HU228175B1 - Cytometric process for comparative analysis of pcr products lengths and the use of this process - Google Patents
Cytometric process for comparative analysis of pcr products lengths and the use of this process Download PDFInfo
- Publication number
- HU228175B1 HU228175B1 HU0800760A HUP0800760A HU228175B1 HU 228175 B1 HU228175 B1 HU 228175B1 HU 0800760 A HU0800760 A HU 0800760A HU P0800760 A HUP0800760 A HU P0800760A HU 228175 B1 HU228175 B1 HU 228175B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- labeled
- pcr
- microspheres
- ligand
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 130
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 title 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 52
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 67
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical group NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 40
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 19
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 19
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 19
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 18
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 12
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108700040618 BRCA1 Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 claims description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims description 3
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 3
- -1 appropriate controls Substances 0.000 claims description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 claims description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims 2
- 241000246358 Thymus Species 0.000 claims 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 claims 1
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 19
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 7
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 91
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 2
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 2
- 101150052727 CA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010008748 Chorea Diseases 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 208000012601 choreatic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000000123 temperature gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N (3aR,4R,9bS)-golgicide A Chemical compound C1([C@@H]2NC3=C(F)C=C(C=C3[C@H]3C=CC[C@H]32)F)=CC=CN=C1 NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024378 AF4/FMR2 family member 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 101100020268 Arabidopsis thaliana KIN4A gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000500884 Ephemera Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150032593 FOSL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023372 Fos-related antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010017065 Foster-Kennedy Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000033640 Hereditary breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000833172 Homo sapiens AF4/FMR2 family member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710159955 Leucine-rich repeat and WD repeat-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000014435 Mentha Nutrition 0.000 description 1
- 241001072983 Mentha Species 0.000 description 1
- 241000819999 Nymphes Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100227696 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FRA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 230000008131 children development Effects 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- LJAOOBNHPFKCDR-UHFFFAOYSA-K chromium(3+) trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cr+3] LJAOOBNHPFKCDR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000014804 familial ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000003302 ferromagnetic material Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 208000025581 hereditary breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 235000014569 mints Nutrition 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- XLXOKMFKGASILN-UHFFFAOYSA-N rhodamine red-X Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(=O)(=O)NCCCCCC(O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O XLXOKMFKGASILN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 201000011096 spinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014618 spinal cord cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás PCR-termékek hosszának összehasonlító citométeren. A találmány továbbá a fenti eljárás alkalmazásaira is vonatkozik, elsősorban genetikai eltérések kimutatására szolgáló eljárásra PCR-termékek hosszának citométeren történő analízisével. A találmány szerinti eljárással különböző DNS-méretváltozások vagy szekvenciabeli eltérések, így például triplet-expanziók, inszerciók, deléciók, mikroszatellita polimorfizmusok, illetve SNP-k, mutációk mutathatók ki. így a módszer alkalmas ezen genetikai jellegekkel összefüggő betegségek és egyedi jellemzők diagnosztizálására, illetve szűrésére, valamint mezőgazdasági szempontból fontos genetikai tulajdonságok szűrésére is. A találmány a fenti eljárás kivitelezésére szolgáló reagenskészletre is vonatkozik.The present invention relates to a method for comparing the length of PCR products to a cytometer. The invention further relates to the use of the above method, in particular to a method for detecting genetic differences by analyzing the length of PCR products on a cytometer. Various DNA size changes or sequences such as triplet expansions, insertions, deletions, microsatellite polymorphisms, or SNPs, mutations can be detected by the method of the invention. Thus, the method is suitable for the diagnosis or screening of diseases and specific characteristics associated with these genetic features, as well as for the screening of genetically important genetic properties. The invention also relates to a kit for carrying out the above process.
Description
A találmány tárgya eljárás OCR-tennékek hosszúnak ''osszehasohhtÖanáfÍzisére ciíométeren. A találmány továbbá a fenti eljárás alkalmazásaira is vonatkozik, elsősorban genetikai eltérések kimutatására szolgáló eljárásra PCR-tsrmékek. hosszának cnométeren történő analízisével. a találmány szerinti eljárással különböző DNS-méretváifozások vagy szekvenciabeli eltérések, Így például frlplet-expanziők, inszerciók, deiéelok, mikroszatellita polimornzmnsok. Illetve SMP-k (single nucleotíde polymorphisíns), mutációk mutathatók ki, amelyek citonfeteren történő detektálására korábban nem. minden esetben volt egyszerűen kivitelezhető lehetőség. így a módszer alkalmas ezen genetikai jellegekkel összefüggő betegségek, és egyedi jellemzők diagnosztizálására illetve szűrésére, valamint mezőgazdasági szempontból fontos genetikai tulajdonságok szűrésére is.The present invention relates to a method for oscillating long OCR articles on a cytometer. The invention also relates to applications of the above method, in particular PCR products for the detection of genetic abnormalities. by analyzing its length on a cnometer. various DNA size changes or sequence differences in the process of the present invention, such as, for example, expansion splices, insertions, deletions, microsatellite polymorphisms. Or SMPs (single nucleotide polymorphinsins), mutations that have not previously been detected on citonfeter. in each case, there was an easily feasible option. Thus, the method is useful for diagnosing and screening for diseases and specific traits associated with these genetic traits and for screening for genetic traits of agricultural importance.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti eljárás kivitelezésére szolgáló reagenskészletek (kit-ek),The invention also provides kits for carrying out the above process,
A találmány háttereBACKGROUND OF THE INVENTION
Ismert, hogy számos humán, állati, növényi betegséget a genomiáhs DNS-ben előforduló elváltozások okoznak. A DNS bázissorrendjében többiek változás fordulhat elő; SNF,. mely a normál genotípus populáción belül meglévő variációit jelenti, mutáció, deléeiő. inszeroió, trípiet-expanzió, átrendeződés, stb. Ezek közül metodikailag a legigényesebb kategóriába atriplet-expanzlős elváltozások és a SNP-kZmutációk kimutatása tartozik. Előszűr a trlplet-expanziós kórképek genetikai analízisének hátterét, majd a SNF/pontmutáció diagnosztikai vonatkozásait vázoljuk.It is known that many human, animal, plant diseases are caused by alterations in genomic DNA. The rest of the DNA base sequence may change; SNF ,. which represents the variants of the normal genotype within a population, mutation, deletion. insertion, triplet expansion, rearrangement, etc. Methodologically, the most demanding category is the detection of atriplet-expansive lesions and SNP-cmutations. We pre-screen the background for genetic analysis of trlplet expansion disorders and then outline the diagnostic aspects of SNF / point mutation.
Ismert, hogy néhány betegségért a genomiáhs DNS-ben előforduló, egy vagy több bázistriplet expanziója felelős (lásd I. táblázat). Igy például a Huntington-kót (Hungtington chorea) nevű betegséget a Hantíngton gén (ΠΊ5) I. exonjában lokalizálódó CAG tripiet ismétlődése idézi elő. A betegség diagnosztizálására a CAG ismétlődéseket PCR-rel (polimerase ebein reactionl amplifikárják, é& a PCR-termékeket ismert módon, pl. agarózvagy pohakrllamld-géielektroforézissei (PAGE) (Russell et ah. Chn. Chem. 49(10): 17261732. 200.3; M. Muglia et ai.. Chn. Chem. 42(10); 1601-3, 1990; JM. Milnnsky et ah. Clin. Génét, 64(1): 70-3. 2003), Southern-blot módszerrel (Russell et ah. Chn, Chem. 49(1.0);Some diseases are known to be responsible for the expansion of one or more base triplets in genomic DNA (see Table I). For example, Huntington's disease (Hungtington chorea) is caused by a repetition of the CAG triple localized in exon I of the Huntington's gene (ΠΊ5). To diagnose the disease, CAG repeats are amplified by PCR (polymerase ebein reaction1) and PCR products are known, such as by agarose or glass gellam electrophoresis (PAGE) (Russell et al. Chn. Chem. 49 (10): 17261732. 200.3; M. Muglia et al., Chn. Chem. 42 (10); 1601-3, 1990; J.M. Milnnsky et al., Clin. Gene, 64 (1): 70-3. 2003), by Southern blot (Russell et al., Chn, Chem. 49 (1.0);
Λ ♦ X ΦΦΛ ♦ X ΦΦ
1726-32, 2903), kapilláris géielektrofivézissei (Russell et al, Gin. Chem. 49(10): 1726-32, 2993: M. Fáik et ah. Génét. Test 10(2): 85-97, 2996: T. Tóth et al, Gin. Chera. 43(12): 2422-3, 1997) vagy szekvenálással analizálják. Ezeknek a módszereknek egyik hátránya, hogy kisméretű (109-200 bp hosszú; FCRAermékeket, csak tömény gél alkalmazásával és nem teljesen megbízhatóan lehet szétválasztani, ami növeli a költségeket, illetve az automatizálás, igy a nagyteljesítményű (bigh-tlrronghput) vizsgálat lehetősége - a költségesebb kapilláris gélelektrofefézis kivételével - nem megoldható. Esetenként a vizsgálatok hosszabb időt igényelnek, igy pl, a Souíhern-blot vizsgálat több napot vesz igénybe.1726-32, 2903), by capillary gel electrophoresis (Russell et al., Gin. Chem. 49 (10): 1726-32, 2993: M. Fak et al., Gen. Test 10 (2): 85-97, 2996: T. Tóth et al., Gin. Chera. 43 (12): 2422-3, 1997) or by sequencing. One disadvantage of these methods is that small (109-200 bp; FCRA products can only be separated using concentrated gel and not completely reliably, which increases costs, and the possibility of automation such as bigh-tlrronghput testing is more expensive). except for capillary gel electrophoresis - not feasible, sometimes studies require more time, such as Souiller's blot, which may take several days.
i, táblázat.i, Table.
Egy genetikai rendellenességet vagy egy betegségre való hajlamot okozhat egy pontmatáeiő (SNF) is a kérdéses génben. Így például az ismert, hogy az emlőrákra való haliamért jelentős részben a ORCÁI génben lévő pontmntáciők felelősek (Antónián et ah, The American Journal of Humán Geneties 72: 1117-39. 2903; Marod S.A. - Foulk.es W.D, Natúré Reviews Cancer 4: 665-697, 2(104). Ezeknek a permutációknak a kimutatására az általánosan; használt módszerek a gradiens gél- efektroforézís (DGGE), hőmérséklet gradiens gélelektrcrforézis (TGOE), egyszálú. .konformációs polimorfizmus (SSCP), heteroduplex analízis (HÉT), RN-áz A enzimes hasítás, kémiai hasítási módszer (CCM), enzimes mismateb hasítás (EMC), klíváz fegmens hossz polimorfizmus (CFEP), mutáció detektálás mis.rn.atch kötő fehérjével, fehérje transzlációs teszt (PTT), alléi specifikus oligonukleótid (ASO) hibridizáció DNS chip-en, alléi .specifikus nukleotld beépítés, alléi specifikus primer extenzió, alléi specifikus o'iigonukleotid ligálás, alléi specifikus PÓR. Továbbá Ismertek mic.roarry-k (chíp) és qPCR. módszerek, melyek segítségével .általában hatékonyan, de egyenlőre jelentős költséggel detektálhatok a fentiekben említett. genetikai sajátságok, rendellenességek. Ráadásul ezek a módszerek a költségesebb qPCR kivételével nagy mintaszámú (high-throughpui) mérésre kevéssé alkalmasak. A fenti eljárások egy része hibridizációs technikáit alapul.A genetic disorder or susceptibility to a disease can also be caused by a dot matrix (SNF) in the gene of interest. For example, it is known that point mutations in the ORCA gene are responsible for a large proportion of breast cancer deaths (Antonias et al., The American Journal of Human Genetics 72: 1117-39. 2903; Marod SA - Foulk.es WD, Naturre Reviews Cancer 4: 665-697, 2 (104) The methods commonly used to detect these permutations are gradient gel electrophoresis (DGGE), temperature gradient gel electrophoresis (TGOE), single stranded conformational polymorphism (SSCP), heteroduplex analysis (HET). RNase Enzyme cleavage, chemical cleavage method (CCM), enzymatic mismate cleavage (EMC), clivase cleavage length polymorphism (CFEP), mutation detection with mis.rn.atch binding protein, protein translation test (PTT), allele specific oligonucleotide ( ASO) hybridization on a DNA chip, allele-specific nucleotide insertion, allele-specific primary extension, allele-specific oligonucleotide ligation, allele-specific POR. There are known mic.roarries (chips) and qPCR methods for detecting the aforementioned effectively but generally at a significant cost. genetic features, disorders. In addition, these methods are unsuitable for high-throughput measurements except for the more expensive qPCR. Some of the above procedures are based on hybridization techniques.
Az is ismert, hogy az áramlási dtomcma nagysebességű minta analízist tesz lehetővé. Az áramlási citométerre kifejlesztett un. „multiplex microbead assay” (MMA) módszerek azon alapulnak, hogy a fluoreszcens festékekkel megjelölt 2-1 ö prn átmérőjű mikrogyöngyök felszínére riporter molekulákat visznek fel, amelyek, képesek felismerni és megkötni biológiai mintákban, fehérjéket, nekleínsavakat. vagy más molekulákat ÍJ, Pataki et ah. Cytometry A 6áí 1 χ 45-52; 2005; í. Székvölgyi et at, Cytometry A 69(10): 1086-91, 2006; É, Hegedűs et ai., Cytometry' A 73 A: 23 8-245,2008). A gyöngyök méretük vagy fluoreszcencia intenzitásuk alapján azonosíthatók áramlási ci tó-méterben. Alkalmasan megválasztott, gyöngyök keverékével nagyszámú fehérje- vagy nukleínsav-kőlesönbatáson alapuló mérés egyidejű megvalósítására nyílik lehetőség. A kereskedelemben kapható gyöngyök anyaga két vagy több fluoreszcens festéket is tartalmazhat. így például két fluoreszcens festék 16— 16 különböző koncentrációban történő alkalmazása 256 egymástól könnyen elkülöníthető gyöngytípust eredményez, amelyek mindegy!kéhez különböző ligandkőtő reagens· vihető fel, ami ezáltal 256 különböző mérést tesz lehetővé. Ennél fogva az MMA assav rendkívül alkalmas lehet genetikai rendellenességek szűrővizsgálatára és köhséghatékony, megbízható alternatívája lehet az egyéb kimutatási módszereknek. Továbbá minden olyan esetben előnyös lehet az eljárás, amikor nagymennyiségű mintát keli rövid idő alatt költséghatékonyan analizálni, illetve ha a fent-emiiietf genetikai jellegek közül egyszerre többet is kívánunk mérni (multiplex mérés)·, akár high-íhroughput módon.It is also known that the flow dtomcma allows high speed sample analysis. The so-called flow cytometer was developed. "Multiplex microbead assay" (MMA) methods are based on the application of reporter molecules on the surface of microspheres of 2 to 10 microns in diameter, labeled with fluorescent dyes, which are capable of recognizing and binding proteins, necleic acids, in biological samples. or other molecules BOW, Pataki et ah. Cytometry A 6? 1? 45-52; 2005; f. Székvölgyi et at, Cytometry A 69 (10): 1086-91, 2006; E, Hegedus et al., Cytometry 'A 73 A: 23 8-245,2008). The beads can be identified by their size or fluorescence intensity in flow cytometers. With the choice of a suitable mixture of beads, it is possible to perform simultaneous measurements based on a large number of protein or nucleic acid differentiation. Commercial beads may contain two or more fluorescent dyes. For example, the use of two fluorescent dyes at 16 to 16 different concentrations results in 256 easily distinguishable bead types, each of which has different ligand stone reagents, allowing 256 different measurements. Therefore, MMA assic acid can be extremely useful for screening for genetic disorders and can be a viable, reliable alternative to other detection methods. Further, it may be advantageous in all cases where large quantities of samples need to be analyzed in a cost-effective manner in the short term, or if several of the above-mentioned genetic characteristics are to be measured simultaneously (multiplex measurement), even in a high-throughput manner.
A Wö 2006/113590 szánra nemzetközi közrebocsátást iratból ismertek eljárások és kít-ek genetikai rendellenességek, elsősorban deléeiók, inszereiők és egy szálú léziők kimutatására, amelyekben heíeroduplex analízis módszert használnak. és az avidinnel bevont mikrogyőngyökhöz kapcsolt beterodupiexeket áramlási citometriávai mérik. A heíeroduplex analízis módszer azonban nem alkalmas triplet-expanzíök kimutatására. SNP-k kimutatása sem lehetséges áramlási chometriás heíeroduplex analízissel, és·általában igen körülményesen használható és kevésbé eredményes, ezért a klinikai diagnosztikába nem került bevezetésre.International Patent Publication No. WO 11/113590 discloses methods and kits for detecting genetic disorders, in particular deletions, insertions and single-stranded lasers, using a method of choleroduplex analysis. and beteroduplexes coupled to avidin coated microbeads are measured by flow cytometry. However, the Heteroduplex analysis method is not suitable for detecting triplet expansions. Detection of SNPs is also not possible with flow chrometerial hemoduplex analysis, and · is generally very difficult to use and less effective, so it has not been introduced into clinical diagnostics.
««««
Továbbá az is ismeri, hogy az eltérő hosszúságú DNS-száiak, DNS-íragmenf«nrok. FCR-tennékek olvadáspontja, az un. Tm hőmérséklet eltérő. A Fm-poat az a hőmérséklet, amelyen a kétszálú DNS-molekula 50%-ban denaturálodik, egyszáiúvá válik. Ez a hőmérséklet kémiai szerekkel csökkenthető.It is also known that DNA strands of different lengths are DNA strands. The melting point of FCR products, the so-called. Tm temperature is different. The temperature at which the double-stranded DNA molecule is 50% denatured becomes monofilament. This temperature can be reduced by chemical agents.
AáaíálmánvjeladataAáaíálmánvjeladata
A találmány célja az volt hogy eljárást dolgozzunk ki legalább két DNS-mímárői készült PCR-termék hosszának összehasonlító analízisére, melynek segítségével citométeren, elsősorban áramlási citométeren köiíséghatékonvan, adott esetben multiplex módon kimutathatók a DNS méretbeli és szekvenciákéit eltérései: az illető DNS területről megfelelő primerek segítségével ampilEkalt PCR-termékek méretbeli különbségeinek detektálásával. További cél volt. hogy az eljárás egyszerien kivitelezhető, szűrővizsgálatra is alkalmas eljárás legyen, és ezzel lehetővé tegyük az áramlási citoméfer alkalmazási lehetőségeinek tovább szélesítését.SUMMARY OF THE INVENTION The object of the present invention was to provide a method for comparing the length of a PCR product made from at least two DNA mimics which can detect costly, possibly multiplex, differences in DNA size and sequence on a cytometer, in particular a flow cytometer. ampilEkalt by detecting differences in size between PCR products. It was another goal. to make the process a simple, screening assay to further expand the application of the flow cytometer.
A találmány összefoglalása:Summary of the Invention:
Vizsgálataink során felismertük, hogyha a tormám idős kezeléssel történő Tm analízist •összekapcsoljuk az áramlási citometríávak olyan új módszerhez jutunk, amely különböző hosszúságú PCR-termékek elkülönítésével lehetővé teszi genetikai eltérések egyszerű, gyors, köhséghatékony, multiplex szűrését széles populációban. A találmány szerinti eljárásban szilárd fázisra kötött dupla-szálú PCR-termék egyik szálának leválását mérjük a denaturáló során citométeren. Szemben az ismert, hibridizáción alapuló módszerekkel a találmány szerinti eljárás a DNS denataráci ójának analízisen alapul, melyet kevesebb módszerben alkalmaznak, mini a széles körben elterjedt hibridizációt.In our studies, we have discovered that by combining Tm analysis of horseradish with elder treatment, flow cytometry provides a novel method that allows simple, rapid, cough-efficient, multiplex screening of genetic differences by separating PCR products of different lengths. In the method of the invention, the separation of one strand of the solid-phase double-stranded PCR product is measured during denaturing on a cytometer. In contrast to known hybridization-based methods, the method of the present invention is based on the analysis of the denaturation of DNA, which is used in fewer methods, and mentions widespread hybridization.
Vizsgálataink során továbbá azt találtuk, hogy a találmány szerinti, különböző hosszúságú PCR-termékek elkülönítésére szolgáló eljárás kiválóan alkalmas a bevezetőben említett, bármely DNS szekvenctabeli eltérés detektálására., pl. tripleí-isméUódések, deléciók. inszerciók és mikroszatellita polimorfizmusok kimutatására. Ez a megfelelő primerekkel végzett ampilfikáció során nyeri PCR-termékek méretbeli különbségeinek detektálásával történik. Így például a Hungfington-kort okozó CAG-ismétiődések kimutatására és ezáltal a betegség diagnosztizálására jól használható a találmány szerinti eljárás.It has further been found that the method of isolating PCR products of various lengths of the invention is well suited for detecting any DNA sequence mismatch mentioned in the introduction, e.g. triple repeats, deletions. insertions and microsatellite polymorphisms. This is done by detecting differences in size of PCR products obtained by amplification with appropriate primers. Thus, for example, the method of the present invention is useful in detecting CAG recurrences causing Hungfington's disease and thereby diagnosing the disease.
Továbbá azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmas a DNS-szakasz hoszszát nem érintő genetikai eltérések, például ponirautáeiok í SNP~k) kimutatására is, megfelelő, különböző hosszúságú primereket alkalmazva. így például a BRCAÍ gén pontmutáeiői közül az egyiknek, nevezetesen az 5382insC mutációnak a kimutatására is rendkívül jól használható a találmány szerbe eljárás. Bűnek igen nagy előnye, hogy ' szűrővizsgálatra alkalmassá tehető, A különböző hosszúságú primerek. Úyea célú alkalmazása ismert, áramlási citometriás Tmpoat analízissel összekapcsolt alkalmazása azonban újnak tekinthető.Further, it has been found that the method of the invention is also suitable for detecting genetic alterations in the length of the DNA region, such as poniroutes (SNPs), using appropriate primers of different lengths. For example, one of the point mutations of the BRCA1 gene, namely the 5382insC mutation, is also very useful in the present invention. The great advantage of sin is that it can be made suitable for screening, primers of different lengths. Its use for this purpose is known, but its use in combination with flow cytometric Tmpoat analysis can be considered novel.
Tm-pootbell eltérés alapján reahiime qPCE eljárásokkal pootmutáeiők is kimutathatók a normál 'illetve a megváltozott genonri szekvenciához hibrköxáio prnserek alkalmazásával. Ezek az eljárások a reakció során keletkező FCR-termékek mennyiségének gPCR berendezésiben történő folyamatos mérésén alapulnak, így annak. felismerése, hogy egyetlen, a vizsgálandó szekvenciát behatároló primer pár alkalmazásával ampltrikálí minta áramlási citnmetriás mérésével hasonló információ nyerhető, áj és meglepő felismerés. Az áramlást cimmetria alkalmazhatóságát számos genetikai elváltozás kimutatására a íentenáített, Wö 2ÖG6/113590 sz. netszetkózá közrebocsátást Iratban említik, de az. ott leírt eljárást minden erőfeszítés ellenére sem· sikerűit porűmutádók, SNF-k detektálására, sem iriplet-cxpanxiők kimutatására sikeresen alkalmazni. Az ott leírt eozimatikas és kémiai eljárásokhoz képest a Trn-pont különbségen alapuló áramlási ehotneiriás megközelítést csak elvileg lehetett célravezetőnek feltételezni., gyakorlati megvalósíthatósága és megfelelő érzékenysége a szakember számára is valószínűtlennek tűnhetett. A találmány az ismert eljárásók olyan új kombinációja, amely egyszerűen kivitelezhető és előre-mm-vári eredményekhez vezetett A találmány szerimi eljárásban a szilárd fázisra kötött duptaszalá P€B-termék egyik szálának a szilárd fázistól történő leválását mérjük a denaturáciő során. Ezt a megközelítést sokkal kevesebb módszerben alkalmazzák, mim az ezzel ellentétes hibridizáción alapuló eljárásokat, pl. a napjainkban egyre Inkább eltenedt, de a rutin diagnosztikában meg nem használatos DNS ehip technológia, vagy egyéb hibridizációs módszerek. Á DNS Tm- pont különbségen, illetve denaturáciőn alapuló áramlási citometriás módszert eddig az irodalomban még nem ismertették.Based on Tm-pootbell divergence, poo mutants can also be detected by reactive qPCE methods using primers hybridizing to normal or altered genonial sequences. These methods are based on the continuous measurement of the amount of FCR products generated during the reaction in the gPCR equipment, such as it. recognizing that similar information can be obtained by flow cytometric measurement of a single amplifier using a single pair of primers delimiting the sequence to be tested is both surprising and surprising. The applicability of flow cymmetry for the detection of a number of genetic abnormalities is described in the patented Wö 2ÖG6 / 113590. netketkozá publication is mentioned in Irat, but it is. Despite all efforts, the procedure described there has not been successfully used to detect dust mutants, SNFs, or iriplet cxpanxes. Compared to the eosymatic and chemical methods described therein, a flow-effervescence approach based on the Trn-point difference could only be theoretically practicable, and its practical feasibility and appropriate sensitivity may also have been unlikely to those skilled in the art. The present invention is a novel combination of known processes which is readily practicable and has yielded pre-mm-expected results. In the serimic process of the invention, the separation of a strand of a solid phase bound dupta-ribbon P B product from the solid phase is measured during denaturation. This approach is used in far fewer methods, as opposed to methods based on reverse hybridization, e.g. nowadays, DNA ehip technology, or other hybridization methods that are increasingly abandoned but not used in routine diagnostics. A flow cytometric method based on DNA Tm-point difference or denaturation has not yet been described in the literature.
A találmány egyik szempontja szedőt eljárást nyújt egy DNS mima HÚR-terméke hosszának összehssonbtö analízisére egy kontroll DNS mintáról ampliílkáli PCR-termékkel ciroméíeren, melyre jellemzik hogy (ί) a mintából a kérdéses DNS-szákasz amplitlkálásóval KiR-terméket kozunk létre olyanOne aspect of the present invention provides a collector method for comparing the length of a DNA mima HOR product from a control DNA sample with an amplification PCR product on a circular pattern, characterized by (ί) generating a KiR product from the sample by amplifying the DNA sequence in question.
kívánt esetben legalább egy hnomszeens molekulával jelöljük;optionally labeled with at least one homologous molecule;
(ii) a kapott Iklk üendékeí a ligandot kötő molekulával bevont núkrogyöngyökre kötjük, (hl) a núkrogyöngyökre kötőn duplaszáid DNS-t tartalmazó mintái kettéosztjuk, majd adott bömérsékleten egy Tm-pontot csökkentő szer etőre-nregbfeározott kooeemrtteiöjú oldataiban bőkezűi juk, ahol az említett knnceotrádöknt olyan koncentráció-sor két szélső értékeként határozzuk meg, amelynél a kontrollal megegyező vagy annál rövidebh KM-íennék lignttddalnem-jeiölt szála a konecndáclöt növelve fokozatosan ledisszncíál a mikcogyöngy felszínéről míg a kontrolinál hosszabb PCR-termék Hgsstddal nem-jelölt szab lényegében nem, majd a mikrogyöngyöket mossuk;(ii) binding the resulting Iklk to ligand binding molecule coated beads, (hl) dividing duplicate DNA samples containing the ligand binding molecule, and removing a Tm-point reducing agent at a given temperature. is defined as the two extreme values of a concentration range in which the lignttddalnem-untranslated strands of the same or shorter KMs gradually degrade from the surface of the mycelium while increasing the length of the PCR product to substantially unlabeled Hgsstd washed;
(Ív) a mlkrogyöogyőkhöz kötött DNS-t éltmreszeeosen. jelöljük,, ha az <l) lépésben nem jelöltük;(Arc) DNA bound to milliliter vectors. denote, if not marked in step <l);
ív) az (i)-(lv) lépéseket a kontroli DNS mintával is elvégezzük;arc) performing steps (i) to (lv) also using a control DNA sample;
(vi) az igy-knpot.t núkmgyöugyök Ouoreszeeneíájüt cüotnéferen tnétjök és a kapott jelek intenzitását kiértékeljük úgy, hogy a Tnnpnntot csökkentő szer bígabh oldatával kezelt FCR-termékhez hasonlítjuk a szer töményebb oldatával kezelt PCR-tertnék Snoreszcencia intenzitását mind a 'kontroll mind a vizsgáit mints esetében, és a kot minta intenzitás·· változásai közti különbséget kiértékeljük..(vi) evaluating the intensity of the Igy-knpot.o. mints, and the difference between the intensity ·· of the kot sample is evaluated.
A találmány második szempontja szerint egy eljárást, nyújt DNS méretbeli eltérések kimutatására. P€R-termékek hosszának analízisével eüometeren. melyre jellemző, hogy (I) biológiai mintából DNS-t tisztítónk;According to a second aspect of the invention there is provided a method for detecting differences in DNA size. By analyzing the length of P € R products on an euometer. characterized in that (I) purifying DNA from a biological sample;
.: . .u (ii) az említett DNS kérdéses, eltérést hordozó szakaszát PCR-ral amplifíkáljuk olyan primer pár alkalmazásával, ahol az egyik prímért egy ligauddal és a másik prímen kívánt esetben legalább egy fluoreszcens molekulával jelöljük;.:. .u (ii) amplifying by PCR the said divergent region of said DNA using a primer pair, one primer being labeled with a ligand and the other primer optionally with at least one fluorescent molecule;
(fii) a kapott FCR-termékekot a ligandot megkötő molekulával bevont mikrogyöngyökre kötjük;(fii) binding the resulting FCR products to microspheres coated with a ligand binding molecule;
(ív) a mlkrogyöngyökre kötött duplaszáíú DNS-t tartalmazó· mintákat kettéosztjuk, majd adott hőmérsékleten egy Tm-pontot csökkentő szer eiőre-meghaiározott koncentráció jó oldataiban hőkezeljük, ahol az. említett koncentrációkat olyan koncentráció-sor szélső értékeként határozzuk öreg, amelynél a negatív és pozitív kontroli közöl a rővidehb FCR -termék líganddal nem-jelölt szála a koncentrációt növelve fokozatosan ledísszoctál a mikrogyöngy felszínéről, míg a negatív és pozitív kontroli közöl a hoszszabb P€R-termék líganddal nem-jelölt szála lényegében nem, majd. a mikrogyöngy őket mossuk;(arc) dividing the samples containing double-stranded DNA bound to ml beads and heat-treated at a given temperature in good solutions of a predetermined concentration of a Tm-point reducing agent, where said concentrations are defined as the extreme values of a concentration series in which the negative and positive control is reported by the unlabeled strand of the shorter FCR product gradually increasing the concentration from the surface of the microsphere to increasing the concentration while the negative and positive control is reported by the longer P € R- non-labeled fiber of the product is essentially not, then. the microspheres wash them;
(v) a míkrogyőngyökhőz kötött DNS-t fluoreszcensen jelöljük, 'ha az (is) lépésben nem jelöltük;(v) labeling the annealed DNA with fluorescence unless otherwise indicated in step (i);
(vi) az így-kapott mtkrogyöouvök fluoreszeewiáját cítometereu átérjük és a kapott fluoreszcencia intenzitásokat összehasonlítjuk a. normális negatív és az ismert eltérést hordozó pozitív kontroll minták által .adott fluoreszcencia intenzitásokkal.(vi) passing the fluorescence of the resultant fluorescence cytometers and comparing the fluorescence intensities obtained with. normal negative and fluorescence intensities of positive control samples of known variation.
A. találmány harmadik szempontja szerint sgy eljárást nyújt DNS szekvenciabeli eltérések,. különösen ponímutációk kimutatására FCR-termékek hosszának analízisével cltornéteren, melyre jellemző, hogy il) biológiai mintából DNS-t tisztttunk;A. A third aspect of the invention thus provides a method for DNA sequence differences. in particular for detecting pony mutations by analyzing the length of FCR products on a storn ether, characterized by (ii) purifying DNA from a biological sample;
(ii)- az említett DNS kérdéses, ponímutációt hordozó szakaszát allélspeciflkus PCRreakcióval amplííikáljuk három primer alkalmazásával, ahol a vad-típusra specifikus rövid forward printer és a mutációra specifikus hosszabb. GC-gazdag Tag-et hordozó forward primer kívánt esetben legalább egy fluoreszcens molekulával jelzett, tűig a közös reverse primer egy líganddal jelzett;(ii) - amplifying the said pony-mutation region of said DNA by an allele-specific PCR reaction using three primers with a wild-type specific short forward printer and a mutation specific longer. A forward primer carrying a GC-rich Tag is optionally labeled with at least one fluorescent molecule, and the common reverse primer is labeled with a ligand until the needle;
(fii) a kapott PCR-tomékeket a ligandot kötő molekulával bevont mlkrogyöngyökre kötjük;(fii) binding the resulting PCR products to ml beads coated with the ligand binding molecule;
tiv) a mlkrogyöngyökre kötött dupla-szálú DNS-; tartalmazó mintákat kettéosztjuk, majd adott hőmérsékleten egy 'frn-pontot csökkentő szer eíöre-megbatározott koncentrációjú oldataiban hökezeíjük, ahol az említett koncentrációkat olyan koncentráció-sor szélső értékeként határozzuk meg, amelynél a röví-debb, mutációt nem-tartalmazó PCRΦΦtiv) double-stranded DNA bound to ml beads; samples are divided into two and then heated at a given temperature in solutions of a predetermined concentration of a 'frn-point depressant, whereby said concentrations are defined as the extremes of a series of shorter, mutation-free PCRs.
termék liganddal nem-jelölt szála a koncentrációt növelve fokozatosan ledísszociál a mikrogyőngy felszínéről, mig a hosszabb, mutációt tartalmazó PCR-termék bgauddal nem-jelölt szála lényegében nem, majd a mikrogyöngyöket mossuk;the ligand-unlabeled strand of the product gradually loosens from the surface of the microbead, increasing the concentration, whereas the longer, unlabeled strand of the PCR product containing the mutation is substantially non-labeled and then washing the microbeads;
(v) a mikrogyöngyőkhőz kötött DNS-t fluoreszcensen jelöljük, ha az (B) lépésben nem jelöltük;(v) microspheres bound DNA is fluorescently labeled if not labeled in step (B);
(vi) az így-kapott míkrogyöngyök fluoreszcenciáját citométeren mérjük és a kapott fluoreszcencia intenzitásokat összehasonlítjuk a kérdéses mutációt nem-hordozó negatív kontroll illetve a kérdéses mutációt hordozó pozitív kontroll mintával(vi) measuring the fluorescence of the resulting microspheres on a cytometer and comparing the fluorescence intensities obtained with a negative control without the mutation in question and a positive control with the mutation in question.
A találmány szerinti eljárás egyszerű diagnosztikai módszer lehet genetikai rendellenességek kimutatására a bevezetőben említett módszerek alternatívájaként vagy ezen módszerekkel kapott eredmények megerősítésére, vagy gyors és köU-séghatékonv előszűrésre, mivel nem igényel költséges reagenseket és készülékeket, széleskörűen alkalmazható·, multiplex vizsgálatok és szűrővizsgálatok elvégzésére is lehetőséget biztosit..The method of the present invention may be a simple diagnostic method for the detection of genetic disorders as an alternative to the methods mentioned in the introduction, or for confirming the results obtained by these methods or for rapid and cost-effective pre-screening since it does not require expensive reagents and equipment. provides ..
AgalólmánvfeszleteslehásaAgalólmánvfeszleteslehása
A találmány szerinti eljárás segítségével eltérő hosszúságú PCR-termékek között tudunk különbséget tenni oly módon, hogy a PCR-termékeket hordozó míkrogyöngyök. fluoreszcencia intenzitás-eloszlását előre beállított koncentrációjú Tm-pont csökkentő szerrel (pl. formánná) hőkezelés után mérjük citométeren.. A találmány szerinti eljárásokban a fluoreszcens-jelölési egyik változat szerint bevezethetjük, az amplifikálás során, libben az esetben fluoreszcens molekulával és kapcsolódást biztosító liganddal (pl. bioim) jelölt, eltérő hosszúságú PCR-íermékeket állítunk elő, melyeket fcölön-küiön reakcióban a ligandot felismerő- és megkötő molekulával (pb sztreptavídin) bevont félszínű mikrogyöngyökre kötünk, és egy Tmpontot csökkentő szer előre-meghatároxott koncentrációjú oldatában néhány percig adott hőmérsékleten kezelünk. A hőkezelést kővetően a. rövldebb PCR-termék fluoreszcens molekulát hordozó szála ledísszociál a mtkrogyöngyről, így a mikrogyőngy fluoreszcenciája jelentősen lecsökken, közel a háttérfluoreszcencia értékére, míg a hosszabb PCR-termék fluoreszcens molekulát hordozó szála lényegében nem disszoeiál le, és a mikrogyőngy továbbra Is emmitálni fog fluoreszcens fenyő Erre a célra a hőkezeléshez alkalmazott hőmérsékletet úgy választjuk meg, hogy az a két eltérő hosszúságú PCR-fermék Tm-pontja közé essen. A DNS Tm-poníját például a formamid csökkenti, ennélfogva alacsonyabb hőmérséklet, a találmány szerinti eljárásban már 4£ri€ is elegendő a hőkezeléshez, amely nem károsítja a ligandligandkötő molekula közötti (pl. hlórin-sxtrcptavldm) kötést, vagy a Hgandkötő molekula (pl. sztreptavidin) és a mikrogyőngy közötti kapcsolatot, vagy esetleg a mikrogyőngy anyagát. AThe method of the present invention makes it possible to distinguish between PCR products of different lengths by the presence of microspheres containing the PCR products. The fluorescence intensity distribution is measured on a cytometer with a predetermined concentration of Tm-point reducing agent (e.g., formane). In one embodiment, the fluorescence labeling may be introduced during amplification, in which case with a fluorescent molecule and a ligand for attachment e.g., bioim) labeled PCR products of varying lengths, which are bound to a semi-colored microspheres coated with a ligand recognition and binding molecule (pb streptavidin) in a different reaction and treated with a predetermined concentration of . After the heat treatment a. the fluorescent molecule strand of the shorter PCR product loosens from the bead so that the fluorescence of the microvilli is significantly reduced close to the background fluorescence value, whereas the longer strand of the PCR product does not substantially dissociate into the fluorescent molecule and the microsome for this purpose, the temperature used for the heat treatment is selected to lie between the Tm points of the two PCR products of different lengths. For example, the Tm-pony of DNA is reduced by formamide and therefore at a lower temperature, the process of the present invention is already sufficient for heat treatment which does not damage the bond between the ligand-ligand binding molecule (e.g., chlorine-xtrcptavldm) or streptavidin) and the microvessel, or possibly the material of the microvessel. THE
- β β«*κ 4 6 ΧΦ «» * S 4 4*4 4 « * * * 4 4 4 » , 9 Φ * 4 4 <*4*Φ * Φ* 4 «νΛχ φΦ- β β «* κ 4 6 ΧΦ« »* S 4 4 * 4 4« * * * 4 4 4 », 9 Φ * 4 4 <* 4 * Φ * Φ * 4« νΛχ φΦ
Ο hőkezelés hatására bekövetkezett Οuoreszceneia-változást a kétféle hosszúságú PCR.»terméket hordozó m ikra gyöngyök eltoméicren történő mérésével detektálhatjuk,. hígh-throughput és multiplex módon Is. A detektálást előnyösen áramlási citométeren végezzük, de pásztázó lézer mikroszkópiával is végezhetjük.Ο The change in esz uorescence caused by heat treatment can be detected by measuring the microwells of two types of PCR-containing product on the beads. dilute-throughput and multiplex way Is. Detection is preferably performed on a flow cytometer, but can also be performed by scanning laser microscopy.
Egy másik változat szerint hőkezelés után a mikrogyöngyökhöz kötött duplaszálú DNS-t jelöljük egy DNS-festékkel, előnyösen egy interkalálódő festékkel, mely az. egyszálú DNS-t nem festi meg, A DNS-t jelölhetjük, olyan festékkel Is, amelynek fluoreszcenciája megváltozik a DNS egy szál óvá válása során.Alternatively, after heat treatment, the microsphere bound double-stranded DNA is labeled with a DNA dye, preferably an intercalating dye, which is. single-stranded DNA is not dyed. DNA can also be labeled with a dye whose fluorescence changes as the DNA becomes a single strand.
Az „Tm-pont csökkentő szer előre-meghatározott koncentrációi” alatt a Tm-pont csökkentő szer olyan koncentráció sorának szélső értékeit érijük, melyeket minden egyes méréshez külön előre meghatározunk az adott hőmérsékleten. Az egyik szélső értéken a rövid PCR-termék fluoreszcens molekulát, hordozó szála nem disszoeiál le a mikrogyöngyökröl, ennek átlagos íluoreszcencia-mtenznását tekintjük IböN-nak, míg a másik szélső értéken a rövid PCR-termék fluoreszcens molekulát hordozó szála jelentős mértékben ledisszoeíál a mikrogyöngyökrökBy "predetermined concentrations of the Tm-point-reducing agent," the extreme values of a range of concentrations of the Tm-point-reducing agent are determined in advance for each measurement at a given temperature. At one extreme, the fluorescent molecule carrier of the short PCR product does not dissociate from the microspheres, its average fluorescence amplification is considered to be IböN, while at the other extreme, the fluorescent molecule carrier strand of the short PCR product significantly disassociates the microspheres.
Az „adott hőmérséklet” alatt a jelen leírásban, azt értjük, hogy olyan hőmérsékletet alkalmazunk a hőkezeléshez, amely a kétféle hosszúságú PCR-termék csökkentett Tm-pontja köze esik.By "specific temperature" as used herein, it is understood that the temperature used for the heat treatment is within the reduced Tm of the PCR product of two lengths.
Genetikai rendellenességek vizsgálatakor a normális, egészséges mintából származó DNS-szakaszhoz állítjuk be a mrmarmd-koncerstráeiöí tetszőlegesen 40°ü-en, ahol ph tripletexpanziö esetén, a normális DNS két szála szétválik, a hibás DNS azonban még nem válik szét, míg deléeió esetén a normális DNS két szála nem válik még szét, a hibás DNS azonban szétválik ennél a koncentrációnál.In the case of genetic disorders, the mrmarmd concertin is arbitrarily set to the DNA segment from the normal healthy sample at 40 ° where two phases of normal DNA are cleaved in ph, but the deletion in the deletion is not yet complete. the two strands of normal DNA are not yet separated, but the defective DNA is separated at this concentration.
Az eljárást előnyösen kivitelezhetjük multiplex módon is, amikor kétféle mikrogyöngyöt alkalmazunk vagy a kétfelé PCR-terméket különböző fluoreszcens festékkel jelöljük és így ezeket egyszerre mérhetjük, és/vagy hlgh-íhroughput módon, amennyiben automatizált készüléket használunk (FACSarray), melynek segítségével 96 vagy 384 lyukú lemez is mérhető, A multiplex mérés esetén attól függően, hogy hányféle mikrogyongvöt használunk, nő a vizsgálható genetikai jellegek száma, hiszen az áramlási citométer ezeket a gyöngyöket el tudja különíteni, fluoreszcencia intenzitásukat képes küiön-külön mérni. Különböző méretű illetve színű míkrogyöugyök alkalmazására van lehetőség, valamint a PCRtermékek jelölésére használt festékek Is lehetnek különbözőek, ami tovább növeli a mérhető genetikai jellegek számát.The method may also be advantageously performed in a multiplexed manner by using two types of microspheres or by labeling the two-sided PCR product with different fluorescent dyes and / or measuring them simultaneously and / or by hlgh-hroughput when using an automated device (FACSarray) Plasma can also be measured. Depending on the number of microgongs used in the multiplex measurement, the number of genetic traits increases, since the flow cytometer can separate these beads and measure their fluorescence intensity individually. There are various sizes and colors of microspheres, and the inks used to label PCR products may also be different, further increasing the number of measurable genetic features.
ίοίο
Az eljárást kivitelezhetjük tárgylemezen is, például polisztirol vagy üveglemezeken. A mikrogyöngyök fluoreszcenciáját ebben az esetben pásztázó lézer mikroszkópiával mérjük.The process can also be carried out on a slide such as polystyrene or glass. The fluorescence of the microspheres in this case is measured by scanning laser microscopy.
A találmány szerinti eljárásban a DNS amplülkálását polimeráz-lánc-reakcióval (PCR) végezzük nJS szabadalmi leírás 4,68X202). A szakember számára nyilvánvaló, hogy a PCR reakciókörülményeit mindig az adott prímerekre -kell optimalizálni.In the method of the invention, DNA amplification is performed by polymerase chain reaction (PCR) (nJS Patent 4,68X202). One skilled in the art will recognize that PCR reaction conditions must always be optimized for the particular primers.
A találmány szerinti eljárásban a kérdéses DNS-szakaszt vagy eleve rendelkezésre álló vagy tervezett printerekkel arapliírkáljnk, Fontmutáclő kimutatásához meghosszabbított .mutáció-specifikus prímért is alkalmazunk.. A szakember számára egy adott DNS-hez minden további nehézség nélkül tervezhetők és eloállhhatók a szükséges primerek.In the process of the present invention, the DNA portion in question is either arapliterated with printers already available or designed, and an extended mutation-specific primer is used to detect the Font Mutator. The required primers for a particular DNA can be designed and constructed without further difficulty.
A találmány .szerinti eljárás kivitelezéséhez szükség van a Tm-pont csökkentó szer koncentrációjának előzetes meghatározására az adott hőmérsékleten (ez 40°C-nak választottuk, de lehet ettől eltérő hőmérséklet is) minden egyes esetben, hogy beállítsuk a kontroll DNS olvadáspontját, a Tm-pontot. Ez a szakember számára minden további nélkül elvégezhető.In order to carry out the process of the invention, it is necessary to pre-determine the concentration of the Tm-point reducing agent at a given temperature (this is chosen as 40 ° C, but may be different) to adjust the melting point of the control DNA, Tm. points. This will be readily accomplished by one skilled in the art.
A találmány szerinti eljárásban a unnia elsősorban biológiai mintát, Így állati, növényi, vagy humán genonnalis DNS-t tartalmazó mintát jelent, pl. perifériás vér. izolált Umfoclíák, illetve bármely más állati, növényi vagy humán szövetféleség sejtjei.In the process of the invention, unnia is primarily a biological sample such as animal, plant, or human genomic DNA, e.g. peripheral blood. cells of isolated Umfoclia or any other animal, plant or human tissue.
A találmány szerinti eljárásban a DNS tetszőleges eredetű lehet, Így prokariőta vagy eukarióta, különösen állati, növényt vagy humán genomiális vagy mitokonöriális illetve kloroplasztisz eredetű DNS, de ide érijük a virálís, pl. tag. vagy plazmid DNS-eket is.The DNA of the present invention may be of any origin, such as prokaryotic or eukaryotic, especially animal, plant or human genomic or mitochondrial or chloroplast derived DNA, but includes viral, e.g. broad. or plasmid DNA.
A Tm-pom csökkentő· szerek olyan kémiai ágensek lehetnek, amelyek a komplementer bázisok közötti hldrogén-hld kötések destabibzádöiával csökkentik a DNS olvadáspontját. Erre példaként szolgálnak a formánná, DMSÖ, karhamid és alkohol, A találmány szerinti eljárásban előnyösen formamldot alkalmazunk,Tm-pom reducing agents can be chemical agents that reduce the melting point of DNA by destabilizing the hldrogen-hld bonds between complementary bases. Examples of this are formane, DMSO, carhamide and alcohol.
A találmány szerinti eljárásban használt rnikrogyőngyök pl. polisztirol alapúak lehetnek. de bármely kémiai anyagból készük, eitometriás analízisre alkalmas mérető és anyagú, akár ferromágueses anyagból készült ün. mágneses gyöngyök is alkalmasak, A polisztirol gyöngyök előnye, hogy nemcsak a méretük, alapján lehet a mérés maltiplexieításat növelni·, hanem a gyöngyök különböző fluoreszcens festékeket is tartalmazhatnak, vagy ugyanazt a festéket eltérő koncentrációban tartalmazhatják. A mágneses gyöngyök előnyös tulajdonsága, hogy a mosási lépéseknél a centrííugálási idő, így a mosás ideje is lerövidíthető, mivel mágnessel a gyöngyök egyszerűen és gyorsan kmlepithefoek, és bár a mohlplexíenás ebben az esetben nem olyan széleskörű, mint a polisztirol gyöngyök esetén, a különböző méretű gyom >,· φ*The microbeads used in the process of the invention are e.g. they may be based on polystyrene. but made of any chemical material, of a size and material suitable for eitometric analysis, even of ferromagnetic material. magnetic beads are also suitable. The advantage of polystyrene beads is that not only their size can be used to increase the measurement of maltiplexing, but also that the beads may contain different fluorescent dyes or the same dye in different concentrations. The advantage of magnetic beads is that the centrifugation time, including washing time, can be shortened during the washing steps, since the magnets easily and quickly kmlepithefo, and although the mohlplexing in this case is not as wide as the polystyrene beads, weed>, · φ *
gyök alkalmazásának lehetősége továbbra is megmarad. A találmány szerinti eljárásokban előnyösen polisztirol gyöngyöket alkalmazunk,the possibility of applying a radical remains. The processes of the invention preferably use polystyrene beads,
A PCR reakcióhoz a pn.merek.el egyrészt iigandokkal konj ágáljuk, másrészt fluoreszcens festékekkel jelöljük. A PCR-fermékek. megkötésére alkalmazott mikrogyongyöket a primerek jelölésére használt íigandót felismerő és megkötő molekulákkal vonjak be. Erre a célra szokásosan használt a bioíin-avidin rendszer, ahol a mi'krogyöngy felszínére kötött molekula bármilyen avidin-számiazék lehet, pl. sztreptavldin, extravidin. vagy .antí-bíotin antitest (monoklonáiis vagy pol&lonálts). A. bioíin-avidin rendszeren kívül bármely olyan ligandligandkötő rendszer alkalmas az eljárás kivitelezésére, amely enztmatlkusan vagy kémiailag beépíthető a prímerekbe, pl. di.goxi.gem», és amelyet felismerő és megkötő molekula beépíthető a mikrogyöngyökbe, pl. ami-öigoxigenin antitest. A találmány szerinti eljárásban előnyösen bioíin-szireptavidín rendszert alkalmazunk..For the PCR reaction, pn.merek.el is conjugated to ligands on the one hand and labeled with fluorescent dyes on the other. The PCR products. microarrays used to bind primers with the ligand recognition and binding molecules used to label primers. The bio-avidin system is commonly used for this purpose, wherein the molecule bound to the surface of the microsphere can be any avidin number sensor, e.g. streptavldin, extravidin. or Antibiotin antibody (monoclonal or polonized). In addition to the A. bioin avidin system, any ligand ligand binding system is suitable for carrying out the process which may be enzymatically or chemically incorporated into the primers, e.g. di.goxi.gem »and which can be incorporated into the microspheres, e.g. amyloxigenin antibody. Preferably, the method of the present invention utilizes a bioinine syreptavidin system.
A primerek fluoreszcens jelzéséhez szóba jöhet bármely olyan, fluoreszcens festék, amellyel nukleotidok módosíthatók PCR reakcióban, történő felhasználáshoz. Ezekre példaként szolgálnak nem-korlátozó jelleggel a 6-PÁhk Alexa Fluor, Cy3, Cy5, Cy.5.5, TÉT, HEX, Fluorescein dT, Rhodamtne Gmm-X, Rhodamine Red-X, ezek észterei (gyártó: IDT, Coralvilié, USA), Ezeken kívül a PCR-termékek fluoreszcens jelölésére használhatók még a duplaszálú DNS festésére alkalmas un. Interkalálódó festékek Is, pl. etidium-bromid. propidium-jodid. Sybr Gold, stb., melyek az egyszáiú DNS-t nem festik meg. Olyan festékek alkalmazása is szóba jöhet, melyek bár képesek az egyszáiú DNS-t is megfestem, de fluoreszcenciájuk különbséget mutat a kétszálú: és egyszáiú DNS-hez kötődve, illetve megváltozik, amikor a DNS cgyszáiúvá válik (pl, akridm narancs vagy a kisárokba kötődő DAPi-festekek (Hoechstj). A találmány szerinti eljárásban előnyösen Cv3 és-CyS festékeket alkalmazunk.Fluorescent labeling of primers may be any fluorescent dye that can be used to modify nucleotides in a PCR reaction. Non-limiting examples of these include Alexa Fluor, Cy3, Cy5, Cy.5.5, BET, HEX, Fluorescein dT, Rhodamtne Gmm-X, Rhodamine Red-X, esters thereof (manufactured by IDT, Coralville, USA). In addition, fluorescence labeling of PCR products is also possible with the so-called double-stranded DNA staining. Intercalating paints Also, e.g. ethidium bromide. propidium iodide. Sybr Gold, etc., which do not stain single-stranded DNA. It is also possible to use dyes that are capable of dyeing single-stranded DNA, but exhibit a difference in fluorescence when bound to double-stranded: and single-stranded DNA, and altered when the DNA becomes c-stranded (e.g., acrid orange or DAPi). Dyes (Hoechstj) Cv3 and CyS dyes are preferably used in the process of the invention.
A kapott fluoreszcens jel meghatározása dtometriávai történik, előnyösen áramlási eitometríávai az erre a célra a szokásosan használt áramlási eitomcterek (fiow-cyiometers) segítségével, így pb: P'ACSarray, FACS Sean, FACS Calibur (gyártó: Öeckton Dicklnson, Svédo.). Egy másik előnyös mérési módban, araikor az eljárást tárgylemezen (pi. üveg, poliszáról; kivitelezzük, a minták fluoreszcenciáját pásztázó lézer mikroszkópiával detektáljuk, pl, LSC-vel ECys laser scanning cytometer, gyártó: CompuCyte Corp., Cambridge, MA, USA}.The resulting fluorescent signal is determined by dtometry, preferably flow eitometry, using commonly used flow cytometers, such as p'ACSarray, FACS Sean, FACS Calibur (manufactured by Öeckton Dicklnson, Sweden). In another preferred mode of measurement, the procedure is performed on a slide (e.g., glass, polysaccharide), and the fluorescence of the samples is detected by scanning laser microscopy, e.g., LSC ECys laser scanning cytometer, manufactured by CompuCyte Corp., Cambridge, MA, USA}.
A kapott fluoreszcens jelek kiértékelését a találmány szerint úgy végezzük, hogy %-os értékben megadjuk, hogy a töményebb formamíd-oldattal kezeit minta átlagos fluoreszcencia intenzitása hány százaléka, a higabb forrnamid-oldattal kezelt minta átlagos fluoreszcencia intenzitásának, ezt célszerűen oszlopdiagramon ábrázoljuk, és. egy elöre-meghatározoít pozitívEvaluation of the resulting fluorescent signals according to the present invention is expressed as a percentage of the mean fluorescence intensity of the sample treated with the more concentrated formamide solution compared to the mean fluorescence intensity of the sample treated with the more dilute solution of rhamnamide, preferably plotted against. a predetermined positive
*.· V ·*. · V ·
és negatív kontroll által adott jellel összehasonlitjuk. A 'kontroll fluoreszcencia érték a rövidebb DNS amplifikálásával kapott P€R~terméL vagy genetikai -eltérések esetén a nem-beteg .(negatív kontroll), illetve a beteg egyénből (pozitív kontroll) származó, előre meghatározott DNS-sxakasx ampiiftkálásával nyert PCR-fermék vizsgálata, során kapott átlagos fluoreszcencia 'intenzitás lehet.and comparing it with a negative control signal. The control fluorescence value is the PCR product obtained by amplification of the shorter DNA by the P € R-terminus or by genetic amplification of a predetermined DNA sxakasx from a non-patient (negative control) or a patient individual (positive control). , the average fluorescence intensity obtained.
A találmány szerinti eljárás egyik kiviteli módja DNS-szekvencia méretbeli eltéréseinek kimutatására szolgál A DNS méretbeli eltérése lehet például tripiet-expanzió, deléció, inszercíó. rekombináció·, javító (repair) mechanizmus vagy mikroszaielUta polimorfizmus. A. DNS méretbeli ekérése számos esetben egy genetikai rendellenességért felelős. így példád a Huntington-kór oka egy bázisfriplet expanziója. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módjában- tripiet-expanziók által okozott genetikai rendellenességek kimutatására szolgál különösért előnyösen Huntington-kór kimutatására és szűrővizsgálatára..One embodiment of the method of the invention is for detecting size differences in DNA sequence. Size differences in DNA may be, for example, triple expansion, deletion, insertion. recombination, repair mechanism, or microsomal polymorphism. A. In many cases, the size plume of DNA is responsible for a genetic disorder. So, for example, the cause of Huntington's disease is the expansion of a base freak. In a preferred embodiment of the method of the invention, it is useful for the detection of genetic disorders caused by triple expansion, particularly for the detection and screening of Huntington's disease.
Egy másik előnyös kiviteli módban a DNS méretbeli eltérése nem genetikai rendel tettességért felelős. Ekkor a találmány szerinti eljáfes pl. immunológiai azonosság fokának jellemzésére (HL-A tipizálási vagy mlkrosxatelhts markerek alapján történő személyazonosításra szolgálhat.In another preferred embodiment, the size difference of the DNA is not responsible for the genetic disorder. In this case, the ephemera according to the invention e.g. can be used to characterize the degree of immunological identity (based on HL-A typing or mlkrosxatelhts markers).
A találmány további előnyős kiviteli módja egy eljárás genetikai rendellenességet okozó tfiplet-expanziők kimutatására PCR-temtékek hosszának analízisével melyre jellemző, hogy (I) biológiai mintából genomiális DNS-t tisztítunk;Another preferred embodiment of the present invention is a method for detecting genomic disruption expansions by analyzing the length of PCR libraries, which comprises (I) purifying genomic DNA from a biological sample;
(li) az említett DNS íriplet-expanziót hordozó szakaszát PCR-ral amplifikáljuk olyan primer pár alkalmazásával, ahol az egyik prímért biommal es a másik prímért legalább egy fluoreszcens molekulával jelöljük;(li) amplifying the lymphoid expansion region of said DNA by PCR using a primer pair labeled with at least one fluorescent molecule for one primer biome and for the other primer;
(ni) a kapott PCR~termékeket sztreptavlbmnel bevont mi-krogyőngyökre kötjük;(ni) binding the resultant PCR products to streptavoid coated microarrays;
(ív) a míkrogyőngyökre kötött dopf aszaló DNS-ΐ tartalmazó mintákat kettéosztjuk, majd adott hőmérsékleten őlőre-meghatározott koncentrációjú fbmtamiá-oídatokban hökezeljük, ahol a formamid-koncentrációkat olyan koncentráció-sor szélső értékeként határozzuk meg, amelynél a íríplet-expanziót nem-hordozó DNS-sel megegyező vagy ennél rövldebb PCR-termék fluoreszcens molekulát hordozó szála a koncentráció növelésével fokozatosan ledlsszociál a mikrogyöngy felsziné-rőL mig a triplét-expanziőt nem-hordozó DNS-uél hosszabb P'CR-termék fluoreszcens molekulát hordozó szála lényegében nem, majd a míkrogyöngyöket mossuk; és (v) az így-kapoti míkrogyőngyök fluoreszcenciáját, áramlási citométeren mérjük és a kapott fluoreszcencia Intenzitásokat összehasonlítjuk a normális negatív kontroll és az *« ·<·*· *>ί < φ $ « χ » * <(arc) dividing the specimens containing dopf dried DNA bound to ergot, and heat treated at specified temperature in ferminated solutions of the specified concentration, where the formamide concentrations are defined as the extremes of the concentration range in which the The fluorescent molecule strand of the same or shorter PCR product will gradually dissociate from the surface of the microspheres with increasing concentration, whereas the longer P'CR product than the non-triplet expansion DNA will have substantially no fluorescent molecule. washed; and (v) measuring the fluorescence of the thus obtained microvilli, measuring on a flow cytometer, and comparing the fluorescence intensities obtained with the normal negative control and the «·« «* * * * *.
ismert eitérés(eke)t hordozó pozitív kontroll minták fluoreszcencia intenzitásával.with positive fluorescence intensities of positive control samples bearing known deviation (s).
A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kiviteli módja DNS szekvencíabeli eltéréseinek kimutatására szolgál. Irt különösen a SNP-k, előnyösen betegséggel társult SNP markerek kimutatásáról van szó, A találmány egyik előnyös kiviteli módjában az emlőrákra való hajlamért felelős BRCAI génben lévő SNF, .még előnyösebben a BRCA1 gén 5382insC pontmutáeiójának kimutatására és szűrővizsgálatára használható.Another preferred embodiment of the method of the invention is for the detection of DNA sequence differences. In one embodiment, the SNF, more preferably the 5382insC point mutation in the BRCAI gene responsible for breast cancer susceptibility, can be used to detect and screen for SNPs, preferably disease-associated SNP markers.
A találmány szerinti eljárás a mezőgazdaság területén szintén felhasználható már Ismert SNP-k detektálására, pontmutáeiőval összefüggő». a mezőgazdaság számára valamilyen előnyös növényi vagy állati tulajdonság növénytermesztés vagy állattenyésztés során történő szelektálására, Igy nagy populációból kiválaszthatöak azok az egyedek, amelyek az adott jelleg számunkra l egkedvezőbb változatát hordozzák.The method of the present invention can also be used in the field of agriculture for the detection of known SNPs, associated with point point. for the selection of any plant or animal trait which is beneficial to agriculture in crop production or animal husbandry, so that individuals with the most favorable variation of that trait may be selected from a large population.
A találmány negyedik szempontja szerint az eljárás kivitelezésére szolgáló reagenskészletre is vonatkozik, amely a szükséges utasításokkal együtt tartalmaz, két vagy több,, a fentiekben felsorolt DNS-ehérés kimutatására alkalmas jelölt prímért vagy a mikrogyöngyökhöz kötött DNS megfestésére szolgáló festéket, a megfelelő- bevonattal ellátott mikrogyöngyöket, egy l'm-pont csökkentő szert, a megfelelő kontrollokat, a. vizsgálathoz szükséges oldatokat, egy vagy több tárolóedényben.According to a fourth aspect of the present invention there is provided a kit for carrying out the method comprising, together with the necessary instructions, two or more labeled primers for the detection of DNA sequencing listed above or dye-coated microspheres, , a l'm-point reducing agent, appropriate controls, a. test solutions in one or more containers.
Á. találmány szerinti eljárás előnyei az alábbiakban foglalhatók össze. Míg eddig, a különböző méretű PCIl-termékek vizsgálatára használt agaróz- vagy poliakritamidgélelektroforézis, kapilláris efcktroforézis, illetve Souíhern-blot módszerekkel csak kevés minta egyidejű vizsgálatára volt lehetőség és ezek hosszabb időt igényeltek, addig a találmány szerinti módszerrel rövid idő alatt alacsony költséggel, sok minta egyidejű vizsgálata valósítható· meg. Továbbá a mérőműszerből illetve a méréshez használt mikrogyöngy technikából adódóan ez a módszer a multiplex vizsgálat lehetőségét is magában hordozza, lehetővé téve több betegség egyidejű szűrését nagyobb populációkon. A módszer széles körben alkalmazható, többek között alkalmas SNP-k kimutatására, pl. a RRCA1- gén emlőrákkal korreláló SNPlére a klinikai diagnosztikában jelenleg alkalmazott, PCR-termékek SDS-PAGE analízisén alapuló módszer áramlásl-citometriás alternatívájaként; iriplei expanziós betegségek, pl a Huatington chorea diagnosztizálására az agaróz- vagy poliakrilamid-géldektroíbrézis, kapilláris elektroforézia, illetve Southern-biot módszerek áramlási-dtometriás alternatívájaként; továbbá alkalmas lehet in/del polimorfizmusok és mikroszatellíta polimorfizmusok detektálására.THE. The advantages of the process according to the invention can be summarized as follows. While so far only a small number of samples have been able to be examined by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, capillary effctrophoresis, or Souiller-blot methods for different sized PCI1 products, the method according to the present invention simultaneous examination can be carried out. Furthermore, due to the measuring instrument and the microspheres technique used for the measurement, this method also offers the possibility of multiplexing, allowing simultaneous screening of several diseases in larger populations. The method is widely applicable, including detection of SNPs, e.g. a SNPle that correlates RRCA1 with breast cancer as an alternative to flow-cytometry as an alternative to the currently used SDS-PAGE analysis of PCR products in clinical diagnostics; for the diagnosis of iriplee expansion diseases, such as Huatington chorea, by flow-dtometric alternatives to agarose or polyacrylamide gel electrolysis, capillary electrophoresis, or Southern biot methods; and may be useful for detecting in / del polymorphisms and microsatellite polymorphisms.
* ♦ * * · ♦* ♦ * * · ♦
A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy költséghaiékony, Mivel az áramiásicitonictriás berendezés mára a legtöbb klinikai laboratóriumban működik, a módszer bevezetése nem igényei különösebb beruházást, csak klt-ek megvásárlását, melyek a megfelelő prímetekéi és standardokat tartalmazzák. A találmány szerinti eljárás költségvonzata például SRCA vizsgálat esetén kb. 500 BEE/tószi, a DNS tisztítási költségeivel együtt ez 1ÖÖ teszt esetén 50 000 HEP. Az egy nap alatt elvégezhető tesztek száma legalább 100, így pl. 3 évre számolva, részleges kihasználtság mellett, legalább 50 000 teszt végezhető, aminek az anyagköltsége 25 millió HUF; a teljes költség pedig az áramlási citometer vagy az ESC amortizációjával, a munkaerő költséggel illetve profittal is számolva kb. 45 millió HUF, Ebből egy teszt teljes költsége 45 millió/öő 000--000 HEP, vagyis kb. 6 ESD. Kisebb kihasználtsággal számolva ilyen módon egy feszt teljes költsége 9000 HEfP-nak adódik, ami kb. 60 ESD. Direkt szekvenáiás esetén, ami a legpontosabb pcmfmutáeiö detektálási módszer, egy vizsgálat költsége pl. az amerikai Mínesota Egyetemen '950-1200 ESD, összehasonlítva a találmány szerinti eljárással, látható, hogy jelentős, kb, IS-szoros a különbség. A direkt szekvenáláson alapuló eljárások költségvonzata más klinikai laboratóriumok, illetve magán laboratóriumok esetén is hasonlóan magas, a kimutatni kívánt mutációk számától függően 300-3000 USD, Magyarországon ez az összeg egy BIICA mutációra 25 000 HUF. az öt leggyakoribb mutációra 90 000 PIUP. A néhány mutációra fókuszáló, hagyományos, «ént szekvenáláson alapuló módszereket alkalmazó szűrővizsgálatokat a szekvenáláshoz képest ö-8-szor alacsonyabb áron, de még mindig a találmány szerimi eljárás költségénél lényegesen magasabb áron végzik. Európai tendencia, hogy évről évre nő az elvégzett genetikai tesztek száma az uniós országokban, illetve növekszik azon klinikai és magán laboratóriumok száma, amelyek genetikai teszteket végeznek diagnosztikai céllal (Ibaretta D. et ah; Nat. Biotechnoi, 2004, 22(10): 1230-5), Ezen kívül a lakosság köréten is egyre inkább nő az igény az ilyen jellegű vizsgálatokra, genetikai szűrésekre, ami szükségessé teszi a költségűatékooy, nagyteljesítményű, multiplex kimutatási eljárások kifejlesztését, mint amilyen a találmány szerinti eljárás is.A further advantage of the method of the invention is that it is cost-inexpensive. Since the flow-through onitric device is nowadays used in most clinical laboratories, the implementation of the method does not require any major investment, only the purchase of kits containing appropriate prime materials and standards. The cost of the method according to the invention, for example, in the case of the SRCA test is approx. 500 BEE / ton, including the cost of DNA purification, 50,000 HEP for 1 test. The number of tests that can be performed in one day is at least 100, eg. Over 3 years, with partial utilization, at least 50,000 tests can be performed at a cost of 25 million HUF; the total cost including flow cytometer or ESC depreciation, labor cost or profit is approx. 45 million HUF, of which the total cost of a test is 45 million HUF / night 000--000 HEP, ie approx. 6 ESD. At a lower utilization rate this way, the total cost of a festival is 9000 HEfP, which is approx. 60 ESD. In the case of direct sequencing, which is the most accurate pcmfmutase detection method, the cost of an assay is e.g. at the University of Minnesota at US $ 950-1,200, compared to the method of the present invention, it is seen that there is a significant difference of about IS. The cost of direct sequencing procedures is similarly high for other clinical and private laboratories, depending on the number of mutations to be detected, from $ 300 to $ 3000, in Hungary this is $ 25,000 for a BIICA mutation. 90,000 PIUPs for the five most common mutations. Screening assays that focus on a few mutations using conventional gene sequencing methods are performed at a cost that is about 8 to 8 times lower than sequencing but still at a substantially higher cost than the serimic method of the invention. European tendency to increase the number of genetic tests performed in the EU countries and the number of clinical and private laboratories carrying out genetic tests for diagnostic purposes every year (Ibaretta D. et al; Nat. Biotechnoi, 2004, 22 (10): 1230 -5) In addition, there is a growing demand among the general public for such assays, genetic screening, which necessitates the development of cost-effective, high performance, multiplex detection methods such as the present invention.
Továbbá a félhasználás nem korlátozódik kizárólag a klinikai diagnosztizálásra, illetve humán vizsgálatokra. A találmány szerinti eljárás mezőgazdaság területen is alkalmazható. A nagyteljesítményű mérés lehetősége és a multiplex ki tás a találmány szerinti eljárást a mezőgazdaságban történő felhasználásra különösen alkalmassá teszi,Furthermore, half-use is not limited to clinical diagnosis or human testing. The process of the invention is also applicable in the field of agriculture. The capability of high performance measurement and multiplexing makes the process of the invention particularly suitable for use in agriculture,
A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás a konkrét alkalmazási területek bármelyike esetén külön-küiön való beállítást igényel, mely a megfelelő primerek kiválasztását és kipróbálását foglalja magában.It will be apparent to those skilled in the art that the process of the invention requires special adjustment for any particular application, which involves selecting and testing the appropriate primers.
1.51.5
Az ábrák ismertetéseDescription of the figures
1. ábra: bemutatja a 27 CAG-isméílodést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh €y3-al jelöli, valamint az 51 CAG-ísmétlődést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh., Cy5-ei jelöli PCR-termékek disszociációjának a formamíd-koncentrációtól való függését 40'C-onFigure 1 shows the amplitude of plasmids with 27 CAG repeats denoted by γ3 and the amplification of plasmids with 51 CAG repeats, denoted by Cy5 as a function of the formamide concentration at 40'C.
2. ábra: bemutatja a 27 CAG-ismétíődést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh Cy5-el jelölt, valamint az 51 CAG-isméfiődést. tartalmazó: plazmidokról amplifikáh Cy3-al jelölt PCR- termékek disszociációjának a formamld-koncentrácíótóí való függését 40'!C~onFigure 2 shows the amplification of Cy5 labeled plasmids containing 27 CAG repeats and 51 CAGs. containing: plasmid-amplified Cy3-labeled PCR product dissociation dependence on formamld concentration 40 ' ! C-one
A ábra.; bemutatja az 51 CAG-lsmétlödést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh Cy3-ai és Cy5-el jelölt PCR-termckek disszociációjának a íörmamld-konceníráclótói való függését 4643-00Figure A .; demonstrates the dependence of the amplification of plasmid plasmids containing 51 CAG repeats on Cy3 and Cy5 labeled germline 4643-00
4. ábra: bemutatja a 27 CAG-ismétlödest tartalmazó plazmidokröi ampliílkáli Cy3-al és CvS-el jelöli PCR-iermékek disszociációjának a fbrmamid-koncentráclőtöl való függését 40 C-<U;Figure 4: Plasmid plasmids containing 27 CAG repeats depicting the dependence of the fbrmamide concentration on the dissociation of PCR products at 40 C <U;
5. ábra: bemutatja a 75 tdA~os formánod-oldattal kezeit mikrogyöngyökön mért átlagos fluoreszcencia Inteuzitást a 65 tf%-os formamld-oldattai kezeit mintához képest %-ban a 27, 32, 39 és 51 CAG-lsmétlödést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh Cv5~el jelzett PCRtermékek esetén, a. homozigóta esetet modellezveFigure 5 shows the average fluorescence inactivity on microspheres treated with 75 tdA formanod solution compared to a sample treated with 65% v / v formaml in Cv5 amplification of plasmids containing 27, 32, 39, and 51 CAG repeats. for labeled PCR products, a. modeling a homozygous case
6. ábra: bemutatja a 75 tf%-os Ibmnamid.-oldattal kezelt mikrogyöngyökön mért átlagos fluoreszcencia intenzitást a 65 tt%-os formamid-oidattal kezelt mintához képest %-ban a 27, 32. 39 és 51 CAG-lsmétlödést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh Cy3-ai jelzett PCRtermékek esetén, a homozigóta esetet modellezveFigure 6 shows the mean fluorescence intensity of microspheres treated with 75% (v / v) Ibmnamid solution compared to the sample treated with 65% (%) formamide solution in% 27, 32, 39 and 51 with plasmids containing CAG repeats. Cy3-labeled PCR products, modeling the homozygous case
7. ábra: bemutatja a 75 tf%-os tórmamid-oldahal kezeit mikrogyöngyökön mért átlagos fluoreszcencia intenzitást a 65 tl%~os lórmantid-oldattal kezelt mintához képest %-ban a 27, 32, 39 és 51 GAG-ismétlődést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh Cy5-el jelzett PCRtermékek esetén, a heterozigóta esetet modellezve. A heterozigóta eset modellezéséhez mindegyik minta 1:1 arányban tartalmaz 27 CAG ismétlődést tartalmazó plazmidtól ampllnkált Cy5~el jelzett PCR-termeket is,Figure 7 shows the average fluorescence intensity of microspheres treated with 75% torrmiamide solution in% of the plasmid containing 27, 32, 39 and 51 GAG repeats in% of the sample treated with 65% lormantide solution Cy5. for PCR products, modeling the heterozygous case. For modeling the heterozygous case, each sample also contains Cy5-labeled PCR products amplified from 27 plasmids containing CAG repeats in a 1: 1 ratio,
8. ábra: bemutatja a 75 ü%-os formamid-oidaítal kezeit mikrogyöngyökön mért átlagos fluoreszcencia intenzitást a 65 tf%-os formamld-oldattal kezeli mintához képest %-ban a 27, 32. 39 és 51 CAG-ismétlődést tartalmazó plazmidokröi amplifikáh Cv3-al jelzett PCRtermékek esetén, a heterozigóta esetet modellezve. A heterozigóta eset modellezéséhez mindegyik minta 1:I arányban tartalmaz 27 CAG-isméflődést tartalmazó plazmádról amplifikáh Cy3-al jelzett PGR-terroéket is.Figure 8 shows the average fluorescence intensity of microliters treated with 75% formamide solution treated with 65% volume formamide solution in% of plasmid amplification Cv3 with 27, 32, 39 and 51 CAG repeats. for PCR products, modeling the heterozygous case. To model the heterozygous case, each sample also contains Cy3-labeled PGR terroids amplified from 27 plasmids containing CAG repeats in a 1: 1 ratio.
« XX Φ«XX Φ
9. ábra; bemutatja az előre meghatározott 10 heterozigóta beteg minta, illetve két negatív kontroll (27 CAG és Jurkat} esetén a 75 tPG-os íónuamid-oldáttal kezelt mikrogyöngyökön mért átlagos fluoreszcencia intenzitást a 65 iÍ%-ös íormamid-oidaítaí kezelt mintához képest %-os értékben megadva. Á heterozigóta beteg minták két alléija CAGismétlődésének számát az X. tengelyen tüntettük tel. A 2? CAG itt a 27 CAG-ismétlodést. tartalmazó plazmldről ampürikált PCR-terrnékeket jelenti.. A Jurkat itt a jurkat sejtekből izolált genomiáiis DNS-ről mnpliírkáit PCR-terrnékeket jelenti,Figure 9; shows the mean fluorescence intensity of the pre-determined 10 heterozygous patient samples and the% of the sample treated with 65 µM formamide solids in the case of two negative controls (27 CAG and Jurkat) on microspheres treated with 75 tPG formamide solution The number of CAG repeats of the two alleles of heterozygous patient samples is plotted on axis X. Here, the 2? CAG is PCR amplified from plasmid containing plasmid containing 27 CAG repeats. Jurkat is a mRNA of genomic DNA isolated from jurkat cells. means products,
10, ábra: bemutatja- 5 egészséges minta, két negatív kontroli (27 CAG és Jurkat), valamint bárom pozitív kontroll beteg minta esetén a 75 tf%--os fortnarnid-oldattai kezelt mikrogyöngyökön mért átlagos fluoreszcencia Intenzitást a 65 it%-os fbrmamid-oldattal kezelt mintához képest %-os értékben megadva. A heterozigóta beteg minták, két ailélja CAGi smét lödé sértek számát az X tengelyen tüntettük fel. A 27 CAG itt a 27 CAG-ismétlődést tartalmazó plazmldről ampli.fíkáit PCR-terrnékeket jelenti.. A Jurkat Itt a Jurkat sejtekből Izolált genomiáiis DNS-ről amplilfkáit PCR-terrnékeket jelenti. A számok az egészséges önkéntesekből izolált genomiáiis DNS-ről -amplifíkált PCR-tennékeket jelentik,Figure 10 shows the mean fluorescence intensity of 5 healthy samples, two negative controls (27 CAGs and Jurkat) and four positive control patient samples on microspheres treated with 75% Fortnarnide solution with 65% fbrmamide % of the sample treated with solution. The number of heterozygous diseased samples, two alleles of CAGi smear loess, are plotted on the X axis. CAG 27 here refers to PCR products amplified from plasmid containing 27 CAG repeats. Jurkat Here refers to PCR products amplified from genomic DNA isolated from Jurkat cells. The numbers represent PCR amplifications from genomic DNA isolated from healthy volunteers,
11. ábra: bemutatja egy előre-meghatározotí mutációt hordozó betegből Izolált, illetve egy vad-típusú, mutációt nem-hordozó- Jurkat-sejtekből izolált genomiáiis DNS-ről aliélspecifikus PCR-reakcíóval arnplífikált PCR-terroékek disszociációjának formamidkoncentrácíótöl való függését 4í7C-onFigure 11 illustrates the dependence of formamide concentration on the dissociation of PCR terraces isolated from a patient carrying a predetermined mutation and genomic DNA isolated from wild-type mutant Jurkat cells by an allele-specific PCR reaction.
12, ábra: bemutatja egy előre-megbatározott mutációt hordozó beteg minta, illetve egy vad- típusú, mutációt nem-hordozó jurkat minta esetén a 75 tf%-os formaraid-oldattal kezelt mikrogyöngyökön mérhető átlagos fluoreszcencia intenzitást a 65 tf%-os formamid-oidatta! kezeit mintához képest %-os értékben megadva,Figure 12 shows the mean fluorescence intensity of microspheres treated with 75% v / v formaride solution in a patient sample carrying a predetermined mutation and in a wild-type non-mutant yogurt sample at 65% v / v formamide. solution! % of your hand sample,
A találmány szerinti eljárást példaképpen egy tríplet-expanziös betegség (Huntíngtonchorea) és egy SNP(BRCAI gén mutációja) kimutatásán keresztül mutatjuk be, azonban ezek csak a találmány szemléltetésére szolgálnak és semmilyen módon nem korlátozzák az oltalmi kört, mely magában foglalja tetszőleges bázissorrendváltozások hasonló kimutatását, egy vizsgált és egy kontroll DNS mintáról készült PCR-termék hosszkülönbségének detektálásán keresztül.The method of the invention is exemplified by the detection of a triple exponential disease (Huntington's gonorrhea) and an SNP (mutation of the BRCAI gene), but is intended to illustrate the invention and in no way limits the scope of the invention, including arbitrary base sequence changes. by detecting the difference in length of a PCR product from a tested and a control DNA sample.
A Muntington-ehorea egy nenrodegeneraítv betegség, melynek hátterében a 4. kromo-Muntington's Ehorea is a non-degenerative disease caused by chromium 4
szórna rövid karján található Huntingion gén (1ΤΊ5) 1. exonjában lokalizálódé- CAGismótiődés meghosszabbodása áh. A betegség autoszomális domináns, így egyetlen beteg alléi megléte is a tünetek megjelenéséhez vezet, A betegségben IÖÖ OOö emberből -5 érintett (.Amerikában és Európában), akiknél a tünetek általában 35-50 év között jelennek meg és megjelenésük után 15-20 évvel halálhoz vezetnek (Russell et ai). A CAG-ismétlodések száma alapján négyféle kategóriát különíthetünk el, a teljesen egészséges (<27€AG), az átmeneti /2?-35CAGj, a csökkent penetranelájú (35-39CAG) és a beteg fénotipust biztosan kifejező (40<CAG) (Russei et ak, Rlchard H, Myers, Sernaka A. et ak) A Huntington-chorea kimutatása alapján lehetőség nyílik áramlási citometriával minden olyan triplet-expanziós betegség diagnosztizálására, amelyek esetén a betegség kiváltó oka egy rövid szakaszt érintő ttipieíexpanzió (lásd l.íábk)localization in exon 1 of the Huntingion gene (1ΤΊ5) on the short arm of the larvae. The disease is autosomal dominant, so the presence of a single patient allele leads to the onset of symptoms. The disease IS one in five people (.America and Europe) who usually show symptoms between 35-50 years and die 15-20 years after onset (Russell et al). Based on the number of CAG repeats, four categories can be distinguished: fully healthy (<27 € AG), transient / 2? -35CAGj, low penetrance (35-39CAG), and confident in the patient's phenotype (40 <CAG) (Russei et al, Rlchard H, Myers, Sernaka A. et al. Detection of Huntington's chorea allows flow cytometry to diagnose all triplet-expansion disorders for which the disease is caused by a short-term thymic expansion (see Table 1).
A találmány szerinti módszert a Buntíngten ehorea betegségre kidolgozott plazmid modell rendszeren állítottak be. Első lépésben meghatároztuk azt a fermamid-koneenírációí, amelynél az egészségesre jellemző maximális hosszúságú CAG-ismétlödést Í27CAG) tartalmazó PCR-termék, és egy 51 CAG-ismétlődést tartalmazó PCR-íermék között tudunk különbséget tenni. A kísérletet elvégeztük kétféle fluoreszcens jelöléssel minden lehetséges kombinációban, így kívántuk bizonyítani,, hogy a módszer megbízhatóan működik, A kővetkező lépésben olyan konstrukcióban végeztük el a méréseket, hogy kiderüljön, vajon el tudjuk e különíteni az intermedier hosszúságú CAG-ismétlódésekeí az egészségesre jellemző, maximális hossztól homozigóta. Illetve heterozigóta esetben. Végül 5 egészséges és 10 előre meghatározott CAG-ismétlödést hordozó beteg humán genomiális DNS mintán végeztünk méréseket, ahol minden egyes minta a várakozásnak megfelelő eredményt mutatta, mind az egészséges DNS-t mind a betegségei hordozó DNS-t tartalmazó minták esetén.The method of the invention was set up on a plasmid model system for Buntíngten ehorea disease. As a first step, we identified the PCR product containing the fermamide machinery annotation at which a healthy product had a maximum length CAG repeat (27CAG) and a PCR product containing 51 CAG repeats. The experiment was performed with two types of fluorescent labels in all possible combinations, so we wanted to prove that the method worked reliably. In the next step, we constructed the construct to see if it was possible to isolate it from the length homozygous. Or in a heterozygous case. Finally, 5 healthy human and 10 patients with predetermined CAG repeats were assayed for human genomic DNA samples, where each sample showed the expected results for both healthy DNA and disease bearing DNA samples.
Az eljárás lépései:Procedure steps:
1. PCR-reakeiő;1. PCR reaction;
lem plát;lem plate;
- 200 ng humán iimfocitáböl izolált genomiális DNS primerek;- genomic DNA primers isolated from 200 ng of human lymphocyte;
- sense primer: bioiin-ő’-o’CAT GGC GÁC CCT GGA AAA GCT 6-Γ- sense primer: bioin-’'-o'CAT GGC GAC CCT GGA AAA GCT 6-Γ
- antisense primer: CyS-5 A’GGC GGT GGC GGGTGT TGC TGC TGC TGCTG-3’ reakcióelegy:- antisense primer: CyS-5 A'GGC GGT GGC GGGTGT TGC TGC TGC TGCTG-3 'reaction mixture:
- Í-i2O 28,5 μ!- Í-i 2 O 28.5 μ!
- 'Pag pallér (Fermenías) 5 ni *χ « ♦ »>- 'Pag pallér (Fermenías) 5 ni * χ «♦»>
MgCU (Fermentas) (25 roM) dNTP(Fermeroas) (2,5 .mMl β-merkaptoetanol (100 raM) konc- formaraid BSA (Promega) (10 mg/ml) sense primer (1ΟΪ) (1 prnel/ul) anfisense primer (ID’T) (i praoi/μί) templát (200 ng/μί}MgCU (Enzyme) (25 µM) dNTP (Fermeroase) (2.5 µM β-mercaptoethanol (100 µM) Conforms BSA (Promega) (10 mg / ml) Sense primer (1ΟΪ) (1 prnel / µl) anfisense primer (ID'T) (i praoi / μί) template (200 ng / μί}
Táq polimeráz (Permemas) (5 U/pí) összesen μί 5 μί 0,5 μί 1..5 μί 1 μί.Táq polymerase (Permemas) (5 U / pi) total μί 5 μί 0.5 μί 1..5 μί 1 μί.
μί 1 μί 1 μί 0,5 μί 50 μίμί 1 μί 1 μί 0.5 μί 50 μί
- a OCR reakció hőmérsékleti profilja:- temperature profile of the OCR reaction:
1. lépés;1st step;
- denat «ráció: 96X1 2 perc- denaturation: 96X1 2 minutes
2. lépés: 12 ciklusStep 2: 12 cycles
- denaturáció: 94 C 30 ropdenaturation 94 C 30 rop
- annclaeiő: 67C 30 mpanncle: 67C for 30 sec
- extenzió: 72 X· 2 pere- Extension: 72 X · 2 Family
3. lépés: 23 ciklus · denaturáció: 92C 30 ropStep 3: 23 cycles · Denaturation: 92C 30 rops
- anneláció: 67C 30 mpannelation: 67C for 30 sec
- extenzió: 72 C 2 pere- Extension: 72 C 2 family
4: lépes4: spleen
- extenzió: 72C 10 pere- Extension: 72C 10 Family
2, Kikötés míkrogy öngyökre (microbead)-::2, Microbead Mating - ::
- 40 μί OCR. tennék <· lő μΐ 40><mícrobcad (Poíysciences. Inc.) (kb, Í0-200öödb) + ÍÖO μί- 40 μί OCR. products <· shoot μΐ 40> <mícrobcad (Polysciences. Inc.) (kb, Í0-200 ööd) + ÍÖO μί
XPBSX PBS
- 40 perc, szobahőmérséklet sötétben- 40 minutes, room temperature in the dark
- mosás 3-szorXÖÖ μ! 1 «PBS-ben (eentriíugálás 1.0 pere. 15000 ford/pere)- washing 3 timesXÖÖ μ! 1 «in PBS (Centrifugation 1.0 Pr. 15,000 rpm)
- az utolsó mosás után 100 μί 1 xPBS-ben szuszpenáálás (voriex)- 100 μί in 1 xPBS after vortexing (voriex)
3. Hőkezelés tőnnamidbau-oídaifean: FA cc. PA ΗχΟ mikrogy ongyt-ΌΝ S3. Heat treatment tnnamidbau-oidaifean: FA cc. PA ΗχΟ mikrogy ongyt-ΌΝ S
tf% 13-ΟμΙ 30μΙ 40μϊtf% 13-ΟμΙ 30µΙ 40µϊ
7.5 tf% 150μί 1 Ομί 49μΙ7.5 tf% 150μί 1 Ομί 49μΙ
- hőkezelés 3 perc. 40€~οη- heat treatment for 3 minutes. 40 € ~ οη
- mosás 3-szór 600 μΐ 1 > FBS-ben (cenirifugálás 10 perc, 15000 ford/perc)- wash 3x 600 μΐ 1> in FBS (centrifugation for 10 min, 15000 rpm)
- az utolsó mosás, után 150 pl 1 xPBS-hen szuszpendálás- last wash followed by resuspension in 150 µl of 1 xPBS
4. Mérés FACSarray áramlási eitométerent4. Measure FACSarray flow eitometer
- boái htások: FSC: 795- booster cools: FSC: 795
SSC; 320 Far Red: 625 treshold: 20000SSC; 320 Far Red: 625 treshold: 20000
Az első kísérl-etsorozafen 27 es 51 CAG-ismétlödést tartalmazó plazmáitokat használva teinplátként, FCR-reakclóval amphrtkáituk az Ismétlődést tartalmazó szakaszt. Áz 51 CÁG-ísmétlődést tartalmazó plazmidról végzett PCR-.reakcióhoz biotirmai és Cy5~e! jelzett prímer-párokat, a 27 CAG-lsmétlődést tartalmazó plazmidrói végzett PCR-reakcíóhoz Wotinnai és Cy3-al jeléit pnmcr-párokat használtunk. Az igy kapott termékeket sztreptavidinnel bevont mikrogyöngyök felszínéhez, kötöttük 1:1 arányban. majd a DNSfragmentumokat hordozó mikrogyőngyökeí 65 és 75 térfogatH közötti formamid-O-ldatban hőkezeltük 40''’C-on és FACSarray készülékkel (Beckton Dfokinsors) mértük, a fluoreszcencia Intenzitás változását (I. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a formannd-koncentrációtól függően a hosszú, 51 CAG- és a rövid, 27 CAG-ismétlödést tartalmazó PCR-termékek fluoreszcens molekulát hordozó szála eltérő mértékben disszociál le a mikrogyöngyökröl. így a különböző hosszúságú PCR-termékek jól megkülönböztethetőek egymástól.The first experiment with sorbosafen was used to amplify the Repeat section using plasmids containing 27 and 51 CAG repeats as a teen plate with an FCR reactor. For the PCR reaction of plasmids containing 51 CAG repeats, biotransmitter and Cy5-e. labeled primer pairs, WnTin and Cy3-labeled pnmcr pairs were used for PCR reaction on 27 CAG repeat plasmids. The products thus obtained were bound to the surface of streptavidin coated microspheres in a 1: 1 ratio. then the microbeads carrying the DNA fragments were heat treated in formamide O-ld 65 to 75 volumes H and measured with a FACSarray (Beckton Dfokinsors), the change in fluorescence intensity (Figure I). The results showed that, depending on the formannd concentration, the fluorescent molecule strand of the long PCR products containing 51 CAG and short 27 CAG repeats dissociated from the microspheres to different degrees. Thus, PCR products of different lengths are well distinguished.
Ezt a kísérietsörozatót elvégeztük fordított jelöléssel is, ahol a hosszú PCR-termék (51 CAG) volt Cy3-mal jelölve és a rövid PCR-termék (27 CAG) pedig Cy5-ek Az előzőhöz hasonló eredményt kaptunk (2. ábra),This escutcheon was also reverse-labeled, with the long PCR product (51 CAG) labeled with Cy3 and the short PCR product (27 CAG) with Cy5. Similar results were obtained (Figure 2),
A következő két kontroll kísérletben azonos hosszúságú, de két különböző fluoreszcens molekulával jelölt PCR-tennékeket használtunk a mikrogyöngyök.re történő kikötéshez. Az első esetben 51 CAG-isméÜödést tartalmazó plazmidró'l végeztünk két külön PCRreakciót Az egyik reakcióhoz biotinnsl és Cy5-el jelölt primer párokat használtunk, a másik .reakcióhoz blotimial és Cy3-al jelölt primer párokat. A keletkezett PCR-termékeket 1:1 arányban kötöttük sztreptavidinnel bevont mlkrogyöngvökhöz, maid a fentiekhez hasonlóan φχφφ ♦* ** ♦ » s ·#♦***♦« χ φ ♦ * ·> V «In the following two control experiments, PCR probes of the same length but labeled with two different fluorescent molecules were used for binding to the microspheres. In the first case, two separate PCR reactions were carried out with 51 plasmids containing CAG repeats. One reaction used primer pairs labeled with biotinyl and Cy5, the other reaction was blotimial and Cy3-labeled primer pair. The resulting PCR products were bound in a 1: 1 ratio to streptavidin-coated mlk-brains, today as above V ♦ ** *** «« V V V> V
X « * * * « ‘ *.·>«.« « «, K » *«-»« A* és 75 térlogat% közötti fonnamió-oIdátokban hőkezehük 4öC-on, és a fluoreszcencia intenzitás változását FACSarray készülékkel mértük (3, ábra). Egy másik kísérletben ugyanezt a mérést rövid, 27 CAö-israétlődésí tartalmazó PCR-termékkel végeztük el (4. ábra). A mérés eredménye azt mutatta, hogy a míkrogyöngyök átlagos fluoreszcenciája a Cy5 és Cy3 jelölés esetén is hasonlóan változott, tehát a mérés független a fluoreszcens molekula milyenségétől.X «* * *« '*. ·> «.« ««, K »*« - »« In fonnamoyl solutions of A * up to 75% by volume, the fluorescence intensity change was measured with a FACSarray (3, figure). In another experiment, the same assay was performed with a short PCR product containing 27 CA6 isra-repeats (Figure 4). The result of the measurement showed that the mean fluorescence of the microspheres changed similarly in the case of Cy5 and Cy3 labeling, therefore the measurement was independent of the fluorescent molecule.
Következő kísérletsorozatban 27, 32, 39, és 51 CAG-ismétlödést tartalmazó plazmidokat használtunk tenipiátként a PCR-reukeíÖhoz. A 32 C.AG-ísmétfödést hordozó plazmíd reprezentálja az intermedier isméílödéshosszt. míg a 39 CAG-lsmétlödést hordozó plazmád reprezentálja a betegre jellemző ismétlődéshossz alsó határát. A kapott termékeket míkrogyösgyökre történő kötés után kettéosztottuk, majd 65 tCó-os és 75 rt%-os íórmamíd•oIdatban hőkezeltük 40 C -on, és mértük, a 65 tfG-os formanaddal kezelt kontrolihoz képest a 75 tf%-os tórmamiddal kezelt mintában a fluoreszcencia intenzitás változását. A k-sérleisort Cy5 (5. ábra) és Cy3 (6. ábra) jelölést alkalmazva is elvégeztük. Azt találtuk, hogy az intermedier hosszúságú 32 CÁG-ismétlődést tartalmazó plazmidokról amplifikáh PCR- termékek jól elkülöníthetőek a 27 CAG-ismétlődést tartalmazó plazmidokról ampkítkált PCRtermékektöLIn the following set of experiments, plasmids containing 27, 32, 39, and 51 CAG repeats were used as tenipia for the PCR reuse. The 32 plasmids carrying the C.AG repeat repeat represent the intermediate repeat length. whereas the 39 CAG repeat plasmids represent the lower limit of patient-specific repetition length. The products obtained after binding to anthrax were split in half and then heat treated at 65 ° C with 75% tlm lmidamide solution at 75 ° C and measured in a 75 t% tmmamide sample relative to the 65 tfG formanate control. change in fluorescence intensity. The k-kernel series was also performed using Cy5 (Figure 5) and Cy3 (Figure 6). We have found that PCR products amplified from plasmids containing 32 CAG repeats of intermediate length are well distinguished from PCR products amplified from plasmids containing 27 CAG repeats.
Intermedier hosszúságú CAG-lsraéflodési tartalmazó PCR-terrnek mérése heterozigóta eseténMeasurement of an Intermediate-length PCR Terrain with CAG-1 Flux in a Heterozygote
Mivel a Huntington-kórban szenvedő betegek legtöbbszer heterozlgóták a triplet expanzióra, tehát egy normális hosszúságú és egy meghosszabbodott alléit hordoznak, ezért az előző kísérletet megismételtük úgy, hogy minden mintához 1:1 arányban egészséges 27 CÁGismétlődést tartalmazó PCR-terméket kevertünk, így modellezve a heíerozigótáknál fennálló esetet, amikor kétféle terméket kapunk a PCR-reakcló során a .normális hosszúságú alléiról (rövid PCR-termék), illetve a megfeosszábbodöft alléiról (hosszú PCR-termék). Ezt a kísérletet szintért kétféleképpen végeztük el Cy5-el jelölt PCR-termékekkel (7. ábra), Illetve Cv3-al jelük PCR-termókekkel ÍR ábra). Jól mérhető jeleket kaptunk, ami azt jelenti, hogy a rendellenesség kimutatható heterozlgóták esetén is.Because patients with Huntington's disease most of the time are heterozygous for triplet expansion, thus carrying a normal length and an extended allele, the previous experiment was repeated by mixing healthy PCR products containing 27 CAG repeats in a 1: 1 ratio, the case where two types of products are obtained in the PCR reactor from the .all length of the allele (the short PCR product) and of the overfold allele (the long PCR product). This experiment was performed in two different ways with Cy5-labeled PCR products (Figure 7) and with Cv3-labeled PCR thermos (Figure 1R). Well measurable signals were obtained, which means that the disorder can be detected in heterozygotes.
WSŐSShEEÁs beíegjaeíe^WSŐSShEEÁs beegjaeíe ^
A modell rendszeren történő beállítást követően klinikai mintákon Is elvégeztük a kísérletet. A PCR-reakciőhoz Pluntington-kőros és egészséges emberek limfocitálböi Izolált gertomiábs DNS-t használtunk. A mintákat Dr. Melegít Béla professzor (Pécsi TudományΛ ♦* :« * » fc egyetem Klinikai Központ Orvosi Genetikai és Gyetmekíejlödésíani intézet, 7624 Pécs, Szigeti út 12, (Molekuláris Genetikai Laboratórium)i bocsátotta rendelkezésünkre, irreverzibilis anonimitás! fokozatú kódolás mellett. A bi.otm.nal és Cy5-el jelölt. PCR-termékeket a korábbiakhoz hasonlóan sztreptavidin felszíná mikrogyöagyökre kötöttük. A kapott termékeket mi krogyöngyökre történő kötés utón kettéosztottuk, majd 65 tíM-os és 75 tfév-os formanüdoldatban hokexekük, és mértük a 65 tféó-os férrnamid-oldaüal kezelt kontrolihoz képest a 75 íflN-os formajuid-oldattal kezeit mintában a fluoreszcencia intenzitás változását FÁCSarray készülékek Az első mérésnél (9, ábra) lö beteg, eiöre-meghatározott hosszúságú CAGismétlődést hordozó mintát vizsgáltunk, egészséges kontrollként 27 CAG-ismétlödést tartalmazó plazmidot, illetve Jutkát szövettenyészeti sejtek genomiáiis DNS-ét (A'l'CC nomber: CRL-lÜbő). A második mérés során (10. ábra) 5 egészséges emberből vett DNS-mimát és pozitív kontrollként három, az előző mérésben már vizsgáit, beteg mintát mértünk le, negatív kontroliként ismét a 27 CAG-ismédödést tartalmazó piaxmidoí, illetve a Jurkat-sejteket használtuk, A 10. ábrából látható, hogy az 5 egészséges minta a negatív kontrolihoz hasonló alacsony átlagos fluoreszcencia értékeket mutatott, tehát valóban nem hordoznak meghosszabbodott, az egészséges 27 CA'G-lsmétlődésnél hosszabb alléit, míg a pozitív kontroli esetén - a korábbi méréshez hasonlóan - jelentős fluoreszcencia értékeket mértünk.After setting up the model system, clinical specimens were also tested. Lymphocytic lymphocytes from Pluntington's disease and healthy humans were used for the PCR reaction. The samples were provided by Professor Béla Melegít (University of Pécs) ♦ *: «*» fc University Clinical Center, Institute of Medical Genetics and Child Development, 7624 Pécs, Szigeti út 12, (Molecular Genetics Laboratory), non-reversible anonymity! bi.otm and Cy5 PCR products were bound to streptavidin surface microarrays as before, and the resulting products were split after binding to crumb beads, then hixexed in 65 and 75 volumes of formanide solution. change in fluorescence intensity in the sample treated with 75 µl formide solution with FAICSarray At the first measurement (Fig. 9), a patient with a predetermined length of CAG repeat was examined, with 27 CAG repeats as healthy controls. plasmid, and Jutka Tissue culture cell genomic DNA (A'l'CC nomber: CRL-like) In the second measurement (Figure 10), DNA samples were taken from 5 healthy human subjects and three patient samples already tested in the previous measurement were used as positive controls. Figure 10 shows that the 5 healthy samples showed low mean fluorescence values similar to the negative control, thus they do not, in fact, carry the elongated, healthy 27 CAG-labeled piaxmid and Jurkat cells. A longer allele than CA'G repetition was observed, whereas significant positive fluorescence values were measured in the positive control, as in the previous measurement.
BRCA1 gé»5382msC mutáctólámfe kimutatásaDetection of BRCA1 Gene »5382msC Mutation Lamp
Magyarországon - a BRCA. gének öröklött mutációi következtében - az emlőrákok kb, 7 %~a, a petefészekrákok 11 %-a, a térti emlőrákok 33 %~a örökletes (Van dér Looij et ah, International Journal ot Caneer 86: 737-740, 2000; Csókay 8, et ah, Caneer Research 59: 995-998, 1999). A BRCA gének auíoszornáks domináns öröklődést mutatnak, igy már a beierozigóták is Őrökhk a daganat iránti hajlamot.In Hungary - the BRCA. due to hereditary mutations in genes - about 7% ~ 11% of breast cancers, 11% of ovarian cancers, 33% ~ of spinal cancers (Van Der Looij et al., International Journal ot Caneer 86: 737-740, 2000; Csókay 8 , et al., Caneer Research 59: 995-998, 1999). The BRCA genes show a dominant heredity, so even the beozygotes are still susceptible to cancer.
Az örökletes emlőrák esetek fele (Magyarországon közel kétharmada) a BR.CA1 gén mutációjára vezethető vissza, Az ilyen BRCA1 mutációkat hordozó egyének emlőrákra illetve petefészek rákra való hajlama igen magas, ezérí a; mutációk szűrése kiemelten fontos. A BRCA-mniácíőkkal kapcsolatos emlőrák-kockázati becslések szerint a BRCA.1 génhibát hordozó nők 80 %-a betegszik meg élete során emlőrákban. (Narod S.A. - Foulkes W13, Natúré Reviews Caneer 4: 665-667, 2004) Egy másik, 12 ezer BRCA 1-mutációt hordozó betegen végzett kockázati elemzés eredménye alapján a BRCA 1 -mutációt hordozók kumulatív kockázata emlőrákra hetvenéves korig 65 % (Ántoniou A. et ah, The American Journal of Humán Gencücs.72: 11S 7-1130, 2003), *Half of the cases of hereditary breast cancer (nearly two thirds in Hungary) are due to mutations in the BR.CA1 gene. Individuals carrying such BRCA1 mutations have a very high susceptibility to breast cancer and ovarian cancer; screening for mutations is extremely important. Estimates of breast cancer risk associated with BRCA manicures indicate that 80% of women with BRCA.1 gene defects will develop breast cancer during their lifetime. (Narod SA - Foulkes W13, Natúré Reviews Caneer 4: 665-667, 2004) Based on the results of another risk analysis of 12,000 patients with BRCA 1 mutation, the cumulative risk of BRCA 1 mutants to breast cancer by age seventy-five (Ántoniou A . et ah, The American Journal of Human Gencücs.72: 11S 7-1130, 2003), *
Vélhetően az örökletes petefészekrákok többségét is a BR.CA1 gén mutációja okozza. A 8RCA1 gén hibája esetén a petefészekrák kialakulásának valószínűsége 40 %. Olyan· BRCA1 génhibávál sújtott csatádban, ahol emlő- és petefészekrák egyaránt előfordul, 80 % felett van annak a valószínűsége, hogy a BRCA1-mutációt hordozó nő hetvenéves koráig valamelyik rákban megbetegszik. Az emlő- és petefészekrákon kívül a 8RCAI hordozók esetében jelentős kockázatnővekedést mutattak ki hasnyálmirigy rákra. továbbá a méhnyak és a méh. rosszindulatú daganataira. Emelkedett kockázat feltételezhető prosztatarákra 65 éves kor alatt. A fentieken kívül a nőgyógyászati (kört.-) tumorok és a hashártya daganatainak kockázata Is fokozott (Ántonloo A. et ah, The American. Journal of Humán Genetícs 72: 1117-1130, 2(503).Most hereditary ovarian cancers are also thought to be caused by mutations in the BR.CA1 gene. If the 8RCA1 gene is defective, the probability of developing ovarian cancer is 40%. In your battle with the BRCA1 gene defect, where both breast and ovarian cancers occur, there is an 80% probability that a woman with the BRCA1 mutation will have cancer before the age of seventy. Apart from breast and ovarian cancers, 8RCAI carriers have shown a significant increase in risk for pancreatic cancer. and the cervix and uterus. malignant tumors. Increased risk for prostate cancer under 65 years of age. In addition, the risk of gynecologic (circumcision) tumors and peritoneal tumors is also increased (Ántonloo A. et al., The American Journal of Human Genetics 72: 1117-1130, 2 (503).
Hogy igazoljuk a találmány szerinti eljárás SNF-k detektálására való alkalmasságát, a BfoCA! gén Magyaroroszágon leggyakrabban előforduló 5382ínsC mutációjának kimutatására végeztünk kísérleteket.To demonstrate the ability of the method of the invention to detect SNFs, BfoCA! We have carried out experiments to detect the most common 5382ínsC mutation in the Hungarian gene.
A találmány szerinti eljárás első lépésében a vizsgálni kívánt DNS-szakaszt tisztítjuk, és multiplex alléi specifikus PCR-reakeió segítségével ampíifikáljuk. Az arnph lokációhoz háromféle primőrt használunk; két iorward és egy közös re verse prímért. A két forward primer .közül az egyik a mutációra, míg a másik. a. vad-típusra specifikus. Ez azi jelenti, hogy a Iorward printereket úgy terveztük, hogy a 3' végük pontosan a mutáció helyére essen, igy csak abban az esetben amplifikálódik a mutácíóra-speoifikus príméiről tennék, ha a mutáció jelen van a vizsgált mintában legalább egy példányban, Ugyanez érvényes a vad-tipusra specifikus forward primőrre is. Ezen kívül a két íőrward primer között további különbség, hogy a mutációra- specifikus primer 5’ végére 6 GAG-ismétlődésből álló (összesen 18 bp hosszú) Tag-szekvenciát szimetizáhattunk, hogy el tudjuk különíteni a mutációt hordozó es a vadtípusú PCR-termékeket egymástól, A CAG-ísrnétlödés helyett ez a plusz szekvencia tartalmazhat bármilyen nukleotid-sorrendő magas GC tartalmú szekvenciát, A magas GC-íartalom azért szükséges, hogy megemeljük a PCR-termékek Tm pontja közötti különbséget annyim, hogy a forrnanndos hőkezelés alkalmazható legyen,In the first step of the method of the invention, the DNA portion to be tested is purified and amplified using a multiplex allele specific PCR reaction. Three primers are used for the arnph location; two iorward and one common re verse for prime. The two forward primers are one for mutation and one for mutation. the. wild type. This means that Iorward printers are designed with their 3 'ends exactly in the site of the mutation, so that they are amplified from the mutation-specific primers only if the mutation is present in at least one copy of the sample. also wild-type forward forward primers. In addition, a further difference between the two forward primers was that the 5 'end of the mutation-specific primer had 6 GAG repeats (18 bp in total) to be used to distinguish between the mutation-carrying and wild-type PCR products, Instead of CAG transcription, this additional sequence may contain any high-GC content sequence to be sequenced. The high GC content is necessary to increase the difference between the Tm-points of the PCR products so that heat-treatment can be applied,
A PCR-reakcioban használt reverse prímért hiotinnah míg a két iorward primőrt fluoreszcens CyS molekulával jelöltük. A keletkezeti PCR-termékeket sztreptavídinnel bevont rnikrogyöngyők felszínéhez kötöttük bioimon keresztül, A PCR-termékei hordozó mikrogyöngyöket megfelelő, az alábbiakban meghatározott koncentrációjú íőrmamidoldaíban hőkezelve a PCR-termék hosszúságától függően a fluoreszcens molekulát hordozó szál fedisszoeiál a mikrogyöngy felszínéről.The reverse primer used in the PCR reaction was labeled with hiotin and the two primers were labeled with fluorescent CyS. The resulting PCR products were bound to the surface of streptavidin coated microspheres through a bioimide. The microspheres carrying their PCR products were heat-treated with appropriate fluorescent molecule, depending on the length of the PCR product, to heat the microspheres of the PCR product.
φ*φ *
A BRCAI mutációs teszthez először meghatároztuk. azt a főnnamid- koncentrációt, ahol a rövid és a. hosszú FCR-tennék között különbséget -mérhetünk. Ezután megvizsgáltuk, hogy hcterozsgóta minta esetén Is kimutatható-e a mutáció.The BRCAI mutation assay was first determined. the nymph concentration where short and. we can measure the difference between long FCRs. Next, it was examined whether the mutation was also detectable in the hot rust sample.
Azdjárásispései:Azdjárásispései:
1. PCR reakció:1. PCR reaction:
te m plát;you m plate;
- 200 ng humán limfocitáhől izolált genomiális DNS prímetek:- Genomic DNA primers isolated from 200 ng of human lymphocytes:
- P4 (közös revem: bíotin-5s~A.GT CTT AGA AÁA IGA AGG GGG CC-3! - P4 (joint whereby: Biotin 5 s ~ A.GT CTT AGA AAA GGG AGG CC-3 IGA!
- P5 (vad~tíuusú forward): Cy5-S‘-A.AA GCG AGG AAG AGA ATC GCA-3’- P5 (wild-type forward): Cy5-S'-A.AA GCG AGG AAG AGA ATC GCA-3 '
- P6 (mutáns forward): CyS-S-'-CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAC CTT AGC GÁG CAA GAG A AT CAC C-T reakcíödegy:- P6 (mutant forward): CyS-S -'- CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CTG AGAGAG CAA GAG AT CAC CAG:
•HO 31,5 pl• HO 31.5 pl
- Taq puliért Fennentas} $ pl- Taq puli for Fennent} $ pl
- MgCh (Fennentas) (25 m.M) 3 μ!- MgCh (Fennent) (25 m.M) 3 μ!
- dNTP (Fermentas) (2,5 mM) 5 pl · reverz primer (1 ÖT) (1 pmol/p I) 2 μ 1- dNTP (Enzyme) (2.5 mM) 5 pl · reverse primer (1 ÖT) (1 pmol / µl) 2 μ 1
- fonvatd primer 1 GDT) π pmol/μΐ) 1 pl- fonvatd primer 1 GDT) π pmol / μΐ) 1 pl
- forward primer 2 (1DT) (1 pmot/ph 1 μΐ- forward primer 2 (1DT) {1 pmot / ph 1 μΐ
- iemplát (20Ö ng/pi) 1 pl- template (20µg / pi) 1 µl
- Taq poHmcráz (Fetmentas) (5 C/pl) 0,5 μΙ- Taq poHmcráz (Fetment) (5 C / pl) 0.5 μΙ
Összesen: 50 μΙTotal: 50 μΙ
- a PCR reakció hőmérsékleti profilja:- temperature profile of the PCR reaction:
1. lépés1st step
- denaturáciő: 95X 12 percdenaturation: 95X 12 min
2. lépés; 3? ciklusStep 2; 3? cycle
- denaturáciő: 9CC 15 mp ·· anneláció: 62A? 15 mp- denaturation: 9CC 15 sec ·· annelation: 62A? 15s
- extenzió: 72:'C 30 mpExtension 72 : C 30 sec
3. lépéstStep 3
- extenzió: ?2C 5 pec- extension:? 2C 5 pec
A .·<A. · <
2. Kikötés mikrogyöngyökre (mlcrobeadí:2. Beading for microspheres (mlcrobeadi:
- 40 μ| PCR tennék v ló μί dö^microbead (Polysdcnces, Inc.) (kb. 10-20(M)0db) * 100 μΐ- 40 μ | PCR Products About μί dö ^ microbead (Polysdcnces, Inc.) (about 10-20 (M) 0pcs) * 100 μΐ
FBSFBS
- 40 perc, szobahőmérséklet, sötétben- 40 minutes, room temperature, dark
- mosás 3-szór 600 μΙ 1 ^FBíS-ben (eentrifúgálás 10 perc. 15000 tord/perc) · az utolsó mosás után !Öf> μί 1 xFBS-ben szuszpendalás .(vortex)- washing 3 times in 600 μΙ FBíS ^ 1 (10 minutes, 15000 eentrifúgálás Tord / min.) · After the last wash of> 1 x μί FBS suspending (vortex)!.
3. Hőkezelés Snraarnid-oldaiban:3. Heat treatment in Snraarnid's sides:
- hőkezelés 3 perc, 4(f C-on ~ mosás 3-szor όΟΟμΙ fe<PBS-ben (eentrifúgálás 102 15000 rpm)- heat treatment for 3 minutes, 4 (wash at 3 ° C in PBS (centrifugation at 102 to 15000 rpm)
- az utolsó mosás után 150μ1 l zpBS-ben szuszpendálás- resuspend in 150µl l zpBS after the last wash
4. Mérés FACSarray áramlási eítométereo; - beállítások: FS'C: 7954. Measurement FACSarray Flow eutometer; - settings: FS'C: 795
SSC: 520 Far Red: 625 tréshold: 20000SSC: 520 Far Red: 625 Treshold: 20000
Formamid-koncentrádóbeállitása,·Formamide koncentrádóbeállitása ·
A íormamid-koneentráció beállításához kétfelé FCR-íerméket használtunk, az egyik csak a rövid, vad-típusra jellemző terméket tartalmazta, míg a másik a hosszú, mutációra specifikus terméket tartalmazta. Áz ampíífikácíő humán .genomiális DNS-ről történt, mindkét esetben egy-egy primerpárt használtunk:: a vad-típus esetén biotinnal jelölt közös re verse, illetve Cy5-el jelölt, vad-típusra specifikus, rövid fenvard prímért; míg a mutációi hordozó minta esetén biotinnal jelölt közös reverse, Illetve Cy5-el jelölt, muiációra-speeifikus hosszú (CAG Tag-et hordozó) fórward printert.. Az igy kapott PCR-termékekeí sztreptavidlnnei bevont mikrogyöngyök felszínéhez kötöttük két külön reakcióban, majd a DNS-fragmentumokat hordozó mikrogyöngyöket 57 tfeó-os és 62 tfeo-os formamid-oldatokban hőkezeltük 40‘C-on és FACSarray készülékkel mértük a fluoreszcencia-intenzitás változását (11. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a tormamid-koncentrácíótól íUggoen a hosszú (mutációt hordozó) és a rövid ( vad-típusú) PCR-termékek fluoreszcens molekulát hordozó-szála elférő mértékben ► Φ χ *For the formation of the formamide amide machine concentration, two FCR bodies were used, one containing only the short wild-type product and the other containing the long mutation specific product. One amplification was made from human. Genomic DNA, in each case one primer pair was used: for the wild-type, a common re verse for biotin labeled, and for Cy5, a wild type-specific short fenvard primer; whereas the mutation carrier sample had a biotin-labeled reverse reverse, or Cy5-labeled, mutation-specific long (CAG Tag) forward transducer. The resulting PCR products were bound to the surface of the streptavidin-coated microspheres in two separate reactions, followed by DNA microspheres bearing fragments were heat-treated in 57 and 62 volumes of formamide solutions at 40 ° C and the change in fluorescence intensity was measured with a FACSarray (Figure 11). The results showed that, depending on the concentration of tormamide, long (mutation) and short (wild-type) PCR products had a fluorescent molecule carrier strand of sufficient size ► Φ χ *
V * 0 » tf « <· »φ· · » ·.♦ tíisszociál le a mikrogyöngyökről. így a mutációt hordozó., illetve a vad-tlpusú PCR-termékek jól megkülönböztethetők egymástól. A PCR.-reakcióhoz használt vad-típusú genomiális DNSt Jurkat-sejtekböl (ATCC .number: CRI,~199Ö) izoláltuk, míg a BRCAI mutációt hordozó betegből származó genomiális DNS-t Profi Dr. Kappehnayer János bocsátotta rendelkezésünkre a DE-OEC Klinikai Biokémiai és Molekuláris .Patológiai Intézetéből (Debrecen).V * 0 »tf« <· »φ · ·» ·. ♦ disassociates from the microspheres. Thus, mutation-carrying and wild-type PCR products can be well distinguished. The wild-type genomic DNA used for the PCR reaction was isolated from Jurkat cells (ATCC. Number: CRI, ~ 199), while the genomic DNA from a patient carrying the BRCAI mutation was provided by Prof. Dr. János Kappehnayer in Clinical Biochemistry at DE-OEC. and Molecular Institute of Pathology (Debrecen).
Ebben a kísérletben az előzőhöz hasonlóan jártunk et azzal a különbséggel hogy a PCR-reakcióban mind a. három primőrt használtuk multiplex módon. A kapott termékeket mlkrogyöngyökm történő kötés után kettéosztottuk, majd 57 tf%-os és 62 ifiK-os formamldoldatban hökezeitük, és mértük az 57 tl%-os íomsamid-oldaítal kezelt kontrolihoz képest a 62 ti%-os. fonnamid-oldattal kezelt mintában a fluoreszcencia intenzitás változását (12. ábra).. A kapott eredmények alapján elmondható, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmas a BRCAI gén 5382ínsC mutációjának kimutatására is..In this experiment, we did the same as the previous one, except that in the PCR reaction both. three primers were used in a multiplex fashion. After binding to ml of beads, the resulting products were split and heated in 57% (v / v) and 62% (ifiK) solution and measured at 62% (%) compared to the 57% formamide treated control. The results obtained indicate that the method according to the invention is also suitable for detecting the 5382in5C mutation of the BRCAI gene.
Claims (17)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0800760A HU228175B1 (en) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | Cytometric process for comparative analysis of pcr products lengths and the use of this process |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0800760A HU228175B1 (en) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | Cytometric process for comparative analysis of pcr products lengths and the use of this process |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0800760D0 HU0800760D0 (en) | 2009-03-02 |
| HUP0800760A2 HUP0800760A2 (en) | 2010-09-28 |
| HU228175B1 true HU228175B1 (en) | 2013-01-28 |
Family
ID=89988669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0800760A HU228175B1 (en) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | Cytometric process for comparative analysis of pcr products lengths and the use of this process |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU228175B1 (en) |
-
2008
- 2008-12-15 HU HU0800760A patent/HU228175B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0800760A2 (en) | 2010-09-28 |
| HU0800760D0 (en) | 2009-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1941050B1 (en) | Methods and composition to generate unique sequence dna probes, iabeling of dna probes and the use of these probes | |
| US6828097B1 (en) | Single copy genomic hybridization probes and method of generating same | |
| US6025126A (en) | Methods and compositions for the detection of chromosomal aberrations | |
| JP2007525998A (en) | Detection of STRP such as fragile X syndrome | |
| KR20030084975A (en) | Highly sensitive method for the detection of cytosine methylation patterns | |
| KR20130118331A (en) | Amplified nucleic acid detection method and detection device | |
| WO1994028178A1 (en) | In-situ hybridization probes for identification and banding of specific human chromosomes and regions | |
| JP3844996B2 (en) | Melting curve analysis method for repetitive PCR products | |
| JP2002537857A (en) | Gene screening | |
| JP4743787B2 (en) | Methods for methylation and detection of cytosine in DNA | |
| WO2020096394A1 (en) | Method, kit, and pcr device for detecting methylation of gene using reduction probe | |
| KR101573467B1 (en) | Method for Detecting Bladder Cancer Using Bladder Cancer Specific Epigenetic Marker Gene | |
| KR101070349B1 (en) | Probe for detecting abl gene mutation and uses thereof | |
| WO1998058081A1 (en) | Methods for stool sample preparation | |
| EP3350347B1 (en) | Methods and materials for detection of mutations | |
| JP2003530893A (en) | Detection of nucleotide sequence variation by proofreading activity of polymerase | |
| US20030113723A1 (en) | Method for evaluating microsatellite instability in a tumor sample | |
| CA2687171A1 (en) | Amplification method of methylated or unmethylated nucleic acid | |
| AU2003276609A1 (en) | Qualitative differential screening for the detection of RNA splice sites | |
| US20100311609A1 (en) | Methylation Profile of Neuroinflammatory Demyelinating Diseases | |
| HU228175B1 (en) | Cytometric process for comparative analysis of pcr products lengths and the use of this process | |
| EP2907872B1 (en) | Methods and compositions for the quantitive analysis of terminal nucleotides of a g chain of human telomeric dna | |
| Wolff | Fluorescence in situ hybridization (FISH) | |
| WO1992010566A1 (en) | In-situ hybridization probes for identification and banding of specific human chromosomes and regions | |
| US20100021971A1 (en) | Method to remove repetitive sequences from human dna |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |