WO2012102208A1 - 核酸修飾方法 - Google Patents

核酸修飾方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012102208A1
WO2012102208A1 PCT/JP2012/051230 JP2012051230W WO2012102208A1 WO 2012102208 A1 WO2012102208 A1 WO 2012102208A1 JP 2012051230 W JP2012051230 W JP 2012051230W WO 2012102208 A1 WO2012102208 A1 WO 2012102208A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
sample
nucleotides
modifying agent
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/051230
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
山本　純子
恵子 久保
上森　隆司
向井　博之
浅田　起代蔵
Original Assignee
タカラバイオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by タカラバイオ株式会社 filed Critical タカラバイオ株式会社
Priority to CN201280014786.1A priority Critical patent/CN103443294B/zh
Priority to EP12739127.4A priority patent/EP2669385B1/en
Priority to JP2012554769A priority patent/JP5766216B2/ja
Priority to EP17155621.0A priority patent/EP3187598B1/en
Priority to US13/980,970 priority patent/US9458498B2/en
Priority to KR1020137021390A priority patent/KR101609224B1/ko
Publication of WO2012102208A1 publication Critical patent/WO2012102208A1/ja
Priority to US15/252,663 priority patent/US9670478B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for modifying a nucleic acid that is effective in reducing a signal derived from a nucleic acid contained in a sample in the execution of a nucleic acid detection method, a kit used for the method, and a composition.
  • Nucleic acid detection technology is currently a general research technique in the fields of medicine and biology, and is widely used in qualitative and quantitative measurements.
  • the combination with the nucleic acid amplification method represented by the PCR method makes it possible to detect the presence of very few cells and microorganisms using these cells and nucleic acids peculiar to microorganisms as a target.
  • As basic research it became widely used throughout the industry.
  • by using artificially mixed nucleic acids of a specific sequence and labeling substances and articles they are also used for tracking distribution channels and determining authenticity.
  • the detection method using the nucleic acid amplification method causes a problem of interference with analysis of other samples by the amplified nucleic acid generated by the nucleic acid amplification reaction during the detection operation.
  • amplification products with enormous number of molecules are generated by logarithmic nucleic acid amplification, so incorrect analysis for amplification that occurs using amplification products mixed in other samples, reagents, test instruments and test environments as templates Results may occur.
  • Non-patent Document 1 a method in which a photoactivated psoralen compound is covalently bonded to a nucleic acid to prevent the nucleic acid from functioning as a template in a nucleic acid amplification reaction.
  • Non-patent Document 2 a method for distinguishing between live and dead cells in which a nucleic acid modifying agent and a nucleic acid amplification method are combined has been reported (Non-patent Document 2, Patent Document 1).
  • This nucleic acid-based detection method uses ethidium monoazide (EMA) or propidium monoazide (PMA) as a nucleic acid modifying agent, and combines with nucleic acid amplification methods such as real-time PCR to determine whether or not live cells and dead cells are amplified.
  • EMA ethidium monoazide
  • PMA propidium monoazide
  • EMA has been reported to be activated under visible light to covalently bind to nucleic acids and inhibit nucleic acid amplification reactions.
  • nucleic acids derived from living cells into which EMA has not invaded by an intact cell membrane or cell wall are not affected by EMA.
  • nucleic acid derived from dead cells invaded by EMA is modified by EMA, and subsequent nucleic acid amplification reaction is inhibited. Therefore, by treating a sample comprising a mixture of living cells and dead cells with the nucleic acid modifying agent, nucleic acids derived from living cells are selectively amplified.
  • the nucleic acid modification method has various uses, a method for modifying the nucleic acid more efficiently is demanded.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently modifying a nucleic acid desired to prevent detection, and to improve the accuracy of various nucleic acid-based detection techniques.
  • the present inventors have achieved a method for modifying a nucleic acid contained in a sample, which comprises a step of bringing the sample into contact with a nucleic acid modifying agent in the presence of acidic polysaccharides and / or nucleotides.
  • the present inventors have found that nucleic acid modification can be carried out more efficiently than in the prior art, and have completed the present invention.
  • a method for modifying a nucleic acid contained in a sample comprising a step of contacting the sample with a nucleic acid modifying agent in the presence of acidic polysaccharides and / or nucleotides.
  • the nucleic acid modifying agent is a compound that modifies a nucleic acid by photoactivation
  • the nucleic acid modifier is a compound selected from ethidium monoazide and propidium monoazide.
  • nucleic acid modifier is a compound selected from ethidium monoazide and propidium monoazide.
  • the acidic polysaccharide is an acidic polysaccharide selected from sodium alginate and chondroitin sulfate B, or the nucleotides are nucleotides selected from DNA and dNTPs,
  • step (b) is performed by a nucleic acid amplification method
  • step (b) is performed by real-time PCR
  • nucleic acid modifier is a compound selected from ethidium monoazide and propidium monoazide.
  • the acidic polysaccharide is an acidic polysaccharide selected from sodium alginate and chondroitin sulfate B, or the nucleotides are nucleotides selected from DNA and dNTPs,
  • nucleic acid modifier is a compound selected from ethidium monoazide and propidium monoazide.
  • the acidic polysaccharide is an acidic polysaccharide selected from sodium alginate and chondroitin sulfate B, or the nucleotides are nucleotides selected from DNA and dNTPs, [19] (A) a nucleic acid modifying agent; and (b) acidic polysaccharides and / or nucleotides; A composition comprising, [20] The composition according to [19], wherein the nucleic acid modifying agent is a compound that modifies a nucleic acid by photoactivation.
  • composition according to [20] wherein the nucleic acid modifier is a compound selected from ethidium monoazide and propidium monoazide, and [22] an acidic polysaccharide in which the acidic polysaccharide is selected from sodium alginate and chondroitin sulfate B Or a composition according to [19], wherein the nucleotides are nucleotides selected from DNA and dNTPs.
  • the method of the present invention can improve the efficiency of nucleic acid modification in the treatment of bringing a sample into contact with a nucleic acid modifying agent, and is extremely useful for improving the accuracy of food hygiene tests and clinical tests.
  • the method for modifying a nucleic acid of the present invention includes a step of bringing a sample into contact with a nucleic acid modifying agent in the presence of acidic polysaccharides and / or nucleotides, and a method for modifying a nucleic acid contained in a sample. It is.
  • the samples to be subjected to the method of the present invention are all samples in which nucleic acids may exist.
  • food agricultural products, marine products, biological tissues and body fluids (blood, urine, spinal fluid, pleural effusion, etc.), cell culture solutions, chemical products (pharmaceuticals, agricultural chemicals, reagents, etc.), industrial water, city water, groundwater, river water , Water storage, rainwater, drainage or soil.
  • the food includes beverages, confectionery, dairy products, functional foods and the like.
  • the sample may be a product, a biological sample, or an environmental sample itself as described above, and may be a sample obtained by pretreatment such as dissolution, suspension, dilution, concentration, or purification. .
  • pretreatment examples include heat treatment, filtration, and centrifugation. Further, as a pretreatment, a treatment for reducing impurities such as proteins and fats present in the sample, for example, an enzyme treatment with a proteolytic enzyme and a lipolytic enzyme may be performed.
  • the nucleic acid modifying agent used in the present invention is a substance that can be modified to a form in which a nucleic acid cannot be detected by its action. That is, one of a change in the ability to form a hybrid with a complementary strand of nucleic acid, a change in function as a template in complementary strand replication, a change in the original sequence, and a fragmentation of nucleic acid, or a combination of these
  • the substance which causes is illustrated.
  • the modification of the nucleic acid in the present invention includes intercalation of the nucleic acid modifying agent to the nucleobase pair, covalent bonding of the nucleic acid modifying agent to the nucleic acid, cross-linking of the nucleic acid, substitution of the nucleobase, nucleic acid modification by the nucleic acid modifying agent. Cutting included.
  • Suitable nucleic acid modifying agents for the present invention include EMA (ethidium monoazide), PMA (propidium monoazide), ethidium diazide, psoralen compound (psoralen), 4'-AMDMIP (4'-aminomethyl-4,5'- dimethylphosphosoralen), AMIP (5-aminothysoposalene), 5-MIP (5-methysopsoralen), 8-methoxypsoralen, etc.] and propidium iodide.
  • modifying agents contained in commercially available kits such as LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, ViaGram Red + Bacterial Gram Stain, Viability Kit (manufactured by Molecular Probe) can also be used.
  • the concentration of the nucleic acid modifying agent used in the present invention and the time of contact with the sample can be appropriately set according to the sample. For example, a plurality of concentrations of the nucleic acid modifying agent are added to the sample, and the time is constant. It can be determined by contacting and analyzing the modification of the nucleic acid after the reaction.
  • the nucleic acid is modified under conditions of a final concentration of 1 to 100 ⁇ M, 1 minute to 48 hours, preferably 5 to 70 ⁇ M, 3 minutes to 10 hours, more preferably 10 to 50 ⁇ M, 5 minutes to 5 hours. be able to.
  • the step of bringing the sample into contact with the nucleic acid modifying agent may be performed under conditions suitable for the nucleic acid modifying agent to be used.
  • the sample is brought into contact with the nucleic acid modifying agent, followed by light irradiation treatment.
  • a nucleic acid modifying agent that undergoes photoactivation such as EMA, PMA, psoralen compound, etc.
  • the nucleic acid modifying agent is usually added to a sample, and the nucleic acid and the nucleic acid modifying agent are kept at low temperatures (for example, After the contact at room temperature to 0 ° C., light irradiation treatment is performed.
  • the wavelength of light used for the light irradiation treatment is not particularly limited as long as it is suitable for the activation of the nucleic acid modifier, and includes, for example, single wavelength light having a wavelength of 350 to 700 nm or wavelength of 350 to 700 nm. Multi-wavelength light can be used.
  • the light intensity and irradiation time of the light irradiation treatment can be appropriately set according to the nucleic acid modifier, the light source and the sample to be used. For example, the intensity of the light source and the distance between the sample and the light source can be changed, It can be determined by analyzing the modification of the nucleic acid.
  • EMA Light Emitting Diode
  • the distance from the sample is set to 1 to 50 cm, and the light irradiation treatment can be performed under the condition of irradiation for 1 to 20 minutes.
  • an LED (Light Emitting Diode) lamp with low power consumption and high brightness has been developed and can be used in the present invention.
  • the light irradiation treatment is preferably performed at a low temperature (for example, on ice).
  • the acidic polysaccharide used in the method of the present invention is a sulfate containing sulfate group typified by sulfated fucose-containing polysaccharide, dextran sulfate, carrageenan, heparin, heparan sulfate, rhamnan sulfate, chondroitin sulfate, chondroitin sulfate B (dermatan sulfate) and the like.
  • Polysaccharides, polyuronic acids such as hyaluronic acid, alginic acid and pectin and their salts.
  • Examples of the salt of the acidic polysaccharide include alkali metal salts such as sodium dextran sulfate, sodium alginate, sodium heparin, potassium dextran sulfate, and lithium heparin.
  • the acidic polysaccharide may be a natural product or a chemically or enzymatically synthesized product. Furthermore, any of an unpurified product, a partially purified product, or a purified product containing an acidic polysaccharide may be used.
  • the acidic polysaccharide can be used singly or in combination.
  • the concentration of the acidic polysaccharide used in the method of the present invention can be appropriately set and added according to the acidic polysaccharide to be used and the sample.
  • the concentration of the acidic polysaccharide is changed to modify the nucleic acid after the treatment.
  • the concentration is 1 ⁇ g / mL to 100 mg / mL, preferably 10 ⁇ g / mL to 10 mg / mL, more preferably 100 ⁇ g / mL to 5 mg / mL.
  • the concentration is 10 ⁇ g / mL to 1000 mg / mL, preferably 100 ⁇ g / mL to 500 mg / mL, more preferably 1 mg / mL to 100 mg / mL.
  • nucleic acid modifying agent When a nucleic acid modifying agent is allowed to act on a sample in the presence of the above acidic polysaccharide, not only free nucleic acids in the sample but also non-free nucleic acids in an environment where the nucleic acid modifying agent can contact, such as biomolecules The rate of modification of nucleic acids, particularly DNA, contained in dead cells with increased permeability to cell membranes or cell membranes is improved. For this reason, it becomes possible to reduce interference derived from these nucleic acids and DNA in the nucleic acid detection method.
  • acting a nucleic acid modifying agent on a sample in the presence of acidic polysaccharide means “an act of artificially adding an acidic polysaccharide to a sample and then causing the nucleic acid modifying agent to act”.
  • the nucleotides used in the method of the present invention refer to substances containing ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and the like constituting nucleic acids as constituents.
  • DNA, RNA, oligoribonucleotide, oligodeoxyribonucleotide, monoribonucleotide (for example, monoribonucleoside triphosphate: NTP), monodeoxyribonucleotide (for example, monodeoxyribonucleoside triphosphate: dNTP) is used in the present invention.
  • NTP includes monoadenosine triphosphate (ATP), monothymidine triphosphate (TTP), monocytidine triphosphate (CTP), monoguanosine triphosphate (GTP), and monouridine triphosphate (UTP). .
  • ATP monoadenosine triphosphate
  • TTP monothymidine triphosphate
  • CTP monocytidine triphosphate
  • GTP monoguanosine triphosphate
  • UDP monouridine triphosphate
  • dNTPs include monodeoxyadenosine triphosphate (dATP), monodeoxythymidine triphosphate (dTTP), monodeoxycytidine triphosphate (dCTP), and monodeoxyguanosine triphosphate (dGTP).
  • the nucleotides in this invention include the salt (for example, alkali metal salt) of the said substance.
  • the nucleotides may be natural products or chemically or enzymatically synthesized products. Furthermore, any of an unpurified product, a partially purified product or a purified product containing nucleotides may be used. The nucleotides can be used singly or in combination.
  • nucleotides selected from DNA and dNTPs can be used.
  • the DNA used in the present invention is not particularly limited, but DNA derived from animals (calf thymus DNA, salmon sperm DNA, etc.) and microorganism-derived DNA (bacterial genomic DNA, bacterio Phage DNA, plasmid DNA, etc.) are exemplified. Calf thymus DNA, ⁇ phage DNA ( ⁇ DNA), and dNTP are commercially available as reagents and are suitable for the present invention.
  • the concentration of nucleotides used in the method of the present invention can be appropriately set according to the nucleotides used and the sample to be added.
  • the concentration of nucleotides can be changed to modify the nucleic acid after treatment. Can be determined by analyzing.
  • the concentration is 10 ng / mL to 10 mg / mL, preferably 100 ng / mL to 1 mg / mL, more preferably 1 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL.
  • the concentration is 10 ⁇ M to 500 mM, preferably 100 ⁇ M to 100 mM, more preferably 1 mM to 50 mM.
  • nucleic acid modifying agent When a nucleic acid modifying agent is allowed to act on a sample in the presence of the above nucleotides, not only free nucleic acids in the sample but also non-free nucleic acids in an environment where the nucleic acid modifying agent can contact, such as biomolecules The rate of modification of nucleic acids, particularly DNA, contained in dead cells with increased permeability to cell membranes or cell membranes is improved. For this reason, it becomes possible to reduce interference derived from these nucleic acids and DNA in the nucleic acid detection method.
  • “to make a nucleic acid modifying agent act on a sample in the presence of nucleotides” means “an act of adding a nucleotide to a sample artificially and then causing the nucleic acid modifying agent to act”.
  • one or more acidic polysaccharides and one or more nucleotides may be used in combination.
  • nucleic acid modification method of the present invention a nucleic acid modifying agent having selectivity for a cell membrane is used to modify a nucleic acid in a cell that can penetrate the nucleic acid modifying agent and has enhanced permeability of the cell wall and cell membrane. be able to.
  • nucleic acids in living cells into which a nucleic acid modifying agent cannot enter are not modified. Accordingly, a method for selectively detecting nucleic acid derived from living cells contained in a sample using the present invention is provided.
  • live cell means a cell that maintains life activity, that is, a cell that maintains metabolic ability and proliferation ability.
  • living cells have no substantial damage to the structure or morphology of the cells.
  • a dead cell whose cell wall and / or cell membrane is damaged and whose ability to maintain vital activity is reduced does not proliferate normally even under conditions suitable for the growth of the cell. Such dead cells are in a state in which extracellular substances can enter the cells.
  • nucleic acid modification method of the present invention When the nucleic acid modification method of the present invention is applied to a sample in which cells may be present, only the nucleic acid in living cells is not affected by the nucleic acid modifying agent and is detected by a nucleic acid detection method such as a nucleic acid amplification method. Keep. Therefore, it is possible to specifically detect the presence of living cells, for example, living cells of microorganisms, regardless of the presence of dead cells, using the method of the present invention.
  • the cells to be subjected to the method of the present invention may be either eukaryotic cells or prokaryotic cells, and include microorganisms such as yeast, fungi and bacteria, animal cells, and plant cells.
  • Bacteria include both gram positive and gram negative bacteria. Examples of Gram-positive bacteria include Bacillus bacteria (B. cereus, B. anthracis, etc.), Staphylococcus bacteria (S. aureus, S. epidermidis, etc.), Listeria bacteria (L. monocytogenes, etc.), Clostridium bacteria ( C. botulinum, C. perfringens, etc.), Streptococcus bacteria (S. pneumoniae, etc.), Mycobacterium bacteria and the like.
  • Escherichia bacteria Escherichia bacteria [E. E. coli etc.], Salmonella bacteria (S. enteritidis, S. typhimurium etc.), Vibrio bacteria (V. parahaemolyticus etc.), Cronobacter bacteria (former E. sakazakiki etc.), Legionella bacteria (L. pneumophila). Etc.) and Pseudomonas bacteria.
  • the method of the present invention can be performed on various samples. However, from the viewpoint of maintaining selectivity, it is necessary to avoid processing that causes damage to the cell membrane of the sample.
  • the method for detecting nucleic acid derived from living cells contained in the sample of the present invention is carried out by the following steps (a) and (b).
  • the nucleic acid in the sample is modified by bringing the sample and the nucleic acid modifying agent into contact with each other in the presence of acidic polysaccharides and / or nucleotides as described in (1) above. It is a process to implement.
  • a nucleic acid can be modified by adding a nucleic acid modifying agent and acidic polysaccharide and / or nucleotides to a sample and placing them under appropriate conditions.
  • the light irradiation treatment can be performed simultaneously with step (a) or after step (a). .
  • the step (a) and the light irradiation treatment may be repeated a plurality of times, for example, 2 to 5 times. That is, the addition of the nucleic acid modifier and the light irradiation treatment can be repeated.
  • an appropriate medium for growing live cells contained in the sample is prepared after the light irradiation treatment.
  • the step of culturing living cells can be combined.
  • a step of removing the nucleic acid modifying agent can be performed.
  • a method for removing the nucleic acid modifying agent a known solid-liquid separation method can be used. For example, a sample is centrifuged to separate a precipitate containing cells and a supernatant containing a nucleic acid modifying agent, and then the supernatant is removed. Is mentioned. In this case, it is possible to add a step of washing the cells after removing the nucleic acid modifying agent.
  • a step of lysing live cells and / or a step of extracting nucleic acid can be performed.
  • Cell lysis and nucleic acid extraction methods include cell destruction by heat treatment (heat extraction), proteinase K / phenol extraction method, proteinase K / phenol / chloroform extraction method, alkali lysis method, alkali-SDS method, lytic enzyme method Various methods such as For these, a suitable cell lysis method and / or nucleic acid extraction method may be selected according to the nucleic acid detection method performed in the step (b) described later.
  • the nucleic acid of the living cell can be specifically detected by selectively detecting the unmodified nucleic acid from the sample after the step (a). That is, in the detection of living cells based on nucleic acids, it is possible to reduce noise due to nucleic acids of dead cells, and it is possible to detect the presence of living cells in a sample with high sensitivity and accuracy.
  • the method for selectively detecting an unmodified nucleic acid in the step (b) can be appropriately selected depending on the method for modifying a nucleic acid in the step (a). For example, if a dead cell (and free) DNA is selectively modified and the nucleic acid amplification reaction using the DNA as a template is inhibited, select the nucleic acid amplification method (DNA amplification method) as the nucleic acid detection method. can do.
  • the DNA amplification method include PCR method, ICAN method, LAMP method, SDA method, LCR method, RCA method, and SMAP method.
  • An unmodified nucleic acid can be selectively detected by subjecting the reaction solution after the nucleic acid amplification reaction to a normal analysis method such as gel electrophoresis and analyzing the amount and base length of the amplified nucleic acid.
  • a normal analysis method such as gel electrophoresis
  • methods for detecting and quantifying nucleic acids in real time can be used, and examples include intercalator method, TaqMan method, Scorpion method, Cycling probe method, and hybridization probe method.
  • the target region of the nucleic acid to be detected can be appropriately set according to the cell to be detected.
  • the target region may be set from a genomic sequence of a cell chromosome, or an episomal sequence such as a mitochondrial genome, a chloroplast genome, or a plasmid.
  • the target region preferably has a sequence specific to the detection target cell.
  • the target area may be one area or a plurality of areas. It is also possible to set a target region specific to the detection target cell and a target region possessed by a wide range of cells.
  • the length of the target region is 40 to 5000 bases, preferably 60 to 1000 bases, particularly preferably 70 to 200 bases.
  • the primer or probe used in the nucleic acid amplification method or real-time detection method can be designed based on the target region according to the nucleic acid amplification method or real-time detection method.
  • the microorganism of the present invention can be detected by targeting the microorganism to detect the living microorganism in the sample.
  • the gene / nucleic acid region to be a target in the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and may be appropriately selected in consideration of specificity and detection sensitivity.
  • a target region can be set from a pathogenic gene in order to distinguish it from a non-pathogenic homologous or genus microorganism. For example, verotoxin type 1 or type 2 gene derived from E.
  • coli O-157 heat-stable enterotoxin gene (STh) or heat-labile enterotoxin gene (STp) derived from enterotoxigenic E. coli, invasive factor-related gene derived from Salmonella bacteria ( invA), heat-resistant hemolytic toxin gene derived from Vibrio parahaemolyticus (tdh), cereulide gene (CRS) derived from Bacillus cereus, internalin A gene derived from Listeria spp. (intA), outer membrane protein A derived from Enterobacter sakazaki A gene (ompA), a cell-swelling lethal toxin gene (cdt) derived from Campylobacter, and the like.
  • genes encoding ribosomal RNA (16SrRNA, 23SrRNA) commonly used for microorganism detection and their spacer regions can be used as targets.
  • the real-time PCR method monitors changes in fluorescence signal.
  • a PCR amplification product is obtained, the fluorescence signal intensity increases and an amplification curve is drawn.
  • the change in fluorescence intensity from 1 to 10 PCR amplification cycles is a noise level, equal to zero, and considered as a sample blank (baseline).
  • a threshold threshold value
  • the number of PCR cycles in which the amplification curve exceeds the threshold value is referred to as a cycle threshold value (Ct value).
  • Tm analysis melting curve analysis
  • Kit and composition of the present invention is a kit for modifying a nucleic acid in a sample by the method of the present invention of (1), (A) a nucleic acid modifying agent; and (b) an acidic polysaccharide and / or nucleotides used with the nucleic acid modifying agent of (a); It is a kit containing.
  • kits of the present invention includes a kit for selectively detecting nucleic acid derived from living cells in a sample by the method of the present invention of (2), (A) a nucleic acid modifying agent; (B) acidic polysaccharides and / or nucleotides used with the nucleic acid modifier of (a); and (c) a nucleic acid detection reagent; It is a kit containing.
  • the nucleic acid modifying agent, acidic polysaccharide and nucleotides contained in the kit of the present invention are described in (1) above.
  • the reagent for nucleic acid detection contained in the kit of the present invention is a reagent used in the nucleic acid detection method described in (2) above.
  • a nucleic acid detection reagent when the PCR method is employed as a nucleic acid detection method, includes a reaction buffer, a primer pair for amplifying a target region, a DNA polymerase, a nucleoside, or a magnesium salt. Furthermore, depending on the nucleic acid detection method, an intercalator dye [SYBR (registered trademark) Green I or the like], a detection probe or an enzyme necessary for the detection reaction (for example, RNase H or the like) is included.
  • SYBR registered trademark
  • a detection probe or an enzyme necessary for the detection reaction for example, RNase H or the like
  • the kit of the present invention further includes a reagent for diluting the sample and the nucleic acid modifying agent, a buffer solution for the nucleic acid modification reaction, instructions describing the method of the present invention, and a reagent for removing and washing contaminants from the sample. , Positive controls, negative controls and the like.
  • composition of the present invention is used in (1) the method for modifying a nucleic acid of the present invention or (2) the method for selectively detecting a nucleic acid derived from a living cell of the present invention.
  • a composition comprising a modifier and (b) an acidic polysaccharide and / or nucleotides.
  • the nucleic acid modifier, acidic polysaccharide and nucleotides contained in the composition of the present invention are described in (1) above.
  • the method for enhancing the action of a nucleic acid modifying agent containing an acidic polysaccharide and / or nucleotides as an active ingredient or the action enhancing of a nucleic acid modifying agent containing an acidic polysaccharide and / or nucleotides as an active ingredient.
  • An agent is provided. This method and enhancer are useful for modifying a target nucleic acid in a sample, and can be applied to various industrial fields.
  • Example 1 Effect of acidic polysaccharide Using an Escherichia coli genomic DNA sample to which acidic polysaccharide (sodium alginate or chondroitin sulfate B) was added, EMA treatment was performed once, and detection sensitivity was obtained by real-time PCR using the LacZ gene as a target region. Compared.
  • acidic polysaccharide sodium alginate or chondroitin sulfate B
  • Genomic DNA prepared from E. coli K-12 was prepared to 1 ⁇ 10 8 copies / 30 ⁇ L with TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) /0.1 mM EDTA), did. Further, as the acidic polysaccharide, sodium alginate (Sodium Alginate 80-120 cp, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, catalog number: 194-13321, hereinafter sometimes referred to as “AlgNa”) 100 ⁇ g, 10 ⁇ g, chondroitin sulfate B (dermatan sulfate, 480 ⁇ g of Sigma, catalog number: C3788) was added, and as a control, a sample solution to which no acidic polysaccharide was added was prepared, and then all the sample solutions were prepared to 50 ⁇ L with sterile water.
  • the copy number is a copy number calculated from the weight of the nucleic acid.
  • EMA treatment EMA (manufactured by Sigma-Aldrich, ethidium bromide monoazide: catalog number: E2028) was completely dissolved in DMSO to a concentration of 5 mM and stored at -20 ° C. When used, this was thawed and diluted with sterile water to 300 ⁇ M. 5 ⁇ L of this EMA aqueous solution was added to 50 ⁇ L of each sample solution of the genomic DNA and allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes under light shielding.
  • each specimen liquid was placed on ice and irradiated with light for 5 minutes using a 500 W photographic illumination lamp (PRS500W: 100 V, 500 W, manufactured by Iwasaki Electric Co., Ltd.) installed at a distance of 20 cm from the specimen liquid (above, The process from addition of the EMA solution to light irradiation may be described as “EMA treatment”).
  • PRS500W 100 V, 500 W, manufactured by Iwasaki Electric Co., Ltd.
  • a sample solution not subjected to EMA treatment was prepared.
  • Each of the sample liquid subjected to EMA treatment and the sample liquid not subjected to EMA treatment was diluted with sterilized water to 100 ⁇ L.
  • a PCR reaction solution (total amount 20 ⁇ L) was prepared according to the following composition.
  • SYBR Premix Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc., catalog number: RR041A): 10 ⁇ L 4 pmol / ⁇ L
  • LazZ-F DNA (SEQ ID NO: 1): 1 ⁇ L 4 pmol / ⁇ L
  • LacZ-R DNA (SEQ ID NO: 2): 1 ⁇ L ⁇ Sterile water: 7 ⁇ L
  • Template DNA (diluted sample solution): 1 ⁇ L
  • Example 1- (2) 1 ⁇ L of each specimen solution prepared in Example 1- (2) was used as template DNA. That includes the template DNA of E. coli genome 106 copies in the reaction solution of 20 [mu] L.
  • a reaction solution to which 1 ⁇ L of sterilized water was added instead of the diluted sample solution was prepared.
  • PCR was carried out under conditions where 40 cycles of reaction were performed with 95 ° C. for 30 seconds and 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a real-time PCR apparatus Thermal Cycler Real Real System System (manufactured by Takara Bio Inc., model number: TP800) or Thermal Cycler Dice Real Time System II (manufactured by Takara Bio Inc., model number: TP900) is used for the reaction.
  • the number of cycles exceeding the threshold value (hereinafter referred to as “Ct value”) was measured.
  • a melting curve analysis (Tm analysis) of the amplification product was performed after PCR under conditions where the temperature was increased from 60 ° C to 95 ° C.
  • Table 1 shows the Ct values and Tm analysis values obtained by PCR in Example 1- (3).
  • Example 2 Effect of acidic polysaccharide in 3 times of EMA treatment (1) Sample preparation Genomic DNA prepared from E. coli JM109 was serially diluted 10-fold with TE buffer and 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 3 copies / 30 ⁇ L. A DNA solution containing the genome was prepared. Otherwise, an E. coli genomic DNA sample solution was prepared in the same manner as in Example 1- (1).
  • Example 2- (1) The E. coli genomic DNA sample solution prepared in Example 2- (1) was subjected to EMA treatment in the same manner as in Example 1- (2). Furthermore, 5 ⁇ L of EMA aqueous solution was added to the sample liquid after treatment, and the EMA treatment of irradiating visible light was repeated twice, for a total of 3 times. Therefore, the amount of the sample liquid after the end of the three EMA treatments was 65 ⁇ L.
  • a sample solution treated with EMA and a sample solution not subjected to EMA treatment as a control were prepared and prepared with sterile water so as to be 100 ⁇ L.
  • PCR using the LacZ gene as a target region PCR was performed in the same manner as in Example 1- (3) using 1 ⁇ L of the diluted solution of each specimen solution prepared in Example 2- (2) as a template DNA and using the LacZ gene as a target region.
  • the reaction solution 20 ⁇ L include template DNA of E. coli genome 106 copies to 10 copies.
  • Table 2 shows Ct values and Tm analysis values obtained by PCR in Example 2- (3).
  • “-” indicates that amplification of the LacZ gene by PCR was not detected.
  • Example 3 Effect of acidic polysaccharide in discrimination of live and dead bacteria of E. coli
  • Sample preparation 50 ⁇ L of E. coli JM109 competent cell (Takara Bio, catalog number: 9052) was inoculated into 5 mL of LB liquid medium. The cells were cultured with shaking at about 130 rpm for 13 to 16 hours in a 37 ° C. constant temperature water bath. This was defined as a viable cell suspension. Moreover, about 700 ⁇ L of this viable cell suspension was put into a 1.5 mL microtube and heated at 100 ° C. for 5 minutes in a heat block to prepare a dead cell suspension.
  • the live cell suspension of the prepared E.coli serially diluted by 10-fold in fresh LB liquid medium to prepare a live cell suspension of 1-10 6-fold dilutions.
  • the dead cell suspension was diluted 10 2 times. 10 ⁇ L of dead cell suspension diluted 10 2 each was added to 20 ⁇ L of live cell suspension at each dilution ratio.
  • a sample solution prepared by adding 100 ⁇ g of sodium alginate to the live suspension / dead bacteria mixed suspension prepared in this way to prepare 50 ⁇ L with sterilized water, and a sample solution prepared to 50 ⁇ L with sterilized water without adding sodium alginate were prepared.
  • Example 3- (1) EMA treatment and DNA extraction step
  • Each sample solution prepared in Example 3- (1) was subjected to EMA treatment three times in the same manner as in Example 2- (2). Therefore, the amount of the sample liquid after the end of the three EMA treatments was 65 ⁇ L.
  • the sample solution treated with EMA and the sample solution not subjected to EMA treatment as a control were each diluted with sterilized water to 100 ⁇ L, heated at 100 ° C. for 5 minutes in a heat block, and DNA was thermally extracted. .
  • Example 3- (3) PCR using the LacZ gene as a target region
  • Each hot extract prepared in Example 3- (2) was centrifuged at 15,000 rpm for 2 minutes, 1 ⁇ L of the supernatant was used as template DNA, and PCR using the LacZ gene as a target region was performed as in Example 1- (3). It carried out similarly.
  • Table 3 shows the results of the EMA-treated sample solution and the results of the E. coli sample solution that was not EMA-treated for the Ct value and Tm analysis value obtained by PCR in Example 3- (3).
  • Table 5 shows an equation indicating a standard curve calculated from the Ct value and a correlation coefficient (R2). In the table, “-” indicates that amplification of the LacZ gene by PCR was not detected.
  • AlgNa represents sodium alginate.
  • Example 4 Effect of Nucleotides Using an Escherichia coli genomic DNA sample to which ⁇ DNA was added as nucleotides, EMA treatment was performed three times, and the detection sensitivity was compared by a real-time PCR method targeting the LacZ gene.
  • sample Genomic DNA prepared from E. coli K-12 was serially diluted 10-fold with TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) /0.1 mM EDTA), and 5 ⁇ 10 7 copies to 5
  • the sample solution was prepared as x10 copies / 20 ⁇ L.
  • 250 ng of ⁇ DNA (manufactured by Takara Bio Inc., catalog number: 3010) was added as nucleotides, and a sample solution to which nucleotides were not added was prepared as a control, and then all sample solutions were prepared to 30 ⁇ L with sterile water. .
  • the copy number is a copy number calculated from the weight of the genomic DNA.
  • Example 2- (2) EMA treatment
  • 3 ⁇ L each of the genomic DNA was added to 30 ⁇ L of each sample solution, and the EMA treatment was performed three times in total. Therefore, the amount of the sample liquid after the end of the three EMA treatments was 39 ⁇ L.
  • Example 4- (1) After preparing as described in Example 4- (1), a sample solution not subjected to EMA treatment was prepared. Each of the sample liquid subjected to EMA treatment and the sample liquid not subjected to EMA treatment was diluted with sterile water so as to be 50 ⁇ L.
  • PCR targeting LacZ gene A PCR reaction solution (total amount 20 ⁇ L) was prepared according to the following composition.
  • SYBR Premix Ex Taq manufactured by Takara Bio Inc., catalog number: RR041A
  • LazZ-F DNA SEQ ID NO: 1 ⁇ L 4 pmol / ⁇ L
  • LacZ-R DNA SEQ ID NO: 2
  • 1 ⁇ L of each specimen solution prepared in Example 4- (2) was used as template DNA. That includes the template DNA of E. coli genome 106 copies to 1 copy in the reaction solution of 20 [mu] L.
  • a reaction solution to which 1 ⁇ L of sterilized water was added instead of the diluted sample solution was prepared.
  • PCR was carried out under conditions where 40 cycles of reaction were performed with 95 ° C. for 30 seconds and 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a real-time PCR apparatus Thermal Cycler Real Real System System manufactured by Takara Bio Inc., model number: TP800
  • Thermal Cycler Dice Real Time System II manufactured by Takara Bio Inc., model number: TP900
  • Ct value, and copy number quantified based on a calibration curve of a sample not subjected to EMA treatment.
  • Qty value copy number quantified based on a calibration curve of a sample not subjected to EMA treatment.
  • Tm analysis melting curve analysis
  • Table 6 shows the Ct values and Tm analysis values obtained by PCR in Example 4- (3).
  • “-” indicates that amplification of the LacZ gene by PCR was not detected.
  • Example 5 Effect of nucleotides on discrimination of live and dead E. coli
  • Sample preparation 50 ⁇ L of E. coli JM109 competent cell (Takara Bio, catalog number: 9052) was inoculated into 5 mL of LB liquid medium. The cells were cultured with shaking at about 130 rpm for 13 to 16 hours in a 37 ° C. constant temperature water bath. This was defined as a viable cell suspension. Moreover, about 700 microliters of this viable cell suspension was put into a 1.5 mL microtube, and it heated at 100 degreeC for 5 minutes with the heat block, and prepared the dead cell suspension.
  • the live cell suspension of the prepared E.coli serially diluted by 10-fold in fresh LB liquid medium to prepare a live cell suspension of 1-10 6-fold dilutions.
  • the dead cell suspension was diluted 10 2 times. 10 ⁇ L of dead cell suspension diluted 10 2 each was added to 15 ⁇ L of live cell suspension at each dilution ratio.
  • a sample solution prepared by adding 250 ⁇ g of ⁇ DNA as nucleotides to 30 ⁇ L of sterilized water and a sample solution prepared by adding 30 ⁇ L of sterilized water without adding ⁇ DNA was prepared.
  • Example 5- (1) was subjected to EMA treatment three times in the same manner as in Example 4- (2). Therefore, the amount of the sample liquid after the end of the three EMA treatments was 39 ⁇ L.
  • the sample solution treated with EMA and the sample solution not subjected to EMA treatment as a control were each diluted with sterilized water so as to be 50 ⁇ L, and heated in a heat block at 100 ° C. for 5 minutes to perform heat extraction of DNA. .
  • Table 7 shows the results of Ct values and Tm analysis values obtained by PCR in Example 5- (3), and further shows an equation showing a standard curve calculated from the Ct values and a correlation coefficient (R2). Table 8 shows. In the table, “-” indicates that amplification of the LacZ gene by PCR was not detected.
  • Example 6 Effect of nucleotides EMA treatment was performed using E. coli genomic DNA samples to which dNTPs were added as nucleotides, and the detection sensitivity was compared by a real-time PCR method targeting LacZ gene or 16SrDNA.
  • Genomic DNA prepared from E. coli K-12 was serially diluted 10-fold with TE buffer to prepare 1 ⁇ 10 8 copies to 1 ⁇ 10 5 copies / 40 ⁇ L.
  • Samples were added to the sample liquid: dATP, dTTP, dCTP and dGTP (manufactured by Takara Bio Inc., catalog number: 4026 to 4029) were added at 250 ⁇ mol each or 125 ⁇ mol each (total amount of deoxynucleotide triphosphate 1000 ⁇ mol or 500 ⁇ mol, respectively).
  • Example 6- (1) Each specimen solution prepared in Example 6- (1) was subjected to only one EMA treatment in the same manner as in Example 4- (2) except that 5 ⁇ L of EMA aqueous solution was added.
  • Example 6- (1) a sample solution not subjected to EMA treatment was prepared.
  • Each of the sample liquid subjected to EMA treatment and the sample liquid not subjected to EMA treatment was diluted with sterilized water to 100 ⁇ L.
  • PCR targeting LacZ gene or 16S rDNA A PCR reaction solution (total amount 20 ⁇ L) was prepared according to the following composition.
  • SYBR Premix Ex Taq manufactured by Takara Bio Inc., catalog number: RR041A
  • 10 ⁇ L -Forward primer 1 ⁇ L
  • Reverse primer 1 ⁇ L
  • Sterile water 7 ⁇ L
  • Template DNA diluted sample solution
  • the forward primer and reverse primer were added to the PCR reaction solution in the following three combinations.
  • A A combination that amplifies a part 70 bp of the LacZ gene. 4 pmol / ⁇ L, LazZ-F DNA (SEQ ID NO: 1): 1 ⁇ L 4 pmol / ⁇ L, LacZ-R DNA (SEQ ID NO: 2): 1 ⁇ L
  • B A combination that amplifies a part 177 bp of the LacZ gene.
  • Example 6- (2) 1 ⁇ L of each specimen solution prepared in Example 6- (2) was used as template DNA. That is, 10 6 copies to 10 3 copies of template DNA of the E. coli genome are contained in a 20 ⁇ L reaction solution. Except this, PCR was performed in the same manner as in Example 4- (3).
  • the Tm analysis values of the amplification products were 83.0 ⁇ 0.5 for the primer pair in (A), 85.5 ⁇ 0.5 for the primer pair in (B), and 82.0 ⁇ for the primer pair in (C). There was no difference in the sample solution at 0.5.
  • kits and compositions to be used are provided and are extremely useful for improving the accuracy of food hygiene tests and clinical tests.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of LacZ-F
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence of LacZ-R
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of LacZ-R_177
  • SEQ ID NO: 4 Nucleotide sequence of 16S-F_95
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence of 16S-R

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法、試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含む方法： （ａ）試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び （ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程、 これらの方法に使用するキット及び組成物。

Description

核酸修飾方法
　本発明は、核酸検出法の実施において試料に含有される核酸由来のシグナルの低減に有効な核酸の修飾方法、当該方法に使用するキット、及び組成物に関する。
　核酸検出技術は、現在では医学、生物学分野では一般的な研究手法であり、定性的、定量的な測定において汎用されている。特にＰＣＲ法に代表される核酸増幅法との組合せにより、ごくわずかな細胞や微生物の存在をこれら細胞、微生物に特有の核酸を標的として検出することが可能となったことから、高感度分析法として基礎研究、産業界にわたって広く利用されるようになった。更に特定配列の核酸を人為的に混入して物質、物品を標識することにより、流通経路の追跡や真贋判定への利用も実施されている。
　一方、核酸増幅法を利用した検出法は、検出作業時の核酸増幅反応で生成する増幅核酸による他試料の分析への干渉という問題を引き起こしている。核酸増幅反応では対数的な核酸増幅により莫大な分子数の増幅産物が生成することから、他試料、試薬類、試験器具、試験環境へ混入した増幅産物を鋳型として起こる増幅のために誤った分析結果が生じる恐れがある。
　このような増幅産物由来の人為的な増幅を防止する観点から、試料、試薬類、試験器具等の厳密な取り扱い、試験環境の清浄化等の一般的注意に加え、増幅核酸の他試験への干渉を防止する手法が開発されてきた。例えば、デオキシウラシル３リン酸を含む反応液で核酸増幅を行うことでウラシル－Ｎ－グリコシラーゼに感受性の増幅核酸を生成させる方法が知られている。試料や反応液を増幅反応前にウラシル－Ｎ－グリコシラーゼで処理することにより、他試験に由来する増幅核酸を分解することができる。また、核酸に光活性化されたソラーレン類化合物を共有結合させることにより修飾し、前記核酸が核酸増幅反応において鋳型として機能することを妨げる方法も報告されている（非特許文献１）。
　核酸を核酸増幅反応の鋳型とならないよう修飾する技術は微生物検出においても利用されている。細胞死の後、数日から３週間までは死細胞に由来するＤＮＡが試料中に残留すると言われており、通常の操作で試料から抽出されたＤＮＡには、生細胞、死細胞の双方に由来するＤＮＡが含まれる。従って、例えば殺菌処理を施した試料における殺菌処理の効果は、核酸を指標とする微生物検出法には十分に反映されない。
　上記の問題を解決する手法として、核酸修飾剤と核酸増幅法を組み合わせた生細胞・死細胞の識別方法が報告されている（非特許文献２、特許文献１）。この核酸に基づく検出法は、核酸修飾剤としてエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）やプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）を使用し、リアルタイムＰＣＲなどの核酸増幅法を組み合わせて生細胞と死細胞を増幅の有無又は速度を指標として区別する方法である。例えばＥＭＡは、可視光下で活性化されて核酸に共有結合し、核酸増幅反応を阻害することが報告されている。一方、試料中に遊離状態のまま残った未結合のＥＭＡは、水分子と反応することによって同時に不活性化される。無傷の細胞膜や細胞壁によってＥＭＡが侵入しなかった生細胞由来の核酸は、ＥＭＡの作用を受けない。一方、ＥＭＡが侵入した死細胞由来の核酸はＥＭＡにより修飾され、後の核酸増幅反応が阻害される。従って、生細胞と死細胞の混合物からなる試料を前記の核酸修飾剤で処理することにより、生細胞由来の核酸が選択的に増幅されるようになる。現在までに、大腸菌Ｏ１５７、ネズミチフス菌、リステリア菌、カンピロバクター・ジェジュニ及びレジオネラなど多くの微生物について、死細胞と区別した生細胞の検出がこのような手法で実施されている。しかし、高濃度の核酸修飾剤は、死細胞由来の核酸に確実に結合する一方、生細胞に対しダメージを与えることが報告されている。
　このように、核酸修飾法はいろいろな用途を有していることから、更に効率よく核酸を修飾する方法が求められている。
特許４１２７８４７号公報
ヌクレイック　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｓｅａｒｃｈ）、第１９巻、第９９～１０７頁、１９９１年 アプライド　アンド　エンバイロメンタル　マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第７３巻、８０２８－８０３０頁、２００７年
　本発明の目的は、検出を防止することが望まれる核酸を効率よく修飾する方法を提供し、種々の核酸ベースの検出技術の正確性を向上させることにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、試料と、核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法により、従来よりも効率よく核酸の修飾を実施できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、
［１］試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法、
［２］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１］に記載の方法、
［３］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項［２］に記載の方法、
［４］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１］に記載の方法、
［５］試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）［１］記載の方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程、
［６］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［５］に記載の方法、
［７］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［６］に記載の方法、
［８］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［５］に記載の方法、
［９］工程（ｂ）が核酸増幅法により実施される、［５］に記載の方法、
［１０］工程（ｂ）がリアルタイムＰＣＲにより実施される、［９］に記載の方法、
［１１］［１］記載の方法により試料中の核酸を修飾するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類； 
を含有するキット、
［１２］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１１］に記載のキット、
［１３］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［１２］に記載のキット、
［１４］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１１］に記載のキット、
［１５］［５］記載の方法により試料中の生細胞由来の核酸を選択的に検出するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤； 
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；及び 
（ｃ）核酸検出用試薬；
を含有するキット、
［１６］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１５］に記載のキット、
［１７］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［１６］に記載のキット、
［１８］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１５］に記載のキット、
［１９］
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；
を含む組成物、
［２０］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１９］に記載の組成物、
［２１］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［２０］に記載の組成物、及び
［２２］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１９］に記載の組成物、に関する。
　本発明の方法により、試料と核酸修飾剤とを接触させる処理において、核酸の修飾効率を向上させることが可能であり、食品衛生検査や臨床検査の正確性向上に極めて有用である。
　以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の核酸の修飾方法
　本発明の核酸の修飾方法は、試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法である。
　本発明の方法の対象となる試料は、核酸が存在する可能性のあるすべての試料である。例えば、食品、農産物、水産物、生物の組織や体液（血液、尿、髄液、胸水等）、細胞培養液、化成品（医薬、農薬、試薬等）、工業用水、市水、地下水、河川水、貯水、雨水、排水又は土壌が挙げられる。特に、食品としては、飲料、菓子、乳製品、機能性食品等が含まれる。本発明においては、試料は、前記のような製品、生体試料又は環境試料そのものであってもよく、これらを溶解、けん濁、希釈、濃縮又は精製などの前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。また前処理として、試料中に存在するタンパク質及び脂肪等の夾雑物を低減させる処理、例えばタンパク質分解酵素及び脂質分解酵素による酵素処理、を施してもよい。
　本発明で使用される核酸修飾剤は、その作用により核酸を検出できない形態に修飾し得る物質である。すなわち、核酸の有している相補鎖とのハイブリッド形成能の変化、相補鎖複製における鋳型としての機能の変化、本来の配列の変化、ならびに核酸の断片化のいずれか、もしくはこれらの複数の組合せを引き起こす物質が例示される。従って、本発明における核酸の修飾には、核酸修飾剤の核酸塩基対へのインターカレート、核酸への核酸修飾剤の共有結合、核酸の架橋結合、核酸塩基の置換、核酸修飾剤による核酸の切断が含まれる。本発明に好適な核酸修飾剤としては、ＥＭＡ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｍｏｎｏａｚｉｄｅ）、ＰＭＡ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｍｏｎｏａｚｉｄｅ）、エチジウムジアジド、ソラーレン化合物［ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、４’－ＡＭＤＭＩＰ（４’－ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ－４，５’－ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、ＡＭＩＰ（５－ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、５－ＭＩＰ（５－ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、８－メトキシソラーレン等］及びヨウ化プロピジウムが例示される。また、商品名、ＳＹＴＯ　Ｒｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ、ＢＯＤＩＰＹ（４，４－ｄｉｆｌｕｏｒ－４－ｂｏｒａ－３ａ，４ａ－ｄｉａｚａ－ｓ－ｉｎｄａｃｅｎｅ）、ＹＯ－ＰＲＯ－１染料、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８アネキシンＶ、Ｃ４－ＢＯＤＩＰＶ５００／５１０ＣＹ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（以上モレキュラープローブ社製）として市販されている試薬を使用することができる。前記核酸修飾剤は、１種類で又は複数種類を混合して使用することができる。更に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　ＢａｃＬｉｇｈｔ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ、ＶｉａＧｒａｍ　Ｒｅｄ＋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｒａｍ　Ｓｔａｉｎ、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（モレキュラープローブ社製）のような市販キットに含まれている修飾剤を使用することもできる。
　本発明で使用される核酸修飾剤の濃度及び試料と接触させる時間は、試料に応じて適宜設定することが可能であり、例えば、試料に複数の濃度の核酸修飾剤を加えて、一定の時間接触させ、反応後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。ＥＭＡを使用する場合、例えば終濃度１～１００μＭ、１分～４８時間、好ましくは５～７０μＭ、３分～１０時間、より好ましくは１０～５０μＭ、５分～５時間の条件で核酸を修飾することができる。また、試料と核酸修飾剤を接触させる工程は使用する核酸修飾剤に適した条件で行えばよい。
　光活性化を受ける核酸修飾剤、例えばＥＭＡ、ＰＭＡ、ソラーレン化合物等を本発明の方法に使用する場合には、試料と核酸修飾剤を接触させた後、光照射処理を実施する。特に本発明を限定するものではないが、光活性化を受ける核酸修飾剤を使用する場合には、通常、試料に核酸修飾剤を添加して核酸と核酸修飾剤とを遮光下、低温（例えば室温～０℃）で接触させた後、光照射処理が行われる。光照射処理に使用される光の波長は、核酸修飾剤の活性化に適したものであれば特に限定はないが、例えば、３５０～７００ｎｍの波長の単波長光又は３５０～７００ｎｍの波長を含む多波長光が使用できる。光照射処理の光強度及び照射時間は、使用する核酸修飾剤、光源及び試料に応じて適宜設定することが可能であり、例えば、光源の強度や試料と光源の距離を変化させ、処理後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。ＥＭＡを使用する場合、例えば１～１０００Ｗのランプを使用し、試料との距離を１～５０ｃｍに設定し１～２０分間照射する条件で光照射処理を実施できる。更に、消費電力が少なく強光度のＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ　Ｅｍｉｔｔｉｎｇ　Ｄｉｏｄｅ）ランプが開発されており、本発明に使用できる。また、光照射処理は低温（例えば氷上）で実施することが好ましい。
　本発明の方法に使用する酸性多糖は、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラムナン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）などに代表される硫酸基を含有する硫酸化多糖類、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチンなどのポリウロン酸及びこれらの塩が含まれる。前記酸性多糖の塩としては、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、デキストラン硫酸カリウム、ヘパリンリチウムなどのアルカリ金属塩などが挙げられる。前記酸性多糖は天然物でもよく、化学的又は酵素的な合成物でもよい。更に酸性多糖を含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。前記酸性多糖は、１種類で又は複数種類を混合して使用することができる。
　本発明の方法に使用する酸性多糖の濃度は、使用する酸性多糖及び試料に応じて適宜設定して添加することが可能であり、例えば、酸性多糖の濃度を変化させ、処理後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。例えばアルギン酸ナトリウムを使用する場合、１μｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬの濃度である。また、例えばコンドロイチン硫酸Ｂを使用する場合、１０μｇ／ｍＬ～１０００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度である。
　上記の酸性多糖の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させた場合には、試料中の遊離の核酸のみならず、核酸修飾剤が接触可能な環境にある非遊離の核酸、例えば生体分子等に結合した核酸や細胞膜透過性の亢進した死細胞に含まれる核酸、特にＤＮＡの修飾される割合が向上する。このため、核酸検出法におけるこれらの核酸やＤＮＡに由来する干渉を低減させることが可能となる。ここで、「酸性多糖の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させる」とは、「試料に酸性多糖を人為的に添加したうえ、核酸修飾剤を作用させる行為」を意味する。
　本発明の方法に使用するヌクレオチド類は、本発明に使用されるヌクレオチド類とは、核酸を構成するリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドやそれらの類似物を構成成分とする物質を指す。特に本発明を限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、モノリボヌクレオチド（例えばモノリボヌクレオシド３リン酸：ＮＴＰ）、モノデオキシリボヌクレオチド（例えばモノデオキシリボヌクレオシド３リン酸：ｄＮＴＰ）が本発明に使用される。天然のリボヌクレオチドの類似物であるイノシンヌクレオチド、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウリジンヌクレオチドやそれらの３リン酸、前記類似物を含有するＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチドも本発明に使用することができる。なお、ＮＴＰには、モノアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、モノチミジン３リン酸（ＴＴＰ）、モノシチジン３リン酸（ＣＴＰ）、モノグアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、モノウリジン３リン酸（ＵＴＰ）が含まれる。また、ｄＮＴＰには、モノデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）、モノデオキシチミジン３リン酸（ｄＴＴＰ）、モノデオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）、モノデオキシグアノシン３リン酸（ｄＧＴＰ）が含まれる。なお、本発明におけるヌクレオチド類は前記の物質の塩（例えばアルカリ金属塩）を包含する。前記ヌクレオチド類は天然物でもよく、化学的又は酵素的な合成物でもよい。更にヌクレオチド類を含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。前記ヌクレオチド類は、１種類で又は複数種類を混合して使用することができる。本発明の一態様として、ＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類が使用できる。本発明に使用されるＤＮＡとしては、特に本発明を限定するのもではないが、入手の容易な動物由来のＤＮＡ（仔牛胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ等）や微生物由来ＤＮＡ（細菌ゲノムＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等）が例示される。仔牛胸腺ＤＮＡやλファージのＤＮＡ（λＤＮＡ）、ｄＮＴＰは試薬として市販されており、本発明に好適である。
　本発明の方法に使用するヌクレオチド類の濃度は、使用するヌクレオチド類及び試料に応じて適宜設定して添加することが可能であり、例えば、ヌクレオチド類の濃度を変化させ、処理後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。例えばλＤＮＡを使用する場合、１０ｎｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度である。また、例えばデオキシＮＴＰを使用する場合、１０μＭ～５００ｍＭ、好ましくは１００μＭ～１００ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ～５０ｍＭの濃度である。
　上記のヌクレオチド類の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させた場合には、試料中の遊離の核酸のみならず、核酸修飾剤が接触可能な環境にある非遊離の核酸、例えば生体分子等に結合した核酸や細胞膜透過性の亢進した死細胞に含まれる核酸、特にＤＮＡの修飾される割合が向上する。このため、核酸検出法におけるこれらの核酸やＤＮＡに由来する干渉を低減させることが可能となる。ここで、「ヌクレオチド類の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させる」とは、「試料にヌクレオチド類を人為的に添加したうえ、核酸修飾剤を作用させる行為」を意味する。
　本発明の方法、キット及び組成物において、上記酸性多糖の１種またはそれ以上及び上記ヌクレオチド類の１種またはそれ以上を併用してもよい。
（２）本発明による生細胞由来の核酸の選択的検出方法
　生存可能で増殖可能な細胞と不可逆的に損傷した死細胞とを識別するために重要なのは、細胞膜の完全性である。本発明の核酸修飾方法によれば、細胞膜への選択性を有する核酸修飾剤を使用して、核酸修飾剤が侵入し得る、細胞壁、細胞膜の透過性が亢進した細胞内の核酸をも修飾することができる。一方、核酸修飾剤が侵入できない生細胞内の核酸は修飾を受けない。従って、本発明を利用して試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法が提供される。
　本明細書において「生細胞」とは、生命活動を維持している細胞、すなわち代謝能力や増殖能力を維持した細胞を意味する。また、生細胞は細胞の構造や形態にも実質的な損傷はない。一方、細胞壁及び／又は細胞膜が損傷し、生命活動を維持する能力が低下した死細胞は、当該細胞の生育に適した条件にあっても正常に増殖しない。このような死細胞は細胞外の物質が細胞内に侵入し得る状態にある。
　細胞が存在する可能性のある試料について本発明の核酸の修飾方法を適用すれば、生細胞内の核酸のみ核酸修飾剤の作用を受けず、核酸検出法、例えば核酸増幅法により検出される状態を保つ。従って、本発明の方法を利用して生細胞、例えば微生物の生細胞の存在を、死細胞の存在に関わらず特異的に検出することが可能となる。
　本発明の方法の対象となる細胞は、真核細胞又は原核細胞のいずれでもよく、酵母、真菌、細菌などの微生物、動物細胞、植物細胞が含まれる。細菌には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、バチルス属細菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ等）、スタフィロコッカス属細菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ等）、リステリア属細菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等）、クロストリジウム属細菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ等）、ストレプトコッカス属細菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等）、マイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア属細菌［Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）等］、サルモネラ属細菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ等）、ビブリオ属細菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ等）、クロノバクター属細菌（旧Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉ等）、レジオネラ属細菌（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ等）、シュードモナス属細菌等が挙げられる。
　本発明の方法は前記のとおり種々の試料を対象として実施することができる。ただし、選択性を保つ観点から、試料について細胞膜の損傷を招くような処理は避ける必要がある。
　本発明の試料に含まれる生細胞由来の核酸を検出する方法は、以下の（ａ）、（ｂ）の工程により実施される。
（ａ）本発明の核酸修飾方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程。
　本発明の方法の工程（ａ）は、前記（１）の記載のとおり、試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類の存在下で接触させることにより、試料中の核酸の修飾を実施する工程である。例えば、試料に核酸修飾剤と酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を添加し、適切な条件下に置くことにより核酸を修飾することができる。本発明の方法において、前記（１）に記載する光活性化を受ける核酸修飾剤を使用する場合には、光照射処理を工程（ａ）と同時に又は工程（ａ）の後に実施することができる。また、工程（ａ）と光照射処理を、複数回、例えば２～５回繰り返して実施しても良い。すなわち、核酸修飾剤の添加と光照射処理を繰り返し実施することができる。工程（ａ）と光照射処理を繰り返す場合には、国際公開第２００９／０２２５５８号パンフレットに記載のように、試料中に含まれる生細胞が増殖するのに適切な培地を光照射処理の後に試料に添加し、生細胞を培養する工程を組み合わせることができる。
　また、工程（ａ）の後に、核酸修飾剤を除去する工程を実施することができる。核酸修飾剤を除去する方法としては公知の固液分離方法を使用できるが、例えば試料を遠心分離して細胞を含む沈殿と核酸修飾剤を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、核酸修飾剤を除去した後、細胞を洗浄する工程を追加することも可能である。
　また、工程（ａ）の後に、生細胞を溶解する工程及び／又は核酸を抽出する工程を実施することができる。細胞溶解方法、核酸抽出方法としては、熱処理による細胞の破壊（熱抽出）の他、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、アルカリ－ＳＤＳ法、溶菌酵素法のような種々の方法が挙げられる。これらは、後述の工程（ｂ）で実施する核酸の検出方法により、適した細胞溶解方法及び／又は核酸抽出方法を選択すればよい。
　本発明の方法の工程（ｂ）において、工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出することにより、生細胞の核酸を特異的に検出することができる。すなわち、核酸に基づく生細胞の検出において、死細胞の核酸によるノイズを低減させることが可能となり、試料中の生細胞の存在を感度良く、正確に検出することが可能である。
　前記工程（ｂ）の修飾されていない核酸を選択的に検出する方法は、工程（ａ）の核酸の修飾方法により適宜選択することができる。例えば、死細胞（ならびに遊離の）ＤＮＡが選択的に修飾される結果、当該ＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応が阻害される場合は、核酸の検出方法として核酸増幅法（ＤＮＡ増幅法）を選択することができる。ＤＮＡ増幅法としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＲＣＡ法、ＳＭＡＰ法が例示される。核酸増幅反応後の反応液をゲル電気泳動法など通常の分析方法に供して増幅核酸の量及び塩基長を分析することにより、修飾されていない核酸を選択的に検出することができる。更にリアルタイムに核酸を検出・定量する方法も使用でき、例えば、インターカレーター法、ＴａｑＭａｎ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ法、Ｃｙｃｌｉｎｇ　ｐｒｏｂｅ法、ハイブリダイゼーションプローブ法が例示される。これらの核酸増幅法やリアルタイム検出法は数多くの総説により解説され、当業者は市販されている多数のキットから選択することが可能である。
　前記の核酸増幅法やリアルタイム検出法において、検出の対象とする核酸のターゲット領域は、検出しようとする細胞に応じて適宜設定することができる。ターゲット領域は、細胞の染色体のゲノム配列から設定してもよく、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノム、プラスミドなどのエピソームの配列を設定してもよい。また、試料に検出対象の細胞と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の細胞に特異的な配列を設定することが好ましい。また、複数種の細胞に共通する配列を設定してもよい。更に、ターゲット領域は１領域であっても、複数領域であってもよい。検出対象の細胞に特異的なターゲット領域と、広汎な細胞が有するターゲット領域を設定することもできる。ターゲット領域の長さとしては、４０～５０００塩基長、好ましくは６０～１０００塩基長、特に好ましくは７０～２００塩基長である。
　前記の核酸増幅法又はリアルタイム検出法に使用するプライマー又はプローブは、核酸増幅法又はリアルタイム検出法に応じて、前記のターゲット領域に基づき設計することができる。
　微生物を標的として本発明の方法を実施し、試料中において生存している微生物を検出することができる。核酸増幅法において標的（ターゲット）とする遺伝子・核酸領域には特に限定はなく、特異性や検出感度を考慮して適宜選択すればよい。検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、非病原性の同種もしくは同属の微生物と区別するため、病原遺伝子からターゲット領域を設定することができる。例えば、大腸菌Ｏ－１５７由来のベロ毒素１型又は２型遺伝子、毒素原性大腸菌由来の耐熱性エンテロトキシン遺伝子（ＳＴｈ）又は易熱性エンテロトキシン遺伝子（ＳＴｐ）、サルモネラ属細菌由来の侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）、腸炎ビブリオ由来の耐熱性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ）、バチルス・セレウス由来のセレウリド遺伝子（ＣＲＳ）、リステリア属細菌由来のインターナリンＡ遺伝子（ｉｎｔＡ）、エンテロバクター・サカザキ由来の外膜タンパクＡ遺伝子（ｏｍｐＡ）、カンピロバクター由来の細胞膨化致死毒素遺伝子（ｃｄｔ）等が挙げられる。また、微生物検出に汎用されるリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ）をコードする遺伝子やそのスペーサー領域をターゲットとして使用できる。
　また、工程（ｂ）の検出方法としてリアルタイムＰＣＲ法を採用する場合の分析方法を以下に例示する。リアルタイムＰＣＲ法では蛍光シグナル変化のモニターを行う。ＰＣＲ増幅産物が得られると蛍光シグナル強度が増し、増幅曲線が描かれる。一般にＰＣＲの増幅サイクル数１～１０程度までの蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しく、サンプルブランク（ベースライン）と見なし、それに比べて有意的に蛍光シグナル差が認められる蛍光シグナル強度を閾値（スレッシュホールド値）として設定する。増幅曲線がそのスレッシュホールド値を上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレシュホールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、全体の核酸量が同じでも、ターゲット領域に核酸の修飾が生じている割合が多くなる程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、増幅産物の融解温度を分析する融解曲線解析（Ｔｍ解析）により、増幅産物がターゲット領域に由来するものかどうかを確認することができる。
（３）本発明のキット及び組成物
　本発明のキットは前記（１）の本発明の方法により試料中の核酸を修飾するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；
を含有するキットである。
　また本発明の別のキットとしては前記（２）の本発明の方法により試料中の生細胞由来の核酸を選択的に検出するためのキットが挙げられ、
（ａ）核酸修飾剤；
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；及び
（ｃ）核酸検出用試薬；
を含有するキットである。
　本発明のキットに含まれる核酸修飾剤、酸性多糖及びヌクレオチド類は、前記（１）に記載される。本発明のキットに含まれる核酸検出用試薬は、前記（２）に記載される核酸検出方法に使用される試薬である。例えば、核酸検出法としてＰＣＲ法を採用する場合は、核酸検出用試薬として、反応緩衝液、ターゲット領域を増幅するためのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド又はマグネシウム塩等が含まれる。更に、核酸検出方法に応じてインターカレーター色素［ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ等］、検出プローブや検出反応に必要な酵素（例えばＲＮａｓｅＨ等）が含まれる。
　本発明のキットには、更に試料や核酸修飾剤を希釈するための試薬、核酸修飾反応の緩衝液、本発明の方法を記載した説明書、試料から夾雑物などを除去・洗浄するための試薬、陽性対照、陰性対照等を含んでも良い。
　本発明の組成物は、前記（１）の本発明の核酸の修飾方法又は（２）の本発明の生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法に使用されるもので、（ａ）核酸修飾剤及び（ｂ）酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を含む組成物である。本発明の組成物に含まれる核酸修飾剤、酸性多糖及びヌクレオチド類は、前記（１）に記載される。
　以上詳細に説明したように、本発明により酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を有効成分とする核酸修飾剤の作用増強方法や、酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を有効成分とする核酸修飾剤の作用増強剤が提供される。この方法や増強剤は試料中の目的の核酸の修飾に有用であり、種々の工業分野に適用できる。
　次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１　酸性多糖の効果
　酸性多糖（アルギン酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸Ｂ）を添加した大腸菌ゲノムＤＮＡサンプルを用いて、ＥＭＡ処理を１回実施して、ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたリアルタイムＰＣＲ法により検出感度を比較した。
（１）試料の調製
　大腸菌Ｋ－１２から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）により１×１０８コピー／３０μＬに調製し、検体液とした。また、酸性多糖として、アルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　Ａｌｇｉｎａｔｅ　８０－１２０ｃｐ、和光純薬社製、カタログ番号：１９４－１３３２１、以下「ＡｌｇＮａ」と記載することがある）１００μｇ、１０μｇ、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸、シグマ社製、カタログ番号：Ｃ３７８８）４８０μｇをそれぞれ加え、また対照として酸性多糖を加えない検体液を用意し、その後すべての検体液を滅菌水で５０μＬに調製した。なお、コピー数は核酸の重量から算出したコピー数である。
（２）ＥＭＡ処理
　ＥＭＡ（シグマ－アルドリッチ社製、ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ　ｍｏｎｏａｚｉｄｅ：カタログ番号：Ｅ２０２８）を５ｍＭとなるようにＤＭＳＯで完全に溶解し、－２０℃に保存した。使用する際はこれを融解し、３００μＭになるように滅菌水で希釈した。このＥＭＡ水溶液を、前記ゲノムＤＮＡの各検体液５０μＬに５μＬずつ添加し、遮光下で、４℃、１５分間放置した。その後、各検体液を氷上に置き、検体液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの写真照明用ランプ（ＰＲＳ５００Ｗ：１００Ｖ、５００Ｗ、岩崎電気社製）を用いて５分間光を照射した（以上の、ＥＭＡ溶液の添加から光照射にわたる工程を、「ＥＭＡ処理」と記載することがある）。
　また、（１）に記載のとおり調製したうえ、ＥＭＡ処理を行わない検体液を用意した。ＥＭＡ処理した検体液、ＥＭＡ処理を行わない検体液のそれぞれを１００μＬになるように滅菌水で希釈した。
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲ（増幅鎖長：７０ｂｐ）
　下記の組成によりＰＣＲ反応液（全量２０μＬ）を調製した。
・ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ社製、カタログ番号：ＲＲ０４１Ａ）：１０μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ－Ｆ　ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ－Ｒ　ＤＮＡ（配列番号２）：１μＬ
・滅菌水：７μＬ
・鋳型ＤＮＡ（前記の希釈された検体液）：１μＬ
　実施例１－（２）で調製した各検体溶液１μＬを鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、２０μＬの反応液中に大腸菌ゲノム１０６コピーの鋳型ＤＮＡを含む。対照として希釈された検体液に換えて滅菌水１μＬを添加した反応液を調製した。ターゲット領域のＬａｃＺ遺伝子を増幅するため、９５℃で３０秒の保温の後、９５℃で５秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとした４０サイクルの反応を行う条件でＰＣＲを実施した。前記反応にはリアルタイムＰＣＲ装置Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ８００）又はＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＳｙｓｔｅｍＩＩ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ９００）を使用し、ＰＣＲ増幅曲線において、スレッシュホールド値を超えるサイクル数（以下「Ｃｔ値」）を測定した。また、ＰＣＲ後に増幅産物の融解曲線解析（Ｔｍ解析）を、６０℃から９５℃まで温度上昇させる条件で実施した。
（４）試験結果
　実施例１－（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より、ＥＭＡ処理なしの各検体液のＣｔ値に変動がないことから、酸性多糖添加によるＰＣＲ阻害がないことが確認できた。ＥＭＡ処理した群の結果を比べると酸性多糖を添加しない場合と比較して酸性多糖を添加している検体液のＣｔ値が１～５程度遅い。このことから、酸性多糖添加によりＥＭＡのＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。また、増幅産物のＴｍ解析値はすべて８３．４±０．５の範囲であり、非特異的な増幅が起こっていないことを確認した。
実施例２　ＥＭＡ処理３回での酸性多糖の効果
（１）試料の調製
　大腸菌ＪＭ１０９から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファーにより１０倍ずつ段階希釈し、１×１０８～１×１０３コピー／３０μＬで前記ゲノムを含むＤＮＡ溶液を調製した。その他は、実施例１－（１）と同様の方法で、大腸菌ゲノムＤＮＡ検体液を調製した。
（２）ＥＭＡ処理
　実施例２－（１）で調製した大腸菌ゲノムＤＮＡ検体液について、実施例１－（２）と同様にＥＭＡ処理を行った。更に、処理後検体液にＥＭＡ水溶液を５μＬずつ添加し、可視光を照射するＥＭＡ処理を２回繰り返し、合計３回ＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は６５μＬとなった。
　ＥＭＡ処理した検体液及び対照としてＥＭＡ処理を行わない検体液を用意し、１００μＬになるように滅菌水で調製した。
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲ
　実施例２－（２）で調製した各検体液の希釈液１μＬを鋳型ＤＮＡとして、ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲを実施例１－（３）と同様に実施した。なお、２０μＬの反応液中には大腸菌ゲノム１０６コピー～１０コピーの鋳型ＤＮＡが含まれる。
（４）試験結果
　実施例２－（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値を表２に示す。なお、表中の「－」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２より、ＥＭＡ処理した結果を比べると、酸性多糖を添加していない検体液を含む反応液では１０６～１０３コピーのゲノムを含むものでＬａｃＺ遺伝子が検出されるが、アルギン酸ナトリウムを添加しているものについては、１０５～１０コピーの範囲でＬａｃＺ遺伝子の増幅は見られなかった。酸性多糖添加によりＥＭＡによるＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。なお、増幅産物のＴｍ解析値は８３．４±０．５で、各群検体液での差はなかった。
実施例３　大腸菌の生菌及び死菌の識別における酸性多糖の効果
（１）試料の調製
　大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製、カタログ番号：９０５２）５０μＬを、ＬＢ液体培地５ｍＬに植菌し、３７℃恒温水槽で１３～１６時間１３０ｒｐｍ程度で振とう培養した。これを生菌懸濁液とした。また、この生菌懸濁液７００μＬ程度を１．５ｍＬ容マイクロチューブに入れ、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して死菌懸濁液を調製した。
　調製した大腸菌の生菌懸濁液を、新しいＬＢ液体培地で１０倍ずつ段階希釈し、１～１０６倍希釈の生菌懸濁液を調製した。死菌懸濁液は１０２倍に希釈した。各希釈倍率の生菌懸濁液２０μＬに、それぞれ１０２倍希釈した死菌懸濁液１０μＬを加えた。こうして調製した生菌・死菌混合懸濁液に、アルギン酸ナトリウム１００μｇを加えて滅菌水で５０μＬに調製した検体液、ならびにアルギン酸ナトリウムを加えずに滅菌水で５０μＬに調製した検体液を調製した。
（２）ＥＭＡ処理及びＤＮＡ抽出工程
　実施例３－（１）で調製した各検体液について、実施例２－（２）と同様に３回のＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は６５μＬとなった。ＥＭＡ処理した検体液及び対照としてＥＭＡ処理を行わなかった検体液をそれぞれ１００μＬになるように滅菌水で希釈し、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して、ＤＮＡの熱抽出を行った。
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲ
　実施例３－（２）で調製した各熱抽出液を１５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、その上清１μＬを鋳型ＤＮＡとして、ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲを実施例１－（３）と同様に実施した。
（４）試験結果
　実施例３－（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値について、ＥＭＡ処理した検体液の結果を表３に、ＥＭＡ処理しなかった大腸菌検体液の結果を表４に、更にＣｔ値から算出した標準曲線を示す式と相関係数（Ｒ２）を表５に示す。なお、表中の「－」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。また、表５中のＡｌｇＮａはアルギン酸ナトリウムを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４から、ＥＭＡ処理を行わない１０３倍の希釈よりも希釈倍率の高い検体では一定量の死菌懸濁液の添加によりアルギン酸ナトリウムの有無にかかわらずほぼ同じＣｔ値が得られており、アルギン酸ナトリウムを添加してもＣｔ値に変動はないことが示された。また、表３から、ＥＭＡ処理した検体では死菌懸濁液の添加に関係なく、生菌量を反映したＣｔ値が得られていることから、ＥＭＡ処理により死菌のＤＮＡを鋳型とする増幅が抑制されていると考えられた。更に、表５のＲ２の数値から、ＥＭＡ処理時に酸性多糖を添加することにより相関係数の改善が見られ、低鋳型量まで定量的に検出できることが分かった。また、増幅産物のＴｍ解析値はすべて８３．４±０．５の範囲であり、本試験では非特異的な増幅が起こっていないことが確認された。
実施例４　ヌクレオチド類の効果
　ヌクレオチド類としてλＤＮＡを添加した大腸菌ゲノムＤＮＡサンプルを用いて、ＥＭＡ処理を３回実施して、ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたリアルタイムＰＣＲ法により検出感度を比較した。
（１）試料の調製
　大腸菌Ｋ－１２から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）により１０倍ずつ段階希釈し、５×１０７コピー～５×１０コピー／２０μＬに調製し、検体液とした。また、ヌクレオチド類として、λＤＮＡ（タカラバイオ社製、カタログ番号：３０１０）２５０ｎｇをそれぞれ加え、また対照としてヌクレオチド類を加えない検体液を用意し、その後すべての検体液を滅菌水で３０μＬに調製した。なお、コピー数はゲノムＤＮＡの重量から算出したコピー数である。
（２）ＥＭＡ処理
　実施例２－（２）と同様にして、前記ゲノムＤＮＡの各検体液３０μＬに３μＬずつ添加し、合計３回ＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は３９μＬとなった。
　また、実施例４－（１）に記載のとおり調製したうえ、ＥＭＡ処理を行わない検体液を用意した。ＥＭＡ処理した検体液、ＥＭＡ処理を行わない検体液のそれぞれを５０μＬになるように滅菌水で希釈した。
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
　下記の組成によりＰＣＲ反応液（全量２０μＬ）を調製した。
・ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ社製、カタログ番号：ＲＲ０４１Ａ）：１０μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ－Ｆ　ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ－Ｒ　ＤＮＡ（配列番号２）：１μＬ
・滅菌水：７μＬ
・鋳型ＤＮＡ（前記の希釈された検体液）：１μＬ
　実施例４－（２）で調製した各検体溶液１μＬを鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、２０μＬの反応液中に大腸菌ゲノム１０６コピー～１コピーの鋳型ＤＮＡを含む。対照として希釈された検体液に換えて滅菌水１μＬを添加した反応液を調製した。ターゲットのＬａｃＺ遺伝子を増幅するため、９５℃で３０秒の保温の後、９５℃で５秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとした４０サイクルの反応を行う条件でＰＣＲを実施した。前記反応にはリアルタイムＰＣＲ装置Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ８００）又はＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＳｙｓｔｅｍＩＩ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ９００）を使用し、ＰＣＲ増幅曲線において、Ｃｔ値、ＥＭＡ処理を行わなかった検体の検量線に基づき定量したコピー数（以下「Ｑｔｙ値」）を算出した。また、ＰＣＲ後に増幅産物の融解曲線解析（Ｔｍ解析）を、６０℃から９５℃まで温度上昇させる条件で実施した。
（４）試験結果
　実施例４－（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値を表６に示す。なお、表中の「－」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６より、２．と４．のＥＭＡ処理したＱｔｙ値を比べると、２．のヌクレオチド類を添加しなかった場合は１０６～１０４コピーのゲノムＤＮＡが数１０～数１００コピーとして検出されるが、４．のヌクレオチド類を添加した場合は検出されても数コピー以下であり、ほぼ検出限界以下となった。ヌクレオチド類添加により、ＥＭＡのＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。なお、増幅産物のＴｍ解析値は８３．６±０．５で各群、検体液での差はなかった。
実施例５　大腸菌の生菌及び死菌の識別におけるヌクレオチド類の効果
（１）試料の調製
　大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製、カタログ番号：９０５２）５０μＬを、ＬＢ液体培地５ｍＬに植菌し、３７℃恒温水槽で１３～１６時間１３０ｒｐｍ程度で振とう培養した。これを生菌懸濁液とした。また、この生菌懸濁液７００μＬ程度を１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して死菌懸濁液を調製した。
　調製した大腸菌の生菌懸濁液を、新しいＬＢ液体培地で１０倍ずつ段階希釈し、１～１０６倍希釈の生菌懸濁液を調製した。死菌懸濁液は１０２倍に希釈した。各希釈倍率の生菌懸濁液１５μＬに、それぞれ１０２倍希釈した死菌懸濁液１０μＬを加えた。こうして調製した生菌・死菌混合懸濁液に、ヌクレオチド類としてλＤＮＡ２５０μｇを加えて滅菌水で３０μＬに調製した検体液、ならびにλＤＮＡを加えずに滅菌水で３０μＬに調製した検体液を調製した。
（２）ＥＭＡ処理及びＤＮＡ抽出工程
　実施例５－（１）で調製した各検体液について、実施例４－（２）と同様に３回のＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は３９μＬとなった。ＥＭＡ処理した検体液及び対照としてＥＭＡ処理を行わなかった検体液をそれぞれ５０μＬになるように滅菌水で希釈し、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して、ＤＮＡの熱抽出を行った。
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
　実施例５－（２）で調製した各熱抽出液を１５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、その上清１μＬを鋳型ＤＮＡとして、ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲを実施例４－（３）と同様に実施した。
（４）試験結果
　実施例５－（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値の結果を表７に、更にＣｔ値から算出した標準曲線を示す式と相関係数（Ｒ２）を表８に示す。なお、表中の「－」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表７から、ＥＭＡ処理を行わない１０３倍の希釈よりも希釈倍率の高い検体では一定量の死菌懸濁液の添加によりほぼ同じＣｔ値が得られており、λＤＮＡを添加してもＣｔ値に変動はないことが示された。また、表７から、ＥＭＡ処理した検体では死菌懸濁液の添加に関係なく、生菌量を反映したＣｔ値が得られていることから、ＥＭＡ処理により死菌のＤＮＡを鋳型とする増幅が抑制されていると考えられた。更に、表８のＲ２の数値から、ＥＭＡ処理時にヌクレオチド類を添加することにより相関係数の改善が見られ、低鋳型量まで定量的に検出できることが分かった。また、増幅産物のＴｍ解析値はすべて８３．６±０．５の範囲であり、本試験では非特異的な増幅が起こっていないことが確認された。
実施例６　ヌクレオチド類の効果
　ヌクレオチド類としてｄＮＴＰを添加した大腸菌ゲノムＤＮＡサンプルを用いて、ＥＭＡ処理を実施して、ＬａｃＺ遺伝子又は１６ＳｒＤＮＡをターゲットにしたリアルタイムＰＣＲ法により検出感度を比較した。
（１）試料の調製
　大腸菌Ｋ－１２から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファーにより１０倍ずつ段階希釈し、１×１０８コピー～１×１０５コピー／４０μＬに調製し、これらに下記のとおりヌクレオチド類を添加して検体液とした：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ（タカラバイオ社製、カタログ番号：４０２６～４０２９）を各２５０μｍｏｌ又は各１２５μｍｏｌ（それぞれデオキシヌクレオチド３リン酸の総量１０００μｍｏｌ又は５００μｍｏｌ）加えた検体液；前記の４種のデオキシヌクレオチド３リン酸をそれぞれ単独で５００μｍｏｌ加えた検体液；ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ各２５０μｍｏｌを加えた検体液；対照として各ｄＮＴＰを加えない検体液。
上記のすべての検体液は滅菌水で５０μＬに調製後、下記（２）の処理に使用した。
（２）ＥＭＡ処理
　実施例６－（１）で調製した各検体液について、ＥＭＡ水溶液を５μＬ添加すること以外は実施例４－（２）と同様にして１回のみのＥＭＡ処理を行った。
　また、実施例６－（１）に記載のとおり調製したうえ、ＥＭＡ処理を行わない検体液を用意した。ＥＭＡ処理した検体液、ＥＭＡ処理を行わない検体液のそれぞれを１００μＬになるように滅菌水で希釈した。
（３）ＬａｃＺ遺伝子又は１６ＳｒＤＮＡをターゲットにしたＰＣＲ
　下記の組成によりＰＣＲ反応液（全量２０μＬ）を調製した。
・ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ社製、カタログ番号：ＲＲ０４１Ａ）：１０μＬ
・フォワードプライマー：１μＬ
・リバースプライマー：１μＬ
・滅菌水：７μＬ
・鋳型ＤＮＡ（前記の希釈された検体液）：１μＬ
　なお、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、以下の３つの組合せでＰＣＲ反応液に添加した。
（Ａ）ＬａｃＺ遺伝子の一部７０ｂｐを増幅する組合せ。
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ－Ｆ　ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ－Ｒ　ＤＮＡ（配列番号２）：１μＬ
（Ｂ）ＬａｃＺ遺伝子の一部１７７ｂｐを増幅する組合せ。
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ－Ｆ　ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ－Ｒ＿１７７　ＤＮＡ（配列番号３）：１μＬ
（Ｃ）１６ＳｒＤＮＡの一部９５ｂｐを増幅する組合せ。
・８ｐｍｏｌ／μＬ、１６Ｓ－Ｆ＿９５　ＤＮＡ（配列番号４）：１μＬ
・８ｐｍｏｌ／μＬ、１６Ｓ－Ｒ　ＤＮＡ（配列番号５）：１μＬ
　実施例６－（２）で調製した各検体溶液１μＬを鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、２０μＬの反応液中に大腸菌ゲノム１０６コピー～１０３コピーの鋳型ＤＮＡを含む。これ以外は実施例４－（３）と同様にＰＣＲを実施した。
（４）試験結果
　実施例６－（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値について、前記（Ａ）のプライマー対の結果を表９に、前記（Ｂ）のプライマー対の結果を表１０に、前記（Ｃ）のプライマー対の結果を表１１及び表１２にそれぞれ示す。なお、表中の「－」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子又は１６ＳｒＤＮＡの増幅が検出されなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表９及び表１０より、ＥＭＡ未処理の場合はｄＮＴＰの添加の有無でＣｔ値に差は認められず、鋳型のコピー数依存的にＣｔ値が低下しているため、ｄＮＴＰの添加はＰＣＲに影響しないことが確認された。また、ＥＭＡ処理をすることによりＥＭＡ未処理の場合と比べてＣｔ値が１０サイクル程度増加し、ヌクレオチド類を添加することで更にＣｔ値が４～５サイクル増加する又は検出限界以下となることから、ヌクレオチド類添加により、ＥＭＡのＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。表１１及び表１２より、１６ＳｒＤＮＡを検出した場合も同様であり、ヌクレオチド類を添加しＥＭＡ処理することで、添加するヌクレオチド類の種類によらず鋳型ＤＮＡの修飾がより促進されることが分かった。なお、増幅産物のＴｍ解析値は（Ａ）のプライマー対は８３．０±０．５、（Ｂ）のプライマー対は８５．５±０．５、（Ｃ）のプライマー対は８２．０±０．５、で検体液での差はなかった。
　本発明により、試料と核酸修飾剤とを接触させる処理において、核酸の修飾効率を向上させることが可能であり、生細胞の核酸の選択的かつ高感度な検出を可能にする方法、当該方法に使用するキット及び組成物が提供され、食品衛生検査や臨床検査の正確性向上に極めて有用である。
  SEQ ID NO:1:Nucleotide sequence of LacZ-F
  SEQ ID NO:2:Nucleotide sequence of LacZ-R
  SEQ ID NO:3:Nucleotide sequence of LacZ-R_177
  SEQ ID NO:4:Nucleotide sequence of 16S-F_95
  SEQ ID NO:5:Nucleotide sequence of 16S-R

Claims (22)

  1. 　試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法。
  2. 　核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１に記載の方法。
  3. 　核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項２に記載の方法。
  4. 　酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１に記載の方法。
  5. 　試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
    （ａ）請求項１記載の方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び
    （ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程。
  6. 　核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項５に記載の方法。
  7. 　核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項６に記載の方法。
  8. 　酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項５に記載の方法。
  9. 　工程（ｂ）が核酸増幅法により実施される、請求項５に記載の方法。
  10. 　工程（ｂ）がリアルタイムＰＣＲにより実施される、請求項９に記載の方法。
  11. 　請求項１記載の方法により試料中の核酸を修飾するためのキットであって、
    （ａ）核酸修飾剤；及び
    （ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類； 
    を含有するキット。
  12. 　核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１１に記載のキット。
  13. 　核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項１２に記載のキット。
  14. 　酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１１に記載のキット。
  15. 　請求項５記載の方法により試料中の生細胞由来の核酸を選択的に検出するためのキットであって、
    （ａ）核酸修飾剤； 
    （ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；及び 
    （ｃ）核酸検出用試薬；
    を含有するキット。
  16. 　核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１５に記載のキット。
  17. 　核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項１６に記載のキット。
  18. 　酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１５に記載のキット。
  19. （ａ）核酸修飾剤；及び
    （ｂ）酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；
    を含む組成物。
  20. 　核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１９に記載の組成物。
  21. 　核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 　酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１９に記載の組成物。
PCT/JP2012/051230 2011-01-24 2012-01-20 核酸修飾方法 WO2012102208A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280014786.1A CN103443294B (zh) 2011-01-24 2012-01-20 用于修饰核酸的方法
EP12739127.4A EP2669385B1 (en) 2011-01-24 2012-01-20 Method for modifying nucleic acids
JP2012554769A JP5766216B2 (ja) 2011-01-24 2012-01-20 核酸修飾方法
EP17155621.0A EP3187598B1 (en) 2011-01-24 2012-01-20 Method for modifying nucleic acids
US13/980,970 US9458498B2 (en) 2011-01-24 2012-01-20 Method for modifying nucleic acids
KR1020137021390A KR101609224B1 (ko) 2011-01-24 2012-01-20 핵산 변형 방법
US15/252,663 US9670478B2 (en) 2011-01-24 2016-08-31 Method for modifying nucleic acids

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-012372 2011-01-24
JP2011012372 2011-01-24
JP2011012363 2011-01-24
JP2011-012363 2011-01-24

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/980,970 A-371-Of-International US9458498B2 (en) 2011-01-24 2012-01-20 Method for modifying nucleic acids
US15/252,663 Division US9670478B2 (en) 2011-01-24 2016-08-31 Method for modifying nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012102208A1 true WO2012102208A1 (ja) 2012-08-02

Family

ID=46580776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/051230 WO2012102208A1 (ja) 2011-01-24 2012-01-20 核酸修飾方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US9458498B2 (ja)
EP (2) EP3187598B1 (ja)
JP (1) JP5766216B2 (ja)
KR (1) KR101609224B1 (ja)
CN (1) CN103443294B (ja)
WO (1) WO2012102208A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016123307A (ja) * 2014-12-26 2016-07-11 東洋紡株式会社 核酸除去法
WO2017010001A1 (ja) * 2015-07-16 2017-01-19 森永乳業株式会社 微生物検出法及び微生物検出キット
US10793917B2 (en) 2014-07-10 2020-10-06 Momentum Bioscience Limited Method and kit of detecting the absence of micro-organisms

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2630648C2 (ru) * 2016-02-05 2017-09-11 Общество С Ограниченной Ответственностью "Биомаркер-Ру" Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, и набор для его осуществления
CN109182469A (zh) * 2018-08-24 2019-01-11 暨南大学 基于数字lamp技术检测阪崎肠杆菌的引物及试剂盒与方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001469A1 (ja) * 2003-06-30 2005-01-06 Japan Science And Technology Agency 酸性多糖類の分析方法および酸性多糖類分析用キット
JP2008137962A (ja) * 2006-12-04 2008-06-19 Kyushu Univ 核酸分解剤および核酸の分解方法
JP4127847B2 (ja) 2006-02-17 2008-07-30 国立大学法人九州大学 微生物検出法及び微生物検出キット
WO2009022558A1 (ja) 2007-08-16 2009-02-19 Kyushu University 微生物検出法及び微生物検出キット

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
US4321919A (en) * 1979-12-11 1982-03-30 Leukocyte Research, Inc. Method and system for externally treating human blood
JPH04127847A (ja) 1990-09-19 1992-04-28 Matsushita Electric Works Ltd 充電回路
EP1816197B1 (en) * 1998-04-23 2009-09-16 Takara Bio Inc. Method for synthesizing DNA
JP4825313B2 (ja) * 2009-07-24 2011-11-30 森永乳業株式会社 微生物検出法及び微生物検出キット

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001469A1 (ja) * 2003-06-30 2005-01-06 Japan Science And Technology Agency 酸性多糖類の分析方法および酸性多糖類分析用キット
JP4127847B2 (ja) 2006-02-17 2008-07-30 国立大学法人九州大学 微生物検出法及び微生物検出キット
JP2008137962A (ja) * 2006-12-04 2008-06-19 Kyushu Univ 核酸分解剤および核酸の分解方法
WO2009022558A1 (ja) 2007-08-16 2009-02-19 Kyushu University 微生物検出法及び微生物検出キット

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 73, 2007, pages 8028 - 8030
NOCKER A. ET AL.: "Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells, J. Microbiol", METH., vol. 67, 2006, pages 310 - 320, XP027926882 *
NOCKER A. ET AL.: "Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 72, no. 3, 2006, pages 1997 - 2004, XP002541184 *
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 19, 1991, pages 99 - 107
See also references of EP2669385A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10793917B2 (en) 2014-07-10 2020-10-06 Momentum Bioscience Limited Method and kit of detecting the absence of micro-organisms
US11746389B2 (en) 2014-07-10 2023-09-05 Momentum Bioscience Limited Method and kit of detecting the absence of micro-organisms
JP2016123307A (ja) * 2014-12-26 2016-07-11 東洋紡株式会社 核酸除去法
WO2017010001A1 (ja) * 2015-07-16 2017-01-19 森永乳業株式会社 微生物検出法及び微生物検出キット

Also Published As

Publication number Publication date
US20160362676A1 (en) 2016-12-15
CN103443294B (zh) 2015-09-30
KR101609224B1 (ko) 2016-04-05
EP2669385B1 (en) 2017-03-08
US9670478B2 (en) 2017-06-06
EP3187598A1 (en) 2017-07-05
EP3187598B1 (en) 2018-12-19
JPWO2012102208A1 (ja) 2014-06-30
JP5766216B2 (ja) 2015-08-19
US20130295576A1 (en) 2013-11-07
KR20140006878A (ko) 2014-01-16
EP2669385A1 (en) 2013-12-04
US9458498B2 (en) 2016-10-04
EP2669385A4 (en) 2014-09-03
CN103443294A (zh) 2013-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lv et al. Detection and quantification of viable but non-culturable Campylobacter jejuni
Fittipaldi et al. Progress in understanding preferential detection of live cells using viability dyes in combination with DNA amplification
Schnetzinger et al. Use of propidium monoazide and increased amplicon length reduce false-positive signals in quantitative PCR for bioburden analysis
JP4127847B2 (ja) 微生物検出法及び微生物検出キット
US9670478B2 (en) Method for modifying nucleic acids
Villarreal et al. DNase I and Proteinase K eliminate DNA from injured or dead bacteria but not from living bacteria in microbial reference systems and natural drinking water biofilms for subsequent molecular biology analyses
CA2666448C (en) Method and kit for the detection of live microorganism cells in a sample
EP3250709B1 (en) Compositions and methods for rapid detection of salmonella
Syafirah et al. An ambient temperature stable and ready-to-use loop-mediated isothermal amplification assay for detection of toxigenic Vibrio cholerae in outbreak settings
Kragh et al. A long-amplicon quantitative PCR assay with propidium monoazide to enumerate viable Listeria monocytogenes after heat and desiccation treatments
Brauge et al. Viability detection of foodborne bacterial pathogens in food environment by PMA-qPCR and by microscopic observation
Chahorm et al. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods
Liao et al. Bacterial drug-resistance and viability phenotyping upon disinfectant exposure revealed by single-nucleotide resolved-allele specific isothermal RNA amplification
Martin et al. Pre-PCR treatments as a key factor on the probability of detection of Listeria monocytogenes and Salmonella in ready-to-eat meat products by real-time PCR
WO2017176469A1 (en) Process for cell lysis and nucleic acid amplification
JP4217797B2 (ja) 微生物検出法及び微生物検出キット
JP4217795B2 (ja) 微生物検出法及び微生物検出キット
RU2395583C2 (ru) Способ детекции микроорганизма и набор для детекции микроорганизма
JP4217796B2 (ja) 微生物検出法及び微生物検出キット
Sen et al. Effect Of Maternal Age On Placental Characteristic And Kıd Birth Weight
BR102012019512A2 (pt) Método de detectação e quantificação de microrganismos viáveis em amostras de alimentos
NZ564847A (en) Method for detection of microorganism and kit for detection of microorganism

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12739127

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012554769

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13980970

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137021390

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2012739127

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012739127

Country of ref document: EP