JPH11341986A - Ｄｎａ試料調製法および試薬 - Google Patents
Ｄｎａ試料調製法および試薬Info
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- JPH11341986A JPH11341986A JP10152598A JP15259898A JPH11341986A JP H11341986 A JPH11341986 A JP H11341986A JP 10152598 A JP10152598 A JP 10152598A JP 15259898 A JP15259898 A JP 15259898A JP H11341986 A JPH11341986 A JP H11341986A
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- restriction enzyme
- primer
- primer set
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 長いDNAの制限酵素断片群をPCR産物から直接
配列決定することで全ての配列を決定する方法の提供。 【解決手段】 第１プライマーセットから選択される第
１プライマーおよび第２プライマーセットから選択され
る第２プライマーからなる少なくとも一対のプライマー
を用いて、ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅す
る工程を含むことを特徴とするＤＮＡ分析、特にＤＮＡ
の塩基配列決定用ＤＮＡ試料の調製法であって、前記第
１プライマーセットは、第１制限酵素が認識する塩基配
列に相補的な塩基配列を含む複数のプライマーから構成
され、前記第２プライマーセットは、第２制限酵素が認
識する塩基配列に相補的な塩基配列を含む複数のプライ
マーから構成され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵
素が認識する塩基配列とは異なる塩基配列を認識する前
記の方法。
配列決定することで全ての配列を決定する方法の提供。 【解決手段】 第１プライマーセットから選択される第
１プライマーおよび第２プライマーセットから選択され
る第２プライマーからなる少なくとも一対のプライマー
を用いて、ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅す
る工程を含むことを特徴とするＤＮＡ分析、特にＤＮＡ
の塩基配列決定用ＤＮＡ試料の調製法であって、前記第
１プライマーセットは、第１制限酵素が認識する塩基配
列に相補的な塩基配列を含む複数のプライマーから構成
され、前記第２プライマーセットは、第２制限酵素が認
識する塩基配列に相補的な塩基配列を含む複数のプライ
マーから構成され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵
素が認識する塩基配列とは異なる塩基配列を認識する前
記の方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はDNA分析用DNA試料、
特に配列決定用DNA試料の調製方法、試薬および試薬キ
ット、ならびにDNAの塩基配列決定法に関するものであ
る。
特に配列決定用DNA試料の調製方法、試薬および試薬キ
ット、ならびにDNAの塩基配列決定法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ゲノム解析を中心にDNA塩基配列決定の
高効率化のニーズが高まっている。従来の放射性同位元
素を用いてDNA断片を標識し、ゲル電気泳動によりDNAの
長さを計測して人手を用いて行なう塩基配列決定法に代
わり、DNAを蛍光体で標識し、ゲル電気泳動しながら光
を当てて自動的にDNA断片を光学検出する装置（DNAシー
ケンサー）が普及してきている。この装置は目的とする
DNAにプライマーと呼ばれるDNAオリゴマーをハイブリダ
イズさせ、酵素を用いた相補鎖合成で配列決定に用いる
種々の長さのDNA断片を作製し、ゲル電気泳動でそれら
の長さを調べて配列決定するものでサンガー法あるいは
ダイデオキシ法と呼ばれている。ここで一度に配列決定
できる長さは、ゲルによる長さ分離能で決められてお
り、400〜700塩基長である。これにより長い数K塩基か
ら数十塩基のDNA塩基配列決定は手間と時間のかかる作
業である。
高効率化のニーズが高まっている。従来の放射性同位元
素を用いてDNA断片を標識し、ゲル電気泳動によりDNAの
長さを計測して人手を用いて行なう塩基配列決定法に代
わり、DNAを蛍光体で標識し、ゲル電気泳動しながら光
を当てて自動的にDNA断片を光学検出する装置（DNAシー
ケンサー）が普及してきている。この装置は目的とする
DNAにプライマーと呼ばれるDNAオリゴマーをハイブリダ
イズさせ、酵素を用いた相補鎖合成で配列決定に用いる
種々の長さのDNA断片を作製し、ゲル電気泳動でそれら
の長さを調べて配列決定するものでサンガー法あるいは
ダイデオキシ法と呼ばれている。ここで一度に配列決定
できる長さは、ゲルによる長さ分離能で決められてお
り、400〜700塩基長である。これにより長い数K塩基か
ら数十塩基のDNA塩基配列決定は手間と時間のかかる作
業である。
【０００３】従来、長いDNA（数K〜数十K塩基）の配列
決定にはショットガン法が用いられてきた。これはDNA
を超音波などを用いてランダムに切断し、DNA断片をク
ローニングして大腸菌等に埋め込み、コロニー培養した
後、各コロニー中の大腸菌を培養してDNAのコピーを増
やす。次いで試料DNAを抽出して配列決定などのDNA解析
をする。この方法では、取り出したコロニーに含まれる
DNAには断片化した試料DNAが含まれるが、それが試料DN
Aのどの部分であるか、配列決定するまで分からないた
め、決定しようとするDNA鎖長の10〜20倍ものDNAに相当
するDNA断片を取り解析しなくてはならない。このた
め、時間と手間が大いにかかり障害をとなっている。一
方、配列決定しようとするDNA断片を端から順に決めて
いく方法（プライマーウオーキング法；Analytical Bio
chemistry,222,127-135(1994)）も提案されている。こ
の方法では配列を決定したら、その中から次のプライマ
ー領域を選びダイデオキシ法により配列を再び決定す
る。このため無駄が少なく効率の良い配列決定ができる
が、時系列的に配列を決めていくので時間がかかる点
と、解析の都度プライマーを用意する手間がかかる難点
がある。
決定にはショットガン法が用いられてきた。これはDNA
を超音波などを用いてランダムに切断し、DNA断片をク
ローニングして大腸菌等に埋め込み、コロニー培養した
後、各コロニー中の大腸菌を培養してDNAのコピーを増
やす。次いで試料DNAを抽出して配列決定などのDNA解析
をする。この方法では、取り出したコロニーに含まれる
DNAには断片化した試料DNAが含まれるが、それが試料DN
Aのどの部分であるか、配列決定するまで分からないた
め、決定しようとするDNA鎖長の10〜20倍ものDNAに相当
するDNA断片を取り解析しなくてはならない。このた
め、時間と手間が大いにかかり障害をとなっている。一
方、配列決定しようとするDNA断片を端から順に決めて
いく方法（プライマーウオーキング法；Analytical Bio
chemistry,222,127-135(1994)）も提案されている。こ
の方法では配列を決定したら、その中から次のプライマ
ー領域を選びダイデオキシ法により配列を再び決定す
る。このため無駄が少なく効率の良い配列決定ができる
が、時系列的に配列を決めていくので時間がかかる点
と、解析の都度プライマーを用意する手間がかかる難点
がある。
【０００４】発明者らはこの欠点を克服する方法として
フラグメントウオーキング法を提案した。この方法では
配列決定しようとするDNAを4塩基認識酵素などの制限酵
素で完全に切断し、重複のない断片群を作製する。生成
したDNA断片は酵素が認識して切断する部分の配列を除
くと塩基配列は未知である。既知配列を持ったプライマ
ーがハイブリダイズし相補鎖合成の起点となるプライミ
ングサイトは特に持っていない。そこで生成した断片の
3'末端側に既知配列のオリゴマーを結合してプライミン
グサイトとする。プライマーをDNA断片にハイブリダイ
ズさせ相補鎖合成でDNA伸長鎖を作る時、プライマーの
3'末端2塩基（選別配列と呼ぶ）がDNA断片と完全に相補
的でぴったりハイブリダイズしている時には反応が進行
するが、そうでない時には反応が遅いか全く進まないこ
とが知られている。そこで蛍光標識プライマーの3'末端
（相補鎖伸長側）に任意の2塩基（16通りの配列）をつ
けておき、DNA断片の中からプライマーと完全に相補な
配列を持つ特定の断片を選び相補鎖合成したり、配列決
定することができる（DNA Research 1, 231-237, 199
4）。
フラグメントウオーキング法を提案した。この方法では
配列決定しようとするDNAを4塩基認識酵素などの制限酵
素で完全に切断し、重複のない断片群を作製する。生成
したDNA断片は酵素が認識して切断する部分の配列を除
くと塩基配列は未知である。既知配列を持ったプライマ
ーがハイブリダイズし相補鎖合成の起点となるプライミ
ングサイトは特に持っていない。そこで生成した断片の
3'末端側に既知配列のオリゴマーを結合してプライミン
グサイトとする。プライマーをDNA断片にハイブリダイ
ズさせ相補鎖合成でDNA伸長鎖を作る時、プライマーの
3'末端2塩基（選別配列と呼ぶ）がDNA断片と完全に相補
的でぴったりハイブリダイズしている時には反応が進行
するが、そうでない時には反応が遅いか全く進まないこ
とが知られている。そこで蛍光標識プライマーの3'末端
（相補鎖伸長側）に任意の2塩基（16通りの配列）をつ
けておき、DNA断片の中からプライマーと完全に相補な
配列を持つ特定の断片を選び相補鎖合成したり、配列決
定することができる（DNA Research 1, 231-237, 199
4）。
【０００５】DNA断片群中に含まれるDNA断片の種類が少
なく、1個のプライマーと完全に相補的なDNA断片が1個
以下の時には各断片の配列を上記プライマーを用いて、
それぞれ決定できる。1つのプライマーが2つ以上のDNA
断片とハイブリダイズする場合には、あらかじめ長さ分
離するなどしてから上述の操作を行なう。このようにし
てフラグメントウオーキングでは混合状態にあるDNA断
片の塩基配列を16種のプライマーを用いてクローニング
などせずにまた重複なく簡単に決定することができる。
断片相互のつながりを決定し、全体配列を決めるには次
の様に行なう。前述した16種の蛍光標識プライマーは末
端にプライミングサイトを持つ断片DNAだけにハイブリ
ダイズし、元の切断されていないDNAにはハイブリダイ
ズしない。しかし、相補鎖伸長すると、伸長した部分は
元のDNAと相補的であり、元のDNAにハイブリダイズす
る。そこで、上記プライマーを用いて各DNA断片の塩基
配列決定用相補鎖合成反応を行なう時、反応温度を昇降
するサイクルシーケンス条件下で行ない、反応液中に未
切断のDNAを加えると、DNA断片の配列に加えて、切断部
に続く元のDNAの配列をも決定することができる。この
方法では異なる16種のプライマーを用いて各DNA断片と
それに続く配列を並列して決定することができ非常に効
率が良い。この方法は断片から次の断片へ配列をつなげ
て歩いて行くのに似ているのでフラグメントウオーキン
グと呼ぶ（Gene,176,231-235(1996)）。
なく、1個のプライマーと完全に相補的なDNA断片が1個
以下の時には各断片の配列を上記プライマーを用いて、
それぞれ決定できる。1つのプライマーが2つ以上のDNA
断片とハイブリダイズする場合には、あらかじめ長さ分
離するなどしてから上述の操作を行なう。このようにし
てフラグメントウオーキングでは混合状態にあるDNA断
片の塩基配列を16種のプライマーを用いてクローニング
などせずにまた重複なく簡単に決定することができる。
断片相互のつながりを決定し、全体配列を決めるには次
の様に行なう。前述した16種の蛍光標識プライマーは末
端にプライミングサイトを持つ断片DNAだけにハイブリ
ダイズし、元の切断されていないDNAにはハイブリダイ
ズしない。しかし、相補鎖伸長すると、伸長した部分は
元のDNAと相補的であり、元のDNAにハイブリダイズす
る。そこで、上記プライマーを用いて各DNA断片の塩基
配列決定用相補鎖合成反応を行なう時、反応温度を昇降
するサイクルシーケンス条件下で行ない、反応液中に未
切断のDNAを加えると、DNA断片の配列に加えて、切断部
に続く元のDNAの配列をも決定することができる。この
方法では異なる16種のプライマーを用いて各DNA断片と
それに続く配列を並列して決定することができ非常に効
率が良い。この方法は断片から次の断片へ配列をつなげ
て歩いて行くのに似ているのでフラグメントウオーキン
グと呼ぶ（Gene,176,231-235(1996)）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】フラグメントウオーキ
ング法は非常に効率の良い方法であるが、試料DNAを多
量に消耗する難点がある。これを補うには各断片を3'末
端に選別配列を持つ2種のプライマーを用いて選択的に
増幅して解析することが有効である。しかし、こうして
増幅したDNA断片には元のDNA鎖あるいはその相補鎖にな
いオリゴマーが結合されており、1つのDNA断片の配列決
定のサイクル反応でその断片に繋がる他のDNA断片の配
列を同時に読み取ることは不可能である。なぜなら、伸
長DNA鎖は3'末端に余分の（元のDNAにない）配列を有し
ており、元のDNAを鋳型にして相補鎖合成できないから
である。また、上記既知配列オリゴマーを共通なプライ
マーとして用いて増幅ＤＮＡ断片を配列決定できれば都
合がよいが、増幅ＤＮＡ断片の両末端には同じ配列のオ
リゴマーが結合しており、このままでは配列決定ができ
ない。本発明はこの難点を解決するためになされたもの
であり、PCR増幅と注目DNA断片およびその隣接断片配列
決定を行ないうる方法を提供することを目的とする。
ング法は非常に効率の良い方法であるが、試料DNAを多
量に消耗する難点がある。これを補うには各断片を3'末
端に選別配列を持つ2種のプライマーを用いて選択的に
増幅して解析することが有効である。しかし、こうして
増幅したDNA断片には元のDNA鎖あるいはその相補鎖にな
いオリゴマーが結合されており、1つのDNA断片の配列決
定のサイクル反応でその断片に繋がる他のDNA断片の配
列を同時に読み取ることは不可能である。なぜなら、伸
長DNA鎖は3'末端に余分の（元のDNAにない）配列を有し
ており、元のDNAを鋳型にして相補鎖合成できないから
である。また、上記既知配列オリゴマーを共通なプライ
マーとして用いて増幅ＤＮＡ断片を配列決定できれば都
合がよいが、増幅ＤＮＡ断片の両末端には同じ配列のオ
リゴマーが結合しており、このままでは配列決定ができ
ない。本発明はこの難点を解決するためになされたもの
であり、PCR増幅と注目DNA断片およびその隣接断片配列
決定を行ないうる方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を克服するため
に本発明は2つの方法を提供する。第1の方法は、PCR増
幅に使用する選択配列を持つプライマーを2セット用意
し、そのうち1セットは制限酵素切断部配列が変化する
置換を含んだものにしておく。それぞれのセットから1
つずつプライマーを選びPCRすることで、生成DNA断片の
両端にはそれぞれ元の制限酵素認識配列およびそれぞれ
元の制限酵素認識配列とは異なる制限酵素認識配列を持
たせたものとする。必要に応じてどちらか一方の端を切
断し、これを鋳型として用いて配列決定する方法であ
る。
に本発明は2つの方法を提供する。第1の方法は、PCR増
幅に使用する選択配列を持つプライマーを2セット用意
し、そのうち1セットは制限酵素切断部配列が変化する
置換を含んだものにしておく。それぞれのセットから1
つずつプライマーを選びPCRすることで、生成DNA断片の
両端にはそれぞれ元の制限酵素認識配列およびそれぞれ
元の制限酵素認識配列とは異なる制限酵素認識配列を持
たせたものとする。必要に応じてどちらか一方の端を切
断し、これを鋳型として用いて配列決定する方法であ
る。
【０００８】第2の方法は、PCR増幅後、制限酵素で切断
した3'末端に配列既知のオリゴマー、例えばポリA鎖を
付加し、ここをプライミングサイトとして選択プライマ
ーを用いて配列決定する方法である。また、本発明は、
上記の第１の方法に利用するこができるＤＮＡ試料の調
製法、試薬および試薬キットも提供する。
した3'末端に配列既知のオリゴマー、例えばポリA鎖を
付加し、ここをプライミングサイトとして選択プライマ
ーを用いて配列決定する方法である。また、本発明は、
上記の第１の方法に利用するこができるＤＮＡ試料の調
製法、試薬および試薬キットも提供する。
【０００９】すなわち、本発明は、ＤＮＡ試料を調製す
る方法であって、以下の工程： (a) 第１制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮ
Ａ断片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片にオリゴヌクレ
オチドを付加する工程、および(c) 前記オリゴヌクレオ
チドを付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、第１プライマー
セットから選択される第１プライマーおよび第２プライ
マーセットから選択される第２プライマーからなる少な
くとも一対のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から
特定の断片を選別して増幅する工程を含み、ここで、前
記第１プライマーセットは、前記オリゴヌクレオチドの
塩基配列に相補的な塩基配列および前記第１制限酵素が
認識する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、
前記ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅するため
の選別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライマーから
構成され、前記第２プライマーセットは、前記オリゴヌ
クレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列および第２制
限酵素が認識する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、
さらに、前記ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅
するための選別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライ
マーから構成され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵
素が認識する塩基配列とは異なる塩基配列を認識する、
前記の方法を提供する。
る方法であって、以下の工程： (a) 第１制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮ
Ａ断片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片にオリゴヌクレ
オチドを付加する工程、および(c) 前記オリゴヌクレオ
チドを付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、第１プライマー
セットから選択される第１プライマーおよび第２プライ
マーセットから選択される第２プライマーからなる少な
くとも一対のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から
特定の断片を選別して増幅する工程を含み、ここで、前
記第１プライマーセットは、前記オリゴヌクレオチドの
塩基配列に相補的な塩基配列および前記第１制限酵素が
認識する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、
前記ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅するため
の選別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライマーから
構成され、前記第２プライマーセットは、前記オリゴヌ
クレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列および第２制
限酵素が認識する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、
さらに、前記ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅
するための選別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライ
マーから構成され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵
素が認識する塩基配列とは異なる塩基配列を認識する、
前記の方法を提供する。
【００１０】また、本発明は、ＤＮＡの塩基配列を決定
する方法であって、以下の工程： (a) 第１制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮ
Ａ断片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片にオリゴヌクレ
オチドを付加する工程、(c) 前記オリゴヌクレオチドを
付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、第１プライマーセット
から選択される第１プライマーおよび第２プライマーセ
ットから選択される第２プライマーからなる少なくとも
一対のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から特定の
断片を選別して増幅する工程、ここで、前記第１プライ
マーセットは、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相
補的な塩基配列および前記第１制限酵素が認識する塩基
配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記ＤＮＡ断
片から特定の断片を選別して増幅するための選別塩基配
列を３’末端に持つ複数のプライマーから構成され、前
記第２プライマーセットは、前記オリゴヌクレオチドの
塩基配列に相補的な塩基配列および第２制限酵素が認識
する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記
ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅するための選
別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライマーから構成
され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵素が認識する
塩基配列とは異なる塩基配列を認識する、(d) 前記の増
幅されたＤＮＡ断片を第１制限酵素または第２制限酵素
で切断する工程、および(e) 断片化していない前記２本
鎖ＤＮＡの一方の鎖を鋳型とし、前記第１制限酵素また
は第２制限酵素で切断されたＤＮＡ断片のうち３’末端
側を切断されたほうの鎖をプライマーとして用いて、前
記の断片化していない２本鎖ＤＮＡの一方の鎖の塩基配
列決定を行う工程を含む、前記の方法を提供する。さら
に、工程(c) で増幅されたＤＮＡ断片を工程(d) で用い
なかった方の制限酵素で切断し、工程(e) で鋳型として
用いたＤＮＡ鎖の相補鎖を鋳型とし、前記制限酵素で切
断されたＤＮＡ断片のうち３’末端側を切断されたほう
の鎖をプライマーとして用いて、工程(e) で塩基配列決
定されたＤＮＡ鎖の相補鎖の塩基配列決定を行ってもよ
い。
する方法であって、以下の工程： (a) 第１制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮ
Ａ断片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片にオリゴヌクレ
オチドを付加する工程、(c) 前記オリゴヌクレオチドを
付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、第１プライマーセット
から選択される第１プライマーおよび第２プライマーセ
ットから選択される第２プライマーからなる少なくとも
一対のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から特定の
断片を選別して増幅する工程、ここで、前記第１プライ
マーセットは、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相
補的な塩基配列および前記第１制限酵素が認識する塩基
配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記ＤＮＡ断
片から特定の断片を選別して増幅するための選別塩基配
列を３’末端に持つ複数のプライマーから構成され、前
記第２プライマーセットは、前記オリゴヌクレオチドの
塩基配列に相補的な塩基配列および第２制限酵素が認識
する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記
ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅するための選
別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライマーから構成
され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵素が認識する
塩基配列とは異なる塩基配列を認識する、(d) 前記の増
幅されたＤＮＡ断片を第１制限酵素または第２制限酵素
で切断する工程、および(e) 断片化していない前記２本
鎖ＤＮＡの一方の鎖を鋳型とし、前記第１制限酵素また
は第２制限酵素で切断されたＤＮＡ断片のうち３’末端
側を切断されたほうの鎖をプライマーとして用いて、前
記の断片化していない２本鎖ＤＮＡの一方の鎖の塩基配
列決定を行う工程を含む、前記の方法を提供する。さら
に、工程(c) で増幅されたＤＮＡ断片を工程(d) で用い
なかった方の制限酵素で切断し、工程(e) で鋳型として
用いたＤＮＡ鎖の相補鎖を鋳型とし、前記制限酵素で切
断されたＤＮＡ断片のうち３’末端側を切断されたほう
の鎖をプライマーとして用いて、工程(e) で塩基配列決
定されたＤＮＡ鎖の相補鎖の塩基配列決定を行ってもよ
い。
【００１１】上記の方法において、２本鎖ＤＮＡとして
は、脳、肝臓、皮膚、腸、胃、種々のガンなどの組織、
肝細胞、白血球、膵臓などの細胞から抽出したｍＲＮＡ
から逆転写により作製したｃＤＮＡを含む溶液、ゲノム
ＤＮＡを切断して断片化した溶液などの試料中に含まれ
るものを挙げることができる。上記の方法において、第
１プライマーセットから選択される第１プライマーおよ
び第２プライマーセットから選択される第２プライマー
からなる一対のプライマーにより、選別して増幅したＤ
ＮＡ断片が第２制限酵素により切断されるときには、こ
のＤＮＡ断片に存在する、第２制限酵素が認識する塩基
配列中の塩基で、第１制限酵素が認識する塩基配列中の
塩基とは異なっている。このため、第１制限酵素が認識
する部位は切断されない。
は、脳、肝臓、皮膚、腸、胃、種々のガンなどの組織、
肝細胞、白血球、膵臓などの細胞から抽出したｍＲＮＡ
から逆転写により作製したｃＤＮＡを含む溶液、ゲノム
ＤＮＡを切断して断片化した溶液などの試料中に含まれ
るものを挙げることができる。上記の方法において、第
１プライマーセットから選択される第１プライマーおよ
び第２プライマーセットから選択される第２プライマー
からなる一対のプライマーにより、選別して増幅したＤ
ＮＡ断片が第２制限酵素により切断されるときには、こ
のＤＮＡ断片に存在する、第２制限酵素が認識する塩基
配列中の塩基で、第１制限酵素が認識する塩基配列中の
塩基とは異なっている。このため、第１制限酵素が認識
する部位は切断されない。
【００１２】さらに、本発明は、第１プライマーセット
および第２プライマーセットから構成されるプライマー
セットであって、前記第１プライマーセットは、特定の
オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列およ
び第１制限酵素が認識する塩基配列に相補的な塩基配列
を含み、さらに、複数のＤＮＡ断片から特定の断片を選
別して増幅するための選別塩基配列を３’末端に持つ複
数のプライマーから構成され、前記第２プライマーセッ
トは、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩
基配列および第２制限酵素が認識する塩基配列に相補的
な塩基配列を含み、さらに、複数のＤＮＡ断片から特定
の断片を選別して増幅するための選別塩基配列を３’末
端に持つ複数のプライマーから構成され、前記第２制限
酵素は前記第１制限酵素が認識する塩基配列とは異なる
塩基配列を認識する、前記のプライマーセットを提供す
る。
および第２プライマーセットから構成されるプライマー
セットであって、前記第１プライマーセットは、特定の
オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列およ
び第１制限酵素が認識する塩基配列に相補的な塩基配列
を含み、さらに、複数のＤＮＡ断片から特定の断片を選
別して増幅するための選別塩基配列を３’末端に持つ複
数のプライマーから構成され、前記第２プライマーセッ
トは、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩
基配列および第２制限酵素が認識する塩基配列に相補的
な塩基配列を含み、さらに、複数のＤＮＡ断片から特定
の断片を選別して増幅するための選別塩基配列を３’末
端に持つ複数のプライマーから構成され、前記第２制限
酵素は前記第１制限酵素が認識する塩基配列とは異なる
塩基配列を認識する、前記のプライマーセットを提供す
る。
【００１３】本発明において、前記第２制限酵素は前記
第１制限酵素が認識する塩基配列とは１塩基または２塩
基異なる塩基配列を含む部位を認識するとよい。前記オ
リゴヌクレオチドは、塩基数６〜１００、好ましくは塩
基数１０〜４８の配列が既知のものであるとよく、例え
ば、第１制限酵素がNlaIIIの例をとると、5'-pACTGGCCG
TCGTTT-3' （配列番号１）や 5'-pCCCTATAGTGAGTC-3'
（配列番号２）、同様に、Sau3AIの場合は、5'-pGATCAC
TGCCGTCGTTT-3'（配列番号３）あるいは5'-pGATCCCCTAT
AGTGAGTC-3'（配列番号４）を挙げることができる。も
ちろん、ライゲーション反応時には、これらのオリゴヌ
クレオチドに相補的なオリゴマーを添加し反応させる必
要があることは言うまでもない。
第１制限酵素が認識する塩基配列とは１塩基または２塩
基異なる塩基配列を含む部位を認識するとよい。前記オ
リゴヌクレオチドは、塩基数６〜１００、好ましくは塩
基数１０〜４８の配列が既知のものであるとよく、例え
ば、第１制限酵素がNlaIIIの例をとると、5'-pACTGGCCG
TCGTTT-3' （配列番号１）や 5'-pCCCTATAGTGAGTC-3'
（配列番号２）、同様に、Sau3AIの場合は、5'-pGATCAC
TGCCGTCGTTT-3'（配列番号３）あるいは5'-pGATCCCCTAT
AGTGAGTC-3'（配列番号４）を挙げることができる。も
ちろん、ライゲーション反応時には、これらのオリゴヌ
クレオチドに相補的なオリゴマーを添加し反応させる必
要があることは言うまでもない。
【００１４】前記選別塩基配列は１塩基〜４塩基長であ
るとよい。また、前記第２制限酵素が認識する塩基配列
の長さは、前記第１制限酵素が認識する塩基配列の長さ
よりも長いとよい。前記プライマーは、５’末端が標識
されているとよく、標識物質としては、スルホローダミ
ン１０１、フルオレッセインイソチオシアナート、ロー
ダミン系蛍光体、Ｃｙシリーズ蛍光体を挙げることがで
きる。
るとよい。また、前記第２制限酵素が認識する塩基配列
の長さは、前記第１制限酵素が認識する塩基配列の長さ
よりも長いとよい。前記プライマーは、５’末端が標識
されているとよく、標識物質としては、スルホローダミ
ン１０１、フルオレッセインイソチオシアナート、ロー
ダミン系蛍光体、Ｃｙシリーズ蛍光体を挙げることがで
きる。
【００１５】本発明の一つの好ましい態様においては、
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列
をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表わし、Ｎ１、Ｎ
２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかの塩基
とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが相補的な塩基で
あるとき、前記第１プライマーセットのプライマーの塩
基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ２によ
り表わされ、前記第２プライマーセットのプライマーの
塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ２に
より表わされる。前記第１プライマーセットのプライマ
ーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ
１を認識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマー
セットのプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ
２ｎ２Ｎ２ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２と
し、前記第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組
合せを（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ
（Ｅ１：Ｅ２）が、（ＴｓｐＥ I：Ｓｓｐ I）、（Ｍａ
ｅ II：Ｍｌｕ I）、（Ｍａｅ II：Ａｆｌ III）、（Ａ
ｌｕ I：Ｅｃｏ４７ III）、（Ｎｌａ III：Ｎｄｅ
I）、（Ｍｓｐ I：Ｄｓａ I）、（Ｍｓｐ I：ＮｓｐＢ
II）、（Ｈｐａ II：Ｄｓａ I）、（Ｈｐａ II：Ｎｓｐ
Ｂ II）、（Ｓａｕ３Ａ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｍｏｂ
I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｄｐｎ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｈａ
ｅ III：Ｂａｎ I)、（Ｈａｅ III：Ｎａｒ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ａｃｙ I)、（Ｈａｅ III：Ｂｂｉ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ｈｉｎｌ I)、（Ｐａｌ I：Ｂａｎ I)、（Ｐａ
ｌ I：：Ｎａｒ I)、（Ｐａｌ I：Ａｃｙ I)、（Ｐａｌ
I：Ｂｂｉ I)、（Ｐａｌ I：Ｈｉｎｌ I)、（Ｒｓａ
I：Ａｃｃ I)および（Ｔａｑ I：，Ｎｌｕ I) からなる
群から選択されるとよい。また、本発明の別の好ましい
態様においては、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表
わし、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣの
いずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが
相補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットの
プライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ
２により表わされ、前記第２プライマーセットのプライ
マーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ１−Ｒ２によ
り表わされる。前記第１プライマーセットのプライマー
の塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１を認識す
る第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマーセットのプ
ライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ１
を認識する第２制限酵素をＥ２とし、前記第１制限酵素
Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組合せを（Ｅ１：Ｅ２）
により表わすとき、前記組合せ（Ｅ１：Ｅ２）が、（Ａ
ｌｕ I：Ｍａｅ II ）、（Ｍａｅ I：Ｎｌａ III）、
（Ｔｈａ I：Ｍｓｐ I）、（Ａｃｃ II：Ｍｓｐ I）、
（ＢｓｔＶI：Ｍｓｐ I）、（Ｔｈａ I：Ｈｐａ II）、
（Ａｃｃ II：Ｈｐａ II）、（ＢｓｔＶI：Ｈｐａ I
I）、（Ｒｓａ I：Ｓａｕ３Ａ I）、（Ｒｓａ I：Ｍｏ
ｂ I）、（Ｈａｅ III：ＨｉｎＰ１ I）、（ＨａｅII
I：ＳｃｉＮ I）、（Ｐａｌ I：ＨｉｎＰ１ I）および
（Ｐａｌ I：ＳｃｉＮI）からなる群から選択されると
よい。本発明のさらなる好ましい態様においては、前記
オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列をＲ
１、前記選別塩基配列をＲ２で表わし、Ｎ１、Ｎ２、ｎ
１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかの塩基とし、
Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが相補的な塩基であると
き、前記第１プライマーセットのプライマーの塩基配列
が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ２により表わ
され、前記第２プライマーセットのプライマーの塩基配
列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１ｎ１ｎ２ｎ１−Ｒ２により表
わされる。前記第１プライマーセットのプライマーの塩
基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１を認
識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマーセット
のプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１
ｎ１ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２とし、前記
第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組合せを
（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ（Ｅ１：
Ｅ２）が、（Ａｌｕ I：Ｂａｌ II）、（Ａｌｕ I：Ｘ
ｈｏ II）、（Ａｌｕ I：Ｍｆｌ I）、（Ｍｓｐ I：Ｃ
ｆｒ９ I）、（Ｍｓｐ I：Ｘｍａ I）、（Ｍｓｐ I：Ａ
ｒａ I）、（Ｈｐａ II：Ｃｆｒ９ I）、（Ｈｐａ II：
Ｘｍａ I）、（Ｈｐａ II：Ａｒａ I）および（Ｔａｑ
I：Ｘｂａ I）からなる群から選択されるとよい。
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列
をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表わし、Ｎ１、Ｎ
２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかの塩基
とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが相補的な塩基で
あるとき、前記第１プライマーセットのプライマーの塩
基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ２によ
り表わされ、前記第２プライマーセットのプライマーの
塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ２に
より表わされる。前記第１プライマーセットのプライマ
ーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ
１を認識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマー
セットのプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ
２ｎ２Ｎ２ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２と
し、前記第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組
合せを（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ
（Ｅ１：Ｅ２）が、（ＴｓｐＥ I：Ｓｓｐ I）、（Ｍａ
ｅ II：Ｍｌｕ I）、（Ｍａｅ II：Ａｆｌ III）、（Ａ
ｌｕ I：Ｅｃｏ４７ III）、（Ｎｌａ III：Ｎｄｅ
I）、（Ｍｓｐ I：Ｄｓａ I）、（Ｍｓｐ I：ＮｓｐＢ
II）、（Ｈｐａ II：Ｄｓａ I）、（Ｈｐａ II：Ｎｓｐ
Ｂ II）、（Ｓａｕ３Ａ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｍｏｂ
I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｄｐｎ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｈａ
ｅ III：Ｂａｎ I)、（Ｈａｅ III：Ｎａｒ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ａｃｙ I)、（Ｈａｅ III：Ｂｂｉ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ｈｉｎｌ I)、（Ｐａｌ I：Ｂａｎ I)、（Ｐａ
ｌ I：：Ｎａｒ I)、（Ｐａｌ I：Ａｃｙ I)、（Ｐａｌ
I：Ｂｂｉ I)、（Ｐａｌ I：Ｈｉｎｌ I)、（Ｒｓａ
I：Ａｃｃ I)および（Ｔａｑ I：，Ｎｌｕ I) からなる
群から選択されるとよい。また、本発明の別の好ましい
態様においては、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表
わし、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣの
いずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが
相補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットの
プライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ
２により表わされ、前記第２プライマーセットのプライ
マーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ１−Ｒ２によ
り表わされる。前記第１プライマーセットのプライマー
の塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１を認識す
る第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマーセットのプ
ライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ１
を認識する第２制限酵素をＥ２とし、前記第１制限酵素
Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組合せを（Ｅ１：Ｅ２）
により表わすとき、前記組合せ（Ｅ１：Ｅ２）が、（Ａ
ｌｕ I：Ｍａｅ II ）、（Ｍａｅ I：Ｎｌａ III）、
（Ｔｈａ I：Ｍｓｐ I）、（Ａｃｃ II：Ｍｓｐ I）、
（ＢｓｔＶI：Ｍｓｐ I）、（Ｔｈａ I：Ｈｐａ II）、
（Ａｃｃ II：Ｈｐａ II）、（ＢｓｔＶI：Ｈｐａ I
I）、（Ｒｓａ I：Ｓａｕ３Ａ I）、（Ｒｓａ I：Ｍｏ
ｂ I）、（Ｈａｅ III：ＨｉｎＰ１ I）、（ＨａｅII
I：ＳｃｉＮ I）、（Ｐａｌ I：ＨｉｎＰ１ I）および
（Ｐａｌ I：ＳｃｉＮI）からなる群から選択されると
よい。本発明のさらなる好ましい態様においては、前記
オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列をＲ
１、前記選別塩基配列をＲ２で表わし、Ｎ１、Ｎ２、ｎ
１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかの塩基とし、
Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが相補的な塩基であると
き、前記第１プライマーセットのプライマーの塩基配列
が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ２により表わ
され、前記第２プライマーセットのプライマーの塩基配
列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１ｎ１ｎ２ｎ１−Ｒ２により表
わされる。前記第１プライマーセットのプライマーの塩
基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１を認
識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマーセット
のプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１
ｎ１ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２とし、前記
第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組合せを
（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ（Ｅ１：
Ｅ２）が、（Ａｌｕ I：Ｂａｌ II）、（Ａｌｕ I：Ｘ
ｈｏ II）、（Ａｌｕ I：Ｍｆｌ I）、（Ｍｓｐ I：Ｃ
ｆｒ９ I）、（Ｍｓｐ I：Ｘｍａ I）、（Ｍｓｐ I：Ａ
ｒａ I）、（Ｈｐａ II：Ｃｆｒ９ I）、（Ｈｐａ II：
Ｘｍａ I）、（Ｈｐａ II：Ａｒａ I）および（Ｔａｑ
I：Ｘｂａ I）からなる群から選択されるとよい。
【００１６】本発明は、また、上記のプライマーセット
を含む、ＤＮＡ試料を調製するための試薬を提供する。
この試薬は、上記のプライマーセットの他、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、基質となるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰおよび上記制限酵素Ｅ１とＥ２の組み合
わせなどを含んでもよい。本発明は、さらに、上記の試
薬を含む、ＤＮＡ試料を調製するための試薬キットを提
供する。この試薬キットにおいて、試薬を構成する要素
は、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまとめにし
て、バイアル, チューブなどのような容器に包含されて
いてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめにして
納めるための区画化された担持手段に納められていても
よい。
を含む、ＤＮＡ試料を調製するための試薬を提供する。
この試薬は、上記のプライマーセットの他、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、基質となるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰおよび上記制限酵素Ｅ１とＥ２の組み合
わせなどを含んでもよい。本発明は、さらに、上記の試
薬を含む、ＤＮＡ試料を調製するための試薬キットを提
供する。この試薬キットにおいて、試薬を構成する要素
は、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまとめにし
て、バイアル, チューブなどのような容器に包含されて
いてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめにして
納めるための区画化された担持手段に納められていても
よい。
【００１７】上記のようなプライマーセット、試薬およ
び試薬キットは、本発明のＤＮＡ試料調製法やＤＮＡの
塩基配列決定法に用いることができる。さらにまた、本
発明は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法であって、以
下の工程： (a) 制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮＡ断
片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片に第１オリゴヌクレ
オチドを付加する工程、(c) 前記第１オリゴヌクレオチ
ドを付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、少なくとも一対の
プライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から特定の断片を
選別して増幅する工程、ここで、該プライマー対の各プ
ライマーは、前記第１オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列および前記制限酵素が認識する塩基配
列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記ＤＮＡ断片
から特定の断片を選別して増幅するための選別塩基配列
を３’末端に持つ(d) 前記の増幅されたＤＮＡ断片を前
記制限酵素で切断する工程、(e) 前記の切断されたＤＮ
Ａ断片の３’末端に第２オリゴヌクレオチドを付加する
工程、および(f) まず前記第２オリゴヌクレオチドを付
加したＤＮＡ断片の一方の鎖を鋳型とし、次いで断片化
していない前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖を鋳型とし、少
なくとも一種のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片の
一方の鎖の塩基配列決定を行う工程、ここで、該プライ
マーは、前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補
的な塩基配列および前記制限酵素が認識する塩基配列に
相補的な塩基配列を含み、さらに、前記選別塩基配列を
３’末端に持つを含む、前記の方法を提供する。制限酵
素としては、NlaIII、Sau3AI、AluIなどいかなるものも
原則的に使用可能である。第１および第２オリゴヌクレ
オチドは、塩基数６〜１００、好ましくは塩基数１０〜
４８の配列が既知のものであるとよく、第１オリゴヌク
レオチドとしては、例えば、制限酵素がNlaIIIである場
合には、5'-pACTGGCCGTCGTTT-3' （配列番号１）あるい
は5'-pCCCTATAGTGAGTC-3' （配列番号２）などを例示す
ることできる。第２オリゴヌクレオチドは、ターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでポリＡ、
ポリＣ、ポリＧ、ポリＴのいずれか、好ましくはポリＡ
あるいはポリＴを付加したものを例示することができ
る。
び試薬キットは、本発明のＤＮＡ試料調製法やＤＮＡの
塩基配列決定法に用いることができる。さらにまた、本
発明は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法であって、以
下の工程： (a) 制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮＡ断
片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片に第１オリゴヌクレ
オチドを付加する工程、(c) 前記第１オリゴヌクレオチ
ドを付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、少なくとも一対の
プライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から特定の断片を
選別して増幅する工程、ここで、該プライマー対の各プ
ライマーは、前記第１オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列および前記制限酵素が認識する塩基配
列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記ＤＮＡ断片
から特定の断片を選別して増幅するための選別塩基配列
を３’末端に持つ(d) 前記の増幅されたＤＮＡ断片を前
記制限酵素で切断する工程、(e) 前記の切断されたＤＮ
Ａ断片の３’末端に第２オリゴヌクレオチドを付加する
工程、および(f) まず前記第２オリゴヌクレオチドを付
加したＤＮＡ断片の一方の鎖を鋳型とし、次いで断片化
していない前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖を鋳型とし、少
なくとも一種のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片の
一方の鎖の塩基配列決定を行う工程、ここで、該プライ
マーは、前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補
的な塩基配列および前記制限酵素が認識する塩基配列に
相補的な塩基配列を含み、さらに、前記選別塩基配列を
３’末端に持つを含む、前記の方法を提供する。制限酵
素としては、NlaIII、Sau3AI、AluIなどいかなるものも
原則的に使用可能である。第１および第２オリゴヌクレ
オチドは、塩基数６〜１００、好ましくは塩基数１０〜
４８の配列が既知のものであるとよく、第１オリゴヌク
レオチドとしては、例えば、制限酵素がNlaIIIである場
合には、5'-pACTGGCCGTCGTTT-3' （配列番号１）あるい
は5'-pCCCTATAGTGAGTC-3' （配列番号２）などを例示す
ることできる。第２オリゴヌクレオチドは、ターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでポリＡ、
ポリＣ、ポリＧ、ポリＴのいずれか、好ましくはポリＡ
あるいはポリＴを付加したものを例示することができ
る。
【００１８】
【作用】本発明の第1の方法では、生成したPCR産物の片
側を元の制限酵素（第１制限酵素）あるいは改変部配列
を認識して切断する酵素（第２制限酵素）を用いて切断
し、片側の3'末端には余分の配列がなく切断前のDNAと
同じあるいは相補な配列のDNAを作製し、これをプライ
マーとして用いて元のDNAの配列決定をすることができ
る。もちろん、断片化されたDNAの末端に結合したオリ
ゴマー部のうち、上記再切断プロセスで残存したオリゴ
マー（3'末端側）をプライミングサイトとして蛍光標識
プライマーを用いてサイクルシーケンシングすることで
DNA断片とそれに続く元のDNAの配列を知ることができ
る。切断に用いる酵素を改変配列を認識して切断する酵
素に換えて同様の操作を行なえば、相補配列について同
様に配列決定できる。
側を元の制限酵素（第１制限酵素）あるいは改変部配列
を認識して切断する酵素（第２制限酵素）を用いて切断
し、片側の3'末端には余分の配列がなく切断前のDNAと
同じあるいは相補な配列のDNAを作製し、これをプライ
マーとして用いて元のDNAの配列決定をすることができ
る。もちろん、断片化されたDNAの末端に結合したオリ
ゴマー部のうち、上記再切断プロセスで残存したオリゴ
マー（3'末端側）をプライミングサイトとして蛍光標識
プライマーを用いてサイクルシーケンシングすることで
DNA断片とそれに続く元のDNAの配列を知ることができ
る。切断に用いる酵素を改変配列を認識して切断する酵
素に換えて同様の操作を行なえば、相補配列について同
様に配列決定できる。
【００１９】本発明の第2の方法では、選択配列を持つ2
つのプライマーでDNA断片のコピー数の増幅が行なわれ
る。制限酵素で切断することで、余分な配列を除去した
DNA断片を多量に得ることができる。次いで3'末端にオ
リゴマー、例えばポリA鎖を適当な酵素、例えばTermina
l nucleotidyl Transferaseを用いて付加する。ポリT鎖
および制限酵素認識配列に相補な配列を含み、さらに、
選別配列を3'末端に持つプライマーを用い、上記DNA断
片と切断前のDNAを鋳型としてサイクルシーケンスを行
ない、DNA断片とそれに続く元のDNAの配列を知ることが
できる。
つのプライマーでDNA断片のコピー数の増幅が行なわれ
る。制限酵素で切断することで、余分な配列を除去した
DNA断片を多量に得ることができる。次いで3'末端にオ
リゴマー、例えばポリA鎖を適当な酵素、例えばTermina
l nucleotidyl Transferaseを用いて付加する。ポリT鎖
および制限酵素認識配列に相補な配列を含み、さらに、
選別配列を3'末端に持つプライマーを用い、上記DNA断
片と切断前のDNAを鋳型としてサイクルシーケンスを行
ない、DNA断片とそれに続く元のDNAの配列を知ることが
できる。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を図面に従って説明
する。図１は、DNAを4塩基認識酵素Nla IIIを用いて切
断し、生成した断片の塩基配列およびそのつながりを効
率良く決めることができる本発明の第１の方法の一態様
の概要のフローを示す。解析しようとするDNA断片（数K
b〜10Kb）1を含む溶液の一部を分注し、含まれるDNAを
制限酵素Nla IIIで切断する。Nla IIIは-CATG-を認識
し、-CATG 3'の断片を生成する。用いる制限酵素はTspE
I, Mae II, AluI, Msp I, Hpa II, NspB II, Sau3A I,
Mbo I, Dpn I, Hae III, Pal I, Rsa I,Taq I等、何で
も良いが切断部位が頻度高く現われる4塩基認識酵素が
良い。切断部の少なくとも3'末端に既知配列を結合す
る。2はライゲーション結合したオリゴマーの様子を示
したもので、Xおよびxは配列決定しようとするDNAを構
成するヌクレオチドである。この配列は個々のフラグメ
ントで異なる配列を持っており、ほとんどのフラグメン
トは制限酵素切断部に続く両端の数塩基の配列がフラグ
メント毎に異なる。そこで、既知配列のオリゴマーを結
合した部分2および制限酵素切断部3と相補的な配列を持
ち、3'末端1〜4塩基がすべての組み合わせの配列4を持
つ一組のプライマー（第1のプライマーセット）5を用意
する。この中から各フラグメントと末端が完全にハイブ
リダイズするプライマー2種を選びPCR増幅することで特
定のDNAフラグメント、例えば第2の断片だけを抜き出す
ことができる。まず16種のプライマーの各々を用いて伸
長反応を行い、伸長するプライマーを選択する。選択部
分の配列が2塩基のプライマーがハイブリダイズし、伸
長した例をそれぞれ6, 7に示した。長いDNAをNla IIIで
切断して得られるDNA断片の切断部に隣接する配列と断
片の長さを知るには10のように蛍光標識された上記プラ
イマーのセットを用いて相補鎖合成産物の電気泳動パタ
ーンを得る。選択配列部分が2塩基の16種のプライマー
を用いて、未知DNAの切断片を分析した例を図2に示す。
2本鎖DNAなので、同じ長さのDNAが2ヵ所に現われる。こ
れからPCRに用いるプライマーを決定することができ
る。例えば長さ約440bの断片を増幅するには末端がACお
よびTCのプライマーを用いる。PCRの結果生成する断片
の両端はNla III切断部を持つものであり、制限酵素で
再度切断しても、片側にプライミングサイトを持ち、反
対側の端が元の長いDNAの配列と同じあるいは相補な断
片を得ることはできない。そこで、図3に示したプライ
マーセット（第2のプライマーセット）8を用意する。こ
のプライマーは3'末端から6塩基目が9のようにCからTに
変化し、6塩基認識制限酵素Nde Iの認識配列１４になる
ように工夫してある。Nde Iは5' -CA↓TATG- 3'を認識
し、↓部で切断する酵素である。Nde Iは6塩基認識酵素
であり、4塩基認識酵素の切断片中に切断部が現われる
確率は小さい。また仮に現われても以下に説明する通り
支障はない。
する。図１は、DNAを4塩基認識酵素Nla IIIを用いて切
断し、生成した断片の塩基配列およびそのつながりを効
率良く決めることができる本発明の第１の方法の一態様
の概要のフローを示す。解析しようとするDNA断片（数K
b〜10Kb）1を含む溶液の一部を分注し、含まれるDNAを
制限酵素Nla IIIで切断する。Nla IIIは-CATG-を認識
し、-CATG 3'の断片を生成する。用いる制限酵素はTspE
I, Mae II, AluI, Msp I, Hpa II, NspB II, Sau3A I,
Mbo I, Dpn I, Hae III, Pal I, Rsa I,Taq I等、何で
も良いが切断部位が頻度高く現われる4塩基認識酵素が
良い。切断部の少なくとも3'末端に既知配列を結合す
る。2はライゲーション結合したオリゴマーの様子を示
したもので、Xおよびxは配列決定しようとするDNAを構
成するヌクレオチドである。この配列は個々のフラグメ
ントで異なる配列を持っており、ほとんどのフラグメン
トは制限酵素切断部に続く両端の数塩基の配列がフラグ
メント毎に異なる。そこで、既知配列のオリゴマーを結
合した部分2および制限酵素切断部3と相補的な配列を持
ち、3'末端1〜4塩基がすべての組み合わせの配列4を持
つ一組のプライマー（第1のプライマーセット）5を用意
する。この中から各フラグメントと末端が完全にハイブ
リダイズするプライマー2種を選びPCR増幅することで特
定のDNAフラグメント、例えば第2の断片だけを抜き出す
ことができる。まず16種のプライマーの各々を用いて伸
長反応を行い、伸長するプライマーを選択する。選択部
分の配列が2塩基のプライマーがハイブリダイズし、伸
長した例をそれぞれ6, 7に示した。長いDNAをNla IIIで
切断して得られるDNA断片の切断部に隣接する配列と断
片の長さを知るには10のように蛍光標識された上記プラ
イマーのセットを用いて相補鎖合成産物の電気泳動パタ
ーンを得る。選択配列部分が2塩基の16種のプライマー
を用いて、未知DNAの切断片を分析した例を図2に示す。
2本鎖DNAなので、同じ長さのDNAが2ヵ所に現われる。こ
れからPCRに用いるプライマーを決定することができ
る。例えば長さ約440bの断片を増幅するには末端がACお
よびTCのプライマーを用いる。PCRの結果生成する断片
の両端はNla III切断部を持つものであり、制限酵素で
再度切断しても、片側にプライミングサイトを持ち、反
対側の端が元の長いDNAの配列と同じあるいは相補な断
片を得ることはできない。そこで、図3に示したプライ
マーセット（第2のプライマーセット）8を用意する。こ
のプライマーは3'末端から6塩基目が9のようにCからTに
変化し、6塩基認識制限酵素Nde Iの認識配列１４になる
ように工夫してある。Nde Iは5' -CA↓TATG- 3'を認識
し、↓部で切断する酵素である。Nde Iは6塩基認識酵素
であり、4塩基認識酵素の切断片中に切断部が現われる
確率は小さい。また仮に現われても以下に説明する通り
支障はない。
【００２１】さて、第1のプライマーセット5および第2
のプライマーセット8からそれぞれ1ヶづつ、例えばプラ
イマー対11を選びPCR増幅すると今度は両端に異なる切
断部を持つDNA断片12を得ることができる。第2のプライ
マーセットに属するプライマーは3'末端から6塩基目に
ミスマッチ（図３の９）があるが相補鎖合成には支障が
ない。こうして生成したDNA断片12はNla III の切断部1
3 およびNde I の切断部14をそれぞれ末端に持つ。この
ような1塩基置換により、他の酵素による認識配列とす
ることはNla III以外でも可能であり、図４〜６にまと
めた。例えば、Alu I（5' -AGCT- 3'）のAをCで置換
し、Eco47 III（5' -AGCGCT- 3'）の認識配列とした
り、Mae IIの認識配列をMlu Iにするなどである。もち
ろん、DNA断片の端に付加するオリゴマー配列を工夫
し、酵素の6塩基認識配列ができるようにする。
のプライマーセット8からそれぞれ1ヶづつ、例えばプラ
イマー対11を選びPCR増幅すると今度は両端に異なる切
断部を持つDNA断片12を得ることができる。第2のプライ
マーセットに属するプライマーは3'末端から6塩基目に
ミスマッチ（図３の９）があるが相補鎖合成には支障が
ない。こうして生成したDNA断片12はNla III の切断部1
3 およびNde I の切断部14をそれぞれ末端に持つ。この
ような1塩基置換により、他の酵素による認識配列とす
ることはNla III以外でも可能であり、図４〜６にまと
めた。例えば、Alu I（5' -AGCT- 3'）のAをCで置換
し、Eco47 III（5' -AGCGCT- 3'）の認識配列とした
り、Mae IIの認識配列をMlu Iにするなどである。もち
ろん、DNA断片の端に付加するオリゴマー配列を工夫
し、酵素の6塩基認識配列ができるようにする。
【００２２】図３のようにして得られたDNA断片１２をN
la IIIで切断すると、図７のように切断された端が3'末
端のDNA鎖16は元の長いDNA1'に17のようにハイブリダイ
ズし、18のように相補鎖合成可能となる。あるいは切断
された端が5'末端のDNA鎖と元の長いDNA鎖1'を鋳型とし
て、蛍光標識プライマー（セット2のプライマー）を用
いてサイクルシーケンシング反応を行なうことで、DNA
断片配列とそれに続く元のDNAの配列を同時に得ること
ができる。同様にNde Iで切断するとNla III切断部と異
なる末端から20のように配列決定できる。配列決定され
る長さはDNA断片の長さでなく、反応とDNAシーケンサの
能力で決定され、通常500b〜600bである。シーケンシン
グ反応を100bより長いDNA断片について行ない、それら
断片とそれに続くDNA塩基配列を決定する。全体の配列
はDNA断片の配列と続き配列の重なりを調べて容易に決
定できる。続き配列の長さは300b前後であり、隣接する
DNA断片が短く塩基配列決定しない時でも、1つ飛ばした
次のDNA断片の配列と重なるので支障はない。
la IIIで切断すると、図７のように切断された端が3'末
端のDNA鎖16は元の長いDNA1'に17のようにハイブリダイ
ズし、18のように相補鎖合成可能となる。あるいは切断
された端が5'末端のDNA鎖と元の長いDNA鎖1'を鋳型とし
て、蛍光標識プライマー（セット2のプライマー）を用
いてサイクルシーケンシング反応を行なうことで、DNA
断片配列とそれに続く元のDNAの配列を同時に得ること
ができる。同様にNde Iで切断するとNla III切断部と異
なる末端から20のように配列決定できる。配列決定され
る長さはDNA断片の長さでなく、反応とDNAシーケンサの
能力で決定され、通常500b〜600bである。シーケンシン
グ反応を100bより長いDNA断片について行ない、それら
断片とそれに続くDNA塩基配列を決定する。全体の配列
はDNA断片の配列と続き配列の重なりを調べて容易に決
定できる。続き配列の長さは300b前後であり、隣接する
DNA断片が短く塩基配列決定しない時でも、1つ飛ばした
次のDNA断片の配列と重なるので支障はない。
【００２３】このようにDNA断片の両側の制限酵素認識
配列を変化させることで片側だけ切断し、それに続く塩
基配列を簡単に知ることができ、全体配列の効率良い決
定が可能であった。なお、制限酵素Nde Iを用いること
で相補鎖についても同様のことができる。この方法は無
駄が少なく重複度は1.5程度と従来の1/2〜1/3であっ
た。
配列を変化させることで片側だけ切断し、それに続く塩
基配列を簡単に知ることができ、全体配列の効率良い決
定が可能であった。なお、制限酵素Nde Iを用いること
で相補鎖についても同様のことができる。この方法は無
駄が少なく重複度は1.5程度と従来の1/2〜1/3であっ
た。
【００２４】図８に、Nla IIIの認識配列を持つ第1のプ
ライマーセットと末端に1塩基置換した認識配列と選択
配列を持つプライマー（5' T…TCATGXY 3'；プライマー
セット3）を用いる、本発明の第２の方法の一態様の概
要のフローを示す。DNA断片101,101'の両側に第1のオリ
ゴマー102をライゲーションで結合する。前例と同様選
別プライマー毎に相補鎖合成を行ない、そのパターンか
らPCR用プライマーを決めて、100bより長い断片につい
てそれぞれPCR増幅し、PCR産物１０３を得る。プライマ
ーは第1のオリゴマーと制限酵素切断部に相補的で3'末
端に任意の２塩基XYを持つ１６種のプライマーセット１
００より選ぶ。コピー数の増えた各断片を制限酵素Nla
IIIで切断した産物１０４を、エタノール沈殿法を用い
て精製する。次いで各断片の3'末端にポリA鎖を付加す
る。こうして得られたDNA断片１０５を含む液を2分割
し、2本鎖のそれぞれにマッチするプライマーすなわち
ポリT鎖と制限酵素認識配列および3'末端に選択配列を
もつ蛍光標識プライマー１０６（セット3の1つ）を用い
てサイクルシーケンシングする。この時、切断前の長い
DNA１、1'を加えておくのは実施例1と同じである。PCR
産物101由来のシーケンス１０８と長いDNA１、1'由来の
１０９の配列が同時に得られる。以下、本発明を実施例
を参照してより具体的に説明する。本発明の範囲はこれ
らの実施例により限定されるものではない。
ライマーセットと末端に1塩基置換した認識配列と選択
配列を持つプライマー（5' T…TCATGXY 3'；プライマー
セット3）を用いる、本発明の第２の方法の一態様の概
要のフローを示す。DNA断片101,101'の両側に第1のオリ
ゴマー102をライゲーションで結合する。前例と同様選
別プライマー毎に相補鎖合成を行ない、そのパターンか
らPCR用プライマーを決めて、100bより長い断片につい
てそれぞれPCR増幅し、PCR産物１０３を得る。プライマ
ーは第1のオリゴマーと制限酵素切断部に相補的で3'末
端に任意の２塩基XYを持つ１６種のプライマーセット１
００より選ぶ。コピー数の増えた各断片を制限酵素Nla
IIIで切断した産物１０４を、エタノール沈殿法を用い
て精製する。次いで各断片の3'末端にポリA鎖を付加す
る。こうして得られたDNA断片１０５を含む液を2分割
し、2本鎖のそれぞれにマッチするプライマーすなわち
ポリT鎖と制限酵素認識配列および3'末端に選択配列を
もつ蛍光標識プライマー１０６（セット3の1つ）を用い
てサイクルシーケンシングする。この時、切断前の長い
DNA１、1'を加えておくのは実施例1と同じである。PCR
産物101由来のシーケンス１０８と長いDNA１、1'由来の
１０９の配列が同時に得られる。以下、本発明を実施例
を参照してより具体的に説明する。本発明の範囲はこれ
らの実施例により限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】〔実施例１〕モデル試料として8.7 kbのヒト
由来DNAクローンを制限酵素で切断して，３’末端にア
ダプター配列を結合したDNA断片混合物を用いた。この
クローンのベクター配列（5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3（配
列番号５）と5-CAGGAAACAGCTATGAC-3（配列番号６））
を用いてPCR増幅して試料DNAとした。PCR増幅には長いD
NAのPCR用にデザインされたEX-Taq DNAポリメラーゼ
（宝酒造）を利用した。以下に手順を示す。
由来DNAクローンを制限酵素で切断して，３’末端にア
ダプター配列を結合したDNA断片混合物を用いた。この
クローンのベクター配列（5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3（配
列番号５）と5-CAGGAAACAGCTATGAC-3（配列番号６））
を用いてPCR増幅して試料DNAとした。PCR増幅には長いD
NAのPCR用にデザインされたEX-Taq DNAポリメラーゼ
（宝酒造）を利用した。以下に手順を示す。
【００２６】増幅した8.7 kbのDNAを制限酵素 Hsp92II
（NlaIII相当品）で切断し，３’両末端に既知配列アダ
プターをDNAリガーゼで連結した。すなわち0.5 pmolの
切断DNAを10 mM MgCl2，15 mM KClを含む10 mM Tris-H
Cl (pH7.4)溶液に溶解し，４０ユニットのHsp92II（Pro
mega，UK）を加え３７℃６０分間反応させて完全に切断
した。エタノール沈殿でDNAを回収した後，アルカリホ
スファターゼで５’末端のリン酸基を除去した。アダプ
ター5-pACTGGCCGTCGTTT-3（配列番号１）（80pmol)とヘ
ルパーオリゴマー5-AAACGACGGCCAGTCATGp-3（配列番号
７）（32 pmol）を400 fmolの切断DNA断片混合物に添加
し，1400ユニットのT4 DNAリガーゼを用い16℃で16時間
ライゲーション反応を行った。これにより，各DNA断片
の３’末端にのみアダプター配列ACTGGCCGTCGTTTが導入
される。ライゲーション反応はDNAの５’末端のリン酸
基と３’末端のOHとの間を連結する反応である。ここで
示した方法は，ヘルパーオリゴマーの5末端はリン酸基
で修飾されているためアダプター同士のライゲーション
が抑えられる上，DNA断片の５’末端のリン酸基を除去
してあるためDNA断片間の再結合を防止することができ
る。このため確実にアダプターを導入することができ
た。反応後，QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN
GmbH, Hilden Germany）を用いて未反応のアダプターを
除去した後，エタノール沈殿によりアダプターを導入し
た断片群を回収した。
（NlaIII相当品）で切断し，３’両末端に既知配列アダ
プターをDNAリガーゼで連結した。すなわち0.5 pmolの
切断DNAを10 mM MgCl2，15 mM KClを含む10 mM Tris-H
Cl (pH7.4)溶液に溶解し，４０ユニットのHsp92II（Pro
mega，UK）を加え３７℃６０分間反応させて完全に切断
した。エタノール沈殿でDNAを回収した後，アルカリホ
スファターゼで５’末端のリン酸基を除去した。アダプ
ター5-pACTGGCCGTCGTTT-3（配列番号１）（80pmol)とヘ
ルパーオリゴマー5-AAACGACGGCCAGTCATGp-3（配列番号
７）（32 pmol）を400 fmolの切断DNA断片混合物に添加
し，1400ユニットのT4 DNAリガーゼを用い16℃で16時間
ライゲーション反応を行った。これにより，各DNA断片
の３’末端にのみアダプター配列ACTGGCCGTCGTTTが導入
される。ライゲーション反応はDNAの５’末端のリン酸
基と３’末端のOHとの間を連結する反応である。ここで
示した方法は，ヘルパーオリゴマーの5末端はリン酸基
で修飾されているためアダプター同士のライゲーション
が抑えられる上，DNA断片の５’末端のリン酸基を除去
してあるためDNA断片間の再結合を防止することができ
る。このため確実にアダプターを導入することができ
た。反応後，QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN
GmbH, Hilden Germany）を用いて未反応のアダプターを
除去した後，エタノール沈殿によりアダプターを導入し
た断片群を回収した。
【００２７】プライマーはサワデーテクノロジー（東
京）に発注した。選択プライマーセットは３種類用意し
た。配列を次に示す。 5-CGTTGTAAAACGACGGCCAGTCACATGNN-3（配列番号８）第
１のプライマーセット 5-CGTTGTAAAACGACGGCCAGTCATATGNN-3（配列番号９）第
２のプライマーセット セット１は制限酵素Hsp92II（NlaIII）の認識配列CATG
を認識することができる。セット２は３’末端より６塩
基目がCよりTに変化た構造をしている。このためHsp92I
I（NlaIII）は認識しないがＮｄｅ I配列CATATGを認識
する。両者とも未標識のものと，５’末端にアミノ基導
入した形のものを発注しこれをスルフォローダミン１０
１で蛍光標識したものを準備した。スルフォローダミン
１０１の標識法は0.2M炭酸緩衝液中で25 fmolの各アミ
ノ化プライマー１５０μｌに２５mMのスルフォローダミ
ン１０１のジメチルホルムアミド溶液を滴下した後直ち
に撹拌し２時間室温で放置することによった。反応終了
後，エタノール沈殿とセファデックスG25カラムクロマ
トグラフィーで精製して用いた。濃度は１mMで０.5%twe
en 20水溶液として保存した。未標識のものは10 mMの濃
度の同一溶媒で保存した。各プライマーセットのNはA，
C，G，Tのいずれかで，各々のプライマーセットは１６
種類からなる。
京）に発注した。選択プライマーセットは３種類用意し
た。配列を次に示す。 5-CGTTGTAAAACGACGGCCAGTCACATGNN-3（配列番号８）第
１のプライマーセット 5-CGTTGTAAAACGACGGCCAGTCATATGNN-3（配列番号９）第
２のプライマーセット セット１は制限酵素Hsp92II（NlaIII）の認識配列CATG
を認識することができる。セット２は３’末端より６塩
基目がCよりTに変化た構造をしている。このためHsp92I
I（NlaIII）は認識しないがＮｄｅ I配列CATATGを認識
する。両者とも未標識のものと，５’末端にアミノ基導
入した形のものを発注しこれをスルフォローダミン１０
１で蛍光標識したものを準備した。スルフォローダミン
１０１の標識法は0.2M炭酸緩衝液中で25 fmolの各アミ
ノ化プライマー１５０μｌに２５mMのスルフォローダミ
ン１０１のジメチルホルムアミド溶液を滴下した後直ち
に撹拌し２時間室温で放置することによった。反応終了
後，エタノール沈殿とセファデックスG25カラムクロマ
トグラフィーで精製して用いた。濃度は１mMで０.5%twe
en 20水溶液として保存した。未標識のものは10 mMの濃
度の同一溶媒で保存した。各プライマーセットのNはA，
C，G，Tのいずれかで，各々のプライマーセットは１６
種類からなる。
【００２８】プライマーセット１とセット２から各々１
種のプライマーを選び，種々プライマーの組み合わせで
DNA断片群のPCR増幅を行った。DNA断片群（5 fmol） 0.
05μl に２種のプライマー（10 pmol/ml）各々0.5 μl
とファルマシア社のTaq ポリメラーゼ(５ユニット/ μl
，製品番号27-0799）0.075 μl，50 mM KCl，1.5mM Mg
Cl2を含むTris-HCl緩衝液（ pH9.0）2.5 μl，H2O 20
μl を混合した。90℃で２分間変性させた後， dNTP基
質（各2.5 mMのdATP，dCTP， dGTP及びdTTPの混合液）2
μl を添加し，熱サイクル反応をスタートさせた。熱
サイクルは94℃で30秒間（変性），66℃で30秒間（アニ
ール），72℃で60秒間（伸長）を35回繰り返すことを基
本とした。以上の操作で片方の末端近傍にHsp92II（Nla
III）認識配列，他の末端近傍にNde I認識配列を持つPC
R増幅産物を得た。
種のプライマーを選び，種々プライマーの組み合わせで
DNA断片群のPCR増幅を行った。DNA断片群（5 fmol） 0.
05μl に２種のプライマー（10 pmol/ml）各々0.5 μl
とファルマシア社のTaq ポリメラーゼ(５ユニット/ μl
，製品番号27-0799）0.075 μl，50 mM KCl，1.5mM Mg
Cl2を含むTris-HCl緩衝液（ pH9.0）2.5 μl，H2O 20
μl を混合した。90℃で２分間変性させた後， dNTP基
質（各2.5 mMのdATP，dCTP， dGTP及びdTTPの混合液）2
μl を添加し，熱サイクル反応をスタートさせた。熱
サイクルは94℃で30秒間（変性），66℃で30秒間（アニ
ール），72℃で60秒間（伸長）を35回繰り返すことを基
本とした。以上の操作で片方の末端近傍にHsp92II（Nla
III）認識配列，他の末端近傍にNde I認識配列を持つPC
R増幅産物を得た。
【００２９】このようにして得られたPCR増幅産物をエ
タノール沈殿で回収し，７５マイクロリットルのNde I
用緩衝液（酵素に添付のもの）に溶解し，２０ユニット
のNdeIを加えて３７℃で２時間の条件で切断した。 QIA
quick PCR Purification Kit(QIAGEN GmbH, Hilden Ger
many）で切断したプライマー部分を除去した後，エタノ
ール沈殿でPCR断片を回収した。再切断したPCR産物２５
fmol とスルフォローダミン１０１標識したセット１の
プライマー１pmol とThermo Sequenase (RPN 2440, Am
ersham社，UK）に添付されている緩衝液の混合物５μl
を９０℃で２分間変性した後、 dNTP基質（各0.067 mM
のdATP，dCTP， 7-deaza-dGTP及びdTTPの混合液）３μl
を添加し，熱サイクルによる伸長反応を５回行った。
熱サイクルは94℃で30秒間（変性），63℃で30秒間（ア
ニール）であった。次に、キット付属の基質と緩衝液混
合物２μl と未切断の8.7 kbのDNAを添加し、同じサイ
クル条件でさらに２５回反応を行った後、94℃で30秒
間，72℃で30秒間のサイクルを１０回行った。エタノー
ル沈殿後、日立蛍光式DNAシーケンサーSQ-5500で配列決
定した。
タノール沈殿で回収し，７５マイクロリットルのNde I
用緩衝液（酵素に添付のもの）に溶解し，２０ユニット
のNdeIを加えて３７℃で２時間の条件で切断した。 QIA
quick PCR Purification Kit(QIAGEN GmbH, Hilden Ger
many）で切断したプライマー部分を除去した後，エタノ
ール沈殿でPCR断片を回収した。再切断したPCR産物２５
fmol とスルフォローダミン１０１標識したセット１の
プライマー１pmol とThermo Sequenase (RPN 2440, Am
ersham社，UK）に添付されている緩衝液の混合物５μl
を９０℃で２分間変性した後、 dNTP基質（各0.067 mM
のdATP，dCTP， 7-deaza-dGTP及びdTTPの混合液）３μl
を添加し，熱サイクルによる伸長反応を５回行った。
熱サイクルは94℃で30秒間（変性），63℃で30秒間（ア
ニール）であった。次に、キット付属の基質と緩衝液混
合物２μl と未切断の8.7 kbのDNAを添加し、同じサイ
クル条件でさらに２５回反応を行った後、94℃で30秒
間，72℃で30秒間のサイクルを１０回行った。エタノー
ル沈殿後、日立蛍光式DNAシーケンサーSQ-5500で配列決
定した。
【００３０】実際にセット１のTGとセット２のTTプライ
マーで増幅した230塩基長のPCR産物の配列決定を行った
結果を図９に示した。図９の結果は，増幅後，Nde Iで
切断したケースである。配列決定用プライマーはセット
２から末端がTGのプライマーを用いて行った。２3０塩
基のあたりに現われたピーク111はPCR産物の終点を表わ
しており実際にPCRで増幅分離した断片の配列決定がで
きることが確認できた。シーケンシング反応にはテンプ
レートとしてPCR産物と8.7 kbの元の長いままのDNAを混
合して用いた。このため、 PCR産物の末端まで伸長した
相補鎖の一部は再度8.7 kbのDNAにはハイブリダイズし
て伸長を続けることができた。このために、図９では２
３０塩基のPCR産物の下流、すなわち隣の断片領域の２
００塩基程度の配列が同時に得られた。このことは、断
片の配列決定と同時に各断片間のつながりを同時に知る
ことができることを示している。このように選択PCRを
用いる断片抽出と配列決定の手法では、わずか３２種の
プライマーセットを予め用意しておくことで、広い範囲
のDNAからいろいろな部分の領域を抽出して配列決定で
きる利点がある。同様に， PCR増幅産物を同様に２０ユ
ニットのNlaIIIで切断すると今度はNde Iとは反対側の
プライマー配列が除去できる。同様な操作で切断したプ
ライマー部分を除去した後，今度はセット２のプライマ
ーで配列決定をおこなったところ，同様にPCR増幅断片
の隣の断片領域の配列が同時に得られた。
マーで増幅した230塩基長のPCR産物の配列決定を行った
結果を図９に示した。図９の結果は，増幅後，Nde Iで
切断したケースである。配列決定用プライマーはセット
２から末端がTGのプライマーを用いて行った。２3０塩
基のあたりに現われたピーク111はPCR産物の終点を表わ
しており実際にPCRで増幅分離した断片の配列決定がで
きることが確認できた。シーケンシング反応にはテンプ
レートとしてPCR産物と8.7 kbの元の長いままのDNAを混
合して用いた。このため、 PCR産物の末端まで伸長した
相補鎖の一部は再度8.7 kbのDNAにはハイブリダイズし
て伸長を続けることができた。このために、図９では２
３０塩基のPCR産物の下流、すなわち隣の断片領域の２
００塩基程度の配列が同時に得られた。このことは、断
片の配列決定と同時に各断片間のつながりを同時に知る
ことができることを示している。このように選択PCRを
用いる断片抽出と配列決定の手法では、わずか３２種の
プライマーセットを予め用意しておくことで、広い範囲
のDNAからいろいろな部分の領域を抽出して配列決定で
きる利点がある。同様に， PCR増幅産物を同様に２０ユ
ニットのNlaIIIで切断すると今度はNde Iとは反対側の
プライマー配列が除去できる。同様な操作で切断したプ
ライマー部分を除去した後，今度はセット２のプライマ
ーで配列決定をおこなったところ，同様にPCR増幅断片
の隣の断片領域の配列が同時に得られた。
【００３１】〔実施例２〕本発明の他の実施例について
述べる。本実施例では実施例１に加え次のプライマーを
合成し用いた。 5'*TGTGGTTTTTTTTTTTTTTTCATGNN 3'（配列番号１０）
（全１６種）セット３ N；A，C，G，Tのいずれか任意の塩基 * :スルホローダミン101 蛍光体 実施例１と同様に、8.7 kbのDNAをHsp92II (NlaIII)で
切断後、既知配列アダプターをDNAリガーゼで連結し
た。次にPCR増幅を行うが，ここではセット１から各組
のプライマーを選んだ。反応条件等は実施例１にしたが
った。実際にTGとＴＴのプライマーで増幅した産物を，
再度Ｈｓｐ９２ＩＩ（Nla III）で切断した。よってこ
の実施例では両端のプライマー配列が除去される。次
に，３‘末端に既知アダプターとしてポリAを導入し
た。この手順は，１pmolの再切断PCR産物に４ nmol ATP
と12.5ユニットのターミナルヌクレオチジルトランス
フェラーゼを加え，1 mMCoCl2 ，0.5 mM MgCl2 ，0.5 m
M２-メルカプトエタノールを含む 100 mM カコジルナト
リウム酸緩衝液（pH 7.2）の溶液 40 μl 中で３７℃３
０分間反応させた。エタノール沈殿でDNAを回収し，50
fmol/μl の濃度にして-20 ℃で保存した。これによ
り，３’末端にのみポリAが付加したPCR産物が得られ
た。
述べる。本実施例では実施例１に加え次のプライマーを
合成し用いた。 5'*TGTGGTTTTTTTTTTTTTTTCATGNN 3'（配列番号１０）
（全１６種）セット３ N；A，C，G，Tのいずれか任意の塩基 * :スルホローダミン101 蛍光体 実施例１と同様に、8.7 kbのDNAをHsp92II (NlaIII)で
切断後、既知配列アダプターをDNAリガーゼで連結し
た。次にPCR増幅を行うが，ここではセット１から各組
のプライマーを選んだ。反応条件等は実施例１にしたが
った。実際にTGとＴＴのプライマーで増幅した産物を，
再度Ｈｓｐ９２ＩＩ（Nla III）で切断した。よってこ
の実施例では両端のプライマー配列が除去される。次
に，３‘末端に既知アダプターとしてポリAを導入し
た。この手順は，１pmolの再切断PCR産物に４ nmol ATP
と12.5ユニットのターミナルヌクレオチジルトランス
フェラーゼを加え，1 mMCoCl2 ，0.5 mM MgCl2 ，0.5 m
M２-メルカプトエタノールを含む 100 mM カコジルナト
リウム酸緩衝液（pH 7.2）の溶液 40 μl 中で３７℃３
０分間反応させた。エタノール沈殿でDNAを回収し，50
fmol/μl の濃度にして-20 ℃で保存した。これによ
り，３’末端にのみポリAが付加したPCR産物が得られ
た。
【００３２】次に配列決定を行った。約50 fmol のポリ
A付加PCR産物に1 pmol/μlのセット３の蛍光標識TTプラ
イマー２μl ，dNTP 4μl ，75 mM MgCl2 を含む250 mM
Tris-HCl (pH9.5)緩衝液２μl を添加し，全体を14μl
とする。3.5 μl ずつ4本に分注し，各々に2 u /μl
のΔTaq DNAポリメラーゼ 0.5μl を添加する。94℃ 30
秒間，64℃ 30秒間，72℃ 60秒間のサーマルサイクルを
５回繰り返し，DNA断片の３’末端までプライマーが伸
長した断片を多量に作成した。次に，この反応液にジデ
オキシヌクレオチド（ddNTP）とデオキシヌクレオチド
の混合液を4.5 μl添加した。94℃ 30秒間，64℃ 30秒
間，72℃ 60秒間のサーマルサイクルを30回繰り返した
後，エタノール沈殿を行い反応生成物を回収し，蛍光式
DNAシーケンサ（日立SQ5500）で計測して塩基配列決定
を行った。その結果，図９と同様な結果を得ることがで
きた。
A付加PCR産物に1 pmol/μlのセット３の蛍光標識TTプラ
イマー２μl ，dNTP 4μl ，75 mM MgCl2 を含む250 mM
Tris-HCl (pH9.5)緩衝液２μl を添加し，全体を14μl
とする。3.5 μl ずつ4本に分注し，各々に2 u /μl
のΔTaq DNAポリメラーゼ 0.5μl を添加する。94℃ 30
秒間，64℃ 30秒間，72℃ 60秒間のサーマルサイクルを
５回繰り返し，DNA断片の３’末端までプライマーが伸
長した断片を多量に作成した。次に，この反応液にジデ
オキシヌクレオチド（ddNTP）とデオキシヌクレオチド
の混合液を4.5 μl添加した。94℃ 30秒間，64℃ 30秒
間，72℃ 60秒間のサーマルサイクルを30回繰り返した
後，エタノール沈殿を行い反応生成物を回収し，蛍光式
DNAシーケンサ（日立SQ5500）で計測して塩基配列決定
を行った。その結果，図９と同様な結果を得ることがで
きた。
【００３３】
【発明の効果】DNA増幅断片の両端を別々に認識し，片
方の末端のプライマー結合部のみを除去することができ
るようになった。 DNA増幅断片の両端に導入されたプラ
イマー結合部位の片方を除去したPCR切断断片と、もと
の長いDNAをテンプレートとしてプライマー結合部から
配列決定することで、PCR断片とその下流の配列を同時
に配列決定できる。これにより制限酵素断片の混合物か
らPCRで増幅分離した各々の断片の前後関係が容易にわ
かるので，長いDNAの配列決定が簡単に行えるようにな
った。第１のプライマーセットと第２のプライマーセッ
トを用いてＰＣＲ増幅を行なうと、ＤＮＡ配列決定以外
にも、ＤＮＡ増幅断片の両端を別々の制限酵素切断部に
かえることができる利点がある。このため、ＤＮＡ増幅
断片の両端のプライマー結合部を除去すれば、ベクター
等に組み込む場合に断片の方向性をもたせることの利点
があるため、一般的な試料調製においても有効な手段で
ある。
方の末端のプライマー結合部のみを除去することができ
るようになった。 DNA増幅断片の両端に導入されたプラ
イマー結合部位の片方を除去したPCR切断断片と、もと
の長いDNAをテンプレートとしてプライマー結合部から
配列決定することで、PCR断片とその下流の配列を同時
に配列決定できる。これにより制限酵素断片の混合物か
らPCRで増幅分離した各々の断片の前後関係が容易にわ
かるので，長いDNAの配列決定が簡単に行えるようにな
った。第１のプライマーセットと第２のプライマーセッ
トを用いてＰＣＲ増幅を行なうと、ＤＮＡ配列決定以外
にも、ＤＮＡ増幅断片の両端を別々の制限酵素切断部に
かえることができる利点がある。このため、ＤＮＡ増幅
断片の両端のプライマー結合部を除去すれば、ベクター
等に組み込む場合に断片の方向性をもたせることの利点
があるため、一般的な試料調製においても有効な手段で
ある。
【００３４】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACTGGCCGTC GTTT 14
【００３５】 配列番号：２ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCCTATAGTG AGTC 14
【００３６】 配列番号：３ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCACTGCC GTCGTTT 17
【００３７】 配列番号：４ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCCCCTAT AGTGAGTC 18
【００３８】 配列番号：５ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TGTAAAACGA CGGCCAGT 18
【００３９】 配列番号：６ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17
【００４０】 配列番号：７ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAACGACGGC CAGTCATG 18
【００４１】 配列番号：８ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGTTGTAAAA CGACGGCCAG TCACATGNN 29
【００４２】 配列番号：９ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡ ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ ＴＣＡＴＡＴＧＮＮ
２９
２９
【００４３】 配列番号：１０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TGTGGTTTTT TTTTTTTTTT CATGNN 26
【図１】図１は、本発明の第１の方法の概要のフローの
一部を示す。
一部を示す。
【図２】図２は、選択塩基配列が２塩基の１６種のプラ
イマーを用いて、未知ＤＮＡの切断片を分析した結果を
示す。
イマーを用いて、未知ＤＮＡの切断片を分析した結果を
示す。
【図３】図３は、本発明の第１の方法において、第１の
プライマーセットおよび第２のプライマーセットからそ
れぞれ選択される１対のプライマーを用いて PCR増幅す
る手順を示す。
プライマーセットおよび第２のプライマーセットからそ
れぞれ選択される１対のプライマーを用いて PCR増幅す
る手順を示す。
【図４】図４は、本発明の第１の方法において利用でき
る２種の制限酵素の組み合わせの一例を示す。
る２種の制限酵素の組み合わせの一例を示す。
【図５】図５は、本発明の第１の方法において利用でき
る２種の制限酵素の組み合わせの一例を示す。
る２種の制限酵素の組み合わせの一例を示す。
【図６】図６は、本発明の第１の方法において利用でき
る２種の制限酵素の組み合わせの一例を示す。
る２種の制限酵素の組み合わせの一例を示す。
【図７】図７は、本発明の第１の方法の概要のフローの
一部を示す。
一部を示す。
【図８】図８は、本発明の第２の方法の概要のフローを
示す。
示す。
【図９】図９は、本発明の第１の方法を用いた実施例の
結果を示す。
結果を示す。
1, 1', 1"…試料DNA，2, 102…ライゲーションで結合し
た既知オリゴマー，3,112…制限酵素認識部，4, 114…
任意の塩基部分，5…第1のプライマーセット，6…選択
したプライマー，7…伸長部分，8…第2のプライマーセ
ット，9…1塩基変化部分，10, 120…蛍光標識，11…選
択したプライマー対，12,103…PCR増幅した断片，13…N
la III断片部，14…Nde I切断部，16…一方の3'末端をN
la III切断した増幅断片，19…Nde I切断した増幅断
片，17, 21…ハイブリダイズした模様，18, 20, 108,10
9…相補鎖合成および配列決定部分, 100…プライマーセ
ット,101…DNA断片, 104 …制限酵素で再切断したPCR産
物,105…ポリA付加したPCR増幅断片,106…第３のプライ
マー, 111…PCRの終点由来のピーク、116…選択したプ
ライマー対
た既知オリゴマー，3,112…制限酵素認識部，4, 114…
任意の塩基部分，5…第1のプライマーセット，6…選択
したプライマー，7…伸長部分，8…第2のプライマーセ
ット，9…1塩基変化部分，10, 120…蛍光標識，11…選
択したプライマー対，12,103…PCR増幅した断片，13…N
la III断片部，14…Nde I切断部，16…一方の3'末端をN
la III切断した増幅断片，19…Nde I切断した増幅断
片，17, 21…ハイブリダイズした模様，18, 20, 108,10
9…相補鎖合成および配列決定部分, 100…プライマーセ
ット,101…DNA断片, 104 …制限酵素で再切断したPCR産
物,105…ポリA付加したPCR増幅断片,106…第３のプライ
マー, 111…PCRの終点由来のピーク、116…選択したプ
ライマー対
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神原 秀記 東京都国分寺市東恋ヶ窪一丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 ティム シー．リチャードソン イギリス国，エイチピー７ ９エルエル, バッキンガムシェア，アマシャム，ホワイ ト ライオン ロード，アマシャム ラボ ラトリーズ内 (72)発明者 マイケル エー．リーヴ イギリス国，エイチピー７ ９エルエル, バッキンガムシェア，アマシャム，ホワイ ト ライオン ロード，アマシャム ラボ ラトリーズ内
Claims (25)
- 【請求項１】 ＤＮＡ試料を調製する方法であって、以
下の工程： (a) 第１制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮ
Ａ断片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片にオリゴヌクレ
オチドを付加する工程、および(c) 前記オリゴヌクレオ
チドを付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、第１プライマー
セットから選択される第１プライマーおよび第２プライ
マーセットから選択される第２プライマーからなる少な
くとも一対のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から
特定の断片を選別して増幅する工程を含み、ここで、前
記第１プライマーセットは、前記オリゴヌクレオチドの
塩基配列に相補的な塩基配列および前記第１制限酵素が
認識する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、
前記ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅するため
の選別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライマーから
構成され、前記第２プライマーセットは、前記オリゴヌ
クレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列および第２制
限酵素が認識する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、
さらに、前記ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅
するための選別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライ
マーから構成され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵
素が認識する塩基配列とは異なる塩基配列を認識する、
前記の方法。 - 【請求項２】 前記第２制限酵素は前記第１制限酵素が
認識する塩基配列とは１塩基または２塩基異なる塩基配
列を含む部位を認識する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記選別塩基配列が１塩基〜４塩基長で
ある請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記第２制限酵素が認識する塩基配列の
長さが、前記第１制限酵素が認識する塩基配列の長さよ
りも長い請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相
補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表わ
し、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣのい
ずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが相
補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットのプ
ライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ
１−Ｒ２により表わされ、前記第２プライマーセットの
プライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２Ｎ２ｎ２
ｎ１−Ｒ２により表わされる請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 前記第１プライマーセットのプライマー
の塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１
を認識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマーセ
ットのプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２
ｎ２Ｎ２ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２とし、
前記第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組合せ
を（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ（Ｅ
１：Ｅ２）が、（ＴｓｐＥ I：Ｓｓｐ I）、（Ｍａｅ I
I：Ｍｌｕ I）、（Ｍａｅ II：Ａｆｌ III）、（Ａｌｕ
I：Ｅｃｏ４７ III）、（Ｎｌａ III：Ｎｄｅ I）、
（Ｍｓｐ I：Ｄｓａ I）、（Ｍｓｐ I：ＮｓｐＢ I
I）、（Ｈｐａ II：Ｄｓａ I）、（Ｈｐａ II：Ｎｓｐ
Ｂ II）、（Ｓａｕ３Ａ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｍｏｂ
I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｄｐｎ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｈａ
ｅ III：Ｂａｎ I)、（ＨａｅIII：Ｎａｒ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ａｃｙ I)、（Ｈａｅ III：Ｂｂｉ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ｈｉｎｌ I)、（Ｐａｌ I：Ｂａｎ I)、（Ｐａ
ｌ I：：Ｎａｒ I)、（Ｐａｌ I：Ａｃｙ I)、（Ｐａｌ
I：Ｂｂｉ I)、（Ｐａｌ I：Ｈｉｎｌ I)、（Ｒｓａ
I：Ａｃｃ I)および（Ｔａｑ I：，Ｎｌｕ I) からなる
群から選択される請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相
補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表わ
し、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣのい
ずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが相
補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットのプ
ライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ２
により表わされ、前記第２プライマーセットのプライマ
ーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ１−Ｒ２により
表わされる請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記第１プライマーセットのプライマー
の塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１を認識す
る第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマーセットのプ
ライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ１
を認識する第２制限酵素をＥ２とし、前記第１制限酵素
Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組合せを（Ｅ１：Ｅ２）
により表わすとき、前記組合せ（Ｅ１：Ｅ２）が、（Ａ
ｌｕ I：Ｍａｅ II ）、（Ｍａｅ I：Ｎｌａ III）、
（Ｔｈａ I：Ｍｓｐ I）、（Ａｃｃ II：Ｍｓｐ I）、
（ＢｓｔＶI：Ｍｓｐ I）、（Ｔｈａ I：Ｈｐａ II）、
（Ａｃｃ II：Ｈｐａ II）、（ＢｓｔＶI：Ｈｐａ I
I）、（Ｒｓａ I：Ｓａｕ３ＡI）、（Ｒｓａ I：Ｍｏｂ
I）、（Ｈａｅ III：ＨｉｎＰ１ I）、（Ｈａｅ III：
ＳｃｉＮ I）、（Ｐａｌ I：ＨｉｎＰ１ I）および（Ｐ
ａｌ I：ＳｃｉＮ I）からなる群から選択される請求項
７記載の方法。 - 【請求項９】 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相
補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表わ
し、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣのい
ずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが相
補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットのプ
ライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ
１−Ｒ２により表わされ、前記第２プライマーセットの
プライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１ｎ１ｎ２
ｎ１−Ｒ２により表わされる請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 前記第１プライマーセットのプライマ
ーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ
１を認識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマー
セットのプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ
２Ｎ１ｎ１ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２と
し、前記第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組
合せを（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ
（Ｅ１：Ｅ２）が、（Ａｌｕ I：Ｂａｌ II）、（Ａｌ
ｕ I：Ｘｈｏ II）、（Ａｌｕ I：Ｍｆｌ I）、（Ｍｓ
ｐ I：Ｃｆｒ９ I）、（Ｍｓｐ I：Ｘｍａ I）、（Ｍｓ
ｐ I：Ａｒａ I）、（Ｈｐａ II：Ｃｆｒ９ I）、（Ｈ
ｐａ II：Ｘｍａ I）、（ＨｐａII：Ａｒａ I）および
（Ｔａｑ I：Ｘｂａ I）からなる群から選択される請求
項９記載の方法。 - 【請求項１１】 ＤＮＡの塩基配列を決定する方法であ
って、以下の工程： (a) 第１制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮ
Ａ断片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片にオリゴヌクレ
オチドを付加する工程、(c) 前記オリゴヌクレオチドを
付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、第１プライマーセット
から選択される第１プライマーおよび第２プライマーセ
ットから選択される第２プライマーからなる少なくとも
一対のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から特定の
断片を選別して増幅する工程、ここで、前記第１プライ
マーセットは、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相
補的な塩基配列および前記第１制限酵素が認識する塩基
配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記ＤＮＡ断
片から特定の断片を選別して増幅するための選別塩基配
列を３’末端に持つ複数のプライマーから構成され、前
記第２プライマーセットは、前記オリゴヌクレオチドの
塩基配列に相補的な塩基配列および第２制限酵素が認識
する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記
ＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅するための選
別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライマーから構成
され、前記第２制限酵素は前記第１制限酵素が認識する
塩基配列とは異なる塩基配列を認識する、(d) 前記の増
幅されたＤＮＡ断片を第１制限酵素または第２制限酵素
で切断する工程、および(e) 断片化していない前記２本
鎖ＤＮＡの一方の鎖を鋳型とし、前記第１制限酵素また
は第２制限酵素で切断されたＤＮＡ断片のうち３’末端
側を切断されたほうの鎖をプライマーとして用いて、前
記の断片化していない２本鎖ＤＮＡの一方の鎖の塩基配
列決定を行う工程を含む、前記の方法。 - 【請求項１２】 さらに、工程(c) で増幅されたＤＮＡ
断片を工程(d) で用いなかった方の制限酵素で切断し、
工程(e) で鋳型として用いたＤＮＡ鎖の相補鎖を鋳型と
し、前記制限酵素で切断されたＤＮＡ断片のうち３’末
端側を切断されたほうの鎖をプライマーとして用いて、
工程(e) で塩基配列決定されたＤＮＡ鎖の相補鎖の塩基
配列決定を行う工程を含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 ＤＮＡの塩基配列を決定する方法であ
って、以下の工程： (a) 制限酵素により２本鎖ＤＮＡを断片化してＤＮＡ断
片を得る工程、(b) 前記ＤＮＡ断片に第１オリゴヌクレ
オチドを付加する工程、(c) 前記第１オリゴヌクレオチ
ドを付加したＤＮＡ断片を鋳型とし、少なくとも一対の
プライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片から特定の断片を
選別して増幅する工程、ここで、該プライマー対の各プ
ライマーは、前記第１オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列および前記制限酵素が認識する塩基配
列に相補的な塩基配列を含み、さらに、前記ＤＮＡ断片
から特定の断片を選別して増幅するための選別塩基配列
を３’末端に持つ(d) 前記の増幅されたＤＮＡ断片を前
記制限酵素で切断する工程、(e) 前記の切断されたＤＮ
Ａ断片の３’末端に第２オリゴヌクレオチドを付加する
工程、および(f) まず前記第２オリゴヌクレオチドを付
加したＤＮＡ断片の一方の鎖を鋳型とし、次いで断片化
していない前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖を鋳型とし、少
なくとも一種のプライマーを用いて、前記ＤＮＡ断片の
一方の鎖の塩基配列決定を行う工程、ここで、該プライ
マーは、前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補
的な塩基配列および前記制限酵素が認識する塩基配列に
相補的な塩基配列を含み、さらに、前記選別塩基配列を
３’末端に持つを含む、前記の方法。 - 【請求項１４】 第１プライマーセットおよび第２プラ
イマーセットから構成されるプライマーセットであっ
て、前記第１プライマーセットは、特定のオリゴヌクレ
オチドの塩基配列に相補的な塩基配列および第１制限酵
素が認識する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、さら
に、複数のＤＮＡ断片から特定の断片を選別して増幅す
るための選別塩基配列を３’末端に持つ複数のプライマ
ーから構成され、前記第２プライマーセットは、前記オ
リゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列および
第２制限酵素が認識する塩基配列に相補的な塩基配列を
含み、さらに、複数のＤＮＡ断片から特定の断片を選別
して増幅するための選別塩基配列を３’末端に持つ複数
のプライマーから構成され、前記第２制限酵素は前記第
１制限酵素が認識する塩基配列とは異なる塩基配列を認
識する、前記のプライマーセット。 - 【請求項１５】 前記第２制限酵素は前記第１制限酵素
が認識する塩基配列とは１塩基または２塩基異なる塩基
配列を含む部位を認識する請求項１４記載のプライマー
セット。 - 【請求項１６】前記選別塩基配列が１塩基〜４塩基長で
ある請求項１４記載のプライマーセット。 - 【請求項１７】 前記第２制限酵素が認識する塩基配列
の長さが、前記第１制限酵素が認識する塩基配列の長さ
よりも長い請求項１４記載のプライマーセット。 - 【請求項１８】 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表
わし、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣの
いずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが
相補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットの
プライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２
ｎ１−Ｒ２により表わされ、前記第２プライマーセット
のプライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２Ｎ２ｎ
２ｎ１−Ｒ２により表わされる請求項１４記載のプライ
マーセット。 - 【請求項１９】 前記第１プライマーセットのプライマ
ーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ
１を認識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマー
セットのプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ
２ｎ２Ｎ２ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２と
し、前記第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組
合せを（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ
（Ｅ１：Ｅ２）が、（ＴｓｐＥ I：Ｓｓｐ I）、（Ｍａ
ｅ II：Ｍｌｕ I）、（Ｍａｅ II：Ａｆｌ III）、（Ａ
ｌｕ I：Ｅｃｏ４７ III）、（Ｎｌａ III：Ｎｄｅ
I）、（Ｍｓｐ I：Ｄｓａ I）、（Ｍｓｐ I：ＮｓｐＢ
II）、（Ｈｐａ II：Ｄｓａ I）、（Ｈｐａ II：Ｎｓｐ
Ｂ II）、（Ｓａｕ３Ａ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｍｏｂ
I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｄｐｎ I：ＥｃｏＲＶ）、（Ｈａ
ｅ III：Ｂａｎ I)、（Ｈａｅ III：Ｎａｒ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ａｃｙ I)、（Ｈａｅ III：Ｂｂｉ I)、（Ｈａ
ｅ III：Ｈｉｎｌ I)、（Ｐａｌ I：Ｂａｎ I)、（Ｐａ
ｌ I：：Ｎａｒ I)、（Ｐａｌ I：Ａｃｙ I)、（Ｐａｌ
I：Ｂｂｉ I)、（Ｐａｌ I：Ｈｉｎｌ I)、（Ｒｓａ
I：Ａｃｃ I)および（Ｔａｑ I：，Ｎｌｕ I) からなる
群から選択される請求項１８記載のプライマーセット。 - 【請求項２０】 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表
わし、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣの
いずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが
相補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットの
プライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１−Ｒ
２により表わされ、前記第２プライマーセットのプライ
マーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ１−Ｒ２によ
り表わされる請求項１４記載のプライマーセット。 - 【請求項２１】 前記第１プライマーセットのプライマ
ーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ１を認識
する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマーセットの
プライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１ｎ２Ｎ２ｎ
１を認識する第２制限酵素をＥ２とし、前記第１制限酵
素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組合せを（Ｅ１：Ｅ
２）により表わすとき、前記組合せ（Ｅ１：Ｅ２）が、
（ＡｌｕI：Ｍａｅ II ）、（Ｍａｅ I：Ｎｌａ II
I）、（Ｔｈａ I：Ｍｓｐ I）、（Ａｃｃ II：Ｍｓｐ
I）、（ＢｓｔＶI：Ｍｓｐ I）、（Ｔｈａ I：Ｈｐａ I
I）、（Ａｃｃ II：Ｈｐａ II）、（ＢｓｔＶI：Ｈｐａ
II）、（Ｒｓａ I：Ｓａｕ３Ａ I）、（Ｒｓａ I：Ｍ
ｏｂ I）、（Ｈａｅ III：ＨｉｎＰ１ I）、（Ｈａｅ I
II：ＳｃｉＮ I）、（Ｐａｌ I：ＨｉｎＰ１ I）および
（Ｐａｌ I：ＳｃｉＮ I）からなる群から選択される請
求項２０記載のプライマーセット。 - 【請求項２２】 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
相補的な塩基配列をＲ１、前記選別塩基配列をＲ２で表
わし、Ｎ１、Ｎ２、ｎ１、ｎ２をＡ、Ｔ、ＧまたはＣの
いずれかの塩基とし、Ｎ１とｎ１およびＮ２とｎ２とが
相補的な塩基であるとき、前記第１プライマーセットの
プライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２
ｎ１−Ｒ２により表わされ、前記第２プライマーセット
のプライマーの塩基配列が、Ｒ１−Ｎ１Ｎ２Ｎ１ｎ１ｎ
２ｎ１−Ｒ２により表わされる請求項１４記載のプライ
マーセット。 - 【請求項２３】 前記第１プライマーセットのプライマ
ーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ２Ｎ１Ｎ２ｎ２ｎ
１を認識する第１制限酵素をＥ１、前記第２プライマー
セットのプライマーの塩基配列のうちの塩基配列Ｎ１Ｎ
２Ｎ１ｎ１ｎ２ｎ１を認識する第２制限酵素をＥ２と
し、前記第１制限酵素Ｅ１と前記第２制限酵素Ｅ２の組
合せを（Ｅ１：Ｅ２）により表わすとき、前記組合せ
（Ｅ１：Ｅ２）が、（Ａｌｕ I：Ｂａｌ II）、（Ａｌ
ｕ I：Ｘｈｏ II）、（Ａｌｕ I：Ｍｆｌ I）、（Ｍｓ
ｐ I：Ｃｆｒ９ I）、（Ｍｓｐ I：Ｘｍａ I）、（Ｍｓ
ｐ I：Ａｒａ I）、（Ｈｐａ II：Ｃｆｒ９ I）、（Ｈ
ｐａ II：Ｘｍａ I）、（ＨｐａII：Ａｒａ I）および
（Ｔａｑ I：Ｘｂａ I）からなる群から選択される請求
項２２記載のプライマーセット。 - 【請求項２４】 請求項１４記載のプライマーセットを
含む、ＤＮＡ試料を調製するための試薬。 - 【請求項２５】 請求項２４記載の試薬を含む、ＤＮＡ
試料を調製するための試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10152598A JPH11341986A (ja) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | Ｄｎａ試料調製法および試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10152598A JPH11341986A (ja) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | Ｄｎａ試料調製法および試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11341986A true JPH11341986A (ja) | 1999-12-14 |
Family
ID=15543932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10152598A Pending JPH11341986A (ja) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | Ｄｎａ試料調製法および試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11341986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036822A1 (fr) * | 2000-10-30 | 2002-05-10 | Takara Bio Inc. | Procede de determination de sequence de base d'un acide nucleique |
-
1998
- 1998-06-02 JP JP10152598A patent/JPH11341986A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036822A1 (fr) * | 2000-10-30 | 2002-05-10 | Takara Bio Inc. | Procede de determination de sequence de base d'un acide nucleique |
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