KR100610312B1 - 인삼의 종간 유전자 감별 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의한 인삼의 종간 유전자를 감별하는 감별 키트에 관한 것으로써, 상세하게는 고려삼과 서양삼을 파이로시퀀싱법에 의하여 유전자형을 분석하고, 인삼의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머를 고안하여 파낙스 종(Panax species)의 종간 연관성과 유전적 변이를 평가하기 위한 감별 키트에 관한 것이다. 본 발명의 감별 키트를 통하여 인삼의 종을 판별함으로써 정확한 인삼 원료를 공급할 수 있으며, 인삼의 품질관리 방법으로 활용 할 수 있다.

고려삼, 서양삼, 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법, 감별 키트

Description

인삼의 종간 유전자 감별 키트{A kit for discriminating genetical identification of ginseng species}

도 1 은 진안에서 재배된 고려삼(Panax ginseng)에 대해 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법을 수행한 결과를 나타낸 도이고,

도 2 는 중국 요녕에서 재배된 서양삼(Panax quinquefolius)에 대해 파이로시퀀싱 법을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의한 인삼의 종간 유전자 감별 키트에 관한 것이다.

인삼은 예로부터 한국과 중국에서 전통적인 약물로 사용되어 왔다(Kang BS., et al., Boncho-Hak, 6th Ed., Seoul:Young-Lim Press, pp400-1, pp531-3, 1991). 한약 보유 시장은 과거 10년간 빠르게 성장해 왔다. 파낙스(Panax)속은 한의학에서 의학적으로 가장 중요한 속(genus)들 중의 하나이다. 이것은 동아시아와 동북아메 리카에 분포되어 있는 대략 120가지 식물의 속들 중의 하나이다.

인삼은 파낙스(Panax)속에 속하는 다년생 식물로, 파낙스속 식물은 식물 분류학상 오가과(Araliaceae)에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 십여 종이 알려져 있다. 대표적인 종으로 고려삼(Panax ginseng), 서양삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼 (Panax trifolia), 히말라야삼 (Panax pseudoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis) 등이 있다 (고려삼의 이해, 고려인삼학회, pp9, 1995; Advances in Ginseng Research, 고려인삼학회, pp127-137, 1998). 기타 파낙스속 식물로는 파낙스 엘레가티오르(Panax elegatior), 파낙스 완지아누스(Panax wangianus), 파낙스 비핀라티푸스(Panax bipinratifidus) 등이 있다.

고려삼(Korean ginseng)으로 알려진 파낙스 진생(P. ginseng)과 서양삼(American ginseng)으로 알려진 파낙스 쿠인쿼폴리우스(P. quinquefolius)는 한국과 중국에서 중요한 약물로 여겨진다(Kaul PN., et al., Prog Drug Res., 57, pp1-75, 2001; Bhattaram VA., et al., Phytomedicine, 9 Suppl 3, pp1-33, 2002; Wen J., et al., Mol. Phylogenet. Evol., 6(2), pp167-77, 1996). 이 두 가지 종 사이에서, 고려삼은 서양삼에 비하여 노화, 허약 및 스트레스에 더 효과적으로 기(氣, Qi)를 강화시킨다고 알려져 있다. 한국의 시장에서 고려삼의 가격은 서양삼에 비하여 매우 고가이다. 몇몇 상인들은 서양삼을 고려삼으로 속여서 판매하기도 한다. 더구나, 많은 상업적 인삼 제품들은 절편이나 분말 또는 추출물 형태여서 확인하는 것이 매우 어려운 문제점들이 있어왔다(Um JY., et al., Biol. Pharm. Bull., 24(8), pp872-5, 2001). 또한, 화학적 측면의 분석을 통한 확인은 토양 조건, 기후, 영양적 요소 등의 다양성 때문에 인삼을 구별하는 것은 매우 어려운 실정이다(Mihalov JJ., et al., J. Agric. Food Chem., 48(8), pp3744-52, 2000).

또한, 기존의 인삼 감별 유전자 분석법의 경우 주관적인 요소가 있을 수 있는 겔을 토대로 한 방법(gel-based method)으로 판독자에 따라 감별 결과가 달라질 가능성이 있었다.

이에 본 발명자들은 최근 발전되고 있는 유전적 변이를 평가하는데 사용되는 DNA 시퀀싱 기술인 '파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법'을 이용하여 파낙스 종(Panax species)들로부터 추출된 DNA로부터 단일 염기 형태의 변이를 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 자동적인 유전자 분석법인 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 인삼의 종간 유전적 변이를 분석하여 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼의 종간 유전적 변이를 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 분석하여 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

본 발명의 감별 키트는 인삼 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1단계; 추출된 DNA 및 프라이머(primer)의 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용액을 증폭시키는 제 3단계; 상기 증폭된 DNA의 전체 염기서열을 분석하는 제 4단계; 증폭된 DNA를 조합하여 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법을 수행함으로써 얻어진 유전자형 분석(genotyping)을 통하여 인삼의 종을 감별하는 제 5단계를 포함함을 특징으로 한다.

상기 감별 키트를 위한 인삼 시료로는 파낙스 종(Panax species), 예를 들어, 고려삼(Panax ginseng), 서양삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼(Panax trifolia), 히말라야삼 (Panax pseudoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 파낙스 엘레가티오르(Panax elegatior), 파낙스 완지아누스(Panax wangianus), 또는 파낙스 비핀라티피두스(Panax bipinratifidus)의 전초, 뿌리, 줄기, 또는 잎 등이 가능하다.

상기 감별 키트의 제 2단계에 사용되는 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 바이오틴 결합성 프라이머(biotinylated primer)를 센스(sense) 프라이머로 하고, 서열번호 2로 기재되는 일반 프라이머를 안티센스(antisense) 프라이머로 함으로서 DNA를 증폭시킨다.

상기 서열번호 1로 기재되는 바이오틴 결합성 프라이머는 20 염기서열(mer)로써 염기서열을 바탕으로 고안됨을 특징으로 한다.

또한, 상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법에 사용되는 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 인삼 시료의 종간 특이성 시퀀싱(sequencing) 프라이머로서 유전자 형 분석에 사용됨을 특징으로한다.

상기 서열번호 3으로 기재되는 프라이머는 15 염기서열(mer)로써 2차 구조(secondary structure)가 형성되지 않게 돌연변이 자리(mutation site)로부터 조금 떨어지게 고안하여 첨가함을 특징으로 한다.

상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법을 수행 시, 신장되는 DNA 가닥에서 누클레오티드가 합성될 때 빛이 발생되며, 이러한 과정을 통하여 인삼의 다형성(polymorphism)이 자동적으로 유전자형이 판별됨을 특징으로 한다.

상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법은 15분 안에 시료의 동시 분석이 가능한 자동화된 미세역가를 기초로 한 파이로시퀀서 기구(microtiter-based pyrosequencer instrument)로 실행되며, 각 누클레오티드의 제조는 약 1분정도 걸리므로, 유전적 변이의 정확한 서열(sequence)의 측정에 빠른 방법으로 이용될 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 서열번호 1로 기재되는 인삼의 센스 프라이머, 서열번호 2로 기재되는 인삼의 안티센스 프라이머 및 서열번호 3으로 기재되는 인삼의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머를 구성요소로 포함하는 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 파이로시퀀싱법에 의해 얻어진 분석결과(도 1 및 도 2 참조)에 따른 종별 인삼 비교를 위한 표준 분석도 및 이를 분석한 분석표를 포함하는 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

본 발명의 감별 키트는 소량의 시료를 이용하여 단시간 내에 감별이 가능하 며, 겔을 이용하지 않는 방법(non-gel based method)으로써 주관적인 요소가 배재된 보다 정확한 진단이 가능하다.

또한, 본 발명의 감별 키트는 육안으로 감별이 어려운 인삼에 있어서 종특이적 프라이머를 이용하여 인삼의 종, 바람직하게는 고려삼 또는 서양삼을 감별 할 수 있다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 인삼 시료의 준비

고려삼 시료는 전라북도 진안에서 재배된 것을 전북진안농협(진안, 전북, 대한민국)으로부터 검열 받은 표준화된 포장으로 구입하여 사용하였다. 서양삼 시료는 중국 요녕(Liaoning)에서 재배된 것을 요녕중의학원(요녕, 중국)의 본초학 전공 교수가 확인한 것을 제공 받아 사용하였다.

실시예 1. 인삼의 DNA 정제

뿌리부분 전체가 포함된 형태의 인삼 3g을 멸균된 작은 칼로 잘게 썰고, 멸균된 분쇄기로 분쇄하여 분말화 하였다. DNA 분리용 키트(DNeasy, No. 69104, Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)는 제조사의 설명서에 의하여 약간 변형하여 사용 하였다. 분말화 된 인삼 시료 300 mg은 세정과정을 거쳐 사용하였다. 시료를 용출(elution)하기 전에, 컬럼(column)은 남은 에탄올을 증발시키기 위해 5분 동안 37℃에서 건조시켰다. 시료들은 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) 총 부피 200 ul에서 용출시켰다.

실험예 1. PCR 법을 이용한 DNA 증폭

추출된 DNA의 증폭은 PCR법에 의하여 수행되었다. 각 인삼 시료의 ITS(internal transcribed spacer regions) 구역은 DNA 25 ng, 각 프라이머 (정방향(forward): 서열번호 1, 역방향(reverse): 서열번호 2) 5 pmol을 사용하여 증폭되었다. PCR 증폭은 0.5 단위(unit) Taq 폴리머라제(HT Biotechnology Ltd., Cambridge, United Kingdom)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응 혼합물 30 ul는 10 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 9.0, 1.5 mM 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), 50 mM 포타슘 클로라이드(potassium chloride), 0.1% 트라이톤(Triton)-X 100, 0.01 % [v/v] 안정제(stabilizer), 데옥시누클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 각 0.25 mM, 올리고누클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer) 각 0.1 M로 구성되었다. PCR 과정은 95 ℃에서 5분동안 변성과정을 거치고, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30 초 동안 30회 PCR 시스템(PCR System, Astec, Japan)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 역방향 프라이머(reverse primer)는 단일가닥 DNA 조합이 가능한 바이오틴 결합성이다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 확인 되었다.

실험예 2. 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법에 의한 유전자형 분석(Genotyping)

파이로시퀀싱을 위한 DNA 조합(preparation)(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)은 제조사의 표준 프로토콜(protocol)을 따라 수행되었다. 스트렙트아비딘 세파로즈 비즈(streptavidin sepharose beads, Streptavidin Sepharose HP, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)는PCR 산물에 고정되었다. 인삼 시료의 시퀀싱 프라이머는 서열번호 3으로 기재된 서열이고, 이것은 파이로시퀀싱 AB(Pyrosequencing AB)로부터 T/C 변종(mutation)의 기부에 바로 가까이 인접한 말단 잔기 혼성화에 의해 제작되었다(http://www.pyrosequencing.com). 10분 동안 실온에 방치한 후, 바이오틴결합성 PCR 산물 20 ul는 스트렙트아비딘 코팅된 세파로즈 비즈에 고정되었고, 고정된 PCR 산물은 96-웰 필터에 옮겨졌다(Millipore, Bedford, MA, USA). 비즈는 웰에 남겨지고 다른 용액과 시약들을 제거하고 순수한 단일가닥 DNA를 얻기 위해 진공(vacuum)을 사용하였다. 시퀀싱 프라이머 0.35 uM이 포함된 4M 아세트산(acetic acid) 55 ul에 주형(template)이 고정된 비즈를 다시 담그고, 부유물의 45 ul를 PSQ 96 플레이트(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)로 이동시켰다. PSQ 96 샘플 프렙 열플레이트(PSQ 96 Sample Prep Thermoplate)를 사용하여, 시료가 포함된 PSQ 96 플레이트를 시퀀싱 프라이머를 어넬링(annealing)하기 위해 90 ℃에서 5분동안 열을 가하고, 10분 동안 실온에 옮겨놓은 후, PSQ 96 플레이트는 PSQ 96 기구의 작동 챔버(process chamber, Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)로 이동시켰다. 효소(enzyme)와 기질(substrate), 누클레오티드(nucleotide)는 PSQ 96 SNP 시약 키트(PSQ 96 SNP Reagent Kit, Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 웰 안에서 시약 카세트(reagent cassette)로부터 제조되었다. 신장되는 DNA 가닥에서 누클레오티드가 합성될 때 빛이 발생된다. 이러한 과정으로부터 인삼의 다형성(polymorphism)은 자동적으로 유전자형이 판별되었다.

상기 실험예 2에서 고려삼과 서양삼의 두 가지 인삼의 종을 구별하기 위하여 파이로시퀀싱 법에 의하여 동정하였고, 그 결과, 서양삼은 고려삼과 비교하여 다른 형태를 보여 명백한 차이를 나타내었다. 고려삼의 피크(peak)는 첫 번째 T 누클레오티드에서 매우 강하게 나타났으나(도 1 참조), 서양삼은 거의 나타나지 않았다(도 2 참조). 또한, 고려삼과 서양삼을 비교하기 위한 인삼의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머를 고안하였다. 시퀀스 상에서, 고려삼은 T 누클레오티드 염기를 갖고 있으나, 서양삼에는 존재하지 않았다. 따라서 본 발명의 인삼의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머가 적합하게 고안되었음을 확인 할 수 있었다.

본 발명은 인삼에 대하여 파이로시퀀싱법을 이용하여 유전자형을 분석하고, 인삼의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머를 고안하여 파낙스 종(Panax species)의 종간 연관성과 유전적 변이를 감별하는 인삼의 종간 확인시험법을 이용한 감별 키트를 제공함으로써 정확한 인삼 원료를 공급하고 인삼의 품질관리 방법으로 활용 할 수 있으며, 인삼 외에 기타 한약재 자원에 대한 신물질 탐색이나 품종간 감별에 대한 기초 자료로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 구성요소로 포함하는 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트.
2. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1로 기재되는 프라이머는 바이오틴 결합성 프라이머로서 인삼의 센스 프라이머이고, 서열번호 2로 기재되는 프라이머는 인삼의 안티센스 프라이머이며, 서열번호 3으로 기재되는 프라이머는 인삼의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머임을 특징으로 하는 감별 키트.
3. 제 1항에 있어서, 상기 인삼 종의 감별은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 인삼의 종간 유전적 변이가 분석됨을 특징으로 하는 감별 키트.

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