JP2016063797A - Ｒｎａ増幅法およびｈｉｖ−１感染診断方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ゲノム変異が起きやすいＨＩＶ−１を加温が簡便な４１℃以下の温度条件で、安定に検出することができるＲＮＡ増幅方法を提供する。【解決手段】 ＨＩＶ−１で報告された変異を詳細に解析した結果、ＨＩＶ−１のゲノムの中で、ＲＮａｓｅ Ｈのゲノム領域では他の領域よりも変異が少ないことを見出したことにより、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１） ＲＮａｓｅ Ｈ ＤＮＡの全部あるいは一部を標的として、標的遺伝子の増幅遺伝子部分の両端を特異的に結合できる２種類のＤＮＡプライマーと逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを増幅する。【選択図】 図１

Description

本発明は、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）のゲノムの一部のＲＮＡを増幅する方法およびその方法を用いたＨＩＶ−１感染診断方法に関する。

ＨＩＶは、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の病原体であり、ＲＮＡを遺伝子として持つ病原体である。ＨＩＶには、全世界で広まっているＨＩＶ−１と、アフリカ西海岸を中心に広まっているＨＩＶ−２が知られている。ＨＩＶ−２感染の臨床症状は軽症である。一方、ＨＩＶ−１感染の臨床症状は重篤である。
ＨＩＶ−１感染の診断およびエイズ治療のためのＨＩＶ−１量のモニタリングには主に、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡを標的とした核酸増幅法が用いられている。しかし、ＨＩＶ−１の逆転写酵素の正確性が低いために、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡは変異を起こしやすく、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡを標的とした核酸増幅法の大きな問題点となっている。具体的には、ＨＩＶ−１の診断方法を開発し提供しても、ゲノムＲＮＡが変異して、開発した診断方法により変異したＨＩＶ−１が検出できなくなり、感染のリスクが拡大する問題である。

核酸増幅法はサンプル中にごく微量にしか存在しない標的ＤＮＡあるいはＲＮＡを、酵素を用いて１０^６倍程度にまで増幅させる方法である。標的ＤＮＡは、ＰＣＲ法と呼ばれるＤＮＡポリメラーゼを用いた方法で増幅されるが、そのためには、サーマルサイクラーと呼ばれる２あるいは３段階の温度を一定時間維持することを繰り返すための装置が必要である。標的ＲＮＡでは、逆転写酵素を用いて一旦、ＤＮＡに変換したあとに、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、増幅することが行われる。このためにも、サーマルサイクラーが必要である。

一方、標的ＲＮＡをＲＮＡとして増幅させるＲＮＡ増幅法としては、特許文献１に示されているように、ＨＩＶ−１を標的遺伝子として、標的遺伝子の増幅遺伝子部分の両端を特異的に結合できる２種類のＤＮＡプライマーと逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いる方法が開示されており、一定温度維持でＲＮＡの増幅が可能であるので、サーマルサイクラーを必要としない。

ＲＮＡ増幅法では、鋳型となる1本鎖のＲＮＡの分子鎖が、その分子鎖途中で二次構造（部分的な２重らせん形状などの複雑な構造）をとり、その部分でのＲＮＡ伸長反応の反応効率が低くなり、反応効率の低下につながることが問題となる。
上記の変異が起きやすいＨＩＶ−１を対象として、変異が起きた場合でも、検出できるように増幅対象の遺伝子部分を選定できたとしても、二次構造がその増幅、すなわち、検出を妨げる可能性がある。

この問題に対しては、反応温度を上げることで、ＲＮＡの二次構造が解消され、ＲＮＡ伸長反応への悪影響を抑制することが考えられる。
反応温度を上げて、逆転写反応を行うために、逆転写酵素の遺伝子改変を行うことで耐熱化する技術（特許文献２）や、ＤＮＡポリメラーゼにＲＮＡ認識活性を付与する遺伝子改変を行う技術（特許文献３）が開示されている。
これらの方法は、ＲＮＡ増幅反応の反応温度を４１℃よりも高温に設定する必要がある。

しかし、温度維持の装置の観点からは、より保温温度が低く、より室温に近い温度に設定する装置が、より簡便であると考えられる。
具体的には、ＲＮＡ増幅法の反応温度を４１℃以下に下げることが望ましいが、ＲＮＡの二次構造が、４１℃より高温の温度条件よりも形成されやすくなり、ＲＮＡ伸長反応の効率は、低下することが懸念される。

特開２００２−３２０４８１号公報 特許４６３４７９９号公報 国際公開ＷＯ２０１０／０５０４１８

本発明の課題は、ゲノム変異が起きやすいＨＩＶ−１を安定に検出することであり、ゲノム変異が起きていても、より安定にゲノムＲＮＡを対象としてＲＮＡ増幅を行うことが出来る方法であり、かつ、加温が簡便な４１℃以下の温度条件でＲＮＡ増幅を行う方法を提供することを目的とする。

本発明者は、ＨＩＶ−１で報告された変異を詳細に解析した結果、ＨＩＶ−１のゲノムの中で、ＲＮａｓｅ Ｈのゲノム領域では他の領域よりも変異が少ないことを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の技術的手段から構成される。

〔１〕 標的遺伝子の増幅遺伝子部分の両端を特異的に結合できる２種類のＤＮＡプライマーと逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ増幅法であって、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）のゲノムの一部のＲＮＡを増幅する方法であって、ＨＩＶ−１ ＲＮａｓｅ Ｈ ＤＮＡ（配列番号：１の１１９８−１６８３に対応する４８６ヌクレオチド）の全部あるいは一部を標的とすることを特徴とするＲＮＡ増幅法。
〔２〕 ＲＮＡ増幅のために、
フォワードプライマーとして下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２の配列、
（ｂ）配列番号：３の配列、
（ｃ）配列番号：４の配列、
のいずれかを、
プロモーターリバースプライマーとして下記（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列番号：５の配列
（ｅ）配列番号：６の配列、
（ｆ）配列番号：７の配列、
のいずれかを用いることを特徴とする前記〔１〕に記載のＲＮＡ増幅法、
〔３〕 有機溶媒を加え、４１℃以下の反応温度で、ＲＮＡ増幅を行う前記〔１〕又は前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕 逆転写酵素として、耐熱性逆転写酵素を用いることを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＲＮＡ増幅法。
〔５〕 逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）であることを特徴とする前記〔４〕に記載のＲＮＡ増幅法。
〔６〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＲＮＡ増幅法を用いることを特徴とするＨＩＶ−１感染診断方法。

本発明のＨＩＶ−１のゲノムの一部のＲＮＡを増幅するＲＮＡ増幅法は、ＲＮＡ増幅の対象とするゲノム領域をＲＮａｓｅ Ｈの特定の領域を標的とすることで、ＨＩＶ−１ゲノムの変異の影響を、より受けにくくすることができる。そのため、ＨＩＶ−１を高い検出率で検出できることが期待できるという優れた性質を有する。
また、有機溶媒と耐熱性逆転写酵素を用いることにより、４１℃以下の低温で実施できるという優れた性質を有し、より簡便な装置でもって検査することが可能である。

ＨＩＶ−１逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ領域をコードするＤＮＡがｐＥＴ２２ｂ（＋）に挿入されたプラスミドの構造を示す。 表１に示す３種類の第一のプライマーのいずれかと３種類の第二のプライマーのいずれかの９種類の組合せ（組合せ番号１−９）を用いて４１℃でＲＮＡ増幅反応を６０分間行ったときの反応物の２％アガロース電気泳動による解析の結果を示す図面代用写真である。 表１に示す組合せ番号５と８を用いて４１℃でＲＮＡ増幅反応を０−６０分間行ったときの反応物の２％アガロース電気泳動による解析の結果を示す図面代用写真である。矢印は増幅産物の位置を示す。 表１に示す組合せ番号８を用いて３７℃でＲＮＡ増幅反応を６０分間行ったときの反応物の２％アガロース電気泳動による解析の結果を示す図面代用写真である。矢印は増幅産物の位置を示す。

本発明のＨＩＶ−１のゲノムの一部のＲＮＡ増幅方法は、標的遺伝子の増幅遺伝子部分の両端を特異的に結合できる２種類のＤＮＡプライマーと逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ増幅法であって、ＨＩＶ−１逆転写酵素ＲＮａｓｅ Ｈ ＤＮＡ（配列番号：１の１１９８−１６８３に対応する４８６ヌクレオチド）の全部あるいは一部を標的とすることを特徴とする。

本発明のＨＩＶ−１逆転写酵素ＲＮａｓｅ ＨのＲＮＡを標的としたＲＮＡ増幅法は、配列番号：１の配列の全部または一部を標的とするものであれば特に制限はない。

本発明は、上記配列番号の配列の全部または一部を標的ＲＮＡとすることによって、ＨＩＶ−１ゲノムの変異の影響を、より受けにくくすることができる。

また、本発明のＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅方法は、ＲＮＡ増幅のために、フォワードプライマーとして下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２の配列、
（ｂ）配列番号：３の配列、
（ｃ）配列番号：４の配列、
のいずれかを、
プロモーターリバースプライマーとして下記（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列番号：５の配列
（ｅ）配列番号：６の配列、
（ｆ）配列番号：７の配列、
のいずれかを用いることを特徴とする。

ＨＩＶ−１などのＲＮＡウイルスは、ゲノムＲＮＡの遺伝子配列が変異し易いが、ウイルスの増殖過程に必須の酵素であるＲＮａｓｅ Ｈの機能を担う遺伝子部分は変異を起こしにくい。本発明のプライマーは、このＲＮａｓｅ Ｈの遺伝子の配列を増幅対象として設計したものであり、特に、ＲＮａｓｅ Ｈの酵素活性を発揮するために必要なアミノ酸配列情報をコードした遺伝子配列情報に基づいて、前記フォワードプライマーおよび前記プロモーターリバースプライマーが設計されている。ウイルス増殖に必須の酵素である前記 ＨＩＶ−１逆転写酵素ＲＮａｓｅ ＨのＤＮＡの 酵素反応を発揮するための必須アミノ酸配列情報に対応する遺伝子部分を、フォワードプライマーまたは プロモーターリバースプライマーとして設計しているので、多様なウイルスゲノム遺伝子の変異があっても、その遺伝子部分は変異を受けず、確実に、ＲＮＡ増幅が行える。

前記フォワードプライマーは、ＲＮＡ増幅対象部分の端の塩基配列を基に有機合成した核酸鎖であり、前記プロモーターリバースプライマーは、ＲＮＡ増幅対象部分の前記フォワードプライマー側とは反対の端の塩基配列を基に、前記フォワードプライマーで伸長される核酸鎖に対する相補鎖の塩基配列を基に有機合成した核酸鎖である。

上記のプライマーの組み合わせは、どのようなものであっても構わないが、その中でも（ｃ）のフォワードプライマーと（ｅ）のプロモーターリバースプライマーの組み合わせが、特に好ましい例として挙げることができる。

本発明のＲＮＡ増幅方法は、ＲＮＡを鋳型として、最終増幅産物がＲＮＡである増幅法であれば、増幅法として制限されない。すなわち、前記基質試薬、標的遺伝子の増幅遺伝子部分の両端を特異的に結合できるＤＮＡを含む２種類のプライマー試薬及び逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼが含まれた酵素試薬を含む反応試薬に、標的のＲＮＡを加える反応条件のＲＮＡ増幅法でよく、ＮＡＳＢＡ法であってもよく、ＴＭＡ法でもよく、ＴＲＣ法であってもよい。

前記基質試薬は、通常、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどのｐＨ緩衝効果のある成分と、塩化マグネシウム、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤、ＤＴＴなどの還元剤、デオキシＡＴＰ、デオキシＧＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＴＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＩＴＰを含む水溶液である。

反応試薬を構成する基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬を混合する順番は特に限定されるものではない。
また、標的ＲＮＡを含むＲＮＡは溶液の状態で反応試薬と混合して反応溶液として増幅反応させる。標的ＲＮＡ溶液と反応試薬の混合は、標的ＲＮＡ溶液を基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬を含む反応試薬と混合しても良いし、標的ＲＮＡ溶液を反応試薬を構成する基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬のいずれかに予め混合しておいても良い。

反応時間は、一定温度で、ＲＮＡが増幅するために要する時間を保持すればよく、数分から数時間でよい。

本発明の好ましい形態は、反応溶液中に有機溶媒を加え、４１℃以下の反応温度で、ＲＮＡ増幅を行うことである。

有機溶媒の添加により、有機溶媒が反応液の誘電率を下げ、プライマーどうしの非特異的な核酸対を形成することによる結合を減少させることができる。プライマーどうしが核酸対を形成してしまうと、本来、ＲＮＡ増幅の開始起点であるプライマーが不足することとなり、増幅対象であるＲＮＡは増幅作用を受けにくくなり、ＲＮＡ増幅の効率が著しく減少してしまう。

ＲＮＡの増幅効率を著しく下げる原因として、プライマーが増幅対象とするＲＮＡに、設計目的通りの核酸対の形成が起きないことがあげられる。目的とした核酸対形成を阻害する大きな要因として、増幅対象のＲＮＡが分子内で核酸対を形成して立体形状化する２次構造形成が起き、プライマーと核酸対を形成する塩基配列部分が隠れて、結果として、プライマーと増幅対象のＲＮＡの核酸対の形成が起きず、ＲＮＡ増幅の効率が下がる。

有機溶媒を加えることにより、反応溶液中の誘電率を下げて、ＲＮＡの分子内での２次構造化を起こさないようにして、上記のＲＮＡの２次構造の問題でＲＮＡ増幅が妨害される可能性に対して、４１℃以下の温度条件でも２次構造を解消することができる。

本発明で用いるＲＮＡ増幅反応に添加する有機溶媒としては、ＲＮＡの２次構造をほぐす効果を有し、増幅対象のＲＮＡとプライマーとが相補的に核酸対を形成することによりプライマーからの核酸伸長が確実としてＲＮＡ増幅操作の効率の低下を防止する効果を有するものであれば特に制限はないが、ホルムアミドを好ましい例として挙げることができる。

有機溶媒は、増幅対象ＲＮＡとプライマーが塩基対を形成することができるように添加すればよく、プライマー試薬溶液に添加して用いてもよいし、増幅対象のＲＮＡとプライマーが混合された後に、添加してもよい。

有機溶媒の濃度は、反応溶液全量中に１〜１０％になるように有機溶媒を添加する。
有機溶媒としてホルムアミドを用いる場合の濃度は反応溶液全量中の濃度が１〜５％であることが好ましく、３％が特に好ましい。

また、本発明の好ましい形態は、逆転写酵素として、耐熱性逆転写酵素を用いることである。耐熱性の酵素を添加することにより、有機溶媒中でも酵素反応を良好に進行させることができる。
耐熱性逆転写酵素が有機溶媒に耐性であることにより、有機溶媒と耐熱性逆転写酵素を用いることにより低温で、ＲＮａｓｅ ＨのＲＮＡを標的としたＲＮＡ増幅反応が行うことが可能である。

本発明で用いる耐熱性逆転写酵素としてはＲＮＡを鋳型としてＤＮＡ鎖を伸長できる酵素活性を有することで、増幅対象のＲＮＡに相補的なＤＮＡを形成できる効果を有するものであれば特に制限はないが、耐熱性を有するＭＭＬＶ ＲＴと耐熱性を有するトリ骨髄芽球症状ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）を好ましい例として挙げることができる。

ＲＮＡ増幅法に必要な基質試薬とプライマー試薬と酵素試薬とを別々に揃えて、キットとして提供してもよく、あるいは、それらを混合して利用可能な反応試薬として提供して、対象とする生物の検出キットとしてもよい。

次に、本発明は、前記したＲＮＡ増幅法を用いることにより、ＨＩＶ−１感染診断方法を提供することができる。

本発明のＲＮＡ増幅法のＨＩＶ−１感染診断方法への適用は、人から採取した血液を通常行われているＲＮＡ増幅法と同じように前処理し、取り出した検体に前記した本発明のＲＮＡ増幅法によって行うことができる。

検体を取り出す方法の一例を示すと、まず、人から血液を採取し、その血液から血清または血漿を分離し検体とすることができる。より望ましくは、血清または血漿を、ＲＮＡ分解酵素の阻害処理を行って、タンパク質除去操作を行い核酸溶液を得る。核酸溶液を得るためには、東ソー社製のＥＸＴＲＡＧＥＮ IIや、ＱＩＡＧＥＮ社製の ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔなどの試薬キットを用いてもよい。

取り出した検体に前記〔１〕〜〔５〕のＲＮＡ増幅法により、ＨＩＶ−１逆転写酵素ＲＮａｓｅ Ｈ ＤＮＡ（配列番号：１の１１９８−１６８３に対応する４８６ヌクレオチド）の全部あるいは一部を標的としてＲＮＡを増幅することによりＨＩＶ−１に感染しているか否かを診断することができる。

次に、前記検体からＨＩＶ−１の増幅対象の遺伝子由来のＲＮＡを増幅する方法の好ましい一例を示す。

検体がウイルス感染陽性の患者由来の試料であれば、前記核酸溶液には、増幅対象のＲＮＡが含まれる。その核酸溶液と前記基質試薬の溶液を混合する。その混合溶液に、塩化カリウムやＤＭＳＯを含む前記２種類のプライマー試薬の溶液を添加し、さらに、ホルムアミドなどのＲＮＡの２次構造をほぐす効果を有する有機溶媒を添加する。その後、酵素試薬を添加して反応させる。

有機溶媒の添加は、あらかじめ、プライマー溶液に２次構造をほぐす効果を有する有機溶媒を添加していてもよく、または、基質試薬の溶液にあらかじめ２次構造をほぐす効果を有する有機溶媒を添加していてもよく、酵素試薬を添加する前に、増幅対象のＲＮＡとプライマーが塩基対を形成させるステップで有機溶媒が添加されていればよい。

検体試料由来の核酸溶液と基質試薬とプライマー溶液と有機溶媒の混合試料を５分程度の一定時間、４１℃などの一定温度で保持した後、酵素試薬を添加して、核酸伸長反応と増幅反応を開始させる。
一定温度で６０分程度の一定時間保持すれば、検体にＨＩＶ−１が内在していれば、ＨＩＶ−１の増幅対象の遺伝子由来のＲＮＡを増幅することができる。

増幅したＲＮＡの確認は、アガロースゲル電気泳動などの方法で、設計通りの分子サイズのＲＮＡが増幅されているかどうかを確認することができる。
リアルタイムＰＣＲや塩基配列分析操作で用いられている核酸の蛍光標識試薬の技術を利用して、増幅ＲＮＡ量が増加することによる蛍光信号強度の増加を検出することによっても、増幅したＲＮＡの確認ができる。
あるいは、増幅ＲＮＡをメンブレンに転写固定して、ノーザンブロティングハイブリダイゼーションで検出確認してもよく、あるいは、核酸チップでのハイブリダイゼーションで検出してもよい。

本発明のＨＩＶ−１感染診断方法は、本発明のＲＮＡ増幅法を用いるため、温度の上げ下げは不要で反応温度を４１℃より低い温度で診断することができるため、簡易で安価な装置により実施できる。また、室温の高いところでは装置がなくても反応させることができ、現場で病原体等の検出が可能となる。
その結果、特に、新興国でのＨＩＶ−１感染症の診断に大きく役立つと考えられる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

（プラスミド（ｐＥＴ−ＨＩＶＭＲＮａｓｅＨの作製）
ＨＩＶ−１ゲノムのＲＮａｓｅ Ｈ領域に相当する配列番号：８で示されるＴＭ−Ｆ、配列番号：９で示されるＴＭ−Ｂを用いて、また、配列番号：１で示されるＨＩＶ-１ ＲＴ（ＨＩＶ−１逆転写酵素） ＤＮＡを用いて、下記（ａ）〜（ｇ）を混合した反応液を用いて、（ｈ）で示す条件のＰＣＲによりＨＩＶ−１ ＲＴ ＲＮａｓｅ ＨのＤＮＡ（配列番号：1の１１９８−１６８３に対応する４８６ヌクレオチド）を増幅させた。
（ａ）水 １７．５μＬ
（ｂ）２ｘ ｂｕｆｆｅｒ ２５μＬ
（ｃ）ｄＮＴＰ ４μＬ
（ｄ）１０ mＭ ＴＭ−Ｆ １μＬ
（ｅ）１０ mＭ ＴＭ−Ｂ １μＬ
（ｆ）ＨＩＶ−１ ＲＴ ＲＮＡ １μＬ
（ｇ）ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡） ０．５μＬ
（ｈ）９５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ６０秒、３０サイクル
得られた増幅ＤＮＡをｐＥＴ−２２ｂ（＋）（クローンテック）を制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断した。次に、これらの２種類の反応物を混合し、ライゲーション反応により目的のプラスミド（ｐＥＴ−ＨＩＶＭＲＮａｓｅＨと命名）（図４）を作製した。

（実施例１）
下記の方法によりＲＮＡ増幅反応を行った。

まず、下記（ａ）〜（ｄ）の試薬を調製した。
（ａ）基質試薬
水：２５．９μＬ
１Ｍ ＭｇＣｌ_２：５．６μＬ
１．９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．６）：１９．８μＬ
４０Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ）０．６μＬ
１００ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ） ３．３μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ３３．０μＬ
５８ｍＭ ＮＴＰ １７．１μＬ
２５０ｍＭ ＩＴＰ ４．８μＬ
（ｂ）プライマー試薬Ｐ１
水：３２．５μＬ
２Ｍ ＫＣｌ：２１．５μＬ
５０μＭ フォワードプライマー：６．６μＬ
５０μＭ プロモータリバースプライマー：６．６μＬ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：４２．９μＬ
（ｃ）プライマー試薬Ｐ２
水：２．５μＬ
ホルムアミド：３０μＬ
２Ｍ ＫＣｌ：２１．５μＬ
５０μＭ フォワードプライマー：６．６μＬ
５０μＭ プロモータリバースプライマー：６．６μＬ
ＤＭＳＯ：４２．９μＬ
（ｄ）酵素試薬
１９．８μＭ 耐熱性ＭΜＬＶ ＲＴ（ＭＭ４）：４．３μＬ
１０ｍｇ／μＬ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：４．０μＬ
２０，０００ｕｎｉｔｓ／μＬ ＡＭＶ−００７（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）：４．４μＬ
６０％ソルビトール：１１．１μＬ
Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ：３１．２μＬ
なお、ＭＭ４はＭＭＬＶ ＲＴの２８６位のグルタミン酸残基がアルギニン残基に、３０２位のグルタミン酸残基がリシン残基に、４３５位のロイシン残基がアルギニン残基に、および５２４位のアスパラギン残基がアラニン残基に置換されることにより耐熱化されたものである（Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｂｙ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年発行、第１５０巻、ｐｐ．２９９−３０６）。

ＨＩＶ−１を標的ＲＮＡとして、ＲＮＡ増幅反応を下記（１）〜（４）の手順で行った。
（１）１×１０^１０コピー／μＬの標準ＲＮＡ溶液（２．５μＬ）、基質試薬（５．０μＬ）、プライマー試薬（計５．０μＬになるように混合）の混合物を各温度で５分間保温した。
（２）これに酵素試薬２．５μＬを加え、各温度で６０分間保温した。
（３）反応後、反応液にＬｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２％アガロース電気泳動にかけた（１００Ｖで４０分間、泳動バッファーはＴＡＥ）。
（４）ゲルを１μｇ／μＬの臭化エチヂウムで染色した後、トランスイリミネータでバンドを解析した。

ただし、標準ＲＮＡは、ＨＩＶ−１ゲノムに相当するものとして、前記のように作製したプラスミド ｐＥＴ−ＨＩＶＭＲＮａｓｅＨ から５００塩基のものをイン・ビトロ転写により作製して、ＲＮＡ増幅反応には、１×１０^１０コピー／μＬのものを使用し、プライマーは表１に示す組合せのものを使用し、ホルムアミド濃度は０％とし、反応温度は４１℃、反応時間は６０分間とした。

結果を図２に示す。組合せ番号１、４、５、６、７、８、９では表１に示す計算された塩基数を有するバンドが見られた。 一方、２ではバンドが見られなかった。また、３では計算された塩基数より短いバンドが見られた。最も濃いバンドが見られた５と８についてさらに検討を行った。

（実施例２）
実施例１に記載する方法により、ＲＮＡ増幅反応を行った。ただし、プライマーは表１の組合せ番号５と８を使用し、反応時間は０、１０、２０、３０、４０、５０、６０分間とした。結果を図３に示す。組合せ番号５では２０分でバンドが見られたが、１０分では見られなかった。一方、組合せ番号８では１０分でバンドが見られた。このことから、組合せ番号８が最適と考えられた。

（実施例３）
実施例１に記載する方法により、ＲＮＡ増幅反応を行った。ただし、プライマーは表１の組合せ番号８を使用し、ＭＭ４濃度（ｎＭ）は０、０．９３、２．８９．３、２８、９３、２８０、ホルムアミド濃度は３％、反応時間は６０分間とした。結果を図４に示す。ＭＭ４濃度が２８ｎＭあるいは９３ｎＭで濃いバンドが見られた。このことからＭＭ４濃度は約５０ｎＭが最適と考えられた。

配列番号：１は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の配列である。
配列番号：２は、ＴＭ−Ｆ１の配列である。
配列番号：３は、ＴＭ−Ｆ２の配列である。
配列番号：４は、ＴＭ−Ｆ３の配列である。
配列番号：５は、ＴＭ−ＰＲ１の配列である。
配列番号：６は、ＴＭ−ＰＲ２の配列である。
配列番号：７は、ＴＭ−ＰＲ３の配列である。
配列番号：８は、ＴＭ−Ｆの配列である。
配列番号：９は、ＴＭ−Ｂの配列である。

配列番号：１は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の対応するアミノ酸配列を伴う塩基配列である。
配列番号：２は、ＴＭ−Ｆ１の配列である。
配列番号：３は、ＴＭ−Ｆ２の配列である。
配列番号：４は、ＴＭ−Ｆ３の配列である。
配列番号：５は、ＴＭ−ＰＲ１の配列である。
配列番号：６は、ＴＭ−ＰＲ２の配列である。
配列番号：７は、ＴＭ−ＰＲ３の配列である。
配列番号：８は、ＴＭ−Ｆの配列である。
配列番号：９は、ＴＭ−Ｂの配列である。
配列番号：１０は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のアミノ酸配列である。

Claims (6)

1. 標的遺伝子の増幅遺伝子部分の両端を特異的に結合できる２種類のＤＮＡプライマーと逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ増幅法であって、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のゲノムの一部のＲＮＡを増幅する方法であって、ＨＩＶ−１ ＲＮａｓｅ Ｈ ＤＮＡ（配列番号：１の１１９８−１６８３に対応する４８６ヌクレオチド）の全部あるいは一部を標的とすることを特徴とするＲＮＡ増幅法。
2. ＲＮＡ増幅のために、
   フォワードプライマーとして下記（ａ）〜（ｃ）：
   （ａ）配列番号：２の配列、
   （ｂ）配列番号：３の配列、
   （ｃ）配列番号：４の配列、
   のいずれかを、
   プロモーターリバースプライマーとして下記（ｄ）〜（ｆ）：
   （ｄ）配列番号：５の配列
   （ｅ）配列番号：６の配列、
   （ｆ）配列番号：７の配列、
   のいずれかを用いることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ増幅法。
3. 有機溶媒を加え、４１℃以下の反応温度で、ＲＮＡ増幅を行う請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 逆転写酵素として、耐熱性逆転写酵素を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ増幅法。
5. 逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）であることを特徴とする請求項４に記載のＲＮＡ増幅法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡ増幅法を用いることを特徴とするＨＩＶ−１感染診断方法。