KR102617633B1 - 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 골무꽃속 식물의 종 식별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골무꽃속(Scutellaria)의 종 식별을 위한 프라이머 세트 및 그를 이용한 골무꽃속의 종 식별방법에 관한 것으로, 상세하게는 골무꽃속에서 골무꽃(Scutellaria indica L.), 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra), 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis), 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 종을 간단하면서도 높은 정확도로 판별해 낼 수 있는 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트 및 그를 이용한 골무꽃속의 종 식별방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 골무꽃속의 종 식별을 위한 프라이머 세트 및 그를 이용한 골무꽃속의 종 식별방법에 관한 것이다.
식물의 경우 다양한 종간, 속간 잡종이 빈번히 보고되고 있으며, 복잡한 양상의 배수화로 인해 식물 분류군의 정확한 동정을 위한 모계 계통과 진화를 이해하는데 어려움이 있다. 따라서, 계통 또는 품종 등을 파악 가능한 DNA의 개발이 요망되고 있다.
최근 분자 생물학이 발달하면서, 특정 DNA 염기 서열의 다형성을 탐색하고 이를 분자마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용 가능되고 있다. 특히, 유전적 분자마커 기술 개발은 작물 육성에서 그 이용가치가 증가되고 있다.
현재까지 사용되고 있는 식물종 감별법으로는 형태학적 특징을 비교하거나, 성분의 정성과 정량분석 및 DNA 수준에서의 차이점을 비교하는 방법 등이 있다. 형태학적 특징을 비교하는 구별은 식물체의 생육환경에 따라 차이를 나타낼 수 있어 식물종 판별에 어려움이 있다. 성분분석에 의한 구별의 경우, 미각센서, 핵자기 공명분광기(NMR spectrometer) 등이 이용되었으나, 이 방법은 생산지의 재배환경에 따라 성분이 영향을 받을 수 있다는 한계점을 가지고 있다.
이러한 종래방법의 한계를 해결하기 위해, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 등 DNA 단편의 다형성을 이용한 분자생물학적 식물종 판별이 시도되고 있다. 또한 최근에는, 식물종 판별에 있어서 CBOL Plant Working Group이 제안한 DNA 바코드를 이용한 분류법이 그 유용성을 인정받고 있다. 특히 유전체(genome) 상에 존재하는 핵 리보솜 DNA(Nuclear Ribosomal DNA, nrDNA)의 nrDNA-ITS(internal transcribed spacer) 부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라, 일반성, 단순성, 재현성 등의 이점으로 인해 계통분류나 종간 유전변이 탐색 등을 위해 널리 이용되는 염기서열로 알려져 있다. rRNA 유전자의 경우 종간 및 속간에 차이가 거의 나타나지 않는 반면, 변이를 많이 지니는 ITS 구간은 단일 유전체당 수천 복제(copy)가 존재하기 때문에 계통학적 분석을 위한 유용한 정보를 가진 특성을 제공할 수 있다.
현재, 유용한 약용식물이 다수 포함되는 골무꽃속(Scutellaria) 식물의 종을 정확하게 식별할 수 있는 유전자 마커는 개발되어 있지 않은 실정이다. 꿀풀과에 속하는 골무꽃속은 과 내에서 두 번째로 큰 속으로, 세계적으로 약 470 분류군이 포함된다. 골무꽃속의 많은 식물들은 온대 지역에 주로 분포하고 있으며, 약용식물 또는 향신료로 사용되고 있다. 골무꽃속 약용식물로는 골무꽃, 산골무꽃, 떡잎골무꽃, 칫솔골무꽃 및 황금 등이 있으며, 이 중 골무꽃과 떡잎골무꽃은 외형상으로 분류가 어려운 부분이 있어, 유전자 분석을 통한 종 분석법의 개발이 필요하다.
골무꽃(Scutellaria indica L.)은 다년생 식물로, 잎은 순두 심장형이며, 꽃에 검은 반점이 있는 것이 특징이다. 중국에서 한신초라 불리우고 있으며 민간에서 진통과 지혈 작용이 있고 종기를 가시게 하거나, 치통과 두통 토혈이나 각혈하는 증세에 사용되어 온 약용식물이다.
산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra)은 잎이 마주나며, 양면에 털이 있고 가장자리에 톱니가 있는 것이 특징이다. 연한 자주색 꽃이 5~6월 개화하며, 봄에 어린순과 연한 잎을 나물로 먹는다.
떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis)은 골무꽃과 외형상으로 매우 유사하며, 골무꽃에 비해 잎이 조금 두껍고 털이 많은 편이다. 어린 잎을 나물로 먹고 해독 및 지통(止痛) 등의 효과가 있는 한약재로 이용된다.
칫솔골무꽃(Scutellaria barbata)은 반지련이라고도 하며, 주로 지상부를 약으로 이용한다. 열을 내리고 붓기를 내리게 하는 효과가 있으며, 항암 효과도 연구되어 있다.
황금(Scutellaria baicalensis)은 중국 원산의 귀화식물로 약용식물로 많이 재배되고 있다. 주로 뿌리를 사용하며, 약용 및 관상식물로서 가치가 높은 생물자원이다. 약리 효과로는 심장 및 폐의 열을 내리게 하거나 기침 및 피를 멈추게 하는 효과를 갖고 있으며, 피부에는 항알레르기, 항산화, 항염, 항균 효과를 가지고 있어, 아토피 피부염, 여드름과 같은 세균성 피부염, 피부 미백 등에 사용되는 화장품 활성 성분으로 사용되고 있다.
본 발명은 골무꽃속(Scutellaria)에 속하는 식물 중 골무꽃(Scutellaria indica L.), 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra), 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis), 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 종을 식별 또는 구별하는 데 이용될 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 프라이머 세트를 이용한 골무꽃속의 종 식별 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 골무꽃속의 종 식별용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 세트;를 포함하는, 골무꽃속(Scutellaria)에서 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra)을 식별할 수 있는, 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트가 제공될 수 있다.
또한, 상기 제 5 프라이머 세트는 trnH-PsbA 유전자 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 골무꽃속 개체로부터 핵산을 분리하는 제 1단계; 분리된 핵산을 주형으로 하여 상기 제 5 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 제 2단계; 및 상기 증폭 반응의 산물을 검출하는 제 3단계;를 포함하고, 골무꽃속(Scutellaria)에서 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra)을 식별할 수 있는, 골무꽃속 식물의 종 식별방법이 제공될 수 있다.
또한, 상기 제 5 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되는 경우 산골무꽃으로 식별될 수 있다.
또한, 상기 제 2단계에서 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머 세트;를 더 이용하되, 상기 제 5 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되고, 상기 제 4 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되지 않는 경우 산골무꽃으로 식별될 수 있다.
또한, 상기 제 2단계에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 6 프라이머 세트; 및, 서열번호 13으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 7 프라이머 세트;를 더 이용하되, 상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트 및 상기 제 7 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되는 경우 산골무꽃으로 식별될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 제 5 프라이머 세트를 포함하고, 골무꽃속(Scutellaria)에서 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra)을 식별할 수 있는, 골무꽃속 식물의 종 식별용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 프라이머 세트 또는 그를 포함하는 식별용 키트를 이용하면, PCR을 수행하여 골무꽃속 식물의 구체적인 종, 상세하게는 골무꽃, 산골무꽃, 떡잎골무꽃, 칫솔골무꽃 및 황금으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 종을 간단하면서도 높은 정확도로 판별해 낼 수 있다. 이를 통하여, 품종간 혼용을 방지하는 데 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 간단하면서도 정확도 높은 골무꽃속 식물종 식별을 위한 정보제공방법에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 식별방법은 골무꽃속 식물의 종 특이적 프라이머를 이용함으로써 종래 골무꽃속 식물종 식별을 위하여 수행된 외형비교에 비하여 보다 신속하면서도 간편하고 높은 정확도로 골무꽃속의 식물종을 식별할 수 있다. 이를 통하여, 골무꽃속 식물종 식별에 걸리는 시간 및 노력을 절감시킬 수 있다.
도 1은 골무꽃속 식물 중 골무꽃(Scutellaria indica L.), 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra), 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis), 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata) 및 황금(Scutellaria baicalensis) 종의 잎 표현형을 비교한 것,
도 2는 GeneBank에 등록된 atpF를 이용한 종 특이 프라이머의 제작 방법을 도시한 것,
도 3은 GeneBank에 등록된 atpF를 이용한 종 특이 프라이머의 PCR 결과,
도 4는 떡잎골무꽃의 전체 유전자 및 GeneBank에 등록된 골무꽃속 다수 종의 염기서열과 BLAST를 수행한 결과를 도시한 것,
도 5는 AtpI_0 염기서열 및 염기서열 내 프라이머로 증폭되는 위치를 나타낸 것,
도 6은 rbcL_3 염기서열 및 염기서열 내 프라이머로 증폭되는 위치를 나타낸 것,
도 7 및 8은 제작된 종 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과.
도 2는 GeneBank에 등록된 atpF를 이용한 종 특이 프라이머의 제작 방법을 도시한 것,
도 3은 GeneBank에 등록된 atpF를 이용한 종 특이 프라이머의 PCR 결과,
도 4는 떡잎골무꽃의 전체 유전자 및 GeneBank에 등록된 골무꽃속 다수 종의 염기서열과 BLAST를 수행한 결과를 도시한 것,
도 5는 AtpI_0 염기서열 및 염기서열 내 프라이머로 증폭되는 위치를 나타낸 것,
도 6은 rbcL_3 염기서열 및 염기서열 내 프라이머로 증폭되는 위치를 나타낸 것,
도 7 및 8은 제작된 종 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과.
본 발명은 골무꽃속(Scutellaria) 식물의 종을 식별 또는 구별하기 위한 프라이머 세트, 이를 이용하는 식별용 조성물 및 정보제공방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 보다 상세히 설명한다.
이 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 DNA 마커는 골무꽃속 식물의 종을 구별할 수 있는 각 골무꽃속 식물종의 DNA상 특이적 표지를 의미한다. 종 특이적 염기서열과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)은 하나 이상의 변형 염기를 보유한 염기서열을 동반하는 임의의 위치를 의미한다. 단일염기다형성은 제작된 기준 참조 DNA 서열과의 차이로서 일반적으로 정의되거나, 또는 일반집단에서 추출한 개체의 부분 집단 사이에서 발견되는 차이로서 정의될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 프라이머(primer)는 짧은 자유 3'말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 주형(template)서열과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 주형 복사를 통한 염기서열의 증폭을 위해서는 일반적으로 포워드 및 리버스 프라이머가 한 쌍인 세트로 사용된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 골무꽃속(Scutellaria) 식물 중 골무꽃(Scutellaria indica L.), 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra), 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis), 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 종을 식별 또는 구별하기 위한 프라이머 세트가 제공될 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머 세트; 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 세트; 서열번호 11로 표시되는 염기서열 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 6 프라이머 세트; 및 서열번호 13으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 7 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 종간 특이적으로 상이한, 종 특이적 염기서열을 증폭시키기 위한 것일 수 있다. 상기 종 특이적 염기서열은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP), 염기삽입 및 염기결손으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프라이머 세트에 포함되는 프라이머는 필요에 따라 변형될 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
상기 종 특이적 염기서열은 CYC2B 유전자, AtpI (ATP synthase subunit a, chloroplastic) 유전자, rbcL_3 (Ribulose bisphosphate carboxylase large chain) 유전자, BOP028266 클로로플라스트 유전체(MF521633.1) 서열, trnH-PsbA 유전자, Scutellaria insignis 클로로플라스트 유전체(KT750009.1) 서열 및 psbK-psbI 인터제닉 스페이서(KX059898.1) 서열로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열 내에 위치되는 것일 수 있다. 전술한 유전자 및 유전체의 서열은 GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 그 구체적인 서열 정보를 확인할 수 있다. 상기 AtpI 유전자는 AtpI_0로 표시될 수도 있으며, 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 rbcL_3 유전자는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 일 실시예에서는, CYC2B 유전자 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제 1 프라이머 세트로, AtpI 유전자 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제 2 프라이머 세트로, rbcL_3 유전자 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제 3 프라이머 세트로, BOP028266 클로로플라스트 유전체(MF521633.1) 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제 4 프라이머 세트로, trnH-PsbA 유전자 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제 5 프라이머 세트로, Scutellaria insignis 클로로플라스트 유전체(KT750009.1) 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제 6 프라이머 세트로, psbK-psbI 인터제닉 스페이서(KX059898.1) 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제 7 프라이머 세트로 하고, 각 프라이머 세트를 단독으로 또는 혼용하여 교차검증으로 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행함으로써 골무꽃속의 종식별에 이용하였다. 상세하게는, 상기 제 2 프라이머 세트 및 상기 제 3 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트, 및 상기 제 1 프라이머 세트를 이용하여 골무꽃이 식별될 수 있고, 상기 제 2 프라이머 세트 및 상기 제 3 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 이용하여 떡잎골무꽃이 식별될 수 있고, 상기 제 4 프라이머 세트를 이용하여 황금이 식별될 수 있고, 상기 제 5 프라이머 세트를 이용하여 산골무꽃이 식별될 수 있고, 상기 제 6 프라이머 세트 및 상기 제 7 프라이머 세트를 이용하여 칫솔골무꽃이 식별될 수 있는 것을 확인하였다.
전술한 바와 같이 제 1 내지 7 프라이머 세트 중 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트는 골무꽃속 식물의 종에 따라 특이적인 증폭결과를 나타낼 수 있어, 그를 이용하는 경우 보다 용이하고 우수한 정확도로 골무꽃속 내에서 종의 식별이 수행될 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 전술한 본 발명의 일 측면에 따른 프라이머 세트를 이용하는 골무꽃속 식물의 종 식별방법이 제공될 수 있다.
상세하게는, 종을 식별하고자 하는 골무꽃속 개체로부터 핵산을 분리한 후, 분리된 핵산을 주형으로 하여 상기 제 1 내지 제 7 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후, PCR 반응 산물을 확인함으로써 종 식별이 수행될 수 있다.
PCR 반응 산물의 확인은 DNA 증폭 산물을 검출함으로써 종 특이적 증폭 반응 유무를 판단하거나 또는 산물의 크기를 판별하는 방법에 의해 이루어 질 수 있다. 상기 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 제 1 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되고, 상기 제 2 프라이머 세트 및 상기 제 3 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되지 않는 경우 골무꽃으로 식별되고, 상기 제 2 프라이머 세트 및 상기 제 3 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되는 경우 떡잎골무꽃으로 식별되고, 상기 제 4 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되는 경우 황금으로 식별되고, 상기 제 5 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되는 경우 산골무꽃으로 식별되고, 상기 제 7 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되고, 상기 제 6 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되지 않는 경우 칫솔골무꽃으로 식별될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 프라이머 세트를 포함하는 골무꽃속 식물의 종 식별용 조성물이 제공될 수 있다.
바람직하게는, 상기 종 식별용 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 분석용 키트일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 PCR 키트는 예를 들면, 단일 PCR, 리얼타임 PCR 및 멀티플렉스 PCR로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 필수 요소로는 예를 들면, 테스트 튜브, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA 분석용 키트는 예를 들면, DNA 칩일 수 있다.
상기 키트는 본 발명의 일 측면에 따른 프라이머 세트를 이용하여 골무꽃속 식물의 각 종별 특이적인 염기서열을 증폭하여 확인함으로써, 구체적인 종을 신속하면서 우수한 정확도로 구별하는데 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
<대상으로부터 핵산 추출>
골무꽃속 식물 중 골무꽃, 산골무꽃, 떡잎골무꽃, 칫솔골무꽃 및 황금 종별로 잎 시료를 검체로 준비하여 사용하였다. 각 잎의 표현형은 도 1에 나타냈다. 도 1에서, a는 골무꽃, b는 산골무꽃, c는 떡잎골무꽃, d는 칫솔골무꽃, e는 황금 유래 잎사귀이다.
각 식물 종별로 생잎 또는 냉동된 잎 검체 약 100 mg을 막자사발에 넣고 액체질소를 사용하여 미세분말 상태가 되도록 분쇄하였다. 분말상의 시료를 1.5 ml 튜브에 옮겨 담고, DNA 추출은 Qiagen사의 DNeasy Plant Mini Kit를 사용하여 매뉴얼에 따라 Genomic DNA를 추출 하였고, RNA 추출은 Bioneer사의 Univeral RNA Extraction kit를 이용하여 추출하였다. 추출된 핵산을 PCR 반응의 주형으로 이용하였다. 필요에 따라, cDNA를 합성하여 주형으로 이용하였다.
<PCR 조건 설정>
본 발명에서 이용된 바코드 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 위한 반응물 조성은 0.5㎕의 Taq polymerase (5 units/㎕) (nTaq Mg2+, enzynomics, Republic of Korea), 2㎕의 10X nTaq buffer, 2㎕의 dNTP Mixture (2.5mM), forward primer(10 pmole) 1㎕, reverse primer(10 pmole) 1㎕와 2㎕의 정량한 주형 DNA (5 ng/㎕)를 혼합하고, 정제수를 첨가하여 최종 반응용량을 총 20 ㎕로 하였다.
PCR 반응조건은 95℃에서 10 분간 예비변성(predenaturation)한 후 95℃에서 30 초간 변성(denaturation), 42~55℃ 에서 30초간 결합(annealing), 72℃에서 30 초간 증폭(extension)하고 변성부터 증폭까지의 과정을 30회 반복한 다음, 72℃에서 10분 최종증폭(final extension)을 시켜 DNA 증폭산물을 얻었다. DNA 증폭산물은 2% agarose 겔에 점적하여 30분간 전기영동하여, 종 특이성이 확인되면 종 감별에 이용하였다.
<atpF, matK, rbcL 및 trnH-psbA 바코드 구간용 종 특이 프라이머 제작>
5가지의 꿀풀과 골무꽃속 약용식물 중 4가지의 골무속 및 황금을 분류하기 위해, NCBI Genbank에 등록되어 있는 4가지 골무꽃속 골무 종 및 황금 종의 Chloroplast DNA(cpDNA) 바코드 4 개 구간(atpF, matK, rbcL 및 trnH-psbA)에 대한 분석을 수행하였다. 각각의 염기서열들을 CLC Sequencce Viewer로 정렬(alignment)하여 해당 종에만 특이적으로 나타나는 SNP, 삽입 또는 결손과 같은 염기서열을 탐색하여 특이 프라이머를 디자인하였다. 특이 프라이머 제작 시 특이성을 높이고자 SNP가 3'-말단에 위치하게 하고 그로부터 5'-쪽으로 3번째의 염기서열을 미스매치(mismatch)시켜 특이 프라이머를 제작하였다.
황금(Scutellaria baicalensis)을 제외한 4종의 골무꽃속 식물종은 NCBI GenBank 내에 등록된 유전자 수가 현저히 적었으며, 그마저도 5종의 scutellaria 식물종에서 전부 겹치는 유전자 부분이 없는 것으로 확인되었다. 이에, 중복되는 cpDNA 부분을 정렬(alignment) 하여 다수의 종 특이 프라이머를 제작하고 교차검정을 하였지만, 기존에 등록되어 있는 염기서열을 이용하여 제작한 프라이머는 PCR을 수행 하였을 때 특이적으로 증폭되지는 않는 것으로 나타났다. GeneBank 등록 서열을 이용한 프라이머 제작 방법을 도 2에, 제작된 atp 프라이머를 이용하여 수행된 PCR 증폭 겔 전기영동 사진을 도 3에 나타냈다. 도 3에서, a)는 떡잎골무꽃 종 특이 프라이머인 Tsu_F 및 R 프라이머를 이용한 결과이고, b)는 황금 종 특이 프라이머인 Bai_F 및 R 프라이머를 이용한 결과이고, a)및 b)모두에서 M는 100bp DNA ladder, 시료 1 및 2는 골무꽃 시료, 3 및 4는 산골무꽃 시료, 5 및 6은 떡잎골무꽃 시료, 7 및 8은 칫솔골무꽃 시료, 9 및 10은 황금 시료를 의미한다.
<떡잎골무꽃의 WGS (Whole Genome De novo Sequencing) 분석 및 종 특이 프라이머 제작>
종 특이 프라이머를 제작하기에는 골무꽃속과 관련된 문헌 및 선행연구가 부족하며, NCBI Genbank에 등록되어 있는 염기서열 또한 부족하였다. 본 발명에서 식별하고자 하는 4가지의 골무꽃속 중 떡잎골무꽃의 전체 유전자 조사를 위해서 gDNA 10 μg, RNA 1μg을 Illumina HiSeq X-Ten 및 PacBio RSII platform 장비를 사용하여 Whole Genome De novo Sequencing 분석을 수행하였다.
Whole Genome De novo Sequencing을 이용하여 떡잎골무꽃의 전체 유전자를 조사한 결과, 318,741,328(약 31MB)의 유전자를 얻었으며, 14,625개의 Contig를 얻었다. 이를 하기 표 1에 나타냈다. 얻어진 유전자를 NCBI BLAST 서비스를 이용하여 기존에 등록된 골무꽃속 염기서열과 유사영역을 비교하였고, 총 279개의 유사한 염기서열을 얻어내었다. 이는 도 4에 도시하였다. 또한, annotation 된 DNA 중, 59개의 cpDNA를 얻을 수 있었다.
도 4의 결과를 참조하여, 염기서열에서 각 속마다 1개의 DNA와 cpDNA 바코드 유전자 9종을 선별하였고, 비교할 유사 염기서열이 없다고 판단하여 NCBI Primer-blast를 사용하여 PCR 제작산물의 크기가 100 ~ 1000 bp가 되도록 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 정보는 하기 표 2에 나타냈다. AtpI_0 및 rbcL_3 염기서열 및 각 염기서열 내 프라이머 위치는 도 5 및 6에 각각 도시하였다.
제작된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 증폭 겔 사진을 도 7에 나타냈다. 도 7에서, 각각 a는 SL 프라이머(제 1 프라이머 세트), b는 SP 프라이머(제 5 프라이머 세트), c는 ST 프라이머(제 2 및 3 프라이머 세트), d는 SD 프라이머(제 6 및 7 프라이머 세트), e는 SB 프라이머(제 4 프라이머 세트)를 이용한 PCR 결과이고, M은 100bp ladder, 1은 골무꽃종 시료, 2는 산골무 시료, 3은 떡잎골무 시료, 4는 칫솔골무 시료, 5는 황금 시료를 의미한다.
도 7을 참조하면, Scutellaria pekinensis var. transitra voucher KUS:2006-1082 trnH-PsbA intergenic spacer, partial sequence; and PsbA (psbA) gene, partial cds; chloroplast (KX060016.1) 염기 서열에서 제작한 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra) 프라이머(SP primer), annotation cpDNA의 AtpI_0 (scaffold936, location 40496-41245, 750 bp) 및 rbcL_3 (scaffold2965, location 7668-9095, 1429 bp)에서 제작한 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis) 프라이머(ST1, ST2 primer) 및 Scutellaria baicalensis isolate BOP028266 chloroplast, complete genome (MF521633.1)에서 제작한 황금 (Scutellaria baicalensis) 프라이머(SB primer)는 종 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있다. 골무꽃과 칫솔골무꽃은 제작한 프라이머에서는 특이적으로 증폭이 되지 않았다.
<Scutellaria sp. 종 특이 프라이머를 이용한 종 분별 방법>
골무꽃속 식물 중 산골무꽃, 떡잎골무꽃 및 황금 종은 제작된 각각의 종 특이 프라이머 SP, ST1, ST2, SB primer로 PCR 수행시 특이적으로 증폭이 되어 식별 가능한 것을 도 7 결과를 참조하여 확인하였다. 골무꽃 및 칫솔골무꽃 종은 특이적으로 증폭되지 않는 것으로 나타났으나 다른 프라이머와 함께 교차검증을 하여 식별 가능한 것을 확인하였다. 교차검증 결과는 도 8에 나타냈다. 도 8에서, 각각 a는 골무꽃 분별을 위해 SL 프라이머 및 ST1 프라이머를 이용한 PCR 결과이고, b는 산골무꽃 분별을 위해 SP 프라이머를 이용한 PCR 결과이고, c는 떡잎골무꽃을 분별하기 위해 ST1 및 2 프라이머를 이용한 PCR 결과이고, d는 칫솔골무꽃 분별을 위해 SD 1 및 2 프라이머를 이용한 PCR 결과이고, e는 황금 부별을 위해 SB 프라이머를 이용한 PCR 결과이다. 각 시료의 의미는 도 7과 동일하다.
도 8을 참조하면, Scutellaria incana TCP transcription factor (CYC2B) gene, partial cds (KM526800.1) 염기서열에서 제작한 골무꽃 특이 프라이머(SL primer)는 골무꽃 DNA와 떡잎골무꽃 DNA에서도 증폭되었는데, 떡잎골무꽃 특이 프라이머인 ST1 Primer 및 ST2 Primer를 사용하여 교차 검증시 골무꽃을 식별할 수 있었다.
또한, Scutellaria insignis chloroplast, complete genome (KT750009.1) 염기서열에서 제작한 칫솔골무꽃 특이 프라이머(SD1 primer)는 칫솔골무꽃 DNA를 제외한 다른 모든 종의 DNA에서 증폭되었는데, Scutellaria indica var. tsusimensis voucher SWUS. Kim 2008-008 psbK-psbI intergenic spacer, partial sequence; chloroplast (KX059898.1) 염기서열에서 제작한 프라이머(SD2 primer)는 칫솔골무꽃을 포함하는 모든 종의 DNA에서 증폭이 되기에 함께 사용하여 교차검증시 칫솔골무꽃을 식별할 수 있는 것으로 나타났다.
<110> Bioresources and Technology (B&Tech) Co., Ltd.
<120> PRIMER SET FOR IDENTIFYING SPECIES OF SCUTELLARIA SP. AND
IDENTIFICATION METHOD USING THE SAME
<130> P-2021-0824
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL primer F
<400> 1
tgcttacctg cttccacagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL primer R
<400> 2
tcggtggcga cgttatatgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ST1 primer F
<400> 3
ttgtggcatc actaaccccc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ST1 primer R
<400> 4
aggggtaggc tgaacgtact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ST2 primer F
<400> 5
cgcattcctc cagcctatgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ST2 primer R
<400> 6
atcacggcag tagtgtgcaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SB primer F
<400> 7
tccccaaaaa gtggatcccg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SB primer R
<400> 8
gggcctcatt ggtaagtgct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SP primer F
<400> 9
gaaattactt ttaaattcat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SP primer R
<400> 10
gtagtctttc ctagacttta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SD1 primer F
<400> 11
ataacttccc tctagactta 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SD1 primer R
<400> 12
tgaatttcaa ttattttttc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SD2 primer F
<400> 13
acccttgatt cgcacactga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SD2 primer R
<400> 14
tgaggaaacg gacgtaagcc 20
<210> 15
<211> 750
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> annotation cpDNA AtpI_0(ATP synthase subunit a, chloroplastic)
<400> 15
atgagtattt attctggtct atttgtggca tcactaaccc ccgctttcca gcttgctagt 60
gtggaagttg gacaacattg gtattggcag cttgggcagt tccaagttca tgcccaagtt 120
ttgattacat cttgggttgt tgctgcgctt ctcttagggt tagcagtttg ggggacacgt 180
agccttaaag ctgtgccaca agggggacaa ggcttggtag aatacgtact tgagtttata 240
cgtgacttga ctcggactca gattggtgaa gaagaatatc gaccttgggt accttttatt 300
ggcactttat ttttgtttat ttttgtatca aattggtcag gggcccttgt accttggaaa 360
gttattgaat tacccaatgg agagcttgcc gctcccacaa acgatattaa tactactgtg 420
gctcttgcat tactaacttc tgtggcttat ttttatgctg gtcttcataa aagaggtcta 480
agctattttg gtaagtacgt tcagcctacc cctgtgttat taccaattaa tattcttgaa 540
gattttacta aacctctgtc gttaagtttc cgactttttg gaaacattct agctgacgaa 600
cttgtcgttg ctgtacttgt ttcattagtc cctcttgtag tacctattcc aatgatgttt 660
ctaggccttt ttactagtgg tattcaagct cttattttcg ccacacttgc tgctgcttat 720
atcggagaat caatggaagg acatcactaa 750
<210> 16
<211> 1428
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> annotation cpDNA rbcL_3 (Ribulose bisphosphate carboxylase large
chain)
<400> 16
atgtcaccac aaactgaaac cagaacaggt actggcttta aagcaggcgt taaggactat 60
cgcctaactt actacactcc tgattatgag accaaagaga ctgatatcct agctgcattt 120
cggatgactc ctcaacctgg agttcctcct gaagaagcag gtgctgcggt tgcagctgaa 180
tcttcaaccg gtacctggac cactgtatgg accgatggac taaccaacct tgatcgttat 240
aagggtcgct gttacgatat tgaacctgtt gctggtgagg aaaaccaata tattgcatat 300
gtggcatatc ctttggacct ttttgaagag ggttcagtca ccaacctgtt tacttctatt 360
gtaggaaacg tattcggctt taaggcactt cgtgctcttc gattggaaga tcttcgcatt 420
cctccagcct atgtgaaaac tttccaaggt cctcctcatg gtatccaggt tgagcgagat 480
aaactaaaca aatacggtcg acctttgctt ggttgtacta ttaagcctaa acttggtctt 540
tctgctaaaa actatggccg ggcagtgtac gaatgcctac gtggtggttt ggactttaca 600
aaagatgatg aaaacgtaaa ctctcagcct ttcatgcgct ggagagatag attccttttt 660
gtagcagagg ctacctttaa agctcaggct gaaactggtg aaatcaaagg acattacctg 720
aatgctacgg ctggtacttc cgaagagatg ctaaaaagag ctcaatttgc aagagagcta 780
ggagcaccaa tcgtaatgca cgattaccta actggtggct ttactgcaaa cacaagtctt 840
gcacactact gccgtgataa cggtttgctt cttcacattc accgtgctat gcacgcggta 900
attgaccgtc agcgtaacca tggtattcat ttccgtgtct tagcgaaagc acttcgtcta 960
tccggtggtg atcatattca ctctggtaca gtcgtaggta agcttgaagg tgagcgtgaa 1020
gtaacccttg gttttgtaga tcttttgaga gatgactaca ttgaaaaaga ccgaagccga 1080
ggcatttact tcactcaaga ttgggtttct cttcctggtg ttctgcctgt ggcttctggt 1140
ggcattcacg tatggcatat gcctgctctt actgagattt ttggcgatga ctccgtactt 1200
caatttggtg gcggtaccct tggtcaccct tggggcaatg ctcctggtgc tgttgcaaac 1260
cgcgtggcac ttgaagcatg tgttcaagct cgtaatgaag gtcgtgacct agctcgcgaa 1320
ggtaaccaag tgatccgtga agcggctaag tggagcccag agcttgctgc agcctgcgaa 1380
gtttggaaag agatcaagtt tgagtttgaa acaattgata ctctatag 1428
Claims (7)
- 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 세트를 포함하고,
골무꽃속(Scutellaria) 식물 중 골무꽃(Scutellaria indica L.), 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra), 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis), 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra)을 식별할 수 있는, 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서,
상기 제 5 프라이머 세트는 trnH-PsbA 유전자 서열 내 종 특이적 염기서열을 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 것인, 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트.
- 골무꽃속 개체로부터 핵산을 분리하는 제 1단계;
분리된 핵산을 주형으로, 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 제 2단계; 및
상기 증폭 반응의 산물을 검출하는 제 3단계;를 포함하고,
골무꽃속(Scutellaria) 식물 중 골무꽃(Scutellaria indica L.), 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra), 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis), 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra)을 식별할 수 있는, 골무꽃속 식물의 종 식별방법.
- 제 3항에 있어서,
상기 제 5 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되는 경우 산골무꽃으로 식별되는, 골무꽃속 식물의 종 식별방법.
- 제 3항에 있어서,
상기 제 2단계에서 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머 세트;를 더 이용하되,
상기 제 5 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되고, 상기 제 4 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되지 않는 경우 산골무꽃으로 식별되는, 골무꽃속 식물의 종 식별방법.
- 제 3항에 있어서,
상기 제 2단계에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 6 프라이머 세트; 및, 서열번호 13으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 7 프라이머 세트;를 더 이용하되,
상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트 및 상기 제 7 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물이 검출되는 경우 산골무꽃으로 식별되는, 골무꽃속 식물의 종 식별방법.
- 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 세트를 포함하고, 골무꽃속(Scutellaria) 식물 중 골무꽃(Scutellaria indica L.), 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra), 떡잎골무꽃(Scutellaria indica var. tsusimensis), 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 산골무꽃(Scutellaria pekinensis var. transitra)을 식별할 수 있는, 골무꽃속 식물의 종 식별용 키트.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210112985A KR102617633B1 (ko) | 2021-08-26 | 2021-08-26 | 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 골무꽃속 식물의 종 식별 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210112985A KR102617633B1 (ko) | 2021-08-26 | 2021-08-26 | 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 골무꽃속 식물의 종 식별 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230030837A KR20230030837A (ko) | 2023-03-07 |
| KR102617633B1 true KR102617633B1 (ko) | 2023-12-27 |
Family
ID=85512439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210112985A KR102617633B1 (ko) | 2021-08-26 | 2021-08-26 | 골무꽃속 식물의 종 식별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 골무꽃속 식물의 종 식별 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102617633B1 (ko) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101362303B1 (ko) * | 2011-12-27 | 2014-02-14 | 강원대학교산학협력단 | 할미꽃 속의 구별을 위한 프라이머 및 이를 이용한 할미꽃 속의 구별방법 |
| KR101804120B1 (ko) | 2016-12-02 | 2017-12-04 | 김권희 | 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 dna 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| KR102026758B1 (ko) * | 2017-09-29 | 2019-10-01 | 대한민국 | 엽록체 유전체와 45Ｓ ｎｒＤＮＡ 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 품종 판별용 분자 마커 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-08-26 KR KR1020210112985A patent/KR102617633B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Sareh Seyedipour et al., Progress in Biological Sciences, 7(2), p.169-181, 2017. |
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| KR20230030837A (ko) | 2023-03-07 |
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