CN115667556A - Rna病毒检测方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于检测生物样品中的RNA病毒的方法，所述方法包括：(1)制备样品溶液的步骤，所述样品溶液含有生物样品、蛋白酶、不变成核酸扩增靶的核酸和选自离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂；(2)制备核酸扩增反应溶液的步骤，所述溶液含有步骤(1)中制备的样品溶液，且含有具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽或具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽；和(3)扩增步骤(2)中制备的反应溶液中的RNA病毒核酸的步骤。

Description

RNA病毒检测方法

技术领域

本发明涉及用于检测生物样品中所含的RNA病毒的方法，以及用于所述方法的组合物和试剂盒。

背景技术

检测生物样品中所含的病毒对于临床诊断等是重要的。为此目的，进行包括通过由PCR等扩增生物样品中的核酸且然后检测扩增的核酸来鉴定病毒的方法。然而，因为生物样品除了核酸之外还含有各种生物物质，所以当在未从生物样品纯化核酸的情况下进行核酸扩增时发生扩增抑制或检测抑制。因此，为了检测生物样品中的靶病毒，例如，采用包括使用柱等从生物样品纯化核酸且然后使所述核酸经受核酸扩增反应的方法。

此外，为了抑制由于生物物质的扩增抑制，已报道了含有核酸的样品的处理方法和包括向核酸扩增反应溶液中添加添加剂的方法。然而，这些方法并不完全排除对核酸扩增反应的影响。例如，已经报道了包括用蛋白水解酶处理RNA病毒且然后进行RT-嵌套式PCR以检测RNA病毒的方法（参见专利文献1）。进一步地，已经报道了包括在提取病毒核酸中用还原剂或多糖降解酶对生物样品进行处理且然后使所述样品经受RT-PCR以检测病毒的方法（参见专利文献2）。

引用列表

专利文献

专利文献1：JP-A H06-046900

专利文献2：JP-A 2018-000124。

发明内容

本发明要解决的问题

包括使用核酸结合载体等从生物样品纯化核酸且然后使所述核酸经受核酸扩增反应的方法涉及执行所述方法的人的病毒感染风险，直到病毒被灭活为止。因此，样品需要在适合病毒的防范水平处理。也就是说，存在高成本和高风险问题。本发明的目的是提供用于检测生物样品中的RNA病毒的方法，其灵敏度高、执行所述方法的人的感染风险降低、成本不高且无需复杂的处理。

解决问题的方案

作为勤奋研究以解决上述问题的结果，本发明人发现，通过经历制备样品溶液的步骤，所述样品溶液含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂，通过含有具有逆转录活性和DNA聚合酶活性的多肽的核酸扩增反应，可以以高灵敏度有效扩增并检测靶RNA病毒核酸。因而完成了本发明。

本发明涉及：

[1] 用于检测生物样品中的RNA病毒的方法，所述方法包括：

(1)制备样品溶液的步骤，所述样品溶液含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂，

(2)制备核酸扩增反应溶液的步骤，所述溶液含有步骤(1)中制备的样品溶液，以及具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录活性和DNA聚合酶活性的多肽，和

(3)扩增步骤(2)中制备的反应溶液中的RNA病毒核酸的步骤；

[2] 根据[1]所述的方法，其中，所述蛋白水解酶为蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶或链霉蛋白酶；

[3] 根据[1]或[2]所述的方法，其中所述离液试剂为胍或其盐、尿素、碘或其盐、或它们的组合；

[4] 根据[1]至[3]中任一项所述的方法，其中所述生物样品是选自口腔刮屑（oral scraping）、咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻吸出物、痰、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、直肠拭子、唾液、血液、尿和粪便悬浮液的至少一种；

[5] 根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述RNA病毒为选自流感病毒、RS病毒、偏肺病毒（metapneumovirus）、副流感病毒、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、麻疹病毒、诺如病毒（norovirus）、轮状病毒、沙波病毒（sapovirus）和HIV的至少一种；

[6] 制备用于核酸扩增的样品溶液的方法，所述方法包括制备混合物的步骤，所述混合物含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂；

[7] 用于根据[1]至[5]中任一项所述的检测生物样品中的RNA病毒的方法的组合物，包含：

(1)含有选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂以及生物样品的样品溶液，和

(2)具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽；

[8] 用于根据[1]至[5]中任一项所述的检测生物样品中的RNA病毒的方法的试剂盒，包括：

(1)选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂，和

(2)具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽；等等。

本发明的效果

根据本发明，可以通过生物样品的简单预处理制备对处理样品溶液的人没有风险并且适合于核酸扩增的用于核酸扩增的样品溶液，其不需要特殊的用于核酸提取和纯化的设备和试剂如有机溶剂和用于提取和纯化的时间。可以通过使用样品溶液进行核酸扩增来检测靶核酸。因此，根据本发明，提供了以高灵敏度安全且简单地检测生物样品中的RNA病毒的方法。

具体实施方式

如本文所用的，“耐热性”意指对热处理的抗性。例如，对于40℃的酶促最佳温度，即使在50℃或更高、60℃或更高或70℃或更高时也保持活性意指提高的“耐热性”。例如，在对于野生型酶具有37至42℃的最佳温度的莫洛尼鼠白血病病毒衍生的逆转录酶的情况中，在例如43℃或更高，优选45℃或更高，更优选50℃或更高保持酶活性的逆转录酶突变体是“耐热的”或具有“提高的耐热性”。

在下文中，将详细解释本发明。

1. 本发明的用于检测生物样品中的RNA病毒的方法

本发明的用于检测生物样品中的RNA病毒的方法特征在于包括：

(1)制备样品溶液的步骤，所述样品溶液含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂，

(2)制备核酸扩增反应溶液的步骤，所述溶液含有步骤(1)中制备的样品溶液，以及具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录活性和DNA聚合酶活性的多肽，和

(3)扩增步骤(2)中制备的反应溶液中的RNA病毒核酸的步骤。

[待检测的RNA病毒]

待通过本发明的方法检测的RNA病毒没有限制，只要它具有基因组RNA即可。RNA病毒的实例包括双链RNA病毒（dsRNA）、单链正链RNA病毒（+链型）和单链负链RNA病毒（-链型）。RNA病毒的具体实例包括，但不特别限于，流感病毒、RS病毒、偏肺病毒、副流感病毒、SARS冠状病毒（包括SARS-CoV-2；如本文所用的，SARS-CoV-2也称为2019-nCoV）、MERS冠状病毒、麻疹病毒、诺如病毒、轮状病毒、沙波病毒和HIV。

[生物样品]

如本文所用的生物样品是怀疑含有RNA病毒的样品，且包括从活体收集的样品本身，以及所述样品的衍生物，例如样品的悬浮液、溶液或稀释液。生物样品的实例包括，但不特别限于，口腔刮屑、咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻吸出物、痰、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、直肠拭子、唾液、血液、尿和粪便悬浮液。除上述样品外，生物样品的例子还包括怀疑含有RNA病毒的环境衍生的样品，例如，环境水（海水、河水、湖水、污水、生活废水、工业废水等）和通过用拭子等擦拭获得的样品的悬浮液。待擦拭的主体包括食品等制造设施、实验设施、医疗设施、厨房、卫生间等的底部、壁、工作台、槽和各种器具和装置等。上述生物样品可以单独用于本发明，或者两种或更多种生物样品可以被混合且然后用于本发明。

[添加剂]

本发明中使用的添加剂用于生物样品的预处理。添加剂的实例包括，但不限于，蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂。

蛋白水解酶没有特别限制，只要它可以作用于RNA病毒的包膜、衣壳等，或衍生自生物样品的核酸酶，以在没有降解的情况下释放存在于衣壳中的基因组RNA。蛋白水解酶的实例包括丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶（天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶）、碱性蛋白酶、半碱性蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和N-末端苏氨酸蛋白酶。这些酶可以单独使用或组合使用。蛋白水解酶也可以是内肽酶。内肽酶的实例包括作为丝氨酸蛋白酶的代表的蛋白酶K，以及优选嗜热菌蛋白酶、链霉蛋白酶及其突变体。在本发明中，可适当确定用于生物样品预处理的蛋白水解酶的浓度。例如，蛋白酶K或其突变体可以以优选3U/ml至150 U/ml，更优选3 U/ml至120 U/ml，且特别优选30 U/ml至100 U/ml范围内的终浓度使用。当与离液试剂或表面活性剂组合时，蛋白酶K或其突变体可以以1 U/ml至120 U/ml，优选2U/ml至100U/ml范围内的终浓度使用。如本文所用的，1 U的蛋白酶K活性定义为在于37℃和pH 7.5利用作为底物的变性牛血红蛋白进行1分钟的反应中释放相当于1.0 μmol酪氨酸的福林阳性氨基酸的酶的量。

不是核酸扩增靶的核酸指具有与衍生自作为本发明的检测靶的RNA病毒的RNA不同的核苷酸序列的DNA和/或RNA或核酸类似物。作为不是核酸扩增靶的核酸，可以使用衍生自除待检测的RNA病毒以外的病毒或生物的各种核酸。不是核酸扩增靶的核酸的实例包括，但不特别限于，衍生自大肠杆菌（Escherichia coli）的核酸、衍生自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的核酸或衍生自酵母的核酸。优选地，使用衍生自大肠杆菌或酵母的核糖体RNA。

离液试剂意指减少水分子之间的相互作用且从而使溶液中存在的分子构型去稳定的物质。离液试剂的实例包括，但不特别限于，胍及其盐、尿素、碘及其盐，以及它们的组合。胍盐的实例包括盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍和硫氰酸胍。碘化物的实例包括碘化锂、碘化钠、碘化钾、碘化镁和碘化钙。在本发明中，离液试剂可以以例如0.5 w/V％至5 w/V％，优选1 w/V％至4 w/V％，且特别优选2 w/V%至4 w/V%范围内的终浓度使用。离液试剂可以以例如40 μmol/ml至450 μmol/ml，优选80 μmol/ml至340 μmol/ml，且特别优选160 μmol/ml至340μmol/ml范围内的最终摩尔浓度使用。

可用于本发明的表面活性剂的实例包括，但不特别限于，阴离子型表面活性剂（十二烷基硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸钠、脱氧胆酸钠等）、非离子型表面活性剂[Triton（注册商标）X-100、吐温（注册商标）20、Nonidet（注册商标）P-40、Brij（注册商标）35等]和阳离子型表面活性剂。例如，十二烷基硫酸钠可以以例如0.001-1％、优选0.005-1％且更优选0.005-0.5％范围内的最终质量百分比浓度（w/v％）使用。结合使用的蛋白水解酶或RT-qPCR试剂适当调整浓度。

[用于核酸扩增的多肽]

在本发明的方法中，具有用于从RNA病毒的基因组RNA合成cDNA的逆转录活性的多肽，以及具有用于扩增衍生自cDNA的DNA片段的依赖DNA的DNA聚合酶活性（本文称为“DNA聚合酶活性”）的多肽可用于核酸扩增反应。具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽可以是分开的多肽，或者可以是具有两种活性的单一多肽。具有逆转录活性的多肽的实例包括HIV逆转录酶、AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、C therm.聚合酶和Tth聚合酶，且其进一步的实例包括PrimeScript（商标）RTase、SuperScript（商标）RTase、ReveRTra Ace（注册商标）RTase、SMARTScribe（商标）RTase、Quantiscript RTase和ProtoScript RTase。

除非另外具体说明，否则如本文所用的具有DNA聚合酶活性的多肽是依赖DNA的DNA聚合酶。聚合酶的优选实例包括属于家族A（Pol I-型）的DNA聚合酶、属于家族B（α-型）的DNA聚合酶以及上述两种类型聚合酶的混合物。优选地，使用耐热的DNA聚合酶。DNA聚合酶的实例包括，但不特别限于，衍生自嗜热真细菌的Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等，以及衍生自嗜热古细菌（archaea）的KOD DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。在某一实施方案中，优选使用具有优秀准确度的α-型DNA聚合酶（或属于家族B的DNA聚合酶）。α-型DNA聚合酶的实例包括，但不特别限于，可商购获得的聚合酶，例如PrimeSTAR DNA聚合酶（由TAKARA BIOINC.制造）、Tks Gflex DNA聚合酶（由TAKARA BIO INC.制造）、Pfu DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶（由TOYOBO CO., LTD.制造）。进一步地，具有DNA聚合酶活性的多肽可以是具有逆转录活性和DNA聚合酶活性的单一多肽，且其实例是Tth聚合酶。

具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽以及具有两种活性的多肽可以是天然形式或突变体，只要它们与本发明的方法一致即可。

在本发明的检测方法中，具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有两种活性的多肽可以是与针对所述多肽的抗体组合用于防止反应前的非特异性扩增的热启动酶。进一步地，具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽或具有两种活性的多肽可以与延伸因子如PCNA或已知提高核酸扩增反应效率的各种物质（例如表面活性剂、牛血清清蛋白、酸性高分子物质、兼性氨基酸等）组合使用。

[核酸扩增反应溶液]

本发明的检测方法中使用的核酸扩增反应溶液是具有组合物的溶液，所述组合物包含含有生物样品和添加剂的样品溶液，和具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽或具有逆转录活性和DNA聚合酶活性的多肽，且其中所述一种或多种多肽可以发挥所述活性。当通过RT-PCR进行核酸扩增时，反应溶液含有用于维持最佳pH的缓冲液组分、二价金属盐（镁盐、锰盐等）和dNTP，且可进一步含有中性盐、表面活性剂和其他成分。反应溶液可以含有用于待检测的RNA病毒的基因组RNA上的特定区域的核酸扩增的引物对、用于检测的核酸探针[例如猝灭探针；Q探针）和Taqman（注册商标）探针]等。代替用于检测的核酸探针，反应溶液可以含有嵌入剂料[例如，SYBR（注册商标）Green、TB Green（注册商标）]等。反应溶液可以进一步含有用于核酸扩增反应的其他试剂。例如，在检测 2019-nCoV 的情况中，可优选使用如日本国立传染病研究所（National Institute of InfectiousDiseases）手册“病原体检测手册2019-nCoV第2.9.1版（Pathogen Detection Manual2019-nCoV Ver. 2.9.1）”中所述的引物对和用于检测的核酸探针、如美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention）（CDC）“2019-Novel Coronavirus(2019-nCoV) Real-time rRT-PCR Panel Primers and Probes”中所述的引物对和用于检测的核酸探针等。为了确认反应抑制等起见，核酸扩增反应可以是多重检测，其中具有与衍生自待检测的RNA病毒的核酸不同序列的内标RNA、用于检测内标RNA的引物对和用于检测的核酸探针组合使用。例如，在检测2019-nCoV的情况中，可优选使用如日本国立传染病研究所手册中所述的N组引物、N组No. 2引物/探针，或如CDC手册中所述的N1引物/探针、N2引物/探针或N3引物/探针。

进一步地，在本发明的检测方法中，可以扩增待检测病毒的基因组RNA上的两个或更多个不同基因区域，并且可以用两种或更多种探针检测不同的基因区域。在这种情况中，两种或更多种探针可以用相同的标记进行标记。换言之，可以在一个波长处检测两个区域。标记的探针可以是基于FRET或非-FRET的荧光标记的组合，或荧光标记和猝灭标记的组合。荧光标记的例子包括FAM、Cy5、ROX和HEX。猝灭物质的实例优选包括称为暗猝灭剂的eclipse和基于BHQ（注册商标）的标记。

在检测2019-nCoV的情况中，例如，可同时使用选自如CDC在“2019-NovelCoronavirus (2019-nCoV) Real-time rRT-PCR Panel Primers and Probes”中公开的N1引物/探针、N2引物/探针或N3引物/探针的两种或更多种，以制备用于同时检测两个或更多个区域的核酸扩增反应溶液。反应溶液中所含的两种或更多种探针可以用相同的荧光染料标记，且从而可以以高灵敏度检测病毒。

将核酸扩增反应溶液在适当的温度条件下温育，从而使得顺序发生从病毒基因组RNA靶区域的cDNA合成和cDNA的扩增。作为条件，可以采用本领域技术人员公知的一步RT-PCR的条件。温度、用于保持温度的时间和循环数可以取决于靶序列、引物或探针的长度适当地调整。

在本发明的检测方法中，(1)制备含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂的样品溶液，且然后添加到核酸扩增反应溶液中。在添加到核酸扩增反应溶液中之前，样品溶液可以如后面所述的保持温暖或加热。

在本发明的检测方法中，可以在不从生物样品中的RNA病毒中纯化核酸的情况下使生物样品经受逆转录反应和核酸扩增反应。因此，增加了引入逆转录反应和核酸扩增反应中的模板的量。例如，生物样品处理溶液（样品溶液）可以例如以30 μl或更少和每50 μl反应体积5 μl至10 μl模板溶液的量被引入逆转录反应和核酸扩增反应中。

2. 制备本发明的用于核酸扩增的样品溶液的方法

本发明的用于核酸扩增的样品溶液是含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂的混合物，如第1节中所述的。因此，制备本发明的用于核酸扩增的样品溶液的方法包括制备含有生物样品和添加剂的混合物的步骤。本发明的样品溶液可以通过将生物样品和添加剂混合来制备，或者可以通过将生物样品直接悬浮在预先制备的含有添加剂的溶液中来制备。样品溶液可以含有两种或更多种添加剂。各添加物的量可以基于RNA病毒的检测灵敏度等适当确定。

样品溶液可以在保持一定时间段后经受核酸扩增反应，尽管本发明没有特别限制。保持时间的实例包括，但不限于，1秒至30分钟，优选10秒至20分钟，更优选20秒至10分钟，且进一步优选30秒至5分钟。进一步地，样品溶液可以在两个或更多个不同的温度保持。含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂的样品溶液可以在添加到核酸扩增反应溶液中之前保持温暖和/或加热。例如，样品溶液可以于室温或1℃至99℃范围内的温度保持温暖和/或加热。当样品溶液含有蛋白水解酶时，从促进酶作用的观点来看，样品溶液可以于例如20℃至90℃，优选30℃至80℃，更优选40℃至70℃，还更优选50℃至60℃保持温暖，并且可以保持温暖达例如1秒至30分钟，优选10秒至20分钟，更优选20秒至10分钟，且进一步优选30秒至5分钟。例如，样品溶液可以于55℃保持温暖达5至10 分钟。进一步地，可以使样品溶液经受高温处理以灭活蛋白水解酶。用于高温处理的温度的例子包括91℃至99℃，且优选93℃至97℃。用于高温处理的时间的实例包括1秒至10分钟，且优选30秒至5分钟。样品溶液可以在如上所述的保持温暖处理后经受高温处理，或者可以在没有保持温暖处理的情况下经受仅仅高温处理。因此，制备本发明的用于核酸扩增的样品溶液的方法可以进一步包括将含有生物样品和添加剂的混合物保持一定时间段的步骤。另一方面，制备本发明的用于核酸扩增的样品溶液的方法可以进一步包括将含有生物样品和添加剂的混合物保持温暖和/或加热的步骤。

3. 本发明的用于检测生物样品中的RNA病毒的组合物

本发明的组合物是用作用于本发明的检测RNA病毒的方法的核酸扩增反应溶液的组合物，且特征在于包含含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂的样品溶液，以及具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽，如第1节中所述的。当样品溶液含有蛋白水解酶时，蛋白水解酶优选为灭活的蛋白水解酶，其在如第2节中所述制备样品溶液后灭活，从而使得本发明组合物中的具有DNA聚合酶活性的多肽不被降解。本发明的组合物可以进一步包含对于具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽发挥活性所必需的各种组分。此外，组合物可以包含用于对靶RNA病毒的基因组RNA上的特定区域进行核酸扩增的引物对、用于检测的核酸探针等。使用核酸探针的核酸检测方法的实例包括包括使用TaqMan（注册商标）探针、Q探针、分子信标（Molecular Beacon）等的方法。在上述方法中，例如，可以通过监控核酸探针的降解或通过将核酸探针与核酸杂交并进行解链曲线分析来检测靶核酸。检测步骤的其他条件可以考虑待检测的核酸的类型和序列、探针的类型等来适当确定。本发明的组合物可以包含嵌入剂染料[例如，SYBR（注册商标）Green、TB Green（注册商标）]等而不是检测核酸探针。例如，在检测2019-nCoV 冠状病毒的情况中，可优选使用如日本国立传染病研究所手册中所述的引物对和用于检测的核酸探针、如US CDC手册中所述的引物对和用于检测的核酸探针等。此外，本发明的组合物可以包含用于内标扩增的引物对和为了确认反应抑制起见的用于检测的核酸探针。

4. 本发明的用于检测生物样品中的RNA病毒的方法的试剂盒

本发明的试剂盒的特征在于包括：

(1)选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂，和

(2)具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽，如第1节中所述的。

本发明的试剂盒可以以用于执行“本发明的用于检测生物样品中的RNA病毒的方法”和制备“本发明的用于检测生物样品中的RNA病毒的组合物”的合适形式包括如上所述的各要素。因此，本发明的试剂盒可以进一步包括用于制备用于核酸扩增的样品溶液的稀释剂、用于制备用于检测RNA病毒的核酸扩增反应溶液的缓冲液等。本发明的试剂盒可以包括用于通过本发明的方法检测RNA病毒的试剂。试剂的实例包括，但不限于，缓冲液组分、二价金属盐、dNTP和中性盐。作为本发明的一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括预混合反应溶液，所述预混合反应溶液含有具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽，以及对于所述一种或多种多肽在适当的浓度发挥活性所必需的各种组分；以及一种或多种添加剂。

本发明的试剂盒可以进一步包括用于对靶RNA病毒的基因组RNA上的特定区域进行核酸扩增的引物对、用于检测的核酸探针等。代替用于检测的核酸探针，本发明的试剂盒可以包括嵌入剂染料等。例如，在检测2019-nCoV 冠状病毒的情况中，可优选使用如日本国立传染病研究所手册中所述的引物对和用于检测的核酸探针、如US CDC手册中所述的引物对和用于检测的核酸探针等。此外，本发明的试剂盒可以包括用于内标扩增的引物对和为了确认反应抑制起见的用于检测的核酸探针。

在下文中，将参考实施例更具体地解释本发明，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1：

添加剂实验-1

对本发明的检测方法进行了证明。首先，通过常规方法制备称为“N2组”的具有SEQID NO：4中所示核苷酸序列的RNA阳性对照，其是用于如日本国立传染病研究所手册“病原体检测手册2019-nCoV第2.9.1版”中所述的引物对和用于检测的核酸探针的灵敏度测试的RNA阳性对照之一。接着，用生理盐水将可商购获得的痰样品（由NOVA Biologics制造）稀释3-倍以制备痰样品的储备悬浮液。将储备悬浮液用生理盐水进一步稀释20-倍，且然后与RNA阳性对照混合以制备生物样品悬浮液。还制备了不含痰样品的混合物。然后，作为蛋白水解酶的蛋白酶K（由TAKARA BIO INC.制造，约400 U/ml）、作为离液试剂的硫氰酸胍（CAS登记号593-84-0）（由TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.制造）或作为表面活性剂的十二烷基硫酸钠（由TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.制造）用作与生物样品混合的添加剂。此外，通过向生物样品悬浮液不添加任何物质来制备对照。

向生物样品悬浮液中添加终浓度为3.5 U/ml（175 μg/ml）、7 U/ml（350 μg/ml）、35 U/ml（1750 μg/ml）或70 U/ml（3500 μg /ml）的蛋白酶K、终浓度为209 μmol/ml的硫氰酸胍和终浓度为0.01%（w/v）的十二烷基硫酸钠；且于55℃保持温暖达5至10分钟，且然后于95℃加热5分钟，或在没有保持温暖的情况下于95℃直接加热5分钟。向如此获得的混合物中添加RNA阳性对照以便变为2.5×10^5拷贝/反应，且然后经受RT-PCR。作为RT-PCR试剂，使用One Step PrimeScript（商标）III RT-qPCR混合物（Mix）（由TAKARA BIO INC.制造）。具体而言，将5 μl如上获得的混合物与25 μl的2×RT-qPCR混合物；具有SEQ ID NOs：1和2的核苷酸序列的日本国立传染病研究所手册中所述的NIID_2019-nCoV_N_F引物（终浓度：0.5 μM）和NIID_2019-nCoV_N_R引物（终浓度：0.7 μM）；具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的NIID_2019-nCoV_N_P探针（终浓度：0.2 μM，5' FAM标记，3' BHQ1标记）；和无RNA酶H₂O混合以制备终体积为50 μl的反应混合物。

作为热循环仪，使用带有PC的Thermal Cycler Dice（注册商标）实时系统（RealTime System）III（Cy5）（由TAKARA BIO INC.制造）。PCR在52℃5分钟和95℃10秒继之以95℃5秒和60℃30秒的45个循环的条件下进行。结果示于表1中。

[表1]

如从表1可看出的，当添加高浓度35至70 U/ml（175 μg/ml至3500 μg/ml）的蛋白酶K（表中“ProK”）时，Ct值几乎与当不添加生物样品悬浮液时相同，且因而消除了生物样品悬浮液的影响。当添加3.5 U/ml的蛋白酶K和硫氰酸胍（表中的“GT”）的组合或3.5 U/ml的蛋白酶K和0.01%的十二烷基硫酸钠（表中的“SDS”）的组合时，Ct值几乎与不添加生物样品悬浮液时的Ct值相同，且因而消除了生物样品悬浮液的影响。因此，发现高浓度的蛋白酶K或蛋白酶K与硫氰酸胍和/或十二烷基硫酸钠的组合作为本发明的添加剂是有效的。即使省略了于55℃的样品溶液的保持温暖处理，也可能检测样品中的RNA病毒。

实施例2：

添加剂实验-2

通过使用灭活的病毒对本发明的检测方法进行了证明。在所述实施例中，使用NATtrol（商标）甲型/乙型流感阳性对照（由ZeptoMetrix制造）作为灭活的RNA病毒。将未稀释的灭活的RNA病毒与实施例1中制备的痰样品混合，或者将灭活的RNA病毒用生理盐水稀释10至20-倍，且然后与实施例1中制备的痰样品混合以制备生物样品悬浮液。还制备了不含痰样品的混合物。

作为蛋白水解酶的蛋白酶K、作为离液试剂的硫氰酸胍或作为表面活性剂的十二烷基硫酸钠用作添加剂。

实验如下进行。具体地，向生物样品悬浮液中组合添加终浓度为3.5 U/ml或70 U/ml的蛋白酶K、终浓度为2.5%（w/v）的硫氰酸胍或终浓度为0.01%（w/v）的十二烷基硫酸钠。混合物于室温或55℃保持温暖达5分钟，于95℃加热5分钟，且然后经受通过RT-qPCR的评价。作为RT-PCR试剂，使用One Step PrimeScript（商标）III RT-qPCR混合物（由TAKARABIO INC.制造）。具体而言，将5 μl含有一种或多种添加剂的生物样品悬浮液与25 μl的2×RT-qPCR混合物、具有SEQ ID NOs：5和6的核苷酸序列的IAmg-F01和IAmg-R01引物（终浓度：0.2 μM）、具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的用于甲型流感病毒检测的IAmg-PR01探针（终浓度：0.2 μM，5' FAM标记，3' BHQ1标记）和无RNA酶H₂O混合以制备终体积为50 μl的反应混合物。

作为热循环仪，使用带有PC的Thermal Cycler Dice（注册商标）实时系统III（Cy5）（由TAKARA BIO INC.制造）。PCR在52℃5分钟和95℃10秒继之以95℃5秒和60℃30秒的45个循环的条件下进行。通过将Ct值与未添加添加剂的对照的Ct值进行比较来评价扩增结果。结果示于表2中。

[表2]

如从表2可看出的，当添加高浓度70 U/ml的蛋白酶K（表中“ProK”）到储备悬浮液中到生物样品的20-倍稀释时，Ct值与当不添加生物样品悬浮液时相同，且因而消除了生物样品悬浮液的影响。当添加3.5 U/ml的蛋白酶K和硫氰酸胍（表中的“GT”）的组合时，Ct值与当添加高浓度70 U/ml的蛋白酶K时的相同。进一步地，当将3.5 U/ml的蛋白酶K和0.01%的十二烷基硫酸钠（表中的“SDS”）的组合添加到生物样品悬浮液的10-至20-倍稀释物中时，Ct值与当添加高浓度70 U/ml的蛋白酶K时的相同。因此，发现高浓度的蛋白酶K或蛋白酶K与硫氰酸胍和/或十二烷基硫酸钠的组合作为本发明的添加剂是有效的，即使在检测来自掺有灭活的病毒的生物样品的RNA时，其接近实际样品。

实施例3：

生物样品实验

通过使用灭活的病毒对本发明的检测方法进行了证明。作为灭活的RNA病毒，使用可商购获得的灭活的RNA病毒，NATtrol（商标）SARS_CORONA阳性对照（有ZeptoMetrix制造），并用生理盐水稀释1.2-倍和12-倍。作为生物样品，使用未稀释的或用病毒转运培养基（产品名称：病毒转运培养基（VTM），由Sugiyama-gen制造）稀释的可商购获得的唾液（由LEEBIOSOLUTIONS制造）。将生物样品与灭活的病毒稀释物混合以制备生物样品悬浮液。作为与生物样品悬浮液混合的添加剂，使用蛋白酶K作为蛋白水解酶。

实验如下进行。具体而言，将终浓度为70 U/ml或17.5 U/ml的蛋白酶K添加到生物样品悬浮液中。将混合物于室温放置5分钟，于55℃保持5分钟，于95℃加热5分钟，且然后经受通过RT-qPCR的评价。使用与实施例1中使用的相同的RT-qPCR试剂。具体地，将含有添加剂的10 μl生物样品悬浮液与2×RT-qPCR混合物、具有SEQ ID NOs：8和9的核苷酸序列的PCR正向引物N1_SARS COV_F和R引物（终浓度：0.2 μM）、具有SEQ ID NOs：11和12的核苷酸序列的PCR正向引物N2_SARS COV_F和R引物（终浓度：0.2 μM）、具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的用于SARS_CORONA检测的N1_SARS COV_P探针（终浓度：0.2 μM，5' Cy5标记，3'BHQ3标记)、具有SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的用于SARS_CORONA检测的N2_SARS COV_P探针（终浓度：0.2 μM，5' Cy5标记，3' BHQ3标记）和无RNA酶H₂O混合以制备终体积为50 μl的反应混合物。

热循环仪和PCR条件与实施例1相同。通过将Ct值与未添加添加剂的对照的Ct值进行比较来评价扩增结果。结果示于表3中。

[表3]

如从表3可看出的，在通过向未稀释的唾液或唾液与VTM的混合物中添加灭活的病毒所获得的所有生物样品悬浮液中都观察到了核酸扩增。当添加70 U/ml 蛋白酶K（表中的“ProK”）作为添加剂时和当添加 17.5 U/ml 蛋白酶K作为添加剂时，获得相同的Ct值。因此，发现本发明即使在从掺有灭活的病毒的生物样品例如唾液中检测RNA时也是有效的。

实施例4

尿嘧啶-N-葡糖苷酶（UNG）处理的实验

通过使用与实施例3相同的生物样品悬浮液和相同的添加剂对本发明的检测方法进行了证明。

在所述实施例中，以与实施例3相同的方式进行RT-PCR之前生物样品悬浮液的处理。通过RT-qPCR的评价也以与实施例3中相同的方式进行，只是使用具有UNG的One StepPrimeScript（商标）III RT-qPCR混合物（由TAKARA BIO INC.制造）而不是One StepPrimeScript（商标）III RT-qPCR混合物（由TAKARA BIO INC.制造）作为RT-PCR试剂。热循环仪和PCR条件与实施例1相同。通过将Ct值与未添加添加剂的对照的Ct值进行比较来评价扩增结果。结果示于表4中。

[表4]

如从表4可看出的，在通过向未稀释的唾液或唾液与VTM的混合物中添加灭活的病毒所获得的所有生物样品悬浮液中都观察到了核酸扩增。当添加 70 U/ml 蛋白酶K（表中的“ProK”）作为添加剂时和当添加 17.5 U/ml 蛋白酶K作为添加剂时，获得相同的Ct值。因此，发现本发明即使在含有用于防止扩增的产物污染的尿嘧啶-N-葡糖苷酶和dUTP的RT-qPCR中也是有效的。

工业适用性

通过使用本发明的检测方法，可以在不需要分离核酸的情况下检测样品中所含的衍生自RNA病毒的核酸。因此，本发明大大有助于临床诊断领域。

序列表自由文本

SEQ ID NO：1：PCR正向引物NIID_2019-nCOV_N_F2

SEQ ID NO：2：PCR反向引物NIID_2019-nCOV_N_R2

SEQ ID NO：3：探针NIID_2019-nCOV_N_P2。5'-端是标记的FAM，且3'-端是标记的BHQ1

SEQ ID NO：4：2019-nCoV N2组的RNA阳性对照序列

SEQ ID NO：5：PCR正向引物IAmg-F01

SEQ ID NO：6：PCR反向引物IAmg-R01

SEQ ID NO：7：探针IAmg-PB1。5'-端为标记的FAM，且3'-端为标记的BHQ1

SEQ ID NO：8 PCR正向引物N1_SARS COV_F

SEQ ID NO：9 PCR反向引物N1_SARS COV_R

SEQ ID NO：10 N1_SARS COV_P。5'-端为标记的Cy5，且3'-端为标记的BHQ3

SEQ ID NO：11 PCR正向引物N2_SARS COV_F

SEQ ID NO：12 PCR反向引物N2_SARS COV_R

SEQ ID NO：13 N2_SARS COV_P。5'-端为标记的Cy5，且3'-端为标记的BHQ3。

序列表

<110> 宝生物工程株式会社

<120> RNA病毒检测方法

<130> 676182

<150> JP2020-080247

<151> 2020-04-30

<150> JP2020-107940

<151> 2020-06-23

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR正向引物NIID_2019-nCOV_N_F2

<400> 1

aaattttggg gaccaggaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR反向引物NIID_2019-nCOV_N_R2

<400> 2

tggcagctgt gtaggtcaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针NIID_2019-nCOV_N_P2。5'-端是标记的FAM，且3'-端是标记的BHQ1

<400> 3

atgtcgcgca ttggcatgga 20

<210> 4

<211> 337

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2019-nCoV N2组的RNA阳性对照序列

<400> 4

gggcagacgu gguccagaac aaacccaagg aaauuuuggg gaccaggaac uaaucagacg 60

gauccagcua gcgcauugga ucucgcaaau ugcacaauuu gcccccagcg cuucagcguu 120

cuucggaaug ucgcgcauug gcauggaagu cacaccuucg ggaacguggu ugaccuacac 180

agcugccauc aaauuggaug acaaagaucc aaauuucaaa gaucaaguca uuuugcugaa 240

uaagcauauu gacgcauaca aaacauuccc accaacagag ccuaaaaagg acaaaaagaa 300

gaaggcugau gaaacucaag ccuuaccgca gagacag 337

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR正向引物IAmg-F01

<400> 5

ccmaggtcga aacgtaygtt ctctctatc 29

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR反向引物IAmg-R01

<400> 6

tgacagraty ggtcttgtct ttagccaytc ca 32

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针IAmg-PB1。5'-端为标记的FAM，且3'-端为标记的BHQ1

<400> 7

atytcggctt tgagggggcc tg 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR正向引物N1_SARS COV_F

<400> 8

gaccccaatc aaaccaacgt agt 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR反向引物N1_SARS COV_R

<400> 9

tctggttatt gtcagttgaa tctg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> N1_SARS COV_P。5'-端为标记的Cy5，且3'-端为标记的BHQ3

<400> 10

cccccgcatt acatttggtg gacc 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR正向引物N2_SARS COV_F

<400> 11

ttacaaacat tggccgcaaa 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR反向引物N2_SARS COV_R

<400> 12

gcgtgacatt ccaaagaa 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> N2_SARS COV_P。5'-端为标记的Cy5，且3'-端为标记的BHQ3

<400> 13

acaatttgct ccaagtgcct ctg 23

Claims (8)

1.用于检测生物样品中的RNA病毒的方法，所述方法包括：

(1)制备样品溶液的步骤，所述样品溶液含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂，

(2)制备核酸扩增反应溶液的步骤，所述溶液含有步骤(1)中制备的样品溶液，以及具有逆转录活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录活性和DNA聚合酶活性的多肽，和

(3)扩增步骤(2)中制备的反应溶液中的RNA病毒核酸的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白水解酶为蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶或链霉蛋白酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述离液试剂为胍或其盐、尿素、碘或其盐、或它们的组合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物样品是选自口腔刮屑、咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻吸出物、痰、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、直肠拭子、唾液、血液、尿和粪便悬浮液的至少一种。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述RNA病毒为选自流感病毒、RS病毒、偏肺病毒、副流感病毒、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、麻疹病毒、诺如病毒、轮状病毒、沙波病毒和HIV的至少一种。

6.制备用于核酸扩增的样品溶液的方法，所述方法包括制备混合物的步骤，所述混合物含有生物样品和选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂。

7.用于根据权利要求1至5中任一项所述的检测生物样品中的RNA病毒的方法的组合物，包含：

(1)含有选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂以及生物样品的样品溶液，和

(2)具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽。

8.用于根据权利要求1至5中任一项所述的检测生物样品中的RNA病毒的方法的试剂盒，包括：

(1)选自蛋白水解酶、不是核酸扩增靶的核酸、离液试剂和表面活性剂的至少一种添加剂，和

(2)具有逆转录酶活性的多肽和具有DNA聚合酶活性的多肽，或具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽。