr Asp Gly Arg Pro Ser Ala Arg Val Ser Glu Gly Phe Gly Ala Leu 85 90 95 gcg cag gcc tac gcg ccc atg cag gcg ctc gac gaa cgc ggc ctg agc 336 Ala Gln Ala Tyr Ala Pro Met Gln Ala Leu Asp Glu Arg Gly Leu Ser 100 105 110 cag tgg gcg gcg ctc ggc gag ggc tac cgc gct ccc ggc gac ttg ccg 384 Gln Trp Ala Ala Leu Gly Glu Gly Tyr Arg Ala Pro Gly Asp Leu Pro 115 120 125 ttg gcg cag ctc aag gtg ctg atc gag cac gcc cgc gac ttc gaa acc 432 Leu Ala Gln Leu Lys Val Leu Ile Glu His Ala Arg Asp Phe Glu Thr 130 135 140 gac tgg tcg gcg ggg cgc ggc gaa acc ttt cag cgc gtg tgg cgc aag 480 Asp Trp Ser Ala Gly Arg Gly Glu Thr Phe Gln Arg Val Trp Arg Lys 145 150 155 160 ggc gac acc ctg ttt gtc gag gtg gcc cgg ccc gcg tcc gcc gag gcc 528 Gly Asp Thr Leu Phe Val Glu Val Ala Arg Pro Ala Ser Ala Glu Ala 165 170 175 gcg ctc tcc gac gct gcc tgg gac gtg atc gcc agc atc aag gac cgc 576 Ala Leu Ser Asp Ala Ala Trp Asp Val Ile Ala Ser Ile Lys Asp Arg 180 185 190 gcc ttc cag cgt gag ctg atg cgc cgc agc gag aag gac ggg atg ctc 624 Ala Phe Gln Arg Glu Leu Met Arg Arg Ser Glu Lys Asp Gly Met Leu 195 200 205 ggc gcc ctg ctc ggg gct cgc cac gcc ggg gcc aag gcc aac ctc gcc 672 Gly Ala Leu Leu Gly Ala Arg His Ala Gly Ala Lys Ala Asn Leu Ala 210 215 220 cag ctg ccc gaa gcg cac ttc acc gtg cag gcg ttc gtg cag acc ctc 720 Gln Leu Pro Glu Ala His Phe Thr Val Gln Ala Phe Val Gln Thr Leu 225 230 235 240 agc gga gcc gcc gcc cgc aac gcc gag gag tac cgc gcg gcc ctg aaa 768 Ser Gly Ala Ala Ala Arg Asn Ala Glu Glu Tyr Arg Ala Ala Leu Lys 245 250 255 acc gcc gcc gct gcg ctg gag gaa tac cag ggc gtg acc acc cgc caa 816 Thr Ala Ala Ala Ala Leu Glu Glu Tyr Gln Gly Val Thr Thr Arg Gln 260 265 270 ctg tcc gaa gtg ctg cgg cac ggc ctg cgc gag agc tga 855 Leu Ser Glu Val Leu Arg His Gly Leu Arg Glu Ser Sto 275 280 285 <200> 2 <211> 855 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans, strain KD8301 <220> <223> Nucleotide sequence of DNA repair promoting protein of Deinococcu s radiodurans, strain KD8301. <400> 2 atggcaaggg ctaaagcaaa agaccaaacg gacggcatct acgccgcctt cgacaccttg 60 atgagcacgg cgggcgtgga cagccagatc gccgccctcg ccgcgagtga ggccgacgcg 120 ggcacgctgg acgcggcgct cacgcagtcc ttgcaagaag cgcaggggcg ctgggggctg 180 gggctgcacc acctgcgcca tgaggcgcgg ctgaccgacg acggcgacat cgaaattctg 240 accgatggcc gccccagcgc ccgcgtgagc gagggcttcg gagcactcgc gcaggcctac 300 gcgcccatgc aggcgctcga cgaacgcggc ctgagccagt gggcggcgct cggcgagggc 360 taccgcgctc ccggcgactt gccgttggcg cagctcaagg tgctgatcga gcacgcccgc 420 gacttcgaaa ccgactggtc ggcggggcgc ggcgaaacct ttcagcgcgt gtggcgcaag 480 ggcgacaccc tgtttgtcga ggtggcccgg cccgcgtccg ccgaggccgc gctctccgac 540 gctgcctggg acgtgatcgc cagcatcaag gaccgcgcct tccagcgtga gctgatgcgc 600 cgcagcgaga aggacgggat gctcggcgcc ctgctcgggg ctcgccacgc cggggccaag 660 gccaacctcg cccagctgcc cgaagcgcac ttcaccgtgc aggcgttcgt gcagaccctc 720 agcggagccg ccgcccgcaa cgccgaggag taccgcgcgg ccctgaaaac cgccgccgct 780 gcgctggagg aataccaggg cgtgaccacc cgccaactgt ccgaagtgct gcggcacggc 840 ctgcgcgaga gctga 855 <200> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense primer for amplifying pprA gene. <400> 3 gggcataata aaggccatat ggcaagggct aaagc 35 <200> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense primer for amplifying pprA gene. <400> 4 ttttggatcc tcagctctcg cgcaggccgt gc 32

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、pDC144とpZA11インサート部分の構造
を示す模式図を示す。

【図２】図2は、pprA遺伝子のサザンハイブリダイゼ
ーションによる検出結果を示す。各レーンは、以下のサ
ンプルに対応する。レーン1〜3は、臭化エチジウム染色
をした電気泳動ゲルを、レーン4〜6は、サザンハイブリ
ダイゼーションの結果を示している。レーン1：分子量マーカーレーン2：デイノコッカス・ラジオデュランスR₁株レーン3：デイノコッカス・ラジオデュランスSark株レーン4：分子量マーカーレーン5：デイノコッカス・ラジオデュランスR₁株レーン6：デイノコッカス・ラジオデュランスSark株

【図３】図3は、pET3pprAwtの構造を示す模式図を示
す。小文字の配列部分は野生型pprAの翻訳領域を示す。

【図４】図4は、タンパク質粗精製物のSDS-PAGEのク
マシー染色像を示す。レーン1は、以下の培養物に対応
する。レーン1：大腸菌BL21（DE3）pLysS pET3pprAwt

【図５】図5は、タンパク質粗精製物による直鎖状二
本鎖DNAのゲルシフト像を示す。各レーンは、以下のサ
ンプルに対応する。レーン1：直鎖状二本鎖pUC19 DNA レーン2：大腸菌BL21（DE3）pLysS pET3pprAwtのタンパ
ク質粗精製物レーン3：2に直鎖状二本鎖pUC19 DNAを加えたもの

【図６】図6は、PprAの各精製過程におけるSDS-PAGE
のクマシー染色像を示す。各レーンは、以下のサンプル
に対応する。レーン1：超音波破砕上澄レーン2：ポリアミン処理レーン3：硫酸アンモニウム処理レーン4：DEAEセファロースCL-6Bカラムクロマトグラフ
ィーレーン5：セファクリルS-300ゲル濾過レーン6：モノQカラムクロマトグラフィー

【図７】図7は、PprAのDNA結合能を示す写真を示す。
各レーンは、以下のサンプルに対応する。レーン1：閉環状二本鎖および開環状二本鎖φX174 DNA レーン2：1にPprAを添加したものレーン3：直鎖状二本鎖および環状一本鎖φX174 DNA レーン4：3にPprAを添加したもの

【図８】図8は、PprAによるDNAリガーゼ修復反応促進
活性の結果を示す写真を示す。各レーンは、以下のサン
プルに対応する。レーン1：直鎖状二本鎖φX174 DNA レーン2：1にPprAを添加したものレーン3：1にT4 DNAリガーゼを添加したものレーン4：3にさらにPprAを添加したものレーン5：1に大腸菌DNAリガーゼを添加したものレーン6：5にさらにPprAを添加したもの

【図９】図9は、DNAリガーゼ修復反応促進活性のpprA
濃度依存性について、T4 DNAリガーゼを使用した場合
（A）および大腸菌DNAリガーゼを使用した場合（B）の
それぞれの結果を表すグラフを示す。

【図１０】図10は、PprAによるRecA鎖交換反応促進活
性の結果を示す写真を示す。各レーンは、以下のサンプ
ルに対応する。レーン1：基質DNAのみレーン2：1に大腸菌RecAを添加したものレーン3：2にさらにPprAを添加したもの

【図１１】図11は、デイノコッカス・ラジオデュラン
ス細胞内におけるPprAのウエスタンブロット法による分
析結果を示す写真を示す。各レーンは、以下のサンプル
に対応する。レーン1：ガンマ線非照射野生株レーン2：ガンマ線照射野生株レーン3：ガンマ線非照射変異株KH3111 レーン4：ガンマ線照射変異株KH3111 レーン5：ガンマ線非照射遺伝子破壊株XN1 レーン6：ガンマ線照射遺伝子破壊株XN1

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (72)発明者崔素珍群馬県高崎市綿貫町1233番地日本原子力研究所高崎研究所内 (72)発明者北山滋群馬県高崎市綿貫町1233番地日本原子力研究所高崎研究所内 (72)発明者渡辺宏群馬県高崎市綿貫町1233番地日本原子力研究所高崎研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA50 BA80 CA02 DA06 EA04 GA11 HA12 HA17 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 CE04 CE07 CE12 DA13 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA11 DA76 EA50 FA74 GA06 GA22 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列ま
たはSEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列において1も
しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され
たアミノ酸配列からなる、DNA修復促進活性を有するタ
ンパク質。
【請求項２】 SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列ま
たはSEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェン
トな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列によ
りコードされるアミノ酸配列からなる、DNA修復促進活
性を有するタンパク質。
【請求項３】 SEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列ま
たはSEQ ID NO: 1で示されるアミノ酸配列との間で少な
くとも60％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列
からなる、DNA修復促進活性を有するタンパク質。
【請求項４】 SEQ ID NO: 2で示される塩基配列または
SEQ ID NO: 2で示される塩基配列において1もしくは複
数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列か
らなるDNAを有し、かつDNA修復促進活性を有するタンパ
ク質をコードする塩基配列を有するDNA。
【請求項５】 SEQ ID NO: 2で示される塩基配列または
SEQ ID NO: 2で示される塩基配列と相補的な塩基配列と
の間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダ
イズ可能な塩基配列からなるDNAを有し、かつDNA修復促
進活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有す
るDNA。
【請求項６】 SEQ ID NO: 2で示される塩基配列との間
で少なくとも60％の塩基配列相同性を有する塩基配列を
含むDNAを有し、かつDNA修復促進活性を有するタンパク
質をコードする塩基配列を有するDNA。
【請求項７】請求項１〜3のいずれか1項に記載のタン
パク質をコードする塩基配列を有するDNAを含有する組
換えベクター。
【請求項８】請求項4〜6のいずれか1項に記載のDNAを
含有する組換えベクター。
【請求項９】請求項7または8記載の組換えベクターを
含む形質転換体。
【請求項１０】請求項9記載の形質転換体を培地中で
培養し、培養物からDNA修復促進活性を有するタンパク
質を採取することからなる、DNA修復促進活性を有する
タンパク質の製造法。
【請求項１１】請求項１〜3のいずれか1項に記載のタ
ンパク質に結合する抗体。