CN103443294A - 用于修饰核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及：用于修饰样品中所含的核酸的方法，所述方法包括在酸性多糖和
/
或核苷酸存在下使样品与核酸修饰剂接触的步骤；和用于选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)
根据修饰样品中所含的核酸的方法来修饰样品中所含的核酸的步骤，所述方法包括在酸性多糖和
/
或核苷酸存在下使样品与核酸修饰剂接触的步骤；和
(b)
从步骤
(a)
以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的步骤。本发明另外涉及用于这些方法中的试剂盒和组合物。
Description
技术领域
本发明涉及用于修饰核酸的方法，所述方法可有效地减少当进行核酸检测方法时由样品中含有的核酸衍生出的信号；用于所述方法中的试剂盒；和用于它们的组合物。
背景技术
目前，核酸检测技术是医学和生物学领域中的常用研究工具，且已经被广泛地用于定性和定量测量中。尤其是与以
PCR
方法为代表的核酸扩增方法相组合的这样的核酸检测技术，能够检测到非常少的细胞或微生物的存在，这通过靶向这些细胞或微生物特有的核酸来实现。因此，核酸检测技术已经被广泛地用作高灵敏度分析方法用于基础研究以及用于工业中。核酸检测技术还被用于分销渠道追踪和鉴定，其中将特定序列的核酸人工地掺入材料或物品中以标记它。
另一方面，利用核酸扩增方法的检测方法具有干扰其它样品的分析的问题，该问题是由在检测工作期间核酸扩增反应所产生的扩增核酸造成。由于核酸扩增反应会通过对数核酸扩增产生巨大数目的扩增产物分子，无意中存在于其它样品、试剂、试验装置或试验环境中的扩增产物可以作为模板被扩增，并由此可能得到错误的分析结果。
为了防止对扩增产物的这种人工扩增的目的，除了对样品、试剂、试验装置等的严谨操作和试验环境的清洁的一般性注意以外，还已经开发了用于防止扩增核酸干扰其它试验的手段。例如，已知生产对尿嘧啶
-N-
糖基化酶敏感的扩增核酸的方法，该方法包括：在含有脱氧尿嘧啶三磷酸的反应溶液中扩增核酸。通过在扩增反应之前用尿嘧啶
-N-
糖基化酶处理样品或反应溶液，可以降解从其它试验衍生出的扩增核酸。另外，还报道了防止核酸在核酸扩增反应中充当模板的方法，该方法包括：用光活化的补骨脂素化合物通过共价键来修饰核酸
(
非专利文献
1)
。
用于修饰核酸以防止它在核酸扩增反应中充当模板的技术还已经用于微生物的检测中。据称，源自死细胞的
DNA
会在样品中保留至细胞死亡后几天至
3
周。当
DNA
是通过平常程序从样品中提取时，它们包括源自活细胞和死细胞两者的
DNA
。因而，例如，当对样品进行灭菌处理时，如果使用核酸作为指标，微生物检测方法不会完全反映灭菌的结果。
作为上述问题的解决方案，已经报道了区分活细胞和死细胞的方法，所述方法包括核酸修饰剂与核酸扩增方法的组合
(
非专利文献
2,
专利文献
1)
。该基于核酸的检测方法是通过使用扩增的存在或速率作为指标来将活细胞与死细胞区分开的方法，所述方法包括：与诸如实时
PCR
等核酸扩增方法联合使用核酸修饰剂诸如单叠氮乙锭
(ethidium monoazide
，
EMA)
或单叠氮丙锭
(propidium
monoazide
，
PMA)
。例如，据报道，
EMA
会在可见光下活化以与核酸共价地键合，使得核酸扩增反应受到抑制。与此同时，在样品中保持处于游离状态的未结合的
EMA
通过与水分子的反应而被失活。源自活细胞（由于完整细胞壁和细胞膜，
EMA
没有侵入）的核酸不会经历
EMA
的作用。另一方面，源自死细胞（其已经被
EMA
侵入）的核酸被
EMA
修饰，使得以后的核酸扩增反应受到抑制。因而，当用上述核酸修饰剂处理由活细胞和死细胞的混合物组成的样品时，源自活细胞的核酸被选择性地扩增。迄今为止，这样的方法已经应用于许多微生物，以检测与死细胞区分开的活细胞，所述微生物例如大肠杆菌（
Escherichia
coli
）
O157
、鼠伤寒沙门氏菌（
Salmonella typhimurium
）、李斯特氏菌属（
Listeria
）、空肠弯曲杆菌（
Campylobacter jejuni
）和军团菌属（
Legionella
）。但是，已经报道，高浓度的核酸修饰剂会造成对活细胞的损伤，尽管它会确保与源自死细胞的核酸的结合。
因而，核酸的修饰具有多种应用。因此，需要更有效地修饰核酸的方法。
引文列表
专利文献
专利文献
1: JP-B 4127847
非专利文献。
非专利文献
1: Nucleic Acids Research,
第
19
卷
,
第
99-107
页
,
1991
非专利文献
2: Appl. Environ. Microbiol.,
第
73
卷
,
第
8028-8030
页
,
2007
发明内容。
技术问题
本发明的一个目的是，提供有效地修饰核酸的方法，所述核酸需要防止被检测出，从而改进各种基于核酸的检测技术的准确度。
问题的解决方案
本发明的发明人做出了深入研究来解决上述问题。结果，他们发现，通过使用修饰样品中所含的核酸的方法，可以比使用常规方法时更有效地修饰核酸，所述修饰样品中所含的核酸的方法包括下述步骤：在酸性多糖和
/
或核苷酸存在下，使样品与核酸修饰剂接触，然后完成了本发明。
也就是说，本发明一般地涉及下述的：
［１］修饰样品中所含的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：在酸性多糖和
/
或核苷酸存在下，使样品与核酸修饰剂接触；
［２］根据
[1]
所述的方法，其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物；
［３］根据
[2]
所述的方法，其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物；
［４］根据
[1]
所述的方法，其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素
B
，或所述核苷酸选自
DNA
和
dNTP
；
［５］选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)
通过根据权利要求
1
所述的方法，修饰样品中所含的核酸的步骤；和
(b)
从步骤
(a)
以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的步骤；
［６］根据
[5]
所述的方法，其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物；
［７］根据
[6]
所述的方法，其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物；
［８］根据
[5]
所述的方法，其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素
B
，或所述核苷酸选自
DNA
和
dNTP
；
［９］根据
[5]
所述的方法，其中所述步骤
(b)
通过核酸扩增方法进行；
［１０］根据
[9]
所述的方法，其中所述步骤
(b)
通过实时
PCR
进行；
［１１］试剂盒，其用于通过根据
[1]
所述的方法修饰样品中的核酸，所述试剂盒含有：
(a)
核酸修饰剂；和
(b)
酸性多糖和
/
或核苷酸，其将与
(a)
的核酸修饰剂一起使用；
［１２］根据
[11]
所述的试剂盒，其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物；
［１３］根据
[12]
所述的试剂盒，其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物；
［１４］根据
[11]
所述的试剂盒，其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素
B
，或所述核苷酸选自
DNA
和
dNTP
；
［１５］试剂盒，其用于通过根据
[5]
所述的方法选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸，所述试剂盒含有：
(a)
核酸修饰剂；
(b)
酸性多糖和
/
或核苷酸，其将与
(a)
的核酸修饰剂一起使用；和
(c)
用于核酸检测的试剂；
［１６］根据
[15]
所述的试剂盒，其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物；
［１７］根据
[16]
所述的试剂盒，其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物；
［１８］根据
[15]
所述的试剂盒，其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素
B
，或所述核苷酸选自
DNA
和
dNTP
；
［１９］一种组合物，其包含：
(a)
核酸修饰剂；和
(b)
酸性多糖和
/
或核苷酸；
［２０］根据
[19]
所述的组合物，其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物；
［２１］根据
[20]
所述的组合物，其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物；和
［２２］根据
[19]
所述的组合物，其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素
B
，或所述核苷酸选自
DNA
和
dNTP
。
发明效果
根据本发明的方法，在使样品与核酸修饰剂接触的处理中，可以增加核酸修饰效率，并且就增加食品卫生检查和临床试验的准确度而言，这是非常有用的。
具体实施方式
下面将详细描述本发明。
（１）本发明的核酸修饰方法
本发明的核酸修饰方法是修饰样品中所含的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：在酸性多糖和
/
或核苷酸存在下，使样品与核酸修饰剂接触。
作为本发明方法的对象的样品包括其中可存在核酸的所有样品。其例子包括：食品、农产品、海产品、生物组织和体液
(
例如，血液、尿、脊髓液和胸腔积液
)
、细胞培养液、化学产品
(
例如，药物、农用化学品和试剂
)
、工业用水、城市给水、地下水、河水、水库水（
impounded
water
）、雨水、排水（
drainage
）和土壤。具体地，所述食品包括饮料、甜点、乳制品、功能食品等。在本发明中，所述样品可以是上述产品、生物样品或环境样品本身，或者可以对它进行预处理诸如溶解、混悬、稀释、浓缩或纯化。预处理的例子包括热处理、过滤、离心等。作为预处理，也可以对样品进行减少存在于样品中的杂质（诸如蛋白和脂肪）的处理，例如，使用蛋白水解酶和脂解酶的酶处理。
在本发明中使用的核酸修饰剂是这样的物质：其可以通过它的作用而将核酸修饰成为不可检测形式。也就是说，核酸修饰剂的一个例子是造成选自下述的任一种的物质：与核酸的互补链杂交的能力的变化，作为互补链复制模板的功能的变化，原始序列的变化，和核酸的片段化，或它们的复数组合。因此，如在本发明中使用的核酸修饰包括：核酸修饰剂向核酸碱基对中的嵌入，核酸修饰剂与核酸的共价键合，核酸的交联，核酸碱基的置换，和核酸修饰剂对核酸的切割。适合用于本发明的核酸修饰剂的例子包括：
EMA (
单叠氮乙锭
)
、
PMA (
单叠氮丙锭
)
、二叠氮乙锭（
ethidium
diazide
）、补骨脂素化合物
[
补骨脂素、
4
’
-AMDMIP
(4
’
-
氨基甲基
-4,5
’
-
二甲基异补骨脂素
)
、
AMIP (5-
氨基甲基异补骨脂素
)
、
5-MIP (5-
甲基异补骨脂素
)
、
8-
甲氧基异补骨脂素（
8-methoxysopsorale
）等
]
和碘化丙锭。另外，可以使用商购可得的试剂，例如，商品名
SYTO
Red Fluorescent
、
BODIPY (4,4-
二氟
-4-
硼
-3a,
4a-
二氮杂
-s-
引达省
(indacene))
、
YO-PRO-1
染料、
Alexa
Fluor 488
膜联蛋白
V
、
C4-BODIPV500/510CY
、和
Hoechst
33258 (
都由
Molecular Probes Inc.
制造
)
。上述核酸修饰剂可以单独使用，或作为
2
种或更多种的混合物使用。此外，也可能使用在商购可得的试剂盒中含有的修饰剂，所述试剂盒例如
LIVE/DEAD
BacLight Bacterial Viability Kit
、
ViaGram
Red + Bacterial Gram Stain
或
Viability
Kit (
由
Molecular Probes Inc.
制造
)
。
可以根据样品来适当地选择在本发明中使用的核酸修饰剂的浓度和核酸修饰剂与样品接触的持续时间。例如，可以如下确定所述浓度和所述持续时间：将具有不同浓度的核酸修饰剂加入样品中，保持接触特定的时间段，并分析反应后核酸的修饰。在使用
EMA
的情况下，可以在下述条件下修饰核酸：例如，
EMA
终浓度为
1-100
μ
M
，且接触时间为
1
分钟至
48
小时，优选地
EMA
终浓度为
5-70
μ
M
，且接触时间为
3
分钟至
10
小时，更优选地
EMA
终浓度为
10-50
μ
M
，且接触时间为
5
分钟至
5
小时。使样品与核酸修饰剂接触的步骤可以在适合使用所述核酸修饰剂的条件下进行。
当在本发明的方法中使用可光活化的核酸修饰剂（诸如
EMA
、
PMA
或补骨脂素化合物）时，在使核酸修饰剂与样品接触后进行光辐照处理。在使用可光活化的核酸修饰剂的情况下，通常将核酸修饰剂加入样品中，以使核酸修饰剂与核酸在蔽光条件下在低温
(
例如，室温至
0
℃
)
接触，然后进行光辐照，但是本发明不限于该情况。用于光辐照处理的光的波长没有特别限制，只要它适合用于活化核酸修饰剂即可。例如，可以使用在
350-700
nm
波长的单波长光或包括
350-700 nm
波长的多波长光。根据要使用的核酸修饰剂、光源和样品，可以适当地选择光辐照处理的光强度和辐照时间。例如，可以如下确定光强度和辐照时间：使用不同的光强度和样品与光源之间的距离处理以后，分析核酸的修饰。在使用
EMA
的情况下，在下述条件下进行光辐照处理是可能的：例如，使用
1-1000W
的灯，
1-50 cm
的灯和样品之间的距离，和
1-20
分钟的辐照时间。此外，已经开发了具有低电力消耗和强光强度的
LED (
发光二极管
)
灯，并且可以用于本发明中。另外，所述光辐照处理优选地在低温
(
例如，在冰上
)
进行。
要在本发明的方法中使用的酸性多糖包括含有硫酸酯基团的硫酸化多糖，其代表为：含有硫酸岩藻糖的多糖、硫酸葡聚糖、角叉菜胶、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸鼠李聚糖（
rhamnan
sulfate
）、硫酸软骨素、硫酸软骨素
B (
硫酸皮肤素
)
等；多糖醛酸诸如透明质酸、海藻酸和果胶；和它们的盐。上述酸性多糖的盐的例子包括碱金属盐，诸如硫酸葡聚糖钠、海藻酸钠、肝素钠、硫酸葡聚糖钾和肝素锂。上述酸性多糖可以是天然存在的物质或化学地或酶促地合成的产物。另外，上述酸性多糖可以是未纯化的或部分纯化的或纯化的含有酸性多糖的产物。上述酸性多糖可以单独使用，或作为
2
种或更多种的混合物使用。
根据要使用的酸性多糖和样品，可以适当地选择和加入要在本发明的方法中使用的酸性多糖的浓度。例如，可以如下确定酸性多糖的浓度：在使用不同浓度的酸性多糖处理以后，分析核酸的修饰。例如，如果使用海藻酸钠，那么它的浓度是
1
μ
g/mL
至
100
mg/mL
，优选
10
μ
g/mL
至
10 mg/mL
，更优选
100
μ
g/mL
至
5
mg/mL
。例如，如果使用硫酸软骨素
B
，那么它的浓度是
10
μ
g/mL
至
1000 mg/mL
，优选
100
μ
g/mL
至
500
mg/mL
，更优选
1 mg/mL
至
100 mg/mL
。
如果在上述酸性多糖存在下使样品遭受核酸修饰剂的作用，那么样品中的游离核酸的修饰的比例增加，且与此同时，在允许接触核酸修饰剂的环境中的非游离核酸（尤其是
DNA
）（例如，与生物分子结合的核酸，和在具有增强的细胞膜渗透性的死细胞中含有的核酸）的修饰的比例也增加。因此，在核酸检测方法中减少衍生自这些核酸或
DNA
的干扰成为可能。本文中使用的短语“在酸性多糖存在下使样品遭受核酸修饰剂的作用”是指，“将酸性多糖人工地加入样品中，然后用核酸修饰剂处理所述样品”。
用于本发明的方法中的核苷酸或用于本发明中的核苷酸是指，构成核酸的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或包含它的类似物作为组分的物质。可以用于本发明中的核苷酸的例子包括、但不限于，
DNA
、
RNA
、寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、单核糖核苷酸
(
例如，单核糖核苷三磷酸
: NTP)
和单脱氧核糖核苷酸
(
例如，单脱氧核糖核苷三磷酸
:
dNTP)
。在本发明中还可以使用肌苷核苷酸、脱氧肌苷核苷酸、脱氧尿苷核苷酸和它们的三磷酸酯，它们是天然的核糖核苷酸类似物，和含有上述类似物的
DNA
、
RNA
、寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸。
NTP
包括单腺苷三磷酸
(ATP)
、单胸苷三磷酸
(TTP)
、单胞苷三磷酸
(CTP)
、单鸟苷三磷酸
(GTP)
和单尿苷三磷酸
(UTP)
。此外，
dNTP
包括单脱氧腺苷三磷酸
(dATP)
、单脱氧胸苷三磷酸
(dTTP)
、单脱氧胞苷三磷酸
(dCTP)
和单脱氧鸟苷三磷酸
(dGTP)
。本文中使用的核苷酸包括上述物质的盐
(
例如，碱金属盐
)
。上述核苷酸可以是天然产物或化学地或酶促地合成的产物。此外，上述核苷酸可以是未纯化的或部分纯化的或纯化的含有核苷酸的产物。上述核苷酸可以单独使用，或作为
2
种或更多种的混合物使用。作为本发明的一个方面，可以使用选自
DNA
和
dNTP
的核苷酸。在本发明中使用的
DNA
的例子包括、但不限于，源自可容易得到的动物的
DNA (
小牛胸腺
DNA
、鲑鱼精
DNA
等
)
和源自微生物的
DNA (
细菌基因组
DNA
、噬菌体
DNA
、质粒
DNA
等
)
。小牛胸腺
DNA
、λ噬菌体
DNA (
λ
DNA)
和
dNTP
可作为试剂商购得到，并且它们适合用于本发明。
根据要使用的核苷酸和样品，可以适当地选择和使用要在本发明的方法中使用的核苷酸的浓度。例如，可以如下确定核苷酸的浓度：使用不同浓度的核苷酸处理以后，分析核酸的修饰。例如，如果使用λ
DNA
，那么它的浓度是
10 ng/mL
至
10
mg/mL
，优选
100 ng/mL
至
1 mg/mL
，更优选
1
μ
g/mL
至
100
μ
g/mL
。例如，如果使用脱氧
NTP
，那么它的浓度是
10
μ
M
至
500 mM
，优选
100
μ
M
至
100 mM
，更优选
1 mM
至
50 mM
。
如果在上述核苷酸存在下使样品遭受核酸修饰剂的作用，那么样品中的游离核酸的修饰的比例增加，且与此同时，在允许接触核酸修饰剂的环境中的非游离核酸（尤其是
DNA
）（例如，与生物分子结合的核酸，和在具有增强的细胞膜渗透性的死细胞中含有的核酸）的修饰的比例也增加。因此，在核酸检测方法中减少衍生自这些核酸或
DNA
的干扰成为可能。本文中使用的短语“在核苷酸存在下使样品遭受核酸修饰剂的作用”是指，“将核苷酸人工地加入样品中，然后用核酸修饰剂处理所述样品”。
在本发明的方法、试剂盒和组合物中，可以联合使用一种或多种上述酸性多糖和一种或多种上述核苷酸。
（２）根据本发明的源自活细胞的核酸的选择性检测方法
在能够存活和生长的活细胞与不可逆损伤的死细胞的区分中，细胞膜完整性是重要的。根据本发明的核酸修饰方法，使用具有对细胞膜的选择性的核酸修饰剂，甚至可以修饰在细胞内的核酸，所述细胞具有增强的细胞壁和细胞膜的渗透性（所述核酸修饰剂可以侵入它）。另一方面，不会修饰在核酸修饰剂不可侵入的活细胞内的核酸。因而，根据本发明，提供了选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法。
本文中使用的术语“活细胞”表示维持生命活动的细胞，即，维持代谢能力和增殖能力的细胞。此外，所述活细胞在结构或形式方面没有实质性损伤。另一方面，死细胞具有细胞壁和
/
或细胞膜损伤，且具有减少的维持生命活动的能力。即使在适合细胞生长的条件下，死细胞通常不会生长。这样的死细胞处于细胞外物质可以侵入所述死细胞中的状态。
当将本发明的核酸修饰方法应用于其中可能存在细胞的样品时，仅活细胞中的核酸不受核酸修饰剂的作用的影响，并且它们保持能够通过核酸检测方法（例如，核酸扩增方法）检测出的状态。因此，本发明的方法的应用，使得特异性地检测活细胞（例如，微生物活细胞）的存在成为可能，而不论死细胞是否存在。
作为本发明方法的对象的细胞可以是真核细胞或原核细胞，且其例子包括：微生物诸如酵母、真菌和细菌、动物细胞和植物细胞。所述细菌包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阳性细菌的例子包括芽孢杆菌属细菌（蜡状芽孢杆菌（
B.
cereus
）、炭疽芽孢杆菌（
B. anthracis
）等）、葡萄球菌属细菌（金黄色葡萄球菌（
S. aureus
）、表皮葡萄球菌（
S. epidermidis
）等）、李斯特氏菌属细菌（单核增生李斯特氏菌（
L. monocytogenes
）等）、梭菌属细菌（肉毒梭菌（
C. botulinum
）、产气荚膜梭菌（
C. perfringens
）等）、链球菌属细菌（肺炎链球菌（
S. pneumoniae
）等）、分枝杆菌属细菌等。所述革兰氏阴性细菌的例子包括埃希氏菌属细菌（大肠杆菌（
E. coli
）等）、沙门氏菌属细菌（肠炎沙门氏菌（
S. enteritidis
）、鼠伤寒沙门氏菌（
S. typhimurium
）等）、弧菌属细菌（副溶血弧菌（
V. parahaemolyticus
）等）、年轻泰坦杆菌属细菌（以前的阪崎氏肠杆菌（
E. sakazaki
）等）、军团菌属细菌（嗜肺军团菌（
L. pneumophila
）等）、假单胞菌属细菌等。
如上所述，本发明的方法可以使用不同的样品作为对象进行。但是，从维持选择性的观点看，必须避免导致细胞膜损伤的样品处理。
本发明的检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法通过下述
(a)
和
(b)
步骤进行：
(a)
通过本发明的核酸修饰方法来修饰样品中所含的核酸的步骤；和
(b)
从步骤
(a)
以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的步骤。
本发明的方法中的步骤
(a)
是这样的步骤：如上面
(1)
中所述，在酸性多糖和
/
或核苷酸存在下，使样品与核酸修饰剂接触，从而修饰样品中的核酸。例如，可以如下修饰核酸：将核酸修饰剂和酸性多糖和
/
或核苷酸加入样品中，并将所述样品置于适当的条件下。在本发明的方法中，当使用如上面
(1)
中所述的可光活化的核酸修饰剂时，可以与步骤
(a)
同时地或在步骤
(a)
以后进行光辐照处理。另外，所述步骤
(a)
和所述光辐照处理可以重复几次，例如，
2-5
次。也就是说，可能重复地执行核酸修饰剂的添加和光辐照处理。在重复所述步骤
(a)
和所述光辐照处理的情况下，可以在光辐照处理以后向样品中加入适合样品中所含的活细胞的生长的培养基，如在
WO
2009/022558
中所述，并由此可以组合培养活细胞的步骤。
此外，在步骤
(a)
以后，可以进行除去核酸修饰剂的步骤。作为除去核酸修饰剂的方法，可以使用本领域已知的固液分离方法。这样的方法的例子包括：将样品离心以分离含有细胞的沉淀物和含有核酸修饰剂的上清液，然后除去上清液。在该情况下，在除去核酸修饰剂以后，也可以添加洗涤细胞的步骤。
另外，在步骤
(a)
以后，可以进行裂解活细胞的步骤和
/
或提取核酸的步骤。细胞裂解方法和核酸提取方法的例子包括多种方法，诸如蛋白水解酶
K/
苯酚提取方法、蛋白水解酶
K/
苯酚
/
氯仿提取方法、碱性裂解方法、碱
-SDS
方法和裂解酶方法，以及通过热处理实现的细胞破坏
(
热提取
)
。在这些方法中，根据在下面提及的、在步骤
(b)
中进行的核酸检测方法，可以选择合适的细胞裂解方法和
/
或合适的核酸提取方法。
在本发明的方法的步骤
(b)
中，通过从步骤
(a)
以后的样品选择性地检测未修饰的核酸，可以特异性地检测活细胞的核酸。也就是说，在基于核酸的活细胞检测中减少由死细胞的核酸造成的噪声成为可能，这使得以高灵敏度准确地检测活细胞在样品中的存在成为可能。
在步骤
(b)
中，根据步骤
(a)
的核酸修饰方法，可以适当地选择选择性地检测未修饰的核酸的方法。例如，如果作为死细胞
DNA (
以及游离
DNA)
的选择性修饰的结果，使用
DNA
作为模板的核酸扩增反应受到抑制，那么可以选择核酸扩增方法
(DNA
扩增方法
)
作为检测核酸的方法。所述
DNA
扩增方法包括
PCR
方法、
ICAN
方法、
LAMP
方法、
SDA
方法、
LCR
方法、
RCA
方法和
SMAP
方法。可以如下选择性地检测未修饰的核酸：对核酸扩增反应以后的反应溶液实施常规分析方法诸如凝胶电泳，从而分析扩增的核酸的量和碱基长度。此外，也可以使用实时检测和定量核酸的方法，且其例子包括嵌入剂方法、
TaqMan
方法、
Scorpion
方法、循环探针方法和杂交探针方法。在许多综述中描述了这些核酸扩增方法和实时检测方法，并且本领域技术人员能够从许多商购可得的试剂盒中做出选择。
在核酸扩增方法中或在实时检测方法中，可以根据要检测的细胞适当地选择要检测的核酸的靶区域。所述靶区域可以选自：细胞染色体的基因组序列，或附加体（诸如线粒体基因组、叶绿体基因组或质粒）的序列。此外，当在样品中含有与要检测的细胞不同类型的细胞时，优选的是，选择要检测的细胞特有的序列作为靶区域。也可以选择
2
种或更多种细胞共有的序列作为靶区域。另外，所述靶区域可以是一个区域，或可以是多个区域。也可能设定要检测的细胞特有的靶区域和广泛范围的细胞具有的靶区域。靶区域的长度是
40-5000
个碱基的长度，优选
60-1000
个碱基的长度，特别优选
70-200
个碱基的长度。
根据核酸扩增方法或实时检测方法，可以基于如上所述的靶区域来设计要在核酸扩增方法中或在实时检测方法中使用的引物或探针。
通过在靶向微生物的同时执行本发明的方法，检测在样品中存活的微生物是可能的。在核酸扩增方法中，靶基因
/
核酸区域没有特别限制，且可以考虑特异性和检测灵敏度来适当地选择。如果要检测的微生物是致病性细菌，可能选择来自致病性基因的靶区域，从而将属于相同种或属的致病性细菌与非致病性微生物区分开。致病性基因的例子包括：源自大肠杆菌
O-157
的
vero
细胞毒素
1
型或
2
型基因，源自产毒的大肠杆菌的耐热肠毒素基因
(STh)
或不耐热肠毒素基因
(STp)
，源自沙门氏菌属细菌的侵入因子（
invasive factor
）相关的基因
(invA)
，源自副溶血弧菌（
Vibrio
parahaemolyticus
）的耐热溶血素基因
(tdh)
，源自蜡状芽孢杆菌（
Bacillus cereus
）的呕吐毒素
(cereulide)
基因
(CRS)
，源自李斯特氏菌属细菌的内化蛋白
A
基因
(intA)
，源自阪崎肠杆菌（
Enterobacter sakazakii
）的外膜蛋白
A
基因
(ompA)
，源自弯曲杆菌属的细胞致死肿胀毒素
(cdt)
基因等。另外，编码被广泛用于微生物检测的核糖体
RNA (16SrRNA, 23SrRNA)
或它的间隔区的基因可以用作靶标。
进一步，下面举例说明了分析方法，其中采用实时
PCR
方法作为步骤
(b)
中的检测方法。在所述实时
PCR
方法中，监测荧光信号的变化。当提供
PCR
扩增产物时，荧光信号强度增加，并且绘制扩增曲线。一般而言，至多约
1-10
个
PCR
扩增循环的荧光强度的变化是等于
0
的噪声水平，且被视作样品空白
(
基线
)
。当与样品空白对比时，将其中观察到荧光信号的显著差异的荧光信号强度设定为阈值。将循环阈值
(Ct
值
)
定义为超过扩增曲线的阈值的
PCR
循环的数目。因而，当
PCR
反应溶液中的
DNA
模板的初始量越大时，
Ct
值越小，且当模板
DNA
的初始量越小时，
Ct
值越大。此外，随着靶区域中的核酸修饰的发生比例增加，
Ct
值是更大的值，即使核酸的总量是相同的。另外，可能通过解链曲线分析
(Tm
分析
)
来分析扩增产物的解链温度，以证实扩增产物是否源自靶区域。
（３）本发明的试剂盒和组合物
本发明的试剂盒是用于通过如上面
(1)
中所述的本发明的方法修饰样品中的核酸的试剂盒，所述试剂盒含有：
(a)
核酸修饰剂；和
(b)
酸性多糖和
/
或核苷酸，其将与
(a)
的核酸修饰剂一起使用。
另外，本发明的另一种试剂盒包括用于通过如上面
(2)
中所述的本发明的方法选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的试剂盒，所述试剂盒含有：
(a)
核酸修饰剂；
(b)
酸性多糖和
/
或核苷酸，其将与
(a)
的核酸修饰剂一起使用；和
(c)
用于核酸检测的试剂。
在本发明的试剂盒中含有的核酸修饰剂、酸性多糖和核苷酸如上面
(1)
中所述。在本发明的试剂盒中含有的用于核酸检测的试剂是如上面
(2)
中所述的核酸检测方法中使用的试剂。例如，当采用
PCR
方法作为核酸检测方法时，所述用于核酸检测的试剂包括反应缓冲液、用于扩增靶区域的引物对、
DNA
聚合酶、核苷、镁盐等。此外，取决于核酸检测方法，所述用于核酸检测的试剂包括检测反应所需的嵌入剂染料
[SYBR
(
注册商标
) Green I
等
]
、检测探针和酶
(
例如，
RNA
酶
H
等
)
。
本发明的试剂盒可以另外含有：用于稀释样品或核酸修饰剂的试剂、核酸修饰反应的缓冲液、描述本发明的方法的说明书、用于从样品中除去和清洁污染物的试剂、阳性对照、阴性对照，等。
本发明的组合物被用于如上面
(1)
中所述的本发明的核酸修饰方法中或如上面
(2)
中所述的本发明的选择性地检测源自活细胞的核酸的方法中，且含有
(a)
核酸修饰剂和
(b)
酸性多糖和
/
或核苷酸。在本发明的组合物中含有的核酸修饰剂、酸性多糖和核苷酸如上面
(1)
中所述。
如上面详细解释的，本发明提供了通过包含酸性多糖和
/
或核苷酸作为活性成分的增强剂来增强核酸修饰剂的作用的方法，以及提供了核酸修饰剂的增强剂，所述增强剂包含酸性多糖和
/
或核苷酸作为活性成分。所述方法和所述增强剂可用于修饰样品中的目标核酸，且可以应用于不同的工业领域中。
实施例
然后，将通过实施例更详细地描述本发明，但是本发明无意限于下述实施例。
实施例
1
酸性多糖的作用
使用已经向其中添加了酸性多糖
(
海藻酸钠或硫酸软骨素
B)
的大肠杆菌基因组
DNA
样品，进行
EMA
处理
1
次，并通过实时
PCR
方法对比
LacZ
基因作为靶区域时的检测灵敏度。
（１）样品的制备
在
TE
缓冲液
[10
mM Tris-HCl (pH 8.0)/0.1 mM EDTA]
中将从大肠杆菌
K-12
制备的基因组
DNA
调节至
1 x
108
个拷贝
/30
μ
L
，得到样本溶液。另外，向所述样本溶液中加入
100
μ
g
或
10
μ
g
海藻酸钠
(
海藻酸钠
80-120 cp
，由
Wako
Pure Chemical Industries
制造
,
目录号：
194-13321
，在下文中也被称作“
AlgNa
”
)
或
480
μ
g
硫酸软骨素
B (
硫酸皮肤素，由
Sigma
制造，目录号：
C3788)
作为酸性多糖。制备其中没有添加酸性多糖的样本溶液作为对照。然后，用无菌水将所有样本溶液调节至
50
μ
L
。在本文中，拷贝数表示从核酸重量计算出的拷贝数。
（２）
EMA
处理
将
EMA (
单叠氮溴化乙锭，由
Sigma-Aldrich Corporation
制造
:
目录号：
E2028)
在
DMSO
中完全溶解至
5 mM
，并在
-20
℃保存。当使用时，将该
EMA
溶液融化，并用无菌水稀释至
300
μ
M
。将
EMA
水溶液
(
各
5
μ
L)
加入各
50
μ
L
的基因组
DNA
的样本溶液中。将所述样本溶液在蔽光条件下在
4
℃静置
15
分钟。然后，将每个样本溶液放在冰上，并用放在离样本溶液
20 cm
距离处的
500 W
照相照明灯
(PRS
500 W: 100 V, 500 W
，由
Iwasaki Electric
Co., Ltd.
制造
)
辐照
5
分钟
(
从加入
EMA
溶液至光辐照的过程有时被称作“
EMA
处理”
)
。
此外，制备如在
(1)
中所述制备的样本溶液，但是不进行
EMA
处理。用无菌水将经过
EMA
处理的样本溶液和未经过
EMA
处理的样本溶液稀释至
100
μ
L
。
（３）靶向
LacZ
基因区域的
PCR (
扩增链长度
: 70 bp)
制备具有下述组成的
PCR
反应溶液
(
总体积
20
μ
L)
。
将在实施例
1-(2)
中制备的每个样本溶液
(1
μ
L)
用作模板
DNA
。换而言之，
20
μ
L
反应溶液含有
106
个大肠杆菌基因组拷贝作为模板
DNA
。作为对照，制备了包含
1
μ
L
灭菌水（替代稀释的样本溶液）的反应溶液。为了扩增靶区域的
LacZ
基因，在下述条件下对反应溶液进行
PCR
：在
95
℃保持
30
秒，然后进行
40
个循环的反应，其中每个循环由在
95
℃保持
5
秒和在
60
℃保持
30
秒组成。在所述反应中，使用实时
PCR
仪器
Thermal
Cycler Dice Real Time System (
由
Takara
Bio Inc.
制造，型号：
TP800)
或
Thermal Cycler Dice Real Time System II (
由
Takara Bio Inc.
制造，型号：
TP900)
，并且测量超过
PCR
扩增曲线上的阈值的循环的数目
(
在下文中被称作“
Ct
值”
)
。另外，在
PCR
以后，在使温度从
60
℃升高至
95
℃的条件下，进行扩增产物的解链曲线分析
(Tm
分析
)
。
（４）试验结果
通过实施例
1-(3)
中的
PCR
得到的
Ct
值和
Tm
分析值显示在表
1
中。
［表
1]
从表
1
可以看出，由于未经过
EMA
处理的样本溶液的
Ct
值没有变化，可以确认，酸性多糖的添加没有抑制
PCR
。当对比经过
EMA
处理的组的结果时，其中添加了酸性多糖的样本溶液的
Ct
值比没有添加酸性多糖的组减慢了约
1-5
。因而，酸性多糖的添加可能促进使用
EMA
的
DNA
修饰，从而导致
PCR
效率下降。另外，扩增产物的
Tm
分析值都是在
83.4
0.5
范围内，并且证实，没有发生任何非特异性的扩增。
实施例
2
酸性多糖在
3
次
EMA
处理中的作用
(1)
样品的制备
对从大肠杆菌
JM109
制备的基因组
DNA
进行
10
次
TE
缓冲液系列稀释，以制备含有
1 x
108
至
1 x 103
个拷贝
/30
μ
L
的基因组的
DNA
溶液。除此以外，以与实施例
1-(1)
中相同的方式，制备大肠杆菌基因组
DNA
的样本溶液。
（２）
EMA
处理
以与实施例
1-(2)
中相同的方式，对在实施例
2-(1)
中制备的大肠杆菌基因组
DNA
的样本溶液进行
EMA
处理。处理后，将另外
5
μ
L EMA
水溶液加入样本溶液中，并将使用可见光辐照的
EMA
处理重复
2
次。总计进行
3
次
EMA
处理。因此，在
3
次
EMA
处理后，样本溶液的体积为
65
μ
L
。
制备用
EMA
处理过的样本溶液和作为对照的没有用
EMA
处理过的样本溶液，并用无菌水调节至
100
μ
L
。
（３）靶向
LacZ
基因区域的
PCR
使用在实施例
2-(2)
中制备的每个样本溶液的稀释液
(1
μ
L)
作为模板
DNA
，以与实施例
1-(3)
中相同的方式，进行靶向
LacZ
基因区域的
PCR
。
20
μ
L
反应溶液含有
106
至
10
个大肠杆菌基因组拷贝作为模板
DNA
。
（４）试验结果
通过实施例
2-(3)
中的
PCR
得到的
Ct
值和
Tm
分析值显示在表
2
中。在这里，表中的符号“
-
”指示，没有检测到
PCR
对
LacZ
基因的扩增。
［表
2]
从表
2
可以看出，当对比经过
EMA
处理的组的结果时，在包含没有加入酸性多糖且含有
106
至
103
个基因组拷贝的样本溶液的反应溶液中检测到
LacZ
基因，而在包含向其中加入酸性多糖且含有
105
至
10
个基因组拷贝的样本溶液的反应溶液中没有检测到
LacZ
基因的扩增。因而，酸性多糖的添加可能促进使用
EMA
的
DNA
修饰，从而导致
PCR
效率的下降。另外，扩增产物的
Tm
分析值为
83.40.5
，从而表明，每个组的样本溶液没有差异。
实施例
3
酸性多糖在区分大肠杆菌的活细胞和死细胞中的作用
(1)
样品的制备
将
50
μ
L
大肠杆菌
JM109
感受态细胞
(
由
Takara Bio Inc.
制造，目录号：
9052)
接种进
5 mL LB
液体培养基中，并在约
130 rpm
摇动下在恒温浴中在
37
℃培养
13-16
小时，由此得到活细胞的混悬液。此外，将约
700
μ
L
活细胞的混悬液放入
1.5
mL
微管中，并用加热器在
100
℃加热
5
分钟，以制备死细胞的混悬液。
用新鲜
LB
液体培养基，将制备的大肠杆菌活细胞的混悬液系列稀释
10
倍，以制备
1
至
106
倍稀释的活细胞的混悬液。将死细胞的混悬液稀释
102
倍。向
20
μ
L
每份稀释的活细胞的混悬液中加入
10
μ
L 102
倍稀释的死细胞的混悬液。向如此制备的混合的活细胞和死细胞的混悬液中，加入
100
μ
g
海藻酸钠，并用无菌水调节至
50
μ
L
，以制备样本溶液。并且，在没有加入海藻酸钠的情况下用无菌水将混合的活细胞和死细胞的混悬液调节至
50
μ
L
，以制备样本溶液。
（２）
EMA
处理和
DNA
提取方法
以与实施例
2-(2)
中相同的方式，对在实施例
3-(1)
中制备的每个样本溶液进行
3
次
EMA
处理。因此，在
3
次
EMA
处理以后，样本溶液的体积为
65
μ
L
。用无菌水将用
EMA
处理过的样本溶液和作为对照的没有用
EMA
处理过的样本溶液调节至
100
μ
L
，并用加热器在
100
℃加热
5
分钟以热提取
DNA
。
（３）靶向
LacZ
基因区域的
PCR
将在实施例
3-(2)
中制备的每份热提取物在
15,000 rpm
离心
2
分钟。使用如此得到的上清液
(1
μ
L)
作为模板
DNA
，以与实施例
1-(3)
中相同的方式，进行靶向
LacZ
基因区域的
PCR
。
（４）试验结果
对于通过实施例
3-(3)
中的
PCR
得到的
Ct
值和
Tm
分析值，用
EMA
处理过的样本溶液的结果显示在表
3
中，没有用
EMA
处理过的大肠杆菌样本溶液的结果显示在表
4
中。此外，显示从
Ct
值和相关系数
(R2)
计算出标准曲线的方程式显示在表
5
中。在这里，表中的符号“
-
”指示，没有检测到
PCR
对
LacZ
基因的扩增。另外，表
5
中的
AlgNa
代表海藻酸钠。
［表
3]
。
［表
4]
［表
5]
从表
4
可以看出，当将特定量的死细胞的混悬液加入没有用
EMA
处理过且用高于
103
倍的稀释率稀释的样本溶液中时，得到了几乎相同的
Ct
值，不论是否存在海藻酸钠，从而表明海藻酸钠的加入没有改变
Ct
值。从表
3
可以看出，在用
EMA
处理过的样本溶液中，
Ct
值会反映活细胞的量，不论是否加入死细胞的混悬液。因而，
EMA
处理可能抑制以死细胞
DNA
作为模板的扩增。另外，从表
5
中的
R2
的数值可以看出，酸性多糖在
EMA
处理中的添加会改进相关系数，并且发现，可以定量地检测到小量的模板。此外，扩增产物的
Tm
分析值都是在
83.4
0.5
的范围内，并且证实，在该研究中没有发生任何非特异性的扩增。
实施例
4
核苷酸的作用
使用向其中加入λ
DNA
作为核苷酸的大肠杆菌基因组
DNA
样品，进行
EMA
处理
3
次，并通过靶向
LacZ
基因的实时
PCR
方法对比检测灵敏度。
（１）样品的制备
用
TE
缓冲液
[10
mM Tris-HCl (pH 8.0)/0.1 mM EDTA]
将从大肠杆菌
K-12
制备的基因组
DNA
系列稀释
10
倍，并调节至
5 x 107
个拷贝
/20
μ
L
至
5 x 10
个拷贝
/20
μ
L
，得到样本溶液。另外，向样本溶液中加入
250
ng
λ
DNA (
由
Takara Bio Inc.
制造，目录号：
3010)
作为核苷酸。制备没有向其中加入核苷酸的样本溶液作为对照。然后，用无菌水将所有样本溶液调节至
30
μ
L
。在这里，拷贝数表示从基因组
DNA
的重量计算出的拷贝数。
（２）
EMA
处理
将
EMA (
各
3
μ
L)
加入各
30
μ
L
的基因组
DNA
的样本溶液中，并以与实施例
2-(2)
中相同的方式共进行
3
次
EMA
处理。因此，在
3
次
EMA
处理以后，样本溶液的体积为
39
μ
L
。
此外，制备如在实施例
4-(1)
中所述制备的样本溶液，但是不进行
EMA
处理。用无菌水将经过
EMA
处理的样本溶液和未经过
EMA
处理的样本溶液稀释至
50
μ
L
。
（３）靶向
LacZ
基因的
PCR
制备具有下述组成的
PCR
反应溶液
(
总体积
20
μ
L)
。
4 pmol/
μ
L, LacZ-R DNA (
序列
ID NO
2): 1
μ
L
将在实施例
4-(2)
中制备的每个样本溶液
(1
μ
L)
用作模板
DNA
。换而言之，
20
μ
L
反应溶液含有模板
DNA
的
106
个拷贝至
1
个拷贝。作为对照，制备了包含
1
μ
L
灭菌水（替代稀释的样本溶液）的反应溶液。为了扩增靶
LacZ
基因，在下述条件下对反应溶液进行
PCR
：在
95
℃保持
30
秒，然后进行
40
个循环的反应，其中每个循环由在
95
℃保持
5
秒和在
60
℃保持
30
秒组成。在所述反应中，使用实时
PCR
仪器
Thermal
Cycler Dice Real Time System (
由
Takara
Bio Inc.
制造，型号：
TP800)
或
Thermal Cycler Dice Real Time System II (
由
Takara Bio Inc.
制造，型号：
TP900)
。基于
PCR
扩增曲线来计算
Ct
值。基于校正曲线来计算定量的拷贝数
(
在下文中被称作“
Qty
值”
)
。另外，在
PCR
以后，在使温度从
60
℃升高至
95
℃的条件下，进行扩增产物的解链曲线分析
(Tm
分析
)
。
（４）试验结果
通过实施例
4-(3)
中的
PCR
得到的
Ct
值和
Tm
分析值显示在表
6
中。在这里，表中的符号“
-
”指示，没有检测到
PCR
对
LacZ
基因的扩增。
［表
6]
从表
6
可以看出，当对比情况
2
和
4
（其中进行
EMA
处理）的
Qty
值时，在没有加入核苷酸的情况
2
中，从含有
106
至
104
个基因组
DNA
拷贝的反应溶液中检测出数十个至数百个基因组
DNA
拷贝，而在加入核苷酸的情况
4
中，检测到几个拷贝或更少的基因组
DNA
，其几乎等于检测限或更低。因而，核苷酸的加入可能促进使用
EMA
的
DNA
修饰，从而导致
PCR
效率的降低。另外，扩增产物的
Tm
分析值为
83.6
0.5
，从而表明在样本溶液和各个组之间没有差异。
实施例
5
核苷酸在区分大肠杆菌的活细胞和死细胞中的作用
(1)
样品的制备
将
50
μ
L
大肠杆菌
JM109
感受态细胞
(
由
Takara Bio Inc.
制造，目录号：
9052)
接种进
5 mL LB
液体培养基中，并在约
130 rpm
摇动下在恒温浴中在
37
℃培养
13-16
小时，由此得到活细胞的混悬液。此外，将约
700
μ
L
活细胞的混悬液放入
1.5
mL
微管中，并用加热器在
100
℃加热
5
分钟，以制备死细胞的混悬液。
用新鲜
LB
液体培养基，将制备的大肠杆菌活细胞的混悬液系列稀释
10
倍，以制备
1
至
106
倍稀释的活细胞的混悬液。将死细胞的混悬液稀释
102
倍。向
15
μ
L
每份稀释的活细胞的混悬液中加入
10
μ
L 102
倍稀释的死细胞的混悬液。向如此制备的混合的活细胞和死细胞混悬液中，加入
250
μ
g
λ
DNA
作为核苷酸，并用无菌水调节至
30
μ
L
，以制备样本溶液。并且，在没有加入λ
DNA
的情况下用无菌水将混合的活细胞和死细胞的混悬液调节至
30
μ
L
，以制备样本溶液。
（２）
EMA
处理和
DNA
提取方法
以与实施例
4-(2)
中相同的方式，对在实施例
5-(1)
中制备的每个样本溶液进行
3
次
EMA
处理。在
3
次
EMA
处理以后，样本溶液的体积为
39
μ
L
。用无菌水将用
EMA
处理过的样本溶液和作为对照的没有用
EMA
处理过的样本溶液调节至
50
μ
L
，并用加热器在
100
℃加热
5
分钟以热提取
DNA
。
（３）靶向
LacZ
基因的
PCR
将在实施例
5-(2)
中制备的每份热提取物在
15,000 rpm
离心
2
分钟，并使用
1
μ
L
上清液作为模板
DNA
，以与实施例
4-(3)
中相同的方式，进行靶向
LacZ
基因的
PCR
。
（４）试验结果
通过实施例
5-(3)
中的
PCR
得到的
Ct
值和
Tm
分析值的结果显示在表
7
中。此外，显示从
Ct
值和相关系数
(R2)
计算出标准曲线的方程式显示在表
8
中。在这里，表中的符号“
-
”指示，没有检测到
PCR
对
LacZ
基因的扩增。
［表
7]
［表
8]
从表
7
可以看出，当将特定量的死细胞的混悬液加入没有用
EMA
处理过且用高于
103
倍的稀释率稀释的样本溶液中时，得到了几乎相同的
Ct
值，从而表明λ
DNA
的加入没有改变
Ct
值。从表
7
可以看出，在用
EMA
处理过的样本溶液中，
Ct
值会反映活细胞的量，不论是否加入死细胞的混悬液。因而，
EMA
处理可能抑制以死细胞
DNA
作为模板的扩增。另外，从表
8
中的
R2
的数值可以看出，核苷酸在
EMA
处理中的添加会改进相关系数，并且发现，可以定量地检测到小量的模板。此外，扩增产物的
Tm
分析值都是在
83.6
0.5
的范围内，并且证实，在该研究中没有发生任何非特异性的扩增。
实施例
6
核苷酸的作用
使用向其中加入了
dNTP
作为核苷酸的大肠杆菌基因组
DNA
样品，进行
EMA
处理，并通过靶向
LacZ
基因或
16SrDNA
的实时
PCR
方法对比了检测灵敏度。
（１）样品的制备
用
TE
缓冲液将从大肠杆菌
K-12
制备的基因组
DNA
系列稀释
10
倍，并调节至
1 x 108
至
1 x 105
个拷贝
/40
μ
L
，并向其中加入下述核苷酸以得到样本溶液：向其中加入了各
250
μ
mol
或各
125
μ
mol
的
dATP
、
dTTP
、
dCTP
和
dGTP (
由
Takara
Bio Inc.
制造，目录号：
4026-4029)(
脱氧核苷酸三磷酸的总重量：
1000
μ
mol
或
500
μ
mol)
的样本溶液；向其中加入了
500
μ
mol
上述
4
种脱氧核苷酸三磷酸之一的样本溶液；向其中加入了各
250
μ
mol
的
dATP
和
dGTP
的样本溶液；和作为对照的没有向其中加入
dNTP
的样本溶液。
用无菌水将所有上述样本溶液调节至
50
μ
L
，并用于如下所述的处理
(2)
中。
（２）
EMA
处理
除了加入
5
μ
L EMA
水溶液以外，以与实施例
4-(2)
相同的方式，用
EMA
处理在实施例
6-(1)
中制备的每个样本溶液仅
1
次。
此外，制备如在实施例
6-(1)
中所述制备的样本溶液，但是不进行
EMA
处理。用无菌水将经过
EMA
处理的样本溶液和未经过
EMA
处理的样本溶液稀释至
100
μ
L
。
（３）靶向
LacZ
基因或
16SrDNA
的
PCR
制备具有下述组成的
PCR
反应溶液
(
总体积
20
μ
L)
。
在这里，以下述
3
种组合将正向引物和反向引物加入
PCR
反应溶液中。
(A)
用于扩增
LacZ
基因的一部分
(70 bp)
的组合
(B)
用于扩增
LacZ
基因的一部分
(177 bp)
的组合
4 pmol/
μ
L, LacZ-R_177 DNA (SEQ ID NO 3): 1
μ
L
(C)
用于扩增
16SrDNA
的一部分
(95 bp)
的组合
使用在实施例
6-(2)
中制备的每个样本溶液
(1
μ
L)
作为模板
DNA
。也就是说，
20
μ
L
反应溶液含有
106
至
103
个大肠杆菌基因组拷贝作为模板
DNA
。除了以上方面以外，以与实施例
4-(3)
相同的方式进行
PCR
。
（４）试验结果
对于通过实施例
6-(3)
中的
PCR
得到的
Ct
值和
Tm
分析值，引物对
(A)
的结果显示在表
9
中，引物对
(B)
的结果显示在表
10
中，引物对
(C)
的结果显示在表
11
和表
12
中。在这里，表中的符号“
-
”指示，没有检测到
PCR
对
LacZ
基因或
16SrDNA
的扩增。
［表
9]
。
［表
10]
［表
11]
［表
12]
从表
9
和
10
可以看出，在没有
EMA
处理的情况下，在加入或不加入
dNTP
的情况下没有观察到
Ct
值的差异，并且
Ct
值依赖于模板的拷贝数而下降。因而，证实了
dNTP
的加入不会影响
PCR
。此外，与没有
EMA
处理的情况相比，
EMA
处理使
Ct
值增加了约
10
个循环，且核苷酸的加入进一步使
Ct
值增加了
4-5
个循环，或者使扩增产物的量低于或等于检测限。因而，核苷酸的加入可能促进使用
EMA
的
DNA
修饰，从而导致
PCR
效率的降低。从表
11
和表
12
可以看出，对于
16SrDNA
的检测，得到了相同的结果。因而，发现了在加入核苷酸以后使用
EMA
处理会促进模板
DNA
的修饰，不论加入的核苷酸的种类如何。在这里，扩增产物的
Tm
分析值为
83.0
0.5
（对于引物对
(A)
）、
85.5
0.5
（对于引物对
(B)
）和
82.0
0.5
（对于引物对
(C)
），并且在样本溶液之间没有差异。
工业适用性
根据本发明，在使样品与核酸修饰剂接触的处理中，可以增加核酸修饰效率。因此，本发明提供了以高灵敏度选择性地检测活细胞的核酸的方法，和用于所述方法的试剂盒和组合物。因而，就增加食品卫生检查和临床试验的准确度而言，本发明是非常有用的。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1
：
LacZ-F
的核苷酸序列
SEQ ID NO: 2
：
LacZ-R
的核苷酸序列
SEQ ID NO: 3
：
LacZ-R_177
的核苷酸序列
SEQ ID NO: 4
：
16S-F_95
的核苷酸序列
SEQ ID NO: 5：16S-R的核苷酸序列
序列表
<110> TAKARA BIO INC.
<120> 用于修饰核酸的方法
<130> 670733
<150> JP 2011-012363
<151> 2011-01-24
<150> JP 2011-012372
<151> 2011-01-24
<160> 5
<170> PatentIn 3.1版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LacZ-F的核苷酸序列
<400> 1
cctgaggccg atactgtcgt
20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LacZ-R的核苷酸序列
<400> 2
ttggtgagat gggcgcat
18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LacZ-R_177的核苷酸序列
<400> 3
gccttcctgt agccagcttt c 21
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16S-F_95的核苷酸序列
<400> 4
agcctgatgc agccat 16
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16S-R的核苷酸序列
<400> 5
gagcaaaggt attaacttta ctc 23
Claims (22)
1.一种修饰样品中所含的核酸的方法，该方法包括下述步骤：在酸性多糖和/或核苷酸存在下，使该样品与核酸修饰剂接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭(ethidium
monoazide)和单叠氮丙锭(propidium monoazide)的化合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B，或该核苷酸选自DNA和dNTP。
5.一种选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法，该方法包括下述步骤：
(a) 通过根据权利要求1所述的方法，修饰该样品中所含的核酸的步骤；和
(b) 从步骤(a)以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物。
8.根据权利要求5所述的方法，其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B，或该核苷酸选自DNA和dNTP。
9.根据权利要求5所述的方法，其中该步骤(b)通过核酸扩增方法进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该步骤(b)通过实时PCR进行。
11.一种试剂盒，其用于通过根据权利要求1所述的方法来修饰样品中的核酸，该试剂盒含有：
(a) 核酸修饰剂；和
(b) 酸性多糖和/或核苷酸，其将与(a)的核酸修饰剂一起使用。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物。
14.根据权利要求11所述的试剂盒，其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B，或该核苷酸选自DNA和dNTP。
15.一种试剂盒，其用于通过根据权利要求5所述的方法来选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸，该试剂盒含有：
(a) 核酸修饰剂；
(b) 酸性多糖和/或核苷酸，其将与(a)的核酸修饰剂一起使用；和
(c) 用于核酸检测的试剂。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物。
18.根据权利要求15所述的试剂盒，其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B，或该核苷酸选自DNA和dNTP。
19.一种组合物，其包含：
(a) 核酸修饰剂；和
(b) 酸性多糖和/或核苷酸。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合物。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化合物。
22.根据权利要求19所述的组合物，其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B，或该核苷酸选自DNA和dNTP。
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| JP2011012363 | 2011-01-24 | ||
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-
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Non-Patent Citations (1)
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| ANDREAS NOCKER ET AL.: "Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide", 《APPL. ENVIRON. MICROBIOL.》, vol. 72, no. 3, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 1997 - 2004 * |
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