CN110317881A - 一种用于鉴别鹿角的荧光pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其以待测鹿角的基因DNA为模板，采用引物探针组合物进行荧光PCR，根据是否出现扩增曲线以及扩增曲线的Ct值大小判定待测样品是否为正品鹿角或是否含有正品鹿角成分；引物探针组合物包括分别为如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示序列的引物F1、引物R1、探针P1；上述引物、探针也可为将其对应的序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该对应的序列具有相同功能的DNA分子。本发明所述的荧光PCR检测方法在提供真假鹿角的定性检测的同时可以精确定量起始DNA拷贝数，具有简单，快速，高特异性和高灵敏度的特点。

Description

一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法。
背景技术
中国药典2015年版规定鹿角来源为马鹿和梅花鹿，其饮片规格为极薄片和鹿角粉，无法从性状上加以区分，也没有专属的鉴别方法，造成了造假的重灾区，给鹿角市场造成了巨大冲击。
根据有关文献报道，目前已出现从DNA分子水平对物种加以界定，每个物种的DNA序列都存在有一定的不同，根据序列的SNP位点来设计特异性引物和探针组合可以对物种进行有效鉴别，采用该分子水平的界别可作为传统形态鉴别方法的有效补充。
发明内容
为了克服现有技术所存在的缺陷，本发明提供一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，该检测方法具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率好，具有很高的可行性与应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其包括以下步骤：以待测鹿角的基因DNA为模板，采用引物探针组合物进行荧光PCR，根据是否出现扩增曲线以及扩增曲线的Ct值大小进行判定待测样品是否为正品鹿角或是否含有正品鹿角成分；
其中，所述引物组合物包括：引物F1、引物R1、探针P1；所述引物F1为如SEQ IDNo.1所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如SEQ ID No.2所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.2所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述探针P1为如SEQ ID No.3所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.3所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子。
上述引物、探针的具体序列如下：
引物F1：5'-CGTCTGAATCGGATTCGAAAT-3'(SEQ ID No.1)；
引物R1：5'-AGTGAGAGCCATTGTTATGAA-3'(SEQ ID No.2)；
探针P1：5'-CACGAGCCACAGAGGCAGCA-3'(SEQ ID No.3)。
进一步地，所述探针P1由荧光基团和荧光淬灭基团修饰；其中，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA。更优选为，所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
进一步地，荧光PCR采用的反应体系为：2×TaqMan Master Mix10μL，引物F1、引物R1、探针P1各0.5μL，DNA模板2μL，双蒸水6.5μL。
进一步地，各引物、探针在反应体系中的浓度均为250nM，DNA模板在反应体系中的浓度为5ng/μL。
进一步地，所述反应体系的配制如下表所示：
进一步地，所述方法还设置阳性对照、阴性对照以及空白对照。
进一步地，荧光PCR扩增程序为，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共30个循环。
进一步地，结果判定具体为：若待测样品具有扩增曲线，并且Ct值<25，说明待测样品为正品鹿角或含有正品鹿角成分；若待测样品不具有扩增曲线，说明待测样品为伪品鹿角。
进一步地，上述用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法还包括对待测样本进行精确定量的步骤，其包括：分别计算正品鹿角的标准质粒DNA拷贝数；将正品鹿角标准质粒DNA分别按10×逐级稀释5个梯度；以标准品为模板，进行实时荧光PCR检测，生成标准曲线，应用所述标准曲线对未知待测样本进行精确定量。
进一步地，所述正品鹿角为马鹿和/或梅花鹿，所述伪品鹿角包括其余18种鹿科动物以及猪、牛、羊，所述其余18种鹿科动物包括鹿亚科鹿属：白唇鹿，水鹿，坡鹿，泽鹿；麋鹿属：麋鹿；黇鹿属：黇鹿；花鹿属：斑鹿，豚鹿。麂亚科毛冠鹿属：毛冠鹿；麂属：小麂，赤麂，黑麂。空齿鹿亚科驯鹿属：驯鹿；驼鹿属：驼鹿；狍属：狍子；空齿鹿属：白尾鹿，黑尾鹿。獐亚科獐属：獐。
进一步地，所述梅花鹿、马鹿样品的起始DNA拷贝数分别为2.42×1011copies/μL和1.82×1010copies/μL；所述梅花鹿、马鹿样品的最低检测限分别为7.680×107copies/μL和8.494×107copies/μL。
本发明的第二个方面是提供一种用于上述荧光PCR检测方法中的试剂盒，其包括引物F1、引物R1和探针P1；其中，所述引物F1为如SEQ ID No.1所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如SEQ ID No.2所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.2所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述探针P1为如SEQ ID No.3所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ IDNo.3所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子。
进一步地，所述探针P1由荧光基团和荧光淬灭基团修饰。
进一步地，所述荧光基团为FAM荧光基团；所述荧光淬灭基团为BHQ1荧光淬灭基团。
进一步地，所述试剂盒中，各引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM。
进一步地，所述试剂盒还包括：2×TaqMan Master Mix，DNA模板和双蒸水。
进一步地，所述试剂盒采用的20μLPCR扩增体系为：2×TaqMan Master Mix10μL，各引物及探针0.5μL，DNA模板2μL，双蒸水补足20μL.
进一步地，上述的荧光PCR检测试剂盒，还包括正品鹿角阳性对照品、阴性对照品以及空白对照品。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明采用荧光PCR检测引物、探针组合实现正品鹿角(马鹿、梅花鹿)和伪品鹿角的定性及定量检测方法，在提供真假鹿角的定性检测的同时可以较为精确定量，具有简单，快速，高特异性和高灵明度的特点。
附图说明
附图仅用于对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
图1为本发明一实施例中样本中含有马鹿成分的扩增图。
图2为本发明一实施例中样本中含有梅花鹿成分的扩增图。
图3为本发明一实施例中马鹿标准质粒ORF1以10倍依次稀释的检测结果图。
图4为本发明一实施例中马鹿标准质粒的标准曲线图。
图5为本发明一实施例中梅花鹿标准质粒ORF2以10倍依次稀释的检测结果图。
图6为本发明一实施例中梅花鹿标准质粒的标准曲线图。
图7为本发明一实施例中检测引物探针特异性的结果示意图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测鹿角的基因DNA为模板，采用引物探针组合物进行荧光PCR，根据是否出现扩增曲线以及扩增曲线的Ct值大小进行判定待测样品是否为正品鹿角或是否含有正品鹿角成分；其中，所述引物组合物包括：引物F1、引物R1、探针P1；所述引物F1为如SEQ ID No.1所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如SEQ ID No.2所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.2所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述探针P1为如SEQ ID No.3所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.3所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例涉及的试剂及仪器具体为：
所用试剂：柱式骨骼DNA提取试剂盒购自北京百奥莱博生物科技有限公司。引物与探针组合、标准质粒由生工生物工程(上海)有限公司负责合成，2×TaqMan Master为罗氏公司LightCycler 480 Probes Master。
所用仪器：LightCycler 480 II荧光定量PCR仪为罗氏公司产品。
实施例1
本实施例为用于鉴别鹿角的引物探针组合物的设计，其具体步骤如下：
对马鹿、梅花鹿和其余18种鹿科动物以及猪牛羊的线粒体完整基因进行序列分析、比对，获得了一套鉴别马鹿、梅花鹿与其余18种鹿科动物以及猪牛羊的引物探针组合，如下所示：
引物F1：5'-CGTCTGAATCGGATTCGAAAT-3'(SEQ ID No.1)；
引物R1：5'-AGTGAGAGCCATTGTTATGAA-3'(SEQ ID No.2)；
探针P1：5'-CACGAGCCACAGAGGCAGCA-3'(SEQ ID No.3)；
探针P1的5'端采用FAM荧光基团修饰，3'端采用BHQ1淬灭基团修饰。
探针P1可同时检测到马鹿和梅花鹿成分。
实施例2
本实施例为采用实施例1所述的引物探针组合物鉴别正品、伪品鹿角的方法或检测是否含有正品鹿角成分的方法，其包括：
(1)鹿角DNA的提取
参照北京百奥莱博柱式骨骼DNA提取试剂盒说明书，从猪牛羊骨粉以及麋鹿、驯鹿、马鹿和梅花鹿鹿角粉中提取鹿角DNA。
(2)定性鉴别模型的建立
以步骤(1)得到的总DNA为模板，进行荧光定量PCR检测。
荧光定量PCR反应体系：引物F1、引物R1、探针P1各0.5μL，2×TaqMan Master 10μL，DNA模板2μL，ddH2O 6.5μL。
各条引物探针在体系中的浓度为250nM，DNA模板以DNA溶液的形式加至反应体系中。
荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共30个循环。
设置阳性对照组、阴性对照组，与待测样本同法提取DNA作为模板设，空白对照以双蒸水作为模板进行实验。
(3)对检测结果进行分析
若待测样品具有扩增曲线，并且Ct值<25，说明待测样品为马鹿角(图1)、梅花鹿角(图2)或含有马鹿角成分(图1)、梅花鹿角成分(图2)；若待测样品不具有扩增曲线，说明待测样品为伪品鹿角。
阳性对照应具有扩增曲线，且Ct值<25，阴性对照及空白对照应无扩增曲线。
实施例3
本实施例为正品鹿角成分的标准曲线的制作过程，该标准曲线用于检测结果的定量，其包括：
1)标准质粒的制备
根据物种间序列比对情况，分别选取由F1、R1引物扩增的马鹿及梅花鹿DNA片段(226bp)，交由生物公司插入pUC57载体制成标准质粒ORF1和ORF2。
2)标准曲线的绘制
制作标准质粒ORF1(2.98×1012copies/μL)，ORF2(3.70×1012copies/μL)，分别作为马鹿和梅花鹿的标准品，计算拷贝数，并以10倍的梯度稀释标准质粒，通过QPCR来绘制标准曲线，并验证该引物探针组合的敏感性。
标准曲线荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共30个循环。
图3为马鹿标准质粒ORF1以10倍依次稀释的检测结果：其中每个梯度做三次重复。
图4为马鹿标准质粒ORF1的标准曲线。
图5为梅花鹿标准质粒ORF2以10倍依次稀释的检测结果：其中每个梯度做三次重复。
图6为梅花鹿标准质粒ORF2的标准曲线。
3)敏感性实验
根据所得标准曲线的方程以及仪器所能检测到的最大Ct值25，计算得出：最低可检测到8.494×107copies/μL的马鹿DNA和7.680×107copies/μL的梅花鹿DNA。
实施例4
本实施例为实际样本的检测，待测样本为一份猪骨粉样本、一份牛骨粉样本、一份羊骨粉样本、一份麋鹿角粉样本、一份驯鹿角粉样本、一份马鹿角粉样本和一份梅花鹿角粉样本。
采用实验例2中的方法进行检测，结果如图7所示。
结果判定：样品具有扩增曲线并且Ct值在25以内为正品鹿角(马鹿和梅花鹿)，样品无扩增曲线均为伪品。
定量结果：梅花鹿、马鹿样品Ct值分别为17.88、21.47，经标准曲线方程换算，其起始DNA拷贝数分别为2.42×1011copies/μL和1.82×1010copies/μL。
上述结果表明，利用本发明的方法鉴别正伪品鹿角，结果准确可靠，特异性好，并且可以精确对样本起始拷贝数进行定量。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海市食品药品检验所
<120> 一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法
<130> IPI192585
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物F1(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtctgaatc ggattcgaaa t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物R1(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgagagcc attgttatga a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针P1(Artificial Sequence)
<400> 3
cacgagccac agaggcagca 20

Claims (10)

1.一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测鹿角的基因DNA为模板，采用引物探针组合物进行荧光PCR，根据是否出现扩增曲线以及扩增曲线的Ct值大小进行判定待测样品是否为正品鹿角或是否含有正品鹿角成分；
其中，所述引物组合物包括：引物F1、引物R1、探针P1；所述引物F1为如SEQ ID No.1所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如SEQ ID No.2所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.2所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述探针P1为如SEQ ID No.3所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.3所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述探针P1由荧光基团和荧光淬灭基团修饰；其中，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA。
3.根据权利要求1所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，荧光PCR采用的反应体系为：2×TaqMan Master Mix10μL，引物F1、引物R1、探针P1各0.5μL，DNA模板2μL，双蒸水6.5μL。
4.根据权利要求3所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，各引物、探针在反应体系中的浓度均为250nM，DNA模板在反应体系中的浓度为5ng/μL。
5.根据权利要求1所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述方法还设置阳性对照、阴性对照以及空白对照。
6.根据权利要求1所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，荧光PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共30个循环。
7.根据权利要求1所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，结果判定具体为：若待测样品具有扩增曲线，并且Ct值<25，说明待测样品为正品鹿角或含有正品鹿角成分；若待测样品不具有扩增曲线，说明待测样品为伪品鹿角。
8.根据权利要求1所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，还包括对待测样本进行精确定量的步骤，其包括：分别计算正品鹿角的标准质粒DNA拷贝数；将正品鹿角标准质粒DNA分别按10×逐级稀释5个梯度；以标准品为模板，进行实时荧光PCR检测，生成标准曲线，应用所述标准曲线对未知待测样本进行精确定量。
9.根据权利要求1所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述正品鹿角为马鹿和/或梅花鹿。
10.根据权利要求9所述的用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述梅花鹿、马鹿样品的起始DNA拷贝数分别为2.42×1011copies/μL和1.82×1010copies/μL；所述梅花鹿、马鹿样品的最低检测限分别为7.680×107copies/μL和8.494×107copies/μL。
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