CN103160576A - 基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于SAA1β/β基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法，所述检测方法采用依据SAA1α、β、γ三个等位基因的核苷酸序列合成引物，进行实时荧光定量等位基因特异性PCR，判断待测目标是否属于肝硬化易感人群。本发明检测方法具有简便、准确、快速、高通量等优点，适用于SAA1 SNP与相关疾病的研究。

Description

基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法

技术领域

本发明涉及利用甄别SAA1(血清淀粉样蛋白A1)基因型来实现对肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的方法，具体涉及了一种基于血清淀粉样蛋白A1SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法，包括适用于临床应用的试剂盒。 

背景技术

人类血清淀粉样蛋白A1(Serum Amyloid A1，SAA1)是一种由104个氨基酸组成的急性期反应蛋白。其在天然状态时的分子量大约为12-14kDa，其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为SAA1是一种急性炎性蛋白，因为在急性炎症中，SAA1可由肝脏活化的巨噬细胞和纤维母细胞合成，浓度达正常水平的100-1000倍(正常值一般为910±270微克/升)。此外，SAA1在生理状态下可与高密度脂蛋白(HDL)结合，在炎症期间通过调节高密度脂蛋白代谢而使其水平升高。但是，近年来大量研究表明：SAA1已经不仅是传统意义上的急性期炎症蛋白，而是作为天然固有免疫的调理素，SAA1可与IL-6、TNF-a等炎症性细胞因子相互作用，参与调节机体的固有免疫和获得性免疫。如已经发现SAA1在糖尿病、冠心病、类风湿性关节炎(RA)等慢性炎症疾病和自身免疫病的发生、发展中扮演了重要的角色。 

在肝脏疾病发生中，香港大学He博士等发现，在由肝炎引起的肝硬化及肝癌病人的肝组织中，SAA1蛋白明显增高。众所周知，乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现，其中肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡并由肝脏纤维组织增生发展而来。其中，SAA1是否参与上述病变至今未见报道。但是法国巴斯德研究所的研究表明：SAA1蛋白与肝炎病毒的感染有着密切的关系，乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)转基因小鼠的肝组织中SAA1蛋白表达明显受抑，提示SAA1可能与HBV感染和后续肝硬化等病变有关。 

SAA1基因基于α、β、γ等位基因可分为α/α，α/β，α/γ，β/β，β/γ，γ/γ6种基因型。不同的SAA1基因型在人群中所占的比例存在一定的差异性。近年来，越来越多的研究聚焦在了SAA1基因型与疾病的关系上。众多研究表明，SAA1基因型确实和疾病有相关性。例如，Yamada等对321名日本人SAA1基因型的研究发现，α(1.1)、β(1.5)、γ(1.3)这3种等位基因在日本人中的分布频率分别为0.310，0.347，0.330。Ishii等发现，在127例RA患者中，发生淀粉样变者最常见的基因型是SAA1γ/γ(1.3/1.3)。淀粉样沉积物的出现和SAA1γ的基因频率高度相关。且在γ/γ纯合子基因型中，血清SAA1蛋白的浓度水平，以及SAA1与同为急性期反应蛋白CRP的比值高于其他基因型。而在高加索人中，淀粉样变与SAA1α等位基因的频 率呈正相关。在地中海出血热的研究中，有文献报道，SAA1α型的发病率是其他型别的7倍。而在SAA1的SNP分析研究中，也有报道表明不同的基因型在HDL-C的水平上存在显著差异。而SAA1基因型与肝硬化的相关性研究至今未见报道。 

多态性(Polymorphism)是指在一个生物群体中，同时存在多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性(Genetic Polymorphism)或基因多态性。基因单核苷酸多态性(Singal Nuclear Ploymorphism，SNP)，即基因核苷酸序列内的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失，插入和置换。人类基因多态性与医学有着密切的关系，在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。通过对基因多态性与疾病的易感性的联系研究，可阐明人体对疾病的易感性，在认识疾病的发生机理、预测疾病等方面具有重要作用，为临床医学及预防医学发展带来新的领域。同时，疾病基因多态性与临床表型多样性的联系已受到广泛重视，如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化，阐明基因型与表型之间的联系在认识疾病的发生机理、预测疾病的转归等方面具有重要的作用。基因多态性还可以用于疾病的分型与治疗，即根据患者疾病多态性的基因型来解释疾病的病因和临床表现。由于基因多态性有明显的种族差异，因此在不同的种族之间有可能不同。所以，开展我国人群的基因多态性研究具有重要的意义。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高了预防的效率。而对特定的易感人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。因此基因多态性在临床医学、检验医学、预防医学、遗传医学等方面均具有重要意义。 

目前检测基因多态性的方法有多种，但主要由以下几种： 

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)：由于DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，就会产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。 

单链构象多态性(Single Strain conformation polymorphism，SSCP)：基于相同长度的单链DNA如果核苷酸序列不同，会形成不同的构象，在电泳时就会出现泳动变位，因此可鉴定是否存在突变及诊断未知突变。该方法的缺点是较多因素的影响，例如电泳分辨率，片段大小、变性条件，电泳电压及时间等，不易进行大样本的操作检测。 

等位基因特异性寡核苷酸探针法(PCR-Allele Specific Oligonucleotide，PCR-ASO)：在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合 子还是杂合子。 

PCR-顺序特异寡核苷酸法(PCR-Sequence Specifc Oligonucleotide，PCR-SSO)：PCR片段扩增后利用序列特异性DNA探针，通过杂交对扩增片段进行分析鉴定。 

等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)：即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的(Allele-specific)或组特异性(Group-specific)的引物。与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增达到分析基因多态性的目的。 

PCR-荧光法：通过不同荧光标记的引物同时反应，PCR扩增待检测的DNA，发现目的基因存在与否。 

DNA测序：对PCR产物直接测序。 

基因芯片法(Gene Chips)：使用大量密集排列已知的序列探针，被标记的靶核酸片段与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据探针的核甘酸序列确定靶基因的序列。 

变性梯度凝胶电泳法(Denaturing Gradinent Electrophoresis，DGGE)：基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。 

随机扩增的多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)。RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的引物，对目的基因组DNA进行PCR扩增，.并对扩增片段进行检测，从而判断基因组相应区域的DNA多态性。 

虽然检测基因多态性的方法有多种形式，但均有其局限和不足。 

目前SAA1基因多态性研究中普遍使用的是RFLP方法，该步骤极为繁琐、重复性差，不易大规模进行SNP基因型分析。因此，开发一种简便、快速、准确、经济、高通量的SAA1基因多态性检测方法，对于相关疾病的诊断有着重要的意义。 

本发明创新地提出了一种基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断检测方法，首创提出了实时荧光定量等位基因特异性PCR，即使用实时荧光定量PCR结合采用等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)原理来对SAA基因型检测的方法，通过将SAA1等位基因的SNP位点设计于下游引物3’端的末端并对其进行硫代磷酸化修饰，采用pfu DAN聚合酶等优化步骤，达到了高通量和高特异性的目标，实现了对肝硬化患者及正常对照人群SAA1基因型的检测分析。本发明首次提出了SAA1β/β纯合子基因型与肝硬化 的显著相关性；提出了SAA1β/β基因型在肝硬化预后和/或肝硬化的临床检测方法及其诊断价值；并对本发明方法进行了临床应用评估。本发明提出的用于检测人SAA1等位基因SNP的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法，具有流程简单、易操作、高通量和高特异性等特点，可实现对肝硬化易感人群的筛选；本发明并适用于SAA1 SNP与其它相关疾病的研究。本发明还采用已往报道的PCR联用RFLP方法，对本发明的高通量实时荧光定量等位基因特异性PCR进行反复论证，证实本发明检测方法的可靠性和准确性。 

发明内容

本发明提出了一种基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的方法，依据SAA1α、β、γ三个等位基因的核苷酸序列合成引物，对待测样品进行实时荧光定量等位基因特异性PCR，依据CT值及溶解曲线判断PCR扩增产物的基因型，经检测PCR产物的基因型为β/β型的，则待测样品属于肝硬化的易感人群。 

其中，所述引物包括： 

1)A3套引物 

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.2)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGG； 

2)A2套引物 

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.3)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGA； 

3)B3套引物 

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.4)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG； 

4)B2套引物 

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.5)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA。 

本发明所述引物还可以是含上述引物序列(Seq ID No.1～Seq ID No.5)的延伸引物系列。 

其中，引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰。 

其中，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中，退火温度为60-67℃之间，PCR扩增片段长度为120-200bp；待测基因组DNA浓度范围为5-15ng之间。 

本发明中，所述肝硬化可以是由肝脏疾病发展形成。 

本发明还提供一种基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和或肝硬化诊断用试剂，其用于实施本发明所述的检测方法，包括优化的实时荧光定量等位基因特异性PCR反应 体系；所述引物；含人SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒阳性对照；pfu DNA聚合酶(Pyrococcus furiosus DNA polymerase)；荧光染料(SYBR Green I)及荧光校正染料ROX。 

本发明还提供一种试剂盒，其用于实施本发明所述的检测方法，包括上述基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和或肝硬化诊断用试剂。 

本发明在甄别SAA1β/β纯合子基因型的技术方案的基础上，提出了肝硬化诊断试剂和肝硬化预后诊断试剂，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中，采用本发明所述的A3套引物、A2套引物、B3套引物、B2套引物。 

本发明甄别SAA1β/β纯合子基因型应用于制备肝硬化诊断试剂及肝硬化预后诊断试剂中，所述诊断试剂是包括本发明的引物、反应缓冲液、含人SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒、pfu DAN聚合酶以及荧光染料的试剂盒。 

本发明在SAA1基因型的研究中，建立了一种简便、准确、快速、高通量的用于检测人SAA1等位基因SNP的实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法，还可以应用于SAA1 SNP与其他疾病的相关性研究。 

本发明依据人SAA1α、β、γ三种等位基因SNP序列(8052位T、C；8067位T、C)合成相应引物，将SNP位点设计在下游引物3’端的末端，上游引物为SAA1基因组上的一段保守内含子核苷酸序列。利用优化的PCR反应程序，通过实时荧光定量等位基因特异性PCR反应，对人血液样本提取的基因组DNA进行扩增，并根据CT值及溶解曲线来进行SAA1基因型分析。 

本发明中，所采用的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的优化过程包括pfu DNA聚合酶的运用、合理的引物设计和修饰以及PCR反应体系的优化。 

由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在，本发明运用了pfu DNA聚合酶，该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’-5’端的DNA外切酶活性，因此其既能进行DNA合成又可以即时的识别并切除错配核苷酸，极大提高了PCR扩增的特异性，同时降低了引物二聚体的产生。 

本发明通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DNA聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。 

同时，通过选择更优化的PCR反应条件，如引物浓度范围(0.5-5mM)；引物长度范围(20-30bp)；反应时的退火温度(60℃-67℃)；扩增片段长度(120-200bp)；待测基因组DNA浓度范围(5-15ng)等进一步提高了PCR扩增的专一性和扩增效率。 

本发明中，运用实时荧光定量等位基因特异性PCR技术中的染料法，根据A3、A2、B3、 B2四套引物间的基因组扩增产物的CT值差异与标准参考样品(克隆的含人SAA1α，β，γ三种等位基因基因组DNA片段的质粒)的比较，提高了数据分析结果的可靠性和准确率。 

本发明利用实时荧光定量等位基因特异性PCR反应中引物在3’端末端存在错配时不能延伸的原理，将SAA1等位基因SNP位点设计在引物的3’端末端；采用合适的引物修饰；使用pfu DNA聚合酶等手段，并对反应体系如引物浓度、退火温度、片段扩增长度、模板DNA浓度等进行一系列优化，从而准确快速检测人基因组中的SAA1基因型SNP位点，本发明技术方案的原理和方法亦适用于其它基因的SNP检测。 

本发明中提供了一种特殊引物，以人SAA1α、β、γ三种等位基因上特异的SNP序列合成四套引物，即A3、A2、B3、B2；运用pfu DNA聚合酶，通过实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法，检测人SAA1α、β、γ等位基因并据此进行SAA1基因型分型，从而研究中国人群以及疾病人群如乙型肝炎及肝硬化等患者中SAA1基因分布频率。本发明首次建立通过实时荧光定量等位基因特异性PCR检测SAA1基因型分布方法。并且本发明的实时荧光定量等位基因特异性PCR具有操作简便、准确率高、高通量等特点，适合进行大规模SAA1α、β、γ等位基因基因型的分布检测及其与疾病的相关性研究。 

本发明通过实时荧光定量等位基因特异性PCR方法分析人SAA1α/α，α/β，α/γ，β/β，β/γ，γ/γ6种基因型，并应用该方法检测SAA1基因型在中国健康人群以及疾病人群如乙型肝炎及肝硬化等患者中的分布，确定特定SAA1β/β纯合子基因型与肝硬化等肝脏疾病的密切的相关性，从而论证了本发明在临床上的应用性和可行性。 

本发明联合采用AS-PCR与RFLP的方法，对427例中国汉族健康人群进行SAA1基因型筛查，结果与已有报道的用同样方法获得的其它人种的SAA1基因分布进行比对，不仅明确了中国汉族人群中SAA1基因型分布，还对本发明的实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法进行了论证。 

本发明对SAA1 β/β纯合子基因型在乙肝转化为肝硬化的临床预后诊断价值的评估，进一步发现SAA1β/β纯合子基因型有可能作为肝硬化的高危因子，实现对肝硬化预后诊断，可从乙肝患者中检测出易感人群。另外，SAA1 β/β纯合子基因型作为全新的肝硬化生物标志物，结合血浆AST/ALT比、TBA和LDL值，可大大提高非侵入性肝硬化诊断的准确性。综上所述，对于SAA1 β/β纯合子基因型的检测不仅可用于监测乙肝患者发展为肝硬化的患病几率，从而指导治疗方案的实施；并且，本发明的SAA1 β/β纯合子基因型检测方法结合血浆AST/ALT比、TBA和LDL值等检测项目，可用于非侵入性的肝硬化诊断。 

鉴于SAA1基因型的检测对于相关疾病的预防、筛查及易感人群的早期干预和诊断等方面有重要作用与临床意义，因此，本发明通过对SAA1基因型的研究不仅为SAA1蛋白参与 乙肝型肝硬化的发病机理提供了实验依据，还为甄别SAA1β/β纯合子基因型从而发现肝硬化易感人群建立了高通量的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法，为实现早期诊断肝硬化和预测治疗转归奠定了理论与实验基础。对肝硬化易感人群进行早期预防，早期诊断，早期干预，从而大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，不仅对患者个人还对整个社会的经济和医疗水平的发展、提高都有不可估量的重大意义。 

附图说明

图1所示为以含人SAA1β基因型基因组DNA片段的质粒为模板进行实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增结果示意图。其中，图1A为扩增产物的溶解曲线图，图1B为扩增产物荧光扩增曲线，图1C为达到设定荧光值的PCR循环数。 

图2所示为实时荧光定量等位基因特异性PCR检测人基因组DNA SAA1基因型的结果示意图。其中，图2A为检测SAA1α/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图，图2B为SAA1β/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图，图2C为SAA1γ/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图。 

图3所示为SAA1基因型中β/β型及非β/β型在健康对照人群、乙型肝炎患者及乙型肝炎后肝硬化(乙肝型肝硬化)患者中所占百分比柱状图。 

图4所示为AS-PCR联用RFLP结果示意图。其中，图4A为3％琼脂糖DNA电泳：以含人SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为模板，B3套引物进行AS-PCR扩增的结果示意图；图4B为3％琼脂糖DNA电泳：以含人SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为模板，B2套引物进行AS-PCR扩增，扩增产物经BanI酶切后的结果示意图。 

图5所示为采用实时荧光定量等位基因特异性PCR的检测方法和AS-PCR联用RFLP的检测方法对SAA1基因型中β/β型及非β/β型在健康对照人群中的分布的比较图。 

图6所示为实施例1阳性克隆DNA序列测定结果示意图。 

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。 

实施例1 实时荧光定量等位基因特异性PCR的建立及其临床评估和应用 

一.实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的建立 

实时荧光定量PCR技术具有实时监测、定量和高通量等特点，而且操作简便、灵敏度高。荧光定量PCR分为探针定量PCR及荧光染料定量PCR。荧光染料定量PCR中加入SYBR Green I染料，它能特异性地嵌入双链DNA分子中，与DNA分子结合时能发出荧光。而当DNA分子为单链时，染料被释放，荧光减弱。因此在一个反应体系中，荧光的强弱与DNA双链分子含量呈正相关。因此每一个循环，收集荧光信号，即可通过荧光强度变化监测到DNA扩增产物量的变化，从而得到一个荧光扩增的曲线图，最终通过计算可得到单个体系反应时间内的PCR产物扩增量。通过定量PCR仪计算CT(Threshold cycle)值可判定扩增产物的有无。CT值为PCR扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数。 

等位基因特异性PCR的原理是基于Taq DNA聚合酶不能修复DNA引物在3′端末端的单个碱基错配。所以，当引物的3′端核苷酸与等位基因变异部位序列互补，则模板被扩增。但是，当引物3′端末端核苷酸与模板错配，则模板不会被扩增或扩增效率极低。因此，通过对PCR产物的检测可确定SAA1基因型。 

本发明采用上述基于等位基因特异性PCR的原理而经过改良的实时荧光定量PCR：实时荧光定量等位基因特异性PCR方法检测SAA1α，β，γ三种等位基因中的两个氨基酸位点V57A、V52A相对应的SNP位点，对66名乙肝(尚未转化为肝硬化)和103名乙肝型肝硬化患者进行临床实验，并对其作为肝硬化生物标志物的可能性作出评估。 

本发明以SAA1全基因组中(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)7800到8300之间的核苷酸序列为基础，运用实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法检测SAA1α、β、γ等位基因上的两个SNP位点。 

本发明依据人SAA1α、β、γ三种等位基因的SNP(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)序列(8052位的T或C；8067位的T或C)合成相应的引物，将SNP位点设计在下游引物3′端的末端，上游引物为SAA1基因组上的一段保守的核苷酸序列。通过实时荧光定量等位基因特异性PCR反应，对人血液样本提取的DNA进行扩增，并根据CT值和溶解曲线进行SAA1基因型分析。 

一.实验方法： 

1.获得待测样品：血液中人基因组DNA的抽提，取人血液500μL，用血液DNA抽提试剂盒抽提，测定260nm吸光值以计算DNA浓度，并将其稀释到10ng/uL浓度。 

2.实时荧光定量等位基因特异性PCR引物的设计：参照已报道的人SAA1α、β、γ等位基因序列，设计四套引物，即A3，B3，A2，B2套引物。引物的3’端末端为SAA1等位基因SNP位点。根据SAA1基因组DNA序列(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)设计引物，其中上游引物为通用引物，在全基因组7907～7933bp(GenBank：NCBI ReferenceSequence：NG_021330.1)处。下游引物为针对α、β、γ等位基因的多态性位点的4条引物，其3’端末端在基因组DNA序列的8052位点或8067位点，分别为A3，B3，A2，B2，见表6。 另外，引物3′端的末端被硫代磷酸化修饰，以期提高检测SAA1α、β、γ等位基因SNP位点的特异性。 

上游端正向通用引物 

实时荧光定量PCR所选用人SAA1基因组序列及引物设计位置如上所示。其中，第一个黑框部分为上游端通用引物tcccttctgcctttcctttcctttcc(Seq ID No.1)，第二个黑框部分为A套反向两条引物(即A3，A2，)CctgggctgcagaagCgatcacg taa，灰底标示序列为B套反向引物(即B3，B2)Cgatcacg taactggagc tcctggga，如表6所示。 

表1 实时荧光定量等位基因特异性PCR引物 

表1中：引物A、B分别为上游正向A套、B套通用引物序列，引物A2、A3分别为A2套、A3套下游反向引物序列，引物B2、B3分别为B2套、B3套下游反向引物序列。A2套引物是针对人SAA1等位基因α基因组8052位(氨基酸为V52GTC)T多态性位点设计。A3套引物是针对人SAA1等位基因γ、β基因组8052位(氨基酸为A52GCC)C多态性位点设计。B2套引物是针对人SAA1等位基因β基因组8067位(氨基酸为V57GTC)T多态性位点设计。B3套引物是针对人SAA1等位基因α、γ基因组8067位(氨基酸为A57GCC)C多态性位点设计。 

采用A3和A2套引物进行PCR反应的扩增产物为168个核苷酸，采用B3和B2套引物进行PCR反应的扩增产物为184核苷酸。 

本发明构建的引物-基因型的对应关系，如表2所示。 

表2 所示为本发明提出的实时荧光定量等位基因特异性PCR的预测检测结果(+表示有 扩增条带；-表示无扩增条带) 

3.人SAA1α、β、γ三种等位基因DNA片段的克隆及测序，测序结果与基因库序列比较一致(见图6)。 

4.实时荧光定量等位基因特异性PCR的实施：对人基因组DNA(gDNA，10ng/μL)，进行实时实时荧光定量等位基因特异性PCR反应。阳性对照为本发明克隆并测序鉴定的三种含人SAA1等位基因(α、β、γ)基因组DNA片段的质粒，阴性对照为水。反应体系及条件如下： 

反应条件为95℃，5min；95℃ 30秒；62℃ 31秒；72℃ 45秒；35个循环。 

5.实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的评估 

5.1.在阳性对照质粒上的测试： 

以本发明制备的三种含SAA1等位基因组DNA片段的pBluescript II(SK(+)质粒为实时荧光定量等位基因特异性PCR反应的阳性对照，即人SAA1α等位基因质粒、人SAA1β等位基因质粒、人SAA1γ等位基因质粒，对实时荧光定量等位基因特异性PCR体系进行评估，如引物及反应条件；并进一步对反应条件进行优化，对方法的临床应用可行性进行探讨。 

以人SAA1β等位基因质粒为模板为例，反应条件：95℃ 5分钟，60℃20秒；72℃45秒；36个循环。根据扩增后所获得的CT值和熔解曲线来进行SAA1基因型分析。 

本实施例中，采用四套引物(通用上游引物/下游反向引物A3，B3，A2，B2)进行PCR扩增反应，实际扩增结果如图1所示。 

图1A结果显示：扩增产物溶解度一致，没有杂峰，因此引物专一性好，该反应条件下没有引物二聚体或其它非特异信号产生； 

图1B、图1C结果显示：采用A3套引物(图1C中的B1组)PCR反应有扩增产物(CT值为26.63)，B2套引物(图1C中的B4组)PCR反应有扩增产物两对引物有扩增产物(CT值为23.93)，而A2套引物(图1C中的B3组)，B3套引物(图1C中的B2组)没有扩增产物，结果证实反应体系DNA模板为SAA1 β型质粒。与表7中的预期结果一致，即β/β基因型的PCR结果为：用A3、B2引物时是有扩增产物的，用B3、A2引物时无扩增产物。 

对其它5种基因型(α/α、γ/γ、α/β、α/γ、γ/β)以3种等位基因质粒排列组合为模板进行试验，结果与表7中的预期结果一致。因此，利用本发明提出的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法能够对SAA1基因型进行分型测试。 

5.2.在人SAA1基因型基因组DNA样本上的测试： 

α/β型样本测试结果如图2A所示，扩增产物的溶解曲线图和PCR产物荧光扩增曲线图中分别显示了采用A3，B3，A2，B2套引物进行PCR扩增的循环数CT值及产物扩增环数；其中，扩增结果为A3+，B3+，A2+，B2+，因此判断为人SAA1α/β基因型。 

β/β型样本测试结果如图2B所示，扩增产物的溶解曲线图和PCR产物荧光扩增曲线图中分别显示了采用A3，B3，A2，B2套引物进行PCR扩增的循环数CT值及产物扩增循环数；其中，扩增结果为A3+，B3-，A2-，B3+，因此判断为人SAA1β/β基因型。 

γ/β型样本测试结果如图2C所示，扩增产物的溶解曲线图和PCR产物荧光扩增曲线图中分别显示了采用A3，B3，A2，B2套引物进行PCR扩增的循环数CT值及产物扩增环数；其中，扩增结果为A3+，B3+，A2-，B2+，因此判断为人SAA1γ/β基因型。 

6.实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的优化 

6.1由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在，本发明运用了pfu DNA聚合酶，该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’-5’端的DNA外切酶活性，因此其既能进行DNA合成又可以即时的识别并切除错配核苷酸，极大地提高了PCR扩增的特异性，同时降低了引物二聚体的产生。 

6.2通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DNA聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。 

6.3通过对引物浓度范围(0.5-5mM)、引物长度范围(20-30bp)、反应时的退火温度(60℃-67℃)、扩增片段长度(120-200bp)、扩增基因组DNA浓度范围(5-15ng)、扩增方法等更精准的优化及测评，再进一步提高了PCR扩增的专一性和扩增效率。 

二.临床评估及临床应用： 

采用本发明建立的检测人SAA1 β/β纯合子基因型和非SAA1β/β纯合子基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法对健康人群、乙肝患者和乙型肝炎后肝硬化(乙肝型肝硬化)患者进行SAA1基因型筛查。并对其成为肝硬化危险因子及肝硬化生物标志物的可能性作出评估。 

SAA1各基因型在乙型肝炎患者及乙肝型肝硬化患者中的分布，如表3所示，在103例乙肝型肝硬化患者中，SAA1 β/β纯合子基因型为92例，占百分比最高，为89.32％。在427例健康对照人群中，SAA1 β/β纯合子基因型为37例，占百分比8.67％。比较显示，在乙肝型肝硬化患者中SAA1 β/β纯合子基因型比例高达89.32％，是健康对照人群(8.67％)的10.3倍。而在乙肝患者中，SAA1 β/β纯合子基因型所占百分比为31.82％，是健康对照人群(8.67％)的3.67倍。由此可见，SAA1 β/β纯合子基因型与乙肝型肝硬化和乙肝存在相关性，可能是乙肝型肝硬化和乙肝的生物标志物。 

表3 SAA1基因型在健康对照组和乙型肝炎及肝硬化患者组中的检测结果 

^*.其它肝硬化：3例原发性胆汁性肝硬化，9例血吸虫性肝硬化 

鉴于SAA1 β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化患者中的极高频率达89.32％，而非SAA1 β/β纯合子基因型仅占10.68％，本发明对其成为乙肝发展为肝硬化的危险因子进行了分析评估。SAA1β/β纯合子基因型及非SAA1 β/β纯合子基因型在健康对照人群、乙型肝炎患者、乙肝型肝硬化及非乙肝转化的其他它肝硬化中所占百分比，如图3和表3所示，在健康对照组中(n＝427)，SAA1 β/β纯合子基因型仅占8.67％，非SAA1 β/β纯合子基因型占91.33％；在乙肝 型肝硬化组中(n＝103)，SAA1 β/β纯合子基因型所占比例高达89.32％，明显高于健康对照组，而非SAA1 β/β纯合子基因型仅占10.68％；在非乙肝转化的其他肝硬化患者中，SAA1 β/β纯合子基因型占33.33％，相较于乙肝型肝硬化，该比例低了2.67倍。而非SAA1β/β纯合子基因型占了66.67％；在乙肝患者中(n＝66)，SAA1 β/β纯合子基因型所占比例相比在健康对照中有所升高为31.82％，而非SAA1 β/β纯合子基因型相应减少为68.18％。该结果显示在乙肝型肝硬化(可能由乙肝转化的肝硬化)组中，SAA1基因型绝大部分为SAA1 β/β纯合子基因型；而在其他类型的肝硬化组中，SAA1 β/β纯合子基因型却并没有占到如此大的比例，所占比例与乙型肝炎组类似，为33.33％；在乙型肝炎组和其他类型的肝硬化组中，SAA1 β/β纯合子基因型所占比例相较于健康对照人群而言，也有一定程度提高。上述结果表明SAA1 β/β纯合子基因型与乙肝型肝硬化高度相关，因此可应用于检测乙肝型肝硬化以及在乙肝患者中筛查肝硬化易感人群。 

实施例2：用AS-PCR联用RFLP方法检测SAA1基因型 

目前SAA1基因多态性研究中普遍使用的是RFLP方法，本实施例采用RFLP和AS-PCR的检测方法对SAA1基因型在健康人群中的分布进行研究。通过与实时荧光定量等位基因特异性PCR所获得的结果进行比对来评估本发明的方法的可靠性和准确性。 

RFLP是指基因型之间限制性酶切片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP能对特定基因进行定位和分离，可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，是目前最普遍使用的用于SNP研究的方法。利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种分子水平上的差异，可用于基因型分型和生物多样性的研究。 

本实施例利用AS-PCR反应中引物在3’端存在错配时不能延伸的特点，将SNP位点设计在荧光定量PCR引物的3’端，采用合适的引物修饰，pfu DNA聚合酶等手段，并对PCR的各条件如引物浓度，退火温度，片段扩增长度，模板DNA浓度等一系列条件进行优化，通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测，根据有无扩增产物及RFPL酶切片段长短而获得可靠、准确的数据。 

以SAA1基因型在健康人群中的筛查分布为例，采用等位基因特异性-PCR(Allele SpecificPCR，AS-PCR)联合限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)手段检测在健康人群中的SAA1基因型分布情况。 

本实施例联合使用AS-PCR与RFLP的检测方法，对SAA1基因型在健康人群中的分布进行研究。通过与其他人种的比较，解析乙肝、肝硬化及肝癌等疾病在中国人群中高发的原因。 

依据人SAA1α、β、γ三种等位基因核苷酸序列上的第8067位的差别分别合成两套相应的引物：B2套引物和B3套引物(B2套引物针对等位基因β8067位T；B3套引物针对等位基因α，γ8067位的C)，将8067位点的核苷酸设计在下游引物3’端的末端，上游引物为SAA1基因组上一段内含子DNA的保守核苷酸序列，为B2和B3套的共用引物。通过AS-PCR反应，对从人血液样本中提取的DNA进行扩增，根据B3套引物是否有扩增产物来判断SAA1β等位基因是否存在(B3引物PCR反应后有扩增产物的，判断为是α、γ等位基因阳性；B3套引物PCR反应后无扩增产物，B2套引物PCR反应后有扩增产物的，判断为是SAA1 β/β纯合子)。进一步，用针对等位基因组序列上第8052-C位点的限制性内切酶BanI酶切鉴定，根据酶切片段大小判断编码8052-C位点是否存在(等位基因α无此酶切位点)，继而判断SAA1基因型，如表5所示。 

优选地，上述的AS-PCR反应程序包括： 

(a)由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在，本发明运用了pfu DAN聚合酶，该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’-5’端的DNA外切酶活性，因此既能进行DNA合成又可以即时识别并切除错配核苷酸，极大提高了PCR扩增的特异性，同时降低了引物二聚体的产生。 

(b)通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DAN聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。 

(c)通过对引物浓度范围(0.5-5mM)、引物长度范围(20-30bp)、反应时的退火温度(60℃-67℃)、扩增片段长度(120-200bp)、待测基因组DNA浓度范围(5-15ng)、反应体系等更精准的优化及选定，进一步提高了PCR的扩增效率和扩增专一性。 

本实施例利用PCR反应中引物在3’端末端存在错配时不能延伸的特点，将等位基因SNP位点设计在荧光定量PCR引物的3’端的末端，并对其进行合适的修饰，加上pfu DNA聚合酶的应用等手段，另外还对PCR的反应条件如引物浓度、退火温度、片段扩增长度、模板DNA浓度等一系列条件进行优化，通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测，根据有无扩增产物及BanI酶切片段长短而获得可靠、准确的结果。本发明不仅可准确检测人基因组中的SAA1基因型，同时还适用于其它基因突变及SNP检测。 

一.实验方法： 

1.获得待测样品：血液中人基因组DNA的抽提，取人血液500μL，用血液DNA抽提试剂盒抽提，测定260nm吸光值以计算DNA浓度，并将其稀释到10ng/μL浓度。 

2.AS-PCR引物的设计：参照已报道的GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1中人SAA1α、β、γ等位基因序列，分别设计两套AS-PCR引物。下游引物的3’末端为SAA1基 因组8067 SNP突变位点。本实验中采用的引物：上游引物为通用引物，在全基因7909-8092处；下游引物为针对α、β、γ等位基因的SNP位点的2套引物，分别为B2套引物和B3套引物(B2套引物针对等位基因γ和α在8067位的C，B3套引物针对等位基因β在8067位的T)，见表2。同时对引物3’端的末端进行硫代磷酸化修饰。 

上游端正向通用引物 

以上为AS-PCR人SAA1基因组序列及引物设计位置。其中，第一个黑框部分为上游端通用引物tcccttctgcctttcctttcctttcc(Seq ID No.1)，灰色标识部分为B套反向引物即B3为TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG(Seq ID No.4)，B2为TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA(Seq ID No.5)，如表2所示。 

表4 AS-PCR引物 

表4所示为上游通用引物，B套下游反向引物B2和B3的序列。B3套引物是针对人SAA1基因β，基因组8067位T位点(氨基酸为V57，核苷酸编码为GTC)设计。B2套引物是针对人SAA1α、γ等位基因，基因组8067-C位点(氨基酸为A57，核苷酸编码为GCC)设计。 

采用B3、B2套引物进行PCR的扩增产物长度为186bp。 

本发明构建的引物与基因型的对应关系见表5。 

表5所示为本发明提出的AS-PCR和RFLP联用的预测检测结果(+表示有扩增条带；-表示无扩增条带) 

由此判断： 

(1)当采用B3套引物进行PCR时有扩增产物、采用B2套引物进行PCR时无扩增产物的情况下，待测样品为β/β纯合子基因型； 

(2)当采用B2/B3进行PCR均有扩增产物的，则对B2套引物扩增产物进行BanI酶切鉴定，有186bp条带的待测样品为α/β基因型；有142/44bp条带的待测样品为SAA1 γ/β基因型； 

(3)当采用B2套引物进行PCR有扩增产物、采用B3套引物进行PCR无扩增产物时，则对B2套引物扩增产物进行BanI酶切鉴定：186bp有条带的待测样品为SAA1 α/α基因型，有142/44bp两条带的待测样品为γ/γ基因型；有186/142bp两条带的待测样品为α/γ基因型。 

3.人SAA1α、β、γ三个等位基因基因组DNA片段的克隆及测序： 

3.1.引物设计：分别参照已报道的人SAA1基因组序列(Seq ID No.8)(GenBank：NCBIReference Sequence：NG_021330.1)设计引物： 

上游正向引物以基因序列7796为起始，序列(Seq ID No.6)为 

CATGGTATCCAAGGCTGCTATGAT； 

下游反向引物为基因序列以8256为起始，序列(Seq ID No.7)为 

ATGAGGAATCACTCACTCCTACCATC。 

7796： 

atggtatccaaggctgctatgatcacaggctgaaagcttgaagtcagtggaagatttgtccttcctcattcccctctaaggtgttgttgga 

gtctttatgttctcctgatgtcccttctgcctttcctttcctttccaggggctcgggacatgtggagagcctactctgacatgagagaagc 

caattacatcggctcagacaaatacttccatgctcgggggaactatgatgctgccaaaaggggacctgggggtgcctgggctgcagaagtg 

atcacgtaactggagctcctgggacgttagggctgggtgagcagagcttgcctgccttggacagtcaggagggagacgagctccttgtgga 

gaagttagaggctgcggcccctcctcctcttgccctctctctgcctctgtgctcagtgtgaggtctgagtggatggtaggagtgagtgatt 

cctcat    8256 

3.2.PCR扩增反应：采用以下PCR反应体系。 

在一个200μL微量PCR反应管内加入以下试剂： 

加入去离子灭菌水至终体积50uL。 

PCR反应条件为94℃ 5分钟，94℃ 30秒，54℃1分钟，72℃1分钟，40个循环，然后72℃延伸10分钟。 

3.3.PCR产物克隆：扩增出的PCR片段，经PCR产物回收试剂盒回收，然后用T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)补平末端，再经琼脂糖凝胶电泳，将目标片段用胶回收试剂盒回收纯化，然后插入到pBluesecript II SK(+)载体上的EcoRV位点中，方法见文献(Sambrooks，分子克隆手册)，将连接产物转化到DH5α菌株中，用PCR方法筛选阳性克隆。 

3.4.将阳性克隆进行DNA序列测定，其测序结果与基因库序列比较一致，结果如图6所示。 

4.AS-PCR方法： 

4.1取抽提的待测样品人基因组DNA稀释至10ng/μL，分别用B2和B3套引物进行AS-PCR反应，阳性对照为上述3个已克隆测序的人SAA1等位基因基因组DNA片段，阴性对照为水。 

4.2 AS-PCR反应条件体系： 

反应条件95℃5min；95℃30秒；62℃30秒s；72℃1分钟；35个循环。 

PCR产物用3％琼脂糖电泳鉴定。 

5.AS-PCR产物的RFLP检测： 

扩增的PCR产物通过凝胶抽提试剂盒纯化收获，并用限制性内切酶BanI在37℃恒温水浴中酶切2小时，酶切后产物用3％琼脂糖电泳鉴定。 

6阳性对照的建立： 

以含SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒(6种排列组合，即：α/α，α/β，α/γ，β/β，β/γ，γ/γ6种基因型)为模板进行AS-PCR反应并联合RFLP检测，用3％琼 脂糖DNA电泳分析反应产物。AS-PCR反应条件为：95℃ 5分钟，62℃ 30秒；72℃ 1分钟；35个循环。 

结果如图4所示：图4A为用B3套引物进行AS-PCR的结果；图4B为用B2套引物进行AS-PCR的结果，扩增产物经BanI酶切。 

含SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒作为待测样品进行实验，测试结果与本发明构建的引物-基因型的对应关系表(表5)中的对应关系一一对应，说明阳性对照符合实验要求。 

二.结果分析： 

1.SAA1基因型在中国汉族人群中的分布(见表6)： 

本发明检测SAA1各基因型在中国汉族人群中的分布百分比如表6。结果显示，在中国汉族人群中，α/β基因型所占百分比最高为A1.22％，其次为β/γ基因型34.67％，β/β纯合子基因型占8.67％，γ/γ纯合子基因型为3.98％，α/α纯合子基因型最低为2.11％。 

2.SAA1等位基因在中国人群中的分布频率及与其它人种中的分布频率比较(见表7)： 

分析SAA1各等位基因在中国汉族人群中的分布频率，并将其与已有报道的在高加索人及日本人群中的分布频率比较。如表7所示，在中国汉族人群中，SAA1等位基因β出现频率最高，达46.6％，是高加索人群(18.9％)的2.5倍，也高于日本人群中的分布(30.1％)。而等位基因α的分布频率为27.4％，大大低于高加索人群中的分布(75.8％)，同时也低于日本人群中的分布(32.5％)。等位基因γ的分布频率为26.0％，则介于高加索人群(5.3％)及日本人群(37.4％)分布频率之间。有研究表明，在日本的RA患者中，发生次生AA型淀粉样变最常见的基因型是γ/γ纯合子基因型，而在高加索人群中地中海热是和α的频率正相关。并且，在乙型肝炎及乙肝型肝硬化中，中国人的发病率显著高于高加索人；乙肝型肝硬化也显著高于日本人。同时又有研究表明，血浆中SAA1蛋白含量在肝癌患者中有显著升高。因此，提示SAA1等位基因多态性可能与中国人群乙肝、肝硬化和肝癌的高发相关。 

表6 SAA1基因型在中国汉族人群中的分布 

表7 SAA1等位基因在中国，高加索及日本人群中的分布频率 

a：淀粉样蛋白(Amyloid).1998 Dec；5(4)：262-5. 

b：人类基因学(Hum Genet)(1999)105：360-366 

3.RCR联用RFLP的检测方法与实施例1所采用实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的比较： 

从两种方法在健康对照组人群的SAA1 β/β纯合子基因型与非SAA1 β/β纯合子基因型的分布百分比的比较上看(见图5)，本发明提出的的检测方法与AS-PCR联用RFLP的检测方法两者结果呈现高度的一致性。因此本发明提出的的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法检测SAA1 β/β纯合子基因型具有较高的可靠性和准确性，从而可用于甄别待测目标血清淀粉样蛋白A1 SAA1基因型来实现肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断。 

实施例3 

本实施例提供了一种人血清淀粉样蛋白A1(Serum Amyloid A，SAA1)基因组单核苷酸多态性SNP实时荧光定量等位基因特异性PCR检测试剂盒。 

本试剂盒可对人基因组中的SAA1等位基因α、β、γ基因型进行鉴定检测，适用于人SAA1基因型的分型。试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光法的原理，包括最适于实时荧光定量等位基因特异性PCR反应的SYBR Green I浓度，并且采用了pfu DNA聚合酶及与实时荧光定量等位基因特异性PCR反应最匹配的缓冲液和引物组合，可以有效地抑制非特异性的PCR扩增，达到高灵敏、高通量实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增反应的目的。进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。可对SAA1基因型进行准确分析。 

试剂盒的组成包括： 

反应液试剂A：10×PCR缓冲液+A3套引物 

反应液试剂B：10×PCR缓冲液+B3套引物 

反应液试剂C：10×PCR缓冲液+A2套引物 

反应液试剂D：10×PCR缓冲液+B3套引物 

反应液试剂E：20×SYBR GREEN I荧光染料 

反应液试剂F：50×ROX荧光校正液 

反应液试剂G：pfu DNA聚合酶(5U/μl) 

工作标准品1：含人SAA1基因组DNAα克隆 

工作标准品2：人SAA1基因组DNAβ克隆 

工作标准品3：人SAA1基因组DNAγ克隆 

本实施例利用本试剂盒对人基因组中的SAA1等位基因α、β、γ基因型进行鉴定检测，所适用的Real Time PCR扩增仪包括： 

Thermal Cycler 

Real Time System 

Smart 

System/Smart 

II System(Cepheid) 

Applied Biosystems 7900HT/7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCRSystem、StepOnePlus^TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems) 

(Roche Diagnostics) 

Mx3000P^TM(Stratagene) 

本试剂盒运输可在2～8℃环境下进行。储存时，须置-20℃保存。 

有效期：本试剂盒有效期为12个月，在有效期内使用。 

本试剂盒使用了pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，通过监测反应液中荧光染料SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物定量的目的。以人基因组DNA中的SAA1基因进行PCR扩增为目的，通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下的引物延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增SAA1基因组DNA片段。 

试剂盒中的DNA聚合酶由于使用了pfu DNA聚合酶，从而抑制引物退火时产生的引物二聚体及其引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增的准确率。同时通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DAN聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。 

利用本试剂盒采用荧光检测法对人基因组中的SAA1等位基因α、β、γ基因型进行鉴定检测，SYBR Green I与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBRGreen I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。其具体检测原理为：通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对人SAA1基因型进行准确检测，同时还可以测定DNA扩增片段的融解温度。 

本试剂盒适用于Real-time PCR反应，可以快速、准确地对人基因组中SAA1基因型进行检测、分析。 

反应液中预先混有引物，PCR反应液配制时，只需加入模板、荧光染料、无菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。 

DNA聚合酶使用了pfu DNA聚合酶，与公司独自开发的缓冲液系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性的特点。 

利用本试剂盒采用荧光检测法对人基因组中的SAA1等位基因α、β、γ基因型进行鉴定检测，包括以下步骤： 

1、将抽提的人基因组DNA用核酸稀释缓冲液稀释到10ng/μL。 

2、各取2μL稀释的样品DNA，分别加入4个PCR反应管中。 

3、向上述4个PCR反应管中分别对应加入10μL反应液A、B、C、D。 

4、4个PCR反应管中分别加入1μL反应液E。 

5、4个PCR反应管中分别加入1μL反应液F。 

6、4个PCR反应管中分别加入8μL反应液G。 

7、依照上述同样方法分别处理阴性对照；工作标准品1；工作标准品2；工作标准品3。 

8、将以上制备好的反应液混匀，然后在5000rpm转速下离心3分钟。 

9、将反应管放入实时荧光PCR扩增仪进行扩增反应。 

10、循环参数设定：95℃ 10min；95℃ 30秒；62℃ 31秒；72℃ 45秒；35个循环。 

采用该试剂盒对427例正常中国汉族人群和103例肝硬化患者的SAA1基因型进行了检测比较，检测结果如以上实施例所述。由此可见，本发明试剂盒不仅可用于正常人群中的SAA1基因型分布的检测，而且可用于SAA1基因型与疾病相关性的研究。例如在上述实施例中可见，在肝硬化患者中，相较于健康对照人群，SAA1β/β纯合子基因型所占比例显著升高，是肝硬化的危险因子。因此，采用本发明的试剂盒可对肝硬化的易感人群或高危人群进行筛查，从而实现对易感人群的早期预防、早期诊断、早期干预，进而大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，提高患者的生活质量。 

Claims (8)

1.一种基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法，其特征在于，依据SAA1α、β、γ三个等位基因的核苷酸序列合成引物，对待测样品进行实时荧光定量等位基因特异性PCR，依据CT值及溶解曲线判断PCR扩增产物的基因型，经检测PCR产物的基因型为β/β基因型的，则待测样品属于肝硬化的易感人群。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物包括：

A3套引物

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.2)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGG；

A2套引物

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.3)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGA；

B3套引物

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.4)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG；

B2套引物

所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；

所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.5)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物还包括含引物序列(Seq ID No.1～SeqID No.5)的延伸引物系列。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中，退火温度为60-67℃之间，PCR扩增片段长度为120-200bp；待测基因组DNA浓度范围为5-15ng之间。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述肝硬化由肝脏疾病发展而成。

7.一种基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的试剂，其特征在于，其用于实施如权利要求1所述的检测方法，包括如权利要求2所述的引物；含人SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为阳性对照；pfu DNA聚合酶；荧光染料SYBR GreenI，及荧光校正染料ROX。

8.一种试剂盒，其特征在于，其用于实施如权利要求1所述的检测方法，包括如权利要求6所述的试剂。

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