JP4224522B2 - Ｄｎａ断片を増幅するためのｄｎａの増幅方法及び鋳型ｄｎａの活性化方法 - Google Patents

Ｄｎａ断片を増幅するためのｄｎａの増幅方法及び鋳型ｄｎａの活性化方法 Download PDF

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Description

本発明は、鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するためのＤＮＡの増幅方法、ＤＮＡ増幅用試薬、ＤＮＡ増幅用試薬キット、鋳型ＤＮＡの活性化方法及び鋳型ＤＮＡ活性化用試薬に関するものである。
ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲという）等のＤＮＡ増幅反応を用いたＤＮＡの増幅方法は、特定のＤＮＡ断片を増幅する方法として、分子生物学の分野で広く用いられている。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｏｃｈｉ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｔａｔｕｋａｗａ／ｅｄｕ／ｓｅｍｃ３／２００２／ｂ１ｓｂ０３５／ｐｒ２．ｈｔｍｌ（非特許文献１）には、ＰＣＲを用いたＤＮＡの増幅方法の一例が示されている。この従来のＤＮＡの増幅方法では、試料として細胞からＤＮＡ（試料ＤＮＡ）を抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲが行われる。このＤＮＡの増幅方法で行われるＰＣＲは、以下の３つの工程で構成されている。まず第１の工程では、試料ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして約９４℃で約６０秒間加熱し、鋳型ＤＮＡを構成する二本鎖ＤＮＡを２本の一本鎖ＤＮＡに分離する。これにより１つの二本鎖ＤＮＡで構成された試料ＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡで構成された２本の鋳型ＤＮＡに変成される（これをディネーチャーという）。分離された２本の一本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡを増幅する鋳型（鋳型ＤＮＡ）となる。
次いで第２の工程では、第１の工程で作成した２つの一本鎖ＤＮＡからなる鋳型ＤＮＡと、これらの２つの鋳型ＤＮＡの両末端と相補的な関係にある１対の短い合成ＤＮＡ鎖（これをプライマーという）とを混ぜて、約５５℃で約９０秒間加熱する。これにより、鋳型ＤＮＡとプライマーとが反応して、２つの鋳型ＤＮＡの末端にそれぞれプライマーが結合し、２つの鋳型ＤＮＡの末端の位置に新たなＤＮＡの二重鎖が形成される（これをアニーリングという）。
第３の工程は、第２の工程で鋳型ＤＮＡの末端に二重鎖が形成されたＤＮＡを、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼという酵素の存在下で約７２℃で約９０秒間加熱する。その結果、鋳型ＤＮＡとこの鋳型ＤＮＡの一部に結合したプライマーのＤＮＡ鎖が鋳型ＤＮＡに沿って伸長し（これをエクステンションという）、２つの二本鎖ＤＡＮが複製される。
これら第１の工程から第３の工程までを１サイクルとすると、１サイクルで１つの鋳型ＤＮＡから２つのＤＮＡが複製される（すなわちＤＮＡが２倍に増幅する）。このサイクルを複数回繰り返すことにより、２サイクルで４倍、３サイクルで８倍とＤＮＡを増幅させることができる。したがって、従来のＰＣＲを用いたＤＮＡの増幅方法により、１分子のＤＮＡを短時間で数１０万倍の分子からなるＤＮＡに増幅することができる。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｏｃｈｉ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｔａｔｕｋａｗａ／ｅｄｕ／ｓｅｍｃ３／２００２／ｂ１ｓｂ０３５／ｐｒ２．ｈｔｍｌ
しかしながら、ＰＣＲを用いた従来のＤＮＡの増幅方法では、細胞から取り出した試料ＤＮＡが微量である場合は、ＰＣＲを行うのに十分な鋳型ＤＮＡが得られないため、ＤＮＡ断片を十分に増幅することができない。特に、鋳型ＤＮＡが極めて微量（１０ｎｇ以下）の場合または変性が高度な鋳型ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡの殆どが変性しているため鋳型ＤＮＡのうちターゲット部分が極めて微量な鋳型ＤＮＡを含む）の場合は、ＤＮＡの増幅は極めて困難である。なお理論的には、ＰＣＲのサイクル回数を増やすことができれば、微量の鋳型ＤＮＡまたは高度に変成された鋳型ＤＮＡからでもＤＮＡを増幅することが可能である。しかし、増幅酵素活性の限界があるため、実際にはＰＣＲのサイクル回数を無限に増やすことはできない。
これらの理由から、微量または変性が高度なＤＮＡが試料の対象となる分野（例えば、法医学における犯罪捜査、医学における遺伝子診断、考古学における古生物、古人類由来のＤＮＡ研究の分野等）では、従来のＰＣＲを用いたＤＮＡの増幅方法を利用しても、十分なＤＮＡの増幅ができないという問題がある。この問題は、試料ＤＮＡが微量（特に時間を経過しているもの）であればあるほど顕著なものとなる。
本発明の目的は、試料ＤＮＡが微量な場合でも、ＰＣＲを用いてＤＮＡを増幅することができるＤＮＡの増幅方法及びＤＮＡ増幅用試薬を提供することにある。
本発明の他の目的は、試料ＤＮＡが極めて微量な場合または試料ＤＮＡの変成が高度な場合でも、ＰＣＲを用いてＤＮＡを増幅することができるＤＮＡの増幅方法、ＤＮＡ増幅用試薬、ＤＮＡ増幅用試薬キット、鋳型ＤＮＡの活性化方法及び鋳型ＤＮＡ活性化用試薬を提供することにある。
本発明が改良の対象とするＤＮＡの増幅方法は、ＰＣＲにより、細胞から抽出した鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡの増幅方法である。このＤＮＡの増幅方法で用いるＰＣＲは、鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーをその鋳型ＤＮＡに結合させ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型ＤＮＡに結合したプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させて鋳型ＤＮＡを複製する反応である。
本発明のＤＮＡの増幅方法は、細胞から抽出した鋳型ＤＮＡと、この鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、鋳型ＤＮＡに結合したプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる機能を有する酵素である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＰＣＲ用反応液を調製するためのＰＣＲ用バッファーを調製するＰＣＲ用バッファー調製工程と、このＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加する添加工程と、添加工程を経たＰＣＲ用バッファーに、鋳型ＤＮＡ、プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを混合してＰＣＲ用反応液を調製するＰＣＲ用反応液調製工程と、ＰＣＲ用反応液を用いて前記ＰＣＲを行うＰＣＲ工程とから構成されている。このようなバナジウム化合物を添加したＰＣＲ用バッファーから調製したＰＣＲ用反応液を用いてＰＣＲを行うと、ＤＮＡの増幅を著しく増強することができる。その結果、細胞から抽出できる鋳型ＤＮＡが微量な場合でも、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を高感度に増幅することができる。したがって、本発明のＤＮＡの増幅方法によれば、鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ〜１ｎｇと微量な場合でも、ＤＮＡを増幅することができる。なお、鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇよりも小さい場合は、適正な鋳型量の範囲を逸脱し、試料ＤＮＡの増幅が困難になる。
添加工程においてＰＣＲ用バッファーに添加するバナジウム化合物としては、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択した１種を用いることができる。
添加工程では、バナジウム化合物のモル濃度が０．４〜２．０ｍＭになるようにＰＣＲ用バッファーを調製するのが好ましい。モル濃度が０．４ｍＭよりも低いと、細胞から抽出できる鋳型ＤＮＡが微量な場合にＰＣＲによるＤＮＡの増幅が困難であり、モル濃度が２．０ｍＭよりも高いと、ＰＣＲの反応が抑制され、却ってＰＣＲによるＤＮＡの増幅ができなくなるからである。なお、本願明細書においてモル濃度とは、溶液１ｄｍ3中に含まれる溶質の一定分子数を単位として表した濃度である。
本発明のＤＮＡの増幅方法では、さらにＰＣＲ用反応液調製工程の前処理工程として、ＰＣＲ用反応液調製工程における調製前の鋳型ＤＮＡを活性化させる活性化工程を加えても良い。この活性化工程は、バナジウム化合物が溶解した活性化用バッファーを調製する活性化用バッファー調製工程と、活性化用バッファーに調製前の鋳型ＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡ混合溶液を調製する混合溶液調製工程と、鋳型ＤＮＡ混合溶液を加熱する加熱工程と、加熱工程を経た鋳型ＤＮＡ混合溶液から鋳型ＤＮＡを抽出する抽出工程とから構成されている。
この活性化工程を加えると、ＤＮＡの増幅をさらに増強することができるように鋳型ＤＮＡを活性化することができる。したがって、極めて微量または変性が高度な鋳型ＤＮＡからでもＤＮＡ断片を増幅することができる。その結果、鋳型ＤＮＡの量が１０〜１００ｐｇと極めて微量な場合でもＤＮＡ断片を増幅することができる。なお、鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇよりも小さい場合は、適正な鋳型量の範囲を逸脱し、試料ＤＮＡの増幅が困難になる。
この活性化工程における加熱工程では、９０℃乃至１００℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第１の加熱ステップと、５０℃乃至６０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第２の加熱ステップと、６５℃乃至８０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第３の加熱ステップとを順番に実行する加熱サイクルを実施する。この加熱サイクルは、２５乃至３５回実施するのが好ましい。加熱サイクルの回数が２５回より少ないと、鋳型ＤＮＡを活性化させることができない。また、加熱サイクルの回数が３５回より多いと、鋳型ＤＮＡが劣化する可能性がある。
なお、活性化用バッファー調製工程において活性化用バッファーに溶解させるバナジウム化合物としては、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種を用いることができる。
これらのバナジウム化合物のうち四塩化バナジウムを用いる場合は、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９〜２．０ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。四塩化バナジウムモル濃度が０．９ｍＭよりも小さいと、鋳型ＤＮＡを活性化することができず、２．０ｍＭよりも大きいと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合もＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
またバナジウム化合物のうち三塩化バナジウムを用いる場合は、三塩化バナジウムのモル濃度が０．４〜１．５ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。三塩化バナジウムのモル濃度が０．４ｍＭよりも小さいと四塩化バナジウムを用いた場合と同様に、鋳型ＤＮＡの活性化されず、１．５ｍＭよりも大きいと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合もＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
上述したＤＮＡの増幅方法では、鋳型ＤＮＡを活性化する活性化工程は、ＰＣＲ用反応液を調製するためのＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加する添加工程を含む場合に実行される。これに対して、鋳型ＤＮＡを活性化する活性化工程を、ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加する添加工程を含まない（すなわちＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加しない）場合にも実行することができる。ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加しない場合に鋳型ＤＮＡを活性化する活性化工程を実行しても、ＤＮＡの増幅を増強することができるように鋳型ＤＮＡを活性化することができる。したがって、極めて微量または変性が高度な鋳型ＤＮＡからでも、通常のＰＣＲを行ってＤＮＡ断片を増幅することができる。すなわち、ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加する添加工程を含まない場合でも、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅をさらに増強することができる。その結果、ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加しなくても、１０〜１００ｐｇと極めて微量な鋳型ＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅することができる。なお、鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇよりも小さい場合は、上記と同様に、適正な鋳型量の範囲を逸脱し、試料ＤＮＡの増幅が困難になる。
ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加しない場合の活性化工程における加熱工程でも、９０℃乃至１００℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第１の加熱ステップと、５０℃乃至６０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第２の加熱ステップと、６５℃乃至８０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第３の加熱ステップとを順番に実行する加熱サイクルを実施する。そして、加熱サイクルも、２５乃至３５回実施するのが好ましい。ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加する場合と同様に、加熱サイクルの回数が２５回より少ないと、鋳型ＤＮＡを活性化させることができない。また、加熱サイクルの回数が３５回より多いと、鋳型ＤＮＡが劣化する可能性がある。
なお、ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加する場合と同様に、活性化用バッファーに溶解させるバナジウム化合物としては、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種を用いることができる。
活性化用バッファーに溶解させるバナジウム化合物として四塩化バナジウムを用いる場合は、四塩化バナジウムのモル濃度が１．２〜２．０ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。四塩化バナジウムモル濃度が１．２ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡの活性化されず、またモル濃度が２．０ｍＭより高いと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合もＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
また活性化用バッファーに溶解させるバナジウム化合物として三塩化バナジウムを用いる場合は、三塩化バナジウムのモル濃度が０．６〜１．２ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。三塩化バナジウムのモル濃度が０．６ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡの活性化されず、またモル濃度が１．２ｍＭよりも大きいと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合も、上述の四塩化バナジウムを用いた場合と同様に、ＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
上述した鋳型ＤＮＡを活性化させる活性化工程は、独立した鋳型ＤＮＡの活性化方法としても実行することができる。このような鋳型ＤＮＡの活性化方法として、本発明が改良の対象とする鋳型ＤＮＡの活性化方法は、ＰＣＲにより、細胞から抽出した鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するための前処理として、その鋳型ＤＮＡを活性化させる鋳型ＤＮＡの活性化方法である。この鋳型ＤＮＡの活性化方法は、鋳型ＤＮＡと、鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、鋳型ＤＮＡに結合したプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含むＰＣＲ用反応液を調製する前に、バナジウム化合物が溶解した活性化用バッファーを調製する活性化用バッファー調製工程と、活性化バッファーに鋳型ＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡ混合溶液を調製する混合溶液調製工程と、鋳型ＤＮＡ混合溶液を加熱する加熱工程と、加熱工程を経た鋳型ＤＮＡ混合溶液からＰＣＲ用反応液を調製するための鋳型ＤＮＡを抽出する抽出工程とから構成されている。
このような鋳型ＤＮＡの活性化方法を用いると、ＤＮＡの増幅を増強することができるように鋳型ＤＮＡを活性化することができる。したがって、極めて微量または変性が高度な鋳型ＤＮＡからでも、通常のＰＣＲを行ってＤＮＡ断片を増幅することができる。その結果、鋳型ＤＮＡの量が１０〜１００ｐｇと極めて微量な場合でも、通常のＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅することができる。なお、鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇよりも小さい場合は、適正な鋳型量の範囲を逸脱し、試料ＤＮＡの増幅が困難になる。
この鋳型ＤＮＡの活性化方法の場合も、ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加しない場合のＤＮＡの増幅方法と同様に、活性化工程における加熱工程でも、９０℃乃至１００℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第１の加熱ステップと、５０℃乃至６０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第２の加熱ステップと、６５℃乃至８０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第３の加熱ステップとを順番に実行する加熱サイクルを実施する。そして、加熱サイクルも、２５乃至３５回実施するのが好ましい。この鋳型ＤＮＡの活性化方法の場合でも、加熱サイクルの回数が２５回より少ないと、鋳型ＤＮＡを活性化させることができない。また、加熱サイクルの回数が３５回より多いと、鋳型ＤＮＡが劣化する可能性がある。
なお、ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加しない場合のＤＮＡの増幅方法と同様に、活性化用バッファーに溶解させるバナジウム化合物として、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種を用いることができる。
活性化用バッファーに溶解させるバナジウム化合物として四塩化バナジウムを用いる場合は、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９〜２．０ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。四塩化バナジウムのモル濃度が０．９ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡの活性化されず、またモル濃度が２．０ｍＭより高いと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合もＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
また活性化用バッファーに溶解させるバナジウム化合物として三塩化バナジウムを用いる場合は、三塩化バナジウムのモル濃度が０．４〜１．５ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。三塩化バナジウムのモル濃度が０．４ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡの活性化されず、またモル濃度が１．５ｍＭより高いと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合も、上述の四塩化バナジウムの場合と同様に、ＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
また、本発明が改良の対象とするＤＮＡ増幅用試薬は、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応により、鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するためのＤＮＡ増幅用試薬である。ここで、ＤＮＡ増幅反応は、ＰＣＲに限らず、サイクルシーケンス反応等のＤＮＡ増幅反応を対象としてもよい。
本発明のＤＮＡ増幅用試薬は、鋳型ＤＮＡと、鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、鋳型ＤＮＡに結合したプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＤＮＡ増幅用反応液を調製するためのＤＮＡ増幅用バッファーからなる。このＤＮＡ増幅用バッファーの成分にはバナジウム化合物が含まれている。
このようなＤＮＡ増幅用試薬を用いてＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応を行うと、ＤＮＡの増幅を著しく増強することができる。その結果、細胞から抽出できるＤＮＡ断片が微量な場合でも、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを高感度に増幅することができる。したがって、鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ〜１ｎｇと微量な場合でも、このＰＣＲ増幅用試薬を用いることにより、ＤＮＡ断片を増幅することができる。なお、鋳型ＤＮＡの量が１０ｎｇよりも小さい場合は、適正な鋳型量の範囲を逸脱し、試料ＤＮＡの増幅が困難になる。
なお、ＰＣＲ用バッファー成分に含まれるバナジウム化合物としては、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種を用いることができる。
ＤＮＡ増幅用バッファーは、バナジウム化合物のモル濃度が０．４〜２．０ｍＭになるように調製するのが好ましい。バナジウム化合物のモル濃度が０．４ｍＭよりも低いと細胞から抽出できるＤＮＡ断片が微量な場合にＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応によるＤＮＡの増幅が困難であり、モル濃度が２．０ｍＭよりも高いとＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応の反応が抑制され、却ってＤＮＡの増幅ができなくなるからである。
本発明では、上述した本発明のＤＮＡ増幅用試薬を構成するＤＮＡ増幅用バッファーを、ＤＮＡ増幅用反応液を調製する前に鋳型ＤＮＡを活性化するための活性化用バッファーと組み合わせてＤＮＡ増幅用試薬キットとして用いてもよい。この活性化用バッファーの成分にはバナジウム化合物が含まれている。このようにＤＮＡ増幅用バッファーと、鋳型ＤＮＡを活性化するための活性化用バッファーを組み合わせて用いると、ＤＮＡの増幅を増強することができるように鋳型ＤＮＡを活性化することができる。したがって、この本発明のＤＮＡ増幅用試薬キットを用いることにより、極めて微量または変性が高度な鋳型ＤＮＡからでもＤＮＡ断片を増幅することができる。
なお、活性化用バッファー成分に含まれるバナジウム化合物としては、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種を用いることができる。
これらのバナジウム化合物のうち四塩化バナジウムを用いる場合は、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９〜２．０ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。四塩化バナジウムモル濃度が０．９ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡが活性化されず、またモル濃度が２．０ｍＭより高いと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合もＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
またバナジウム化合物のうち三塩化バナジウムを用いる場合は、三塩化バナジウムのモル濃度が０．４〜１．５ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。三塩化バナジウムのモル濃度が０．４ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡが活性化されず、またモル濃度が１．５ｍＭより高いと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合も、上述の四塩化バナジウムを用いた場合と同様に、ＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
上記のＤＮＡ増幅用試薬キットの一部を構成する活性化用バッファーは、独立した鋳型ＤＮＡ活性化用試薬として用いることができる。このような鋳型ＤＮＡ活性化用試薬として、本発明が改良の対象とする鋳型ＤＮＡ活性化用試薬は、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応により、鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するための鋳型ＤＮＡ活性化用試薬である。この場合も、ＤＮＡ増幅反応は、ＰＣＲに限らず、サイクルシーケンス反応等のＤＮＡ増幅反応を対象としてもよい。
本発明の鋳型ＤＮＡ活性化用試薬は、鋳型ＤＮＡと、鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、鋳型ＤＮＡに結合したプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＤＮＡ増幅用反応液を調製する前に鋳型ＤＮＡを活性化するための活性化用バッファーからなる。この活性化用バッファーの成分には、バナジウム化合物が含まれている。
このような活性化用バッファーを用いると、ＤＮＡの増幅を増強することができるように鋳型ＤＮＡを活性化することができる。したがって、この鋳型ＤＮＡ活性化用試薬を用いることにより、極めて微量（１０ｐｇ〜１００ｐｇ）または変性が高度なＤＮＡ断片（鋳型ＤＮＡ）でも、通常のＰＣＲを行って増幅することができる。
なお、活性化用バッファー成分に含まれるバナジウム化合物としては、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種のバナジウム化合物を用いることができる。
これらのバナジウム化合物のうち四塩化バナジウムを用いる場合は、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９〜２．０ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。四塩化バナジウムモル濃度が０．９ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡが活性化されず、またモル濃度が２．０ｍＭよりも高いと鋳型ＤＮＡの活性化を阻害するため、いずれの場合もＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
またバナジウム化合物のうち三塩化バナジウムを用いる場合は、三塩化バナジウムのモル濃度が０．４〜１．５ｍＭになるように活性化用バッファーを調製するのが好ましい。三塩化バナジウムのモル濃度が０．４ｍＭより低いと鋳型ＤＮＡが活性化されず、またモル濃度が１．５ｍＭより高いと鋳型ＤＮＡの活性化が阻害され、いずれの場合も、上述の四塩化バナジウムを用いた場合と同様に、ＤＮＡ断片の増幅が困難になるからである。
一定のモル濃度の範囲で四塩化バナジウムが添加されたＰＣＲ用バッファーを用いてＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度をプロットしたグラフである。 （Ａ）は、図１におけるＤＮＡの増幅バンド強度の一部に対応するＤＮＡの電気泳動像（増幅バンド）を撮影した写真であり、（Ｂ）は、（Ａ）の写真を説明するための模式図である。 四塩化バナジウムが溶解した活性化用バッファーを用いて鋳型ＤＮＡに前処理を行い、かつ四塩化バナジウムが添加されたＰＣＲ用バッファーを用いてＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度をプロットしたグラフである。 （Ａ）は、図３におけるＤＮＡの増幅バンド強度の一部に対応するＤＮＡの電気泳動像（増幅バンド）を撮影した写真であり、（Ｂ）は、（Ａ）の写真を説明するための模式図である。 四塩化バナジウムが溶解した活性化用バッファーを用いて鋳型ＤＮＡに前処理を行い、かつ通常のＰＣＲ用バッファーを用いてＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度をプロットしたグラフである。 三塩化バナジウムが溶解した活性化用バッファーを用いて鋳型ＤＮＡに前処理を行い、かつ三塩化バナジウムが添加されたＰＣＲ用バッファーを用いてＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度をプロットしたグラフである。 三塩化バナジウムが溶解した活性化用バッファーを用いて鋳型ＤＮＡに前処理を行い、かつ通常のＰＣＲ用バッファーを用いてＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度をプロットしたグラフである。
以下、本発明の実施の形態について、適宜、表及び図を参照して説明する。最初に、鋳型ＤＮＡの前処理を行わない場合（鋳型ＤＮＡを活性化させない場合）について説明する。この実施の形態では、まず、試料としてヒト白血球（男性由来）の細胞からＤＮＡ断片（試料ＤＮＡ）を抽出した。抽出したＤＮＡ断片（試料ＤＮＡ）は、本実施の形態で行われるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型ＤＮＡとして用いられる。次に、ＰＣＲを行うためＰＣＲ用反応液を調製するためのＰＣＲ用バッファーを調製する。ＰＣＲ用バッファーの調製は、ＰＣＲの条件に応じて適宜行えばよい。本実施の形態では、ＰＣＲ用バッファーは、塩化カリウム（モル濃度５０ｍＭ）、（ＮＨ ４ ） ２ ＳＯ ４ （モル濃度０．１ｍＭ）、及び塩化マグネシウム（モル濃度１．５ｍＭ）を含み、Ｔｒｉｓ塩酸（モル濃度１０ｍＭ）でｐＨ８．４に調整されている。このＰＣＲ用バッファーに、通常のＰＣＲでは増幅が困難な微量（１００ｐｇ）の試料ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして加え、さらにこの鋳型ＤＮＡの特定領域（ＤＹＳ１９部位）に相補的な関係にある、プライマーを加え、かつ酵素として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを加えてＰＣＲ用反応液を作成する。このＰＣＲ用反応液に、バナジウム化合物として表１に示す四塩化バナジウム（実施例１Ａ）及び三塩化バナジウム（実施例２Ａ）をモル濃度が１．２ｍＭ及び０．９ｍＭになるようにそれぞれ添加した。なお、実施例１Ａ及び２Ａの効果を比較するために、別途、バナジウム化合物（四塩化バナジウム及び三塩化バナジウム）以外の無機塩を、実施例１Ａ及び２Ａと同様にモル濃度が１．０ｍＭになるように上記のＰＣＲ用反応液にそれぞれ添加した（比較例１Ａ〜８Ａ。なお比較例８Ａはブランクである）。これらのＰＣＲ用反応液を、サーマルサイクラーを用いて、９４℃で６０秒間加熱して、鋳型ＤＮＡを構成する２本鎖のＤＮＡを一本鎖のＤＮＡに解離して２つの鋳型ＤＮＡに変成する（ディネーチャー）。次に、５５℃で６０秒間加熱して、２つの鋳型ＤＮＡとプライマーとを反応させる。これにより、２つの鋳型ＤＮＡの末端にそれぞれプライマーが結合し、２つの鋳型ＤＮＡの末端の位置にそれぞれ新たなＤＮＡの二重鎖が形成される（アニーリング）。さらに７２℃で６０秒間加熱して、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの働きによりプライマーに挟まれた部位の塩基を伸長させ、２つの新たなＤＮＡ鎖を合成する（エクステンション）。本実施の形態では、この試料ＤＮＡから新たなＤＮＡを合成するサイクルを３５回繰り返した。
ＤＮＡの合成を確認するため、ＤＮＡの増幅バンド強度をデンシトメータ（富士フイルム社製のバイオ・イメージング・アナライザ）で測定し、ＮＩＨ ｉｍａｇｅソフトウェア（National Institute of Health, Ver 1.63）で解析した。表１に、実施例１Ａ，２Ａ（四塩化バナジウム及び三塩化バナジウム）及び比較例１Ａ〜８Ａ（無機塩化物及びブランク）の増幅バンド強度（単位Ｕ）を示した。なお、本実施の形態では、ＤＮＡタイピングが十分可能なレベルとして増幅バンド強度が８００以上の場合にＤＮＡが増幅したものと判定し、増幅バンド強度が８００より小さい場合はＤＮＡが増幅しなかったものと判定した。
表１において、実施例１Ａ及び２Ａと比較例１Ａ〜８Ａとにおいて各増幅バンド強度を比較すると、比較例１Ａ〜８Ａの増幅バンド強度はいずれも０または１となったのに対して、実施例１Ａ及び２Ａのでは増幅バンド強度がいずれも１０００以上となった。この結果は、ＰＣＲ用反応液にバナジウム化合物として四塩化バナジウムまたは三塩化バナジウムを添加してＰＣＲを行うことにより、１００pｇという微量のＤＮＡ断片（試料ＤＮＡ）からでもＤＮＡを増幅することができることを示している。
実施例１Ａ（四塩化バナジウム）及び実施例２Ａ（三塩化バナジウム）のバンド強度を比較すると、実施例１Ａ（四塩化バナジウム）の方が実施例２Ａ（三塩化バナジウム）よりもわずかながら高い増幅バンド強度を示した。そこで四塩化バナジウム（実施例１Ａ）について、ＰＣＲ用反応液に添加する場合の最適濃度を確認した。具体的には、１００ｐｇの試料ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして加えたＰＣＲ用反応液にモル濃度が０〜２．２ｍＭの範囲になるようにバナジウム化合物として四塩化バナジウムを添加してＰＣＲを行った場合（実施例１Ａ−１〜１Ａ−５及び比較例１Ａ−１〜１Ａ−８）のＤＮＡの増幅バンド強度（単位Ｕ）を、上述のデンシトメータを用いて測定した。実施例１Ａ−１〜１Ａ−５及び比較例１Ａ−１〜１Ａ−８の増幅バンド強度（単位Ｕ）を表２に示す。また、表２の結果をプロットしてグラフ化したものを図１に示す。なお、表２の結果についても、表１の場合と同様に、増幅バンド強度が８００以上の場合にＤＮＡが増幅したものと判定し、増幅バンド強度が８００より小さい場合はＤＮＡが増幅しなかったものと判定した。
表２及び図１によれば、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９〜１．８ｍＭの範囲（実施例１Ａ−１〜１Ａ−５）では増幅バンド強度（単位Ｕ）は８００以上となったのに対して、それ以外の濃度範囲（比較例１Ａ−１〜１Ａ−８）では増幅バンド強度（単位Ｕ）は８００より小さい強度となった。これらの結果は、四塩化バナジウムの最適モル濃度が０．９〜１．８ｍＭの範囲であり、この濃度範囲内であれば極めて微量（１００ｐｇ）の試料ＤＮＡ（ＤＮＡ断片）からでもＤＮＡを増幅することができることを示している。したがって、この実施例１Ａ−１〜１Ａ−５は、本発明のＤＮＡ増幅用試薬として用いることができる。
なお、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９ｍＭよりも小さい場合は、四塩化バナジウムの添加量が少ないためにＤＮＡを増幅することができず、四塩化バナジウムのモル濃度が１．９ｍＭよりも大きいと、却ってＰＣＲの反応を阻害し、ＤＮＡを増幅することができなかったものと考えられる。
なお、図２（Ａ）は、上述のデンシトメータにおいて、表２及び図１の結果の一部の濃度範囲（四塩化バナジウムのモル濃度が、０〜２．１ｍＭ（０ｍＭ，１．０ｍＭ，１，５ｍＭ，１．７ｍＭ，１．９ｍＭ，２．１ｍＭの範囲）におけるＤＮＡの増幅バンドのアガロースゲル電気泳動像を撮影した写真であり、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の写真を説明するための模式図である。この写真をみると、四塩化バナジウムのモル濃度が１．０ｍ〜１．９ｍＭの範囲で増幅バンドが出現し、１．７ｍＭのときに最も増幅バンドが濃くなっている。したがって、図２の写真の結果を考慮すると、四塩化バナジウムの最適モル濃度は、厳密には０．９〜１．９ｍＭの範囲となる。
このように、最適濃度の四塩化バナジウムを添加したＰＣＲ用反応液を用いてＰＣＲを実施すること（本発明のＤＮＡ増幅用試薬に相当する実施例１Ａ−１〜１Ａ−５）により、従来のＰＣＲではＤＮＡを十分に増幅することができなかった微量のＤＮＡ断片（鋳型ＤＮＡ）からでもＤＮＡを増幅することができる。
次に、本発明の他の実施の形態として、鋳型ＤＮＡの前処理を行う場合（すなわち鋳型ＤＮＡを活性化させる場合）について説明する。なお、上述した鋳型ＤＮＡに前処理を行わない場合と共通する部分についてはその説明を省略する。この他の実施の形態では、まず鋳型ＤＮＡを活性化するための活性化用バッファーを調製する。活性化用バッファーの調製は、活性化する鋳型ＤＮＡの種類、条件等に応じて適宜行えばよい。本実施の形態では、活性化用バッファーは、上述のＰＣＲ用バッファーの成分から塩化マグネシウムを除いた成分に、バナジウム化合物として表３に示す四塩化バナジウム（実施例１Ｂ）及び三塩化バナジウム（実施例２Ｂ）をモル濃度が１．８ｍＭ及び０．９ｍＭになるようにそれぞれ添加して調製されている。なお、実施例１Ｂ及び２Ｂの効果を比較するために、別途、バナジウム化合物（四塩化バナジウム及び三塩化バナジウム）以外の無機塩を、実施例１Ａ及び２Ａと同様にモル濃度が１．０ｍＭになるように上記のＰＣＲ用バッファーと同様の成分にそれぞれ調製した（比較例１Ｂ〜４Ｂ。なお比較例４Ｂはブランク）。
この活性化用バッファーを１２μｌ（マイクロリットル）作成し、これに毛髪から抽出したＤＮＡ断片（試料ＤＮＡ）を鋳型ＤＮＡとして１０ｐｇを混合した。これをサーマルサイクラーを用いて加熱した。このサーマルサイクラーは、９７℃で３０秒加熱する第１の加熱ステップと、５５℃で３０秒間加熱する第２の加熱ステップと、７２℃で３０秒間加熱する第３の加熱ステップとを順番に実行する加熱サイクルを２５回実施するように設定した。
次にサーマルサイクラーで加熱した後の鋳型ＤＮＡを全量（１０ｐｇ）採取して、上述の実施の形態と同様に、この前処理を施した加熱後の鋳型ＤＮＡ、プライマー（ＤＹＳ１９）及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ用バッファーに加えてＰＣＲ用反応液を作成し、このＰＣＲ用反応液を用いてＰＣＲを行った。なおこの場合のＰＣＲも、上述の本発明の実施の形態におけるＰＣＲの条件と同様の条件で、前処理における活性化バッファーに使用した化合物と同じ化合物を、活性化バッファーにそれぞれ添加した濃度と同じ濃度で添加して行った。
鋳型ＤＮＡに前処理を行った場合のＤＮＡの増幅の有無を確認するため、ＤＮＡの増幅バンド強度（単位Ｕ）を上述のデンシトメータで測定した。表３に、実施例１Ｂ，２Ｂ（四塩化バナジウム及び三塩化バナジウム）、比較例１Ｂ〜４Ｂ（バナジウム化合物以外の無機塩及びブランク）を列挙し、これらの増幅バンド強度（単位Ｕ）を示した。なお、この場合も、増幅バンド強度が８００以上の場合にＤＮＡが増幅したものと判定し、増幅バンド強度が８００より小さい場合はＤＮＡが増幅しなかったものと判定した。
表３において、実施例１Ｂ，２Ｂ及び比較例１Ｂ〜４Ｂの各増幅バンド強度を比較すると、比較例１Ｂ〜４Ｂの増幅バンド強度はいずれも０となったのに対して、実施例１Ｂ及び２Ｂの増幅バンド強度はいずれも１００００以上と極めて高いバンド強度となった。この結果は、ＰＣＲの前処理として三塩化バナジウムまたは四塩化バナジウムによる鋳型ＤＮＡの前処理（活性化）をしてからＰＣＲを行うことにより、１０ｐｇという極めて微量の試料ＤＮＡ（ＤＮＡ断片）からでもＤＮＡを増幅することができ、しかも毛髪から抽出したＤＮＡのような変性高度なＤＮＡでも増幅することができることを示している。
上述の鋳型ＤＮＡを活性化する場合において、四塩化バナジウム（実施例１Ｂ）を用いて鋳型ＤＮＡ活性化バッファーを調製したときの四塩化バナジウム（実施例１Ｂ）の最適濃度を確認した。具体的には、ＰＣＲを行う前に、上述のＰＣＲ用バッファーと同様の成分にモル濃度が０〜３．０ｍＭの範囲（実施例１Ｂ−１〜１Ｂ−６及び比較例１Ｂ−１〜１Ｂ−１１）になるように四塩化バナジウムを添加して鋳型ＤＮＡ活性化バッファーを調製し、これに上記の条件と同様の条件で、試料ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして１０ｐｇを混合し、前処理における活性化バッファーに使用した際の濃度と同じ濃度の四塩化バナジウムを添加して、サーマルサイクラーにて加熱した。そして、上記の条件と同様の条件で、この加熱後に得られた鋳型ＤＮＡを採取し、それぞれのＰＣＲ用反応液を作成してＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度を、上述のデンシトメータを用いて測定した。実施例１Ｂ−１〜１Ｂ−６及び比較例１Ｂ−１〜１Ｂ−１１の増幅バンド強度を表４に示す。また、表４の結果をグラフ化したものを図３に示す。なお、表４の結果についても、上記と同様に、増幅バンド強度が８００以上の場合にＤＮＡが増幅したものと判定し、増幅バンド強度が８００より小さい場合はＤＮＡが増幅しなかったものと判定した。
表４及び図３によれば、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９〜２．０ｍＭの範囲で鋳型ＤＮＡの前処理を行った場合（実施例１Ｂ−１〜１Ｂ−６）は、増幅バンド強度が約１５００〜１２５００Ｕと基準の８００Ｕを大幅に超えるバンド強度となったのに対して、それ以外の範囲で鋳型ＤＮＡの前処理を行った場合（比較例１Ｂ−１〜１Ｂ−１１）は、増幅バンド強度は８００Ｕより小さい値となった。これらの結果は、鋳型ＤＮＡの前処理を行う場合の四塩化バナジウムの最適モル濃度が０．９〜２．０ｍＭの範囲であり、この濃度範囲内で前処理した鋳型ＤＮＡを用いることにより、極めて微量（１０ｐｇ）の試料ＤＮＡからでもＤＮＡを増幅することができることを示している。したがって、実施例１Ｂ−１〜１Ｂ−６は本発明のＰＣＲ反応用バッファーと活性化用バッファーとが組み合わされた鋳型ＤＮＡ活性化用試薬キットとして用いることができる。
なお、四塩化バナジウムのモル濃度が０．９ｍＭよりも小さい場合は、四塩化バナジウムの添加量が少ないためにＤＮＡを増幅することができず、四塩化バナジウムのモル濃度が１．９ｍＭよりも大きいと、却ってＰＣＲの反応を阻害し、ＤＮＡを増幅することができなかったものと考えられる。
なお、図４（Ａ）は、上述のデンシトメータにおいて、表４及び図３の結果の一部の濃度範囲（四塩化バナジウムのモル濃度が、０．２〜４．０ｍＭ（０．２ｍＭ，０．４ｍＭ，１，８ｍＭ，２．２ｍＭ，２．５ｍＭ，４．０ｍＭの範囲）におけるＤＮＡの増幅バンドのアガロースゲル電気泳動像を撮影した写真であり、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の写真を説明するための模式図である。この写真によれば、四塩化バナジウムのモル濃度が１．８ｍＭのときに最も増幅バンドが濃くなっている。この図４の写真の結果は、表４及び図３の結果（実施例１Ｂ−５が最も増幅バンド強度が高い）に一致している。
上述の四塩化バナジウムによる鋳型ＤＮＡに前処理を施す場合は、前処理後にＰＣＲ用反応液を作成し、このＰＣＲ用反応液にさらに四塩化バナジウムを添加している。しかしながら、出願人は、四塩化バナジウムによる鋳型ＤＮＡに前処理を施すことにより、前処理後のＰＣＲ用反応液にさらに四塩化バナジウムを添加しないでＰＣＲを行っても、ＤＮＡの増幅効果が得られるのではないかと考えた。そこで、この考察に従って、四塩化バナジウムによる前処理を施した鋳型ＤＮＡを用いて、四塩化バナジウム等を添加しないＰＣＲ用反応液を作成し、これを用いてＰＣＲを実施することを試みた。
具体的には、上述の四塩化バナジウムによる前処理を施す条件と同様の条件で前処理した鋳型ＤＮＡを用いて、四塩化バナジウムを添加しないＰＣＲ用反応液を作成して通常のＰＣＲを行った。すなわち、四塩化バナジウムを添加しないＰＣＲ用反応液を作成してＰＣＲを行う条件で、四塩化バナジウム（実施例１Ｂ）を用いて鋳型ＤＮＡ活性化バッファーを調製したときの四塩化バナジウム（実施例１Ｂ）の最適濃度を確認した。この例では、ＰＣＲを行う前に上述のＰＣＲ用バッファーと同様の成分にモル濃度が０〜３．０ｍＭの範囲（実施例１Ｂ−７〜１Ｂ−１１及び比較例１Ｂ−１２〜１Ａ−２３）になるように四塩化バナジウムを添加して鋳型ＤＮＡ活性化バッファーを調製し、上記の条件と同様の条件でＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度を、上述のデンシトメータを用いて測定した。実施例１Ｂ−７〜１Ｂ−１１及び比較例１Ｂ−１２〜１Ａ−２３の増幅バンド強度を表５に示す。また、表５の結果をプロットしてグラフ化したものを図５に示す。なお、表５の結果についても、上記と同様に、増幅バンド強度が８００以上の場合にＤＮＡが増幅したものと判定し、増幅バンド強度が８００より小さい場合はＤＮＡが増幅しなかったものと判定した。
表５及び図５によれば、四塩化バナジウムのモル濃度が１．２〜２．０ｍＭの範囲で鋳型ＤＮＡの前処理を行った場合（実施例１Ｂ−７〜１Ｂ−１１）は、増幅バンド強度が約１８００〜２５００Ｕとなった。この数値は、ＰＣＲ用反応液に四塩化バナジウムを添加した場合ほどではないが、基準の８００Ｕを大幅に超えるバンド強度となっている。これに対して、それ以外のモル濃度範囲で鋳型ＤＮＡの前処理を行った場合（比較例１Ｂ−１２〜１Ａ−２３）では増幅バンド強度は８００Ｕより小さい値となりＤＮＡの増幅は見られなかった。これらの結果は、鋳型ＤＮＡの前処理を行う場合の四塩化バナジウムの最適モル濃度が１．２〜２．０ｍＭの範囲（実施例１Ｂ−７〜１Ｂ−１１）であり、この濃度範囲内で前処理した鋳型ＤＮＡを用いるだけで、ＰＣＲ用反応液に四塩化バナジウムを添加しなくても、極めて微量（１０ｐｇ）の試料ＤＮＡからでもＤＮＡを増幅することができることを示している。したがって、実施例１Ｂ−７〜１Ｂ−１１は、本発明の鋳型ＤＮＡ活性化用試薬として用いることができる。
上述のように、本発明の他の実施の形態では、四塩化バナジウムによる前処理を施した鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ用反応液に四塩化バナジウムを添加した場合と四塩化バナジウムを添加しない場合とでそれぞれＰＣＲを行った。出願人は、さらに他の実施の形態として、四塩化バナジウムの代わりに三塩化バナジウムを用いた場合、すなわち三塩化バナジウムによる前処理を施した鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加した場合と三塩化バナジウムを添加しない場合とでそれぞれＰＣＲの実施を試みた。具体的には、上述の四塩化バナジウムにより鋳型ＤＮＡに前処理を施す場合の条件と同様の条件で、三塩化バナジウム（実施例２Ｂ）を用いて鋳型ＤＮＡ活性化バッファーを調製したときの三塩化バナジウム（実施例１Ｂ）の最適濃度も確認した。この例では、ＰＣＲを行う前に、上述のＰＣＲ用バッファーと同様の成分にモル濃度が０〜３．０ｍＭの範囲で三塩化バナジウムを添加して鋳型ＤＮＡ活性化バッファーを調製し、ＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加した場合（実施例２Ｂ−１〜２Ｂ−６及び比較例２Ｂ−１〜２Ｂ−１１）及びＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加しない場合（実施例２Ｂ−７〜２Ｂ−１０及び比較例１Ｂ−１２〜１Ｂ−２４）にＰＣＲを行った。なお、この例では上述の条件で抽出した試料ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を２０ｐｇ用いた。また、前処理における活性化バッファーに使用した際の濃度と同じ濃度の四塩化バナジウムを添加した。これらの条件でそれぞれＰＣＲを行った場合のＤＮＡの増幅バンド強度を、上述のデンシトメータを用いて測定した。ＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加した場合（実施例２Ｂ−１〜２Ｂ−６及び比較例１Ｂ−１〜１Ｂ−１１）の増幅バンド強度を表６に示し、ＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加しない場合（実施例２Ｂ−７〜２Ｂ−１０及び比較例１Ｂ−１２〜１Ｂ−２４）の増幅バンド強度を表７に示す。また、表６及び７の結果をプロットしてグラフ化したものを図６及び図７にそれぞれ示す。なお、表６及び７の結果についても、上記と同様に、増幅バンド強度が８００以上の場合にＤＮＡが増幅したものと判定し、増幅バンド強度が８００より小さい場合はＤＮＡが増幅しなかったものと判定した。
まず、表６及び図６によれば、三塩化バナジウムのモル濃度が０．４〜１．５ｍＭの範囲（実施例２Ｂ−１〜２Ｂ−６）で鋳型ＤＮＡの前処理を行いかつＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加した場合は、増幅バンド強度が約９００〜１００００Ｕとなった。特に三塩化バナジウムのモル濃度が０．９ｍＭ（実施例２Ｂ−４）の場合に基準の８００Ｕを大幅に超える最も高い増幅バンド強度を示した。これに対して、それ以外の濃度範囲で鋳型ＤＮＡの前処理を行いかつＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加した場合（比較例２Ｂ−１〜２Ｂ−１１）では、増幅バンド強度は８００Ｕより小さい値となった。これらの結果は、鋳型ＤＮＡの前処理を行う場合の三塩化バナジウムの最適モル濃度が０．４〜１．５ｍＭの範囲であり、この濃度範囲内で前処理した鋳型ＤＮＡを用いることにより、極めて微量（２０ｐｇ）の試料ＤＮＡ（ＤＮＡ断片）からでもＤＮＡを増幅することができることを示している。
また、表７及び図７によれば、三塩化バナジウムのモル濃度が０．６〜１．２ｍＭの範囲で鋳型ＤＮＡの前処理を行いかつＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加しない場合（実施例２Ｂ−７〜２Ｂ−１０）は、増幅バンド強度が約８００〜１５００ＵとなりＤＮＡの増幅が確認された。これに対して、それ以外の範囲で鋳型ＤＮＡの前処理を行いかつＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加しない場合（比較例２Ｂ−１２〜２Ｂ−２４）では、増幅バンド強度は８００Ｕより小さい値となった。この結果は、鋳型ＤＮＡの前処理を行う場合の三塩化バナジウムの最適モル濃度が０．６〜１．２ｍＭの範囲であり、この濃度範囲内で前処理した鋳型ＤＮＡを用いることにより、極めて微量（２０ｐｇ）の試料ＤＮＡ（ＤＮＡ断片）からでもＤＮＡを増幅することができることを示している。
なお、三塩化バナジウムによる前処理を行った上で活性化用バッファーに三塩化バナジウムを添加しない場合（実施例２Ｂ−７〜２Ｂ−１０）の増幅バンド強度（約８００〜１５００Ｕという数値）は、三塩化バナジウムによる前処理を行った上でＰＣＲ用バッファーに三塩化バナジウムを添加した場合（実施例２Ｂ−１〜２Ｂ−６）のバンド強度（約１５００〜１３０００Ｕという数値）ほど高くはない。しかし、三塩化バナジウムによる前処理を鋳型ＤＮＡに施すことにより、ＰＣＲ用反応液に三塩化バナジウムを添加しなくても、極めて微量または変性高度なＤＮＡ断片が増幅できるように鋳型ＤＮＡを活性化することができたことを確認できた点で有意義である。
このように、最適濃度の三塩化バナジウムにより前処理が施された鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施することにより、従来のＰＣＲに比べてＤＮＡの増幅を著しく増強することができ、極めて微量または毛髪のように変性が高度なＤＮＡを増幅することができる。したがって、実施例２Ｂ−１〜２Ｂ−１０の活性化用バッファーは、本発明の鋳型ＤＮＡ活性化用試薬に用いることができる。
なお、本実施の形態では、ＰＣＲを用いてＤＮＡ断片を増幅する技術を対象としているが、本発明をＰＣＲ以外の耐熱性ポリメラーゼを用いてＤＮＡ断片を増幅する技術に用いてもよい。
本発明によれば、バナジウム化合物を添加したＰＣＲ用反応液に対してＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡの増幅を増強させることができるため、試料ＤＮＡが微量な場合でも、ＤＮＡを増幅することができる。また、本発明によれば、バナジウム化合物を用いて前処理した鋳型ＤＮＡを用いることにより、鋳型ＤＮＡが活性化されてＤＮＡの増幅をさらに増強させることができるため、試料ＤＮＡが極めて微量または変性高度な場合でも、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを増幅することができる。

Claims (36)

  1. ＰＣＲにより、細胞から抽出した鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡの増幅方法であって、
    前記鋳型ＤＮＡと、前記鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、前記鋳型ＤＮＡに結合した前記プライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＰＣＲ用反応液を調製するためのＰＣＲ用バッファーを調製するＰＣＲ用バッファー調製工程と、
    前記ＰＣＲ用バッファーにバナジウム化合物を添加する添加工程と、
    前記添加工程を経た前記ＰＣＲ用バッファーに、前記鋳型ＤＮＡ、前記プライマー及び前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを混合して前記ＰＣＲ用反応液を調製するＰＣＲ用反応液調製工程と、
    前記ＰＣＲ用反応液を用いて前記ＰＣＲを行うＰＣＲ工程とからなることを特徴とするＤＮＡの増幅方法。
  2. 前記添加工程における前記バナジウム化合物が、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種である請求項１に記載のＤＮＡの増幅方法。
  3. 前記バナジウム化合物のモル濃度が前記ＰＣＲ用バッファー中で０．４〜２．０ｍＭになるように前記ＰＣＲ用バッファーが調製されている請求項２に記載のＤＮＡの増幅方法。
  4. 前記鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ〜１ｎｇである請求項１、２または３に記載のＤＮＡの増幅方法。
  5. 前記ＰＣＲ用反応液調製工程の前処理工程として、前記ＰＣＲ用反応液調製工程における調製前の前記鋳型ＤＮＡを活性化させる活性化工程を含み、
    前記活性化工程は、
    バナジウム化合物が溶解した活性化用バッファーを調製する活性化用バッファー調製工程と、
    前記活性化用バッファーに前記調製前の前記鋳型ＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡ混合溶液を調製する混合溶液調製工程と、
    前記鋳型ＤＮＡ混合溶液を加熱する加熱工程と、
    前記加熱工程を経た前記鋳型ＤＮＡ混合溶液から前記鋳型ＤＮＡを抽出する抽出工程とからなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡの増幅方法。
  6. 前記活性化工程における加熱工程では、９０℃乃至１００℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第１の加熱ステップと、５０℃乃至６０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第２の加熱ステップと、６５℃乃至８０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第３の加熱ステップとを順番に実行する加熱サイクルを実施する請求項５に記載のＤＮＡの増幅方法。
  7. 前記加熱サイクルを、２５乃至３５回実施する請求項６に記載のＤＮＡの増幅方法。
  8. 前記活性化用バッファー調製工程における前記バナジウム化合物が、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種である請求項５に記載のＤＮＡの増幅方法。
  9. 前記バナジウム化合物が前記四塩化バナジウムである場合の前記四塩化バナジウムのモル濃度が０．９〜２．０ｍＭになるように前記活性化用バッファーが調製されている請求項８に記載のＤＮＡの増幅方法。
  10. 前記バナジウム化合物が前記三塩化バナジウムである場合の前記三塩化バナジウムのモル濃度が０．４〜１．５ｍＭになるように前記活性化用バッファーが調製されている請求項８に記載のＤＮＡの増幅方法。
  11. 前記調製前の前記鋳型ＤＮＡの量が１０〜１００ｐｇである請求項５，６，７，８、９または１０に記載のＤＮＡの増幅方法。
  12. ＰＣＲにより、細胞から抽出した鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡの増幅方法であって、
    前記鋳型ＤＮＡと、前記鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、前記鋳型ＤＮＡに結合した前記プライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＰＣＲ用反応液を調製するためのＰＣＲ用バッファーを調製するＰＣＲ用バッファー調製工程と、
    前記鋳型ＤＮＡ、前記プライマー及び前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを前記ＰＣＲ用バッファーに混合して前記ＰＣＲ用反応液を調製するＰＣＲ用反応液調製工程と、
    前記ＰＣＲ用反応液を用いて前記ＰＣＲを行うＰＣＲ工程とからなり、
    前記ＰＣＲ用反応液調製工程の前処理工程として、前記ＰＣＲ用反応液調製工程における調製前の前記鋳型ＤＮＡを活性化させる活性化工程を含み、
    前記活性化工程は、
    バナジウム化合物が溶解した活性化用バッファーを調製する活性化用バッファー調製工程と、
    前記活性化用バッファーに前記調製前の前記鋳型ＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡ混合溶液を調製する混合溶液調製工程と、
    前記鋳型ＤＮＡ混合溶液を加熱する加熱工程と、
    前記加熱工程を経た前記鋳型ＤＮＡ混合溶液から前記鋳型ＤＮＡを抽出する抽出工程とからなることを特徴とするＤＮＡの増幅方法。
  13. 前記活性化工程における加熱工程では、９０℃乃至１００℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第１の加熱ステップと、５０℃乃至６０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第２の加熱ステップと、６５℃乃至８０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第３の加熱ステップとを順番に実行する加熱サイクルを実施する請求項１２に記載のＤＮＡの増幅方法。
  14. 前記加熱サイクルを、２５乃至３５回実施する請求項１３に記載のＤＮＡの増幅方法。
  15. 前記活性化用バッファー調製工程における前記バナジウム化合物が、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種である請求項１２に記載のＤＮＡの増幅方法。
  16. 前記バナジウム化合物が前記四塩化バナジウムである場合の前記バナジウム化合物のモル濃度が１．２〜２．０ｍＭになるように前記活性化用バッファーが調製されている請求項１３に記載のＤＮＡの増幅方法。
  17. 前記バナジウム化合物が前記三塩化バナジウムである場合の前記バナジウム化合物のモル濃度が０．６〜１．２ｍＭになるように、前記活性化用バッファーが調製されている請求項１３に記載のＤＮＡの増幅方法。
  18. 前記調製前の前記鋳型ＤＮＡの量が１０〜１００ｐｇである請求項１２，１３，１４，１５，１６または１７に記載のＤＮＡの増幅方法。
  19. ＰＣＲにより、細胞から抽出した鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するための前処理として、前記鋳型ＤＮＡを活性化させる鋳型ＤＮＡの活性化方法であって、
    前記鋳型ＤＮＡと、前記鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、前記鋳型ＤＮＡに結合した前記プライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含むＰＣＲ用反応液を調製する前に、バナジウム化合物が溶解した活性化用バッファーを調製する活性化用バッファー調製工程と、
    前記活性化バッファーに前記鋳型ＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡ混合溶液を調製する混合溶液調製工程と、
    前記鋳型ＤＮＡ混合溶液を加熱する加熱工程と、
    前記加熱工程を経た前記鋳型ＤＮＡ混合溶液から前記ＰＣＲ用反応液を調製するための前記鋳型ＤＮＡを抽出する抽出工程とからなることを特徴とする鋳型ＤＮＡの活性化方法。
  20. 前記加熱工程では、９０℃乃至１００℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第１の加熱ステップと、５０℃乃至６０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第２の加熱ステップと、６５℃乃至８０℃で２０秒乃至４０秒間加熱する第３の加熱ステップとを順番に実行する加熱サイクルを実施する請求項１９に記載の鋳型ＤＮＡの活性化方法。
  21. 前記加熱サイクルを、２５乃至３５回実施する請求項２０に記載の鋳型ＤＮＡの活性化方法。
  22. 前記活性化用バッファー調製工程における前記バナジウム化合物が、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種である請求項１９に記載の鋳型ＤＮＡの活性化方法。
  23. 前記バナジウム化合物が前記四塩化バナジウムである場合の前記バナジウム化合物のモル濃度が０．９〜２．０ｍＭになるように前記活性化用バッファーが調製されている請求項２２に記載の鋳型ＤＮＡの活性化方法。
  24. 前記バナジウム化合物が前記三塩化バナジウムである場合の前記バナジウム化合物のモル濃度が０．４〜１．５ｍＭになるように前記活性化用バッファーが調製されている請求項２２に記載の鋳型ＤＮＡの活性化方法。
  25. 前記調製前の前記鋳型ＤＮＡの量が１０〜１００ｐｇである請求項１９，２０，２１，２２，２３または２４に記載の鋳型ＤＮＡの活性化方法。
  26. ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応により、鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するためのＤＮＡ増幅用試薬であって、
    前記鋳型ＤＮＡと、前記鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、前記鋳型ＤＮＡに結合した前記プライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＤＮＡ増幅用反応液を調製するためのＤＮＡ増幅用バッファーからなり、
    前記ＤＮＡ増幅用バッファーの成分にバナジウム化合物が含まれていることを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
  27. 前記ＤＮＡ増幅用バッファーの成分中の前記バナジウム化合物が、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種である請求項２６に記載のＤＮＡ増幅用試薬。
  28. 前記バナジウム化合物のモル濃度が０．４〜２．０ｍＭである請求項２７に記載のＤＮＡ増幅用試薬。
  29. 請求項２６に記載のＤＮＡ増幅用試薬を構成する前記ＤＮＡ増幅用バッファーと、
    前記ＤＮＡ増幅用反応液を調製する前に前記鋳型ＤＮＡを活性化するための活性化用バッファーとからなり、
    前記活性化用バッファーの成分にバナジウム化合物が含まれていることを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬キット。
  30. 前記活性化用バッファー成分中の前記バナジウム化合物が、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種である請求項２９に記載のＤＮＡ増幅用試薬キット。
  31. 前記バナジウム化合物が前記四塩化バナジウムの場合の前記バナジウムのモル濃度は０．９〜２．０ｍＭである請求項３０に記載のＤＮＡ増幅用試薬キット。
  32. 前記バナジウム化合物が前記三塩化バナジウムの場合の前記三塩化バナジウムのモル濃度は０．４〜１．５ｍＭである請求項３０に記載のＤＮＡ増幅用試薬キット。
  33. ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応により、鋳型ＤＮＡから特定のＤＮＡ断片を増幅するために前記鋳型ＤＮＡを活性化させる鋳型ＤＮＡ活性化用試薬であって、
    前記鋳型ＤＮＡと、前記鋳型ＤＮＡの特定領域に相補的なプライマーと、前記鋳型ＤＮＡに結合した前記プライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＤＮＡ増幅用反応液を調製する前に前記鋳型ＤＮＡを活性化するための活性化用バッファーからなり、
    前記活性化用バッファーの成分にバナジウム化合物が含まれていることを特徴とする鋳型ＤＮＡ活性化用試薬。
  34. 前記活性化用バッファーの成分中の前記バナジウム化合物が、三酸化バナジウム、四酸化バナジウム、五酸化バナジウム、メタバナジン酸アンモン、メタバナジン酸カリウム、メタバナジン酸ナトリウム、オキシ塩化バナジウム、二塩化バナジウム、三塩化バナジウム、四塩化バナジウムまたは硫酸バナジルから選択された１種である請求項３３に記載の鋳型ＤＮＡ活性化用試薬。
  35. 前記バナジウム化合物が前記四塩化バナジウムである場合の前記バナジウム化合物のモル濃度は０．９〜２．０ｍＭである請求項３４に記載の鋳型ＤＮＡ活性化用試薬。
  36. 前記バナジウム化合物が前記三塩化バナジウムである場合の前記バナジウム化合物のモル濃度が０．４〜１．５ｍＭである請求項３４に記載の鋳型ＤＮＡ活性化用試薬。
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