CN112852650A - 一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程和代谢工程技术领域。本发明通过敲除LPP1、DPP1、GAL80基因，将酿酒酵母ERG9基因内源性启动子替换成PHXT1启动子，过表达OptiSaSS和SanSyn中的至少一种基因，以及过表达ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、SmFPPS、tHMG1、UPC2‑1、PGM2、GAL4、CYP736A167和SaCPR2基因，抑制酵母三萜的生物合成，构建得到酿酒酵母工程菌。将得到的菌株WL‑1和WL‑2发酵培养4天，檀香烯和檀香醇总产量分别可达1.6g/L和1.4g/L。

Description

一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与 应用
技术领域
本发明属于基因工程和代谢工程技术领域，具体涉及一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其 构建方法与应用。
背景技术
檀香树是一种古老、神秘的珍稀树种，半寄生性常绿乔木，原产印度南方及印尼帝汶群岛。檀香树生 长极其缓慢，通常要数十年才能成材。檀香树用途广泛，经济价值较高，集芳香、药用、材用植物于一身。 檀香在我国有着悠久的药用历史，始载于汉代的《名医别录》。中医认为檀香能行气、散寒、止痛，主治 霍乱吐泻、噎膈吐食、寒疝腹痛等。如《本草纲目》所载“治噎膈吐食，又面生黑子，每夜以浆水洗拭令 赤，磨汁涂之”。挥发油是檀香的重要组成成分，其主要成分包括(Z)-α-檀香醇((Z)-α-santalol)、(E)-α-檀 香醇((E)-β-santalol)、(Z)-epi-β-檀香醇((Z)-epi-β-santalol)、(Z)-β-檀香醇((Z)-β-santalol)、(E)-β-檀香醇 ((E)-β-santalol)、α-檀香烯(α-santalene)和β-檀香烯(β-santalene)七种倍半萜占檀香挥发油成分比重 的95％以上，檀香挥发油被用作许多食品中的风味成分，包括酒精和非酒精饮料，具有很大的经济价值， 同时它具有抗炎，解热，抗溃疡，抗真菌，抗病毒，抗菌，抗氧化，解痉(肌肉松弛剂)，利尿和抗癌性。
目前檀香油的生产主要是通过用蒸汽蒸馏从成熟(>25年)的檀香树的心材和根部获得，生产成本较 高，且由于檀香生长环境苛刻，资源有限，难以满足市场需求，导致檀香树的过度采伐，对檀香资源的合 理利用产生了严重的威胁，使得檀香成为世界上最珍贵的精油之一。目前市场上檀香价格约每吨15万澳 元，且以每年9％的速度增长，檀香挥发油的价格也变得极为昂贵，如TFS公司生产的制药级檀香挥发油， 售价约为每公斤4500美元。
近年来合成生物学已经在生产重要的中药活性成分方面取得了突破性的进展，Tsuruta等人通过在酿酒 酵母中过表达青蒿中的紫穗槐二烯合成酶(amorpha-4,11.dienesynthase)，成功地在酿酒酵母内实现了青蒿 素的前体化合物紫穗槐二烯的合成(Tsuruta H,Paddon C J,Eng D,et al.PLoS ONE,2009,4:e4489)。Paddon 等人在此基础上导入相关基因，最终使酵母中青蒿酸的含量达到25g/L(Paddon C J,Westfall P J,Pitera D J, et al.Nature,2013,496:528-532)，由此可见，青蒿素是目前利用合成生物学技术实现产业化最成功的案例 之一。Dai等人在酿酒酵母中构建原人参二醇的生物合成途径，并通过一系列代谢工程策略，最终原人参 二醇的产量达到了1189mg/L(Dai Z,LiuY,Zhang X,et al.Metab.Eng.,2013,20:146–156)。Wei等人在酵 母中过表达CYP716A47及ATR2-1，实现了人参二醇型皂苷CK的生物合成。灯盏乙素是治疗心脑血管类 疾病的良好天然药物。Liu等功能验证了灯盏花素合成途径中的关键酶EbF6H和EbF7GAT，并成功在酿酒酵母中构建了灯盏乙素的全合成途径，通过进一步的条件优化，灯盏乙素的产量达到了108mg/L(Wei W, Wang P,Wei Y,et al.Mol.Plant,2015,8:1412–1424)。
瑞典查尔姆斯理工大学Jens Nielsen课题组已经通过酵母表达系统成功在酿酒酵母中表达生产α-檀香 烯，产量达到了163mg/L(Gionata Scalcinati,et al.MicrobialCell Factories 2012,11:117)。韩国Seon-Won Kim 课题组在大肠杆菌中也成功表达出了α-檀香烯(Hyo-jung Han,et al.International Meeting of the MicrobiologicalSociety of Korea,2017.4,213-213)。
目前尚未见有有关在微生物表达系统中进行檀香醇的代谢工程研究。
发明内容
本申请的首要目的在于提供一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌。
本申请的另一目的在于提供上述高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法。
本申请的再一目的在于提供上述高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的应用。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，具有如下特点：以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、 DPP1、GAL80基因，将酿酒酵母的ERG9基因内源性启动子替换成PHXT1启动子，过表达OptiSaSS和SanSyn 中的至少一种基因，以及过表达ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、SmFPPS、tHMG1、 UPC2-1、PGM2、GAL4、CYP736A167和SaCPR2基因；其中：
tHMG1和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；
PGM2基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
GAL4、IDI1、SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体GAL80位点；
ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；
OptiSaSS和SanSyn中的至少一种基因、CYP736A167和SaCPR2基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons2 位点。
所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。
所述的敲除LPP1、DPP1、GAL80基因为通过CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除；优选通过如下步骤 进行敲除：
S1.将LPP1、DPP1基因的crRNA spacer通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质 粒pCRCT-LPP1-DPP1；其中，crRNA spacer的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2.将重组质粒pCRCT-LPP1-DPP1转化酿酒酵母，经过培养表达筛选，得到敲除LPP1、DPP1基因 的菌株。
步骤S2中所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。
步骤S2中所述的培养温度为28～32℃；优选为30℃。
步骤S2中所述的筛选为通过SD-URA缺陷培养基进行筛选。
所述的SD-URA缺陷培养基的配方如下：YNB培养基6.7g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×) 10mL/L，葡萄糖20g/L(固体SD-URA缺陷培养基在制备时多添加20g/L的琼脂粉即可)。
上述SD-URA缺陷培养基中，所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)的配方如下：亮氨酸0.36g， 精氨酸0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，苯丙氨酸0.3g，色氨酸0.24g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，缬氨 酸0.9g，甲硫氨酸0.12g，组氨酸0.12g，苏氨酸1.2g，赖氨酸0.18g，酪氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，用 ddH2O定容到57mL。
所述的tHMG1、PGM2、IDI1、ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、GAL4基因优选从酿酒酵母 BY4741基因组克隆得到，其中，tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；PGM2的核苷酸序列见GenBank: NM_001182605.1；IDI1的核苷酸序列见GenBank:NM_001183931.1；ERG8的核苷酸序列见GenBank: NM_001182727.1；ERG10的核苷酸序列见GenBank:NM_001183842.1；ERG12的核苷酸序列见GenBank: NM_001182715.1；ERG13的核苷酸序列见GenBank:NM_001182489.1；ERG19的核苷酸序列见GenBank: NM_001183220.1；GAL4的核苷酸序列见GenBank:NM_001184062.1。
所述的UPC2-1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp得到UPC2-1，其中UPC2的核苷酸序列 见GenBank:NM_001180521.1；UPC2-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
所述的SanSyn、OptiSaSS基因为酵母菌通过密码子优化人工合成得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5所示。
所述的SmFPPS基因为通过如下方法制备得到：提取丹参总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以 cDNA为模板，克隆得到SmFPPS基因；其核苷酸序列见GenBank:HQ687768.1。
所述的CYP736A167、SaCPR2基因为通过如下方法制备得到：提取檀香总RNA，然后将其反转录成 cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到CYP736A167、SaCPR2基因；其中，CYP736A167的核苷酸序列见 GenBank:KU169302.1；SaCPR2的核苷酸序列见GenBank:KC842188.1。
一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)基因敲除：通过CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除LPP1、DPP1，其中所用的crRNAspacer的核 酸序列如SEQ ID NO.1所示；经过培养表达筛选，得到敲除LPP1、DPP1基因的菌株；
(2)载体构建：分别将OptiSaSS、SanSyn、CYP736A167、SaCPR2、PGM2、tHMG1、UPC2-1、IDI1 和SmFPPS基因构建到相应载体上；
(3)模块构建：分别将ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因和相应的启动子、终止子顺 序连接得到对应的基因模块；
(4)构建菌株：将上述相应的基因模块整合到酿酒菌株对应的染色体位点上即得高产檀香烯和檀香 醇的酿酒酵母工程菌；
其中：tHMG1和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；
PGM2基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
GAL4、IDI1、SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体GAL80位点；
ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；
OptiSaSS和SanSyn中的至少一种基因、CYP736A167和SaCPR2基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons2 位点。
具体地，作为一种优选方式，所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步 骤：
(1)基因敲除：将如SEQ ID NO.1所示的crRNA spacer的核酸序列通过限制性内切酶BsaΙ连接到 pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-LPP1-DPP1；然后将重组质粒pCRCT-LPP1-DPP1转化酿酒酵母， 经培养筛选后即得敲除LPP1、DPP1基因的酵母菌株M；
(2)载体的构建：
(a)将OptiSaSS基因构建到pESC-LEU载体上，得到PGAL1-OptiSaSS-TCYC1 DNA片段，命名为pWL01；
(b)将SanSyn基因构建到pESC-LEU载体上，得到PGAL1-SanSyn-TCYC1 DNA片段，命名为pWL02；
(c)将CYP736A167和SaCPR2基因构建到pESC-URA载体上，得到 SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167 DNA片段，命名为pWL03；
(d)将PGM2基因构建到pESC-URA载体上，得到PGAL10-PGM2-TADH1 DNA片段，命名为pWL04；
(e)将tHMG1和UPC2-1构建到载体pESC-URA上，得到tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1 DNA片段， 命名为pWL05；
(f)将tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1 DNA片段从pWL05载体上扩增下来，并构建到pCFB2796载体 上，得到TCYC1-tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-TADH1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL06；
(g)将SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167 DNA片段从pWL03载体上扩增下来，并构建到pCFB2988 载体上，得到TCYC1-SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167-TADH1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL07；
(h)将PGAL1-OptiSaSS-TCYC1 DNA片段从pWL01载体上扩增下来继而构建到pWL07载体上，得到 TCYC1-OptiSaSS-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL08；
(i)将PGAL1-SanSyn-TCYC1 DNA片段从pWL02载体上扩增下来继而构建到pWL07载体上，得到 TCYC1-SanSyn-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL09；
(j)将IDI1、SmFPPS基因构建到pESC-URA载体上，得到TCYC1-IDI1-PGAL1-PGAL10-SmFPPS-TADH1片段，命名为pWL10；
(3)模块的构建：
(a)将HIS3、PHXT1顺序连接，得到模块HIS3-PHXT1，命名为模块1；
(b)将PGAL1、ERG8和TPYX212顺序连接，得到模块PGAL1-ERG8-TPYX212，命名为模块2；
(c)将PPGK1、ERG10和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-ERG10-TADH1，命名为模块3；
(d)将PTDH3、ERG12和TTDH2顺序连接，得到模块PTDH3-ERG12-TTDH2，命名为模块4；
(e)将PTEF1、ERG13和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-ERG13-TCYC1，命名为模块5；
(f)将PTPI1、ERG19和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1-ERG19-TFBA1，命名为模块6；
(g)以pWL04载体为模板，通过PCR扩增得到模块PGAL10-PGM2-TADH1，命名为模块7；
(h)以酿酒酵母基因组为模板，通过PCR扩增得到PGAL4-GAL4-TGAL4，命名为模块8；
(i)以pWL06载体为模板，通过PCR扩增得到模块TCYC1-IDI1-PGAL1-PGAL10-SmFPPS-TADH1，命名为 模块9；
(4)构建菌株M-6
(I)用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pWL06，得到DNA整合片段A1(即 TCYC1-tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-TADH1-KIURA3 DNA片段)；再将DNA整合片段A1整合到步骤(1) 中得到的酵母菌株M的染色体TY4位点，得到菌株M-2；
(II)将pSH65载体转化菌株M-2，然后用含有博来霉素(zeocin)的YPD培养基进行表达筛选，通 过划板稀释挑选单菌落，提取基因组，通过PCR克隆出整合的DNA片段，通过测序找出筛选标记KIURA3 被敲除的菌株，用YPD传代培养五天丢失pSH65质粒，得到菌株M-3；
(III)将模块1和模块8共同转化菌株M-3，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-4；
(IV)将模块7、模块9和筛选标记MET15共同转化菌株M-4，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养， 得到菌株M-5；
(V)将模块2～5和筛选标记LEU2共同转化M-5，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株 M-6；
(5)构建菌株WL-1
用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pWL08，得到DNA整合片段A2(即： TCYC1-OptiSaSS-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段)；再将DNA整合片段A2整合到步骤(V)中得到的菌株M-6的染色体TY1Cons2位点，得到菌株WL-1，即为所述的高 产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌；
(6)构建菌株WL-2
用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pWL09，得到DNA整合片段A3(即：TCYC1-SanSyn-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段)；再将DNA整合片段A3整合到步骤(V)中得到的菌株M-6的染色体TY1Cons2位点，得到菌株WL-2，即为所述的高产 檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌。
所述的酵母菌株M优选为酿酒酵母BY4741。
步骤(2)中，所述的tHMG1、PGM2和IDI1基因优选从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其中， tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；PGM2的核苷酸序列见GenBank:NM_001182605.1；IDI1的 核苷酸序列见GenBank:NM_001183931.1。
步骤(2)中，所述的UPC2-1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp得到UPC2-1；其中，UPC2 的核苷酸序列见GenBank:NM_001180521.1；UPC2-1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3。
步骤(2)中，所述的SanSyn和OptiSaSS基因针对酵母菌经过密码子优化人工合成，其核苷酸序列 如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
步骤(2)中，所述的SmFPPS基因通过如下方法制备得到：提取丹参总RNA，将其反转录为cDNA， 再以cDNA为模板，可克隆得到SmFPPS基因；其核苷酸序列见GenBank:HQ687768.1。
步骤(2)中，所述的CYP736A167、SaCPR2基因通过如下方法制备得到：提取檀香总RNA，然后 将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到CYP736A167、SaCPR2基因；CYP736A167的核苷 酸序列见GenBank:KU169302.1；SaCPR2的核苷酸序列见GenBank:KC842188.1。
步骤(3)中，所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、GAL4基因可从酿酒酵母BY4741 基因组克隆得到，其中，ERG8的核苷酸序列见GenBank:NM_001182727.1；ERG10的核苷酸序列见 GenBank:NM_001183842.1；ERG12的核苷酸序列见GenBank:NM_001182715.1；ERG13的核苷酸序列见 GenBank:NM_001182489.1；ERG19的核苷酸序列见GenBank:NM_001183220.1；GAL4的核苷酸序列见 GenBank:NM_001184062.1。
步骤(3)中，所述的PHXT1、PGAL1、PPGK1、PTDH3、PTEF1和PTPI1可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得 到，其中，PHXT1的核苷酸序列见GenBank:CP036477.1，从第292634位到第293756位；PGAL1的核苷酸序 列见GenBank:MF084286.1，从第15722位到第16176位；PPGK1的核苷酸序列见GenBank:KF366479.1， 从第789位到第1772位；PTDH3的核苷酸序列见GenBankCP020129.1，从第884060位到第884735位；PTEF1的核苷酸序列见GenBank:CP020138.1，从第700414位到第700832位；PTPI1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示。
步骤(3)中，所述的TPYX212、TADH1、TCYC1、TTDH2和TFBA1为终止子，可从酿酒酵母BY4741基因 组克隆得到，其中，TPYX212的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；TADH1的核苷酸序列见GenBank:CP020137.1， 从第159411位到第159575位；TCYC1的核苷酸序列见GenBank:MH453954.1，从第3883位到第4072位； TTDH2的核苷酸序列见GenBank:CP020132.1，从第459200位到第459599位；TFBA1的核苷酸序列见GenBank: CP020133.1，从第326017位到第326416位。
步骤(3)中，所述的HIS3为筛选标记，可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列见 GenBank:JX901383.2，从第141位到第1420位。
步骤(4)中，所述的整合片段A1、A2和A3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所述。
步骤(4)中，所述的MET15和LEU2为筛选标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12 所述。
步骤(4)、(5)、(6)中，所述的整合为采用酵母转化试剂盒进行整合；优选为用ZymoResearch Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM试剂盒进行整合。
步骤(II)中，所述的YPD平板的配方为：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。(固体 培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)，博来霉素(zeocin)的浓度为100μg/mL。
步骤(III)中，所述的酵母缺陷型培养基的配方为：YNB 6.7g/L，HIS(组氨酸)缺陷氨基酸(100×) 10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。
其中，所述的组氨酸(HIS)缺陷氨基酸(100×)配方如下：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬 氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g， 亮氨酸0.36g，色氨酸0.24g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(IV)中，所述的酵母缺陷型培养基的配方为：YNB 6.7g/L，甲硫氨酸(MET)缺陷氨基酸(100 ×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。
其中，所述的甲硫氨酸(MET)缺陷氨基酸(100×)的配方为：尿嘧啶0.12g，缬氨酸0.9g，腺嘌呤 硫酸盐0.25g，色氨酸0.24g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，酪氨酸0.18g，谷氨酸0.6g，苏氨酸1.2g， 组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，赖氨酸0.18g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(V)中，所述的酵母缺陷型培养基的配方为：YNB 6.7g/L，亮氨酸(LEU)缺陷氨基酸(100×) 10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。
其中，所述的亮氨酸(LEU)缺陷氨基酸(100×)的配方如下：尿嘧啶0.12g，缬氨酸0.9g，腺嘌呤 硫酸盐0.25g，色氨酸0.24g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸 0.6g，苏氨酸1.2g，组氨酸0.12g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，赖氨酸0.18g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(5)和(6)中所述的酵母缺陷型培养基的配方如下：YNB 6.7g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸 (100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。
其中，所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)配方如下：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪 氨酸0.18g，精氨酸0.12g，色氨酸0.24g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g， 苯丙氨酸0.3g，甲硫氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，丝氨酸2.25g，组氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(I)、(II)、(III)、(IV)、(5)和(6)中所述的培养的条件优选为：30℃培养3～6天。
步骤(III)中，所述的模块1、模块8共同转化菌株M-3后，2个模块和筛选标记通过酵母体内同源 重组连接成完整的一条DNA片段，并且由于两端(模块1和模块8)带有50bp特异性的同源臂，使得这 个DNA片段可以整合到酵母染色体的PERG9位点；同理，步骤(VI)中所述的模块7、模块9和筛选标记 MET15通过同源重组原理整合到菌株M-4的染色体GAL80位点；步骤(V)中所述的模块2～5和筛选标 记LEU2通过同源重组原理整合到菌株M-5的染色体NDT80位点。
所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌在制备檀香挥发油中的应用。
一种制备檀香烯和檀香醇的方法，通过将上述构建方法构建得到的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工 程菌接种于发酵培养基中培养，待溶氧值达到60％时补加补料培养基，使培养基内半乳糖的含量维持在5 g/L，即得檀香烯和檀香醇；
其中，所述的发酵培养基组份包括：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，5g/L硫酸铵，25g/L半乳糖， 10g/L葡萄糖；
所述的补料培养基组份包括：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，5g/L硫酸铵，200g/L半乳糖，200 g/L葡萄糖。
所述的基因工程菌在发酵培养基中的培养条件为：温度25～35℃，pH值3～7，溶氧值40％，搅拌速 度300～1000rpm，通气量2～20L/min，发酵时间24～168h。
所述的基因工程菌在发酵培养基中的培养条件优选为：发酵温度30℃，pH值5.5，溶氧值40％，搅拌 速度300～450rpm，通气量2～3L/min，发酵时间96h。
所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的接种量为0.01％～20％(v/v)。
所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌在接种于发酵培养基中培养前需要进行活化。
所述的活化为多级活化。
所述的活化方法为：将高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的单菌落接种到100mL摇瓶中，于 220～250rpm、30℃条件下培养10～24h；然后将培养得到的菌液接种到1L摇瓶中于220～250rpm、30℃ 条件下培养24～48h。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本发明通过优化MVA途径限速步骤基因，过表达MVA途径转录因子，敲除旁路基因，解除半乳糖 调节，增加酵母菌对半乳糖的利用率，增强GAL启动子的启动强度，同时过表达檀香醇生物合成途径上 的基因，成功构建了高产檀香挥发油主要成分的酿酒酵母工程菌株。具体通过敲除LPP1、DPP1、GAL80 基因，将酿酒酵母ERG9基因内源性启动子替换成PHXT1启动子，过表达OptiSaSS和SanSyn中的至少一 种基因，以及过表达ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、SmFPPS、tHMG1、UPC2-1、PGM2、 GAL4、CYP736A167和SaCPR2基因，抑制酵母三萜的生物合成，构建得到酿酒酵母工程菌。其中，将得 到的酿酒酵母工程菌株WL-1进行4天发酵培养，可产生(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-香柠烯醇、 (Z)-epi-β-檀香醇、α-檀香烯、β-檀香烯、α-香柠檬烯和epi-β-檀香烯八种产物，总产量可以达到1.6g/L，其中(Z)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇分别占总产物的35.7％和17.8％。将酿酒酵母工程菌株WL-2进行4天发酵 培养，可产生(Z)-α-檀香醇和α-檀香烯两种主要产物，其(Z)-α-檀香醇和α-檀香烯的总产量可达1.4g/L。本 发明通过酿酒酵母工程菌株生产檀香烯和檀香醇能够有效解决药源问题，具有节省植物资源，保护环境的 优点。
附图说明
图1是檀香烯和檀香醇在酵母内的生物合成途径图。
图2是菌株WL-1和WL-2经过4天发酵培养后发酵产物总离子流图；其中，图A为菌株WL-1的发 酵产物结果图；图B为菌株WL-2的发酵产物结果图；1代表α-檀香烯、2代表α-香柠檬烯、3代表epi-β- 檀香烯、4代表β-檀香烯、6代表(Z)-α-檀香醇、7代表(Z)-α-香柠烯醇、8代表(Z)-epi-β-檀香醇、9代表(Z)-β- 檀香醇。
图3是菌株WL-2经4天发酵培养后发酵产物中α-檀香烯和(Z)-α-檀香醇质谱图；其中，图A为菌株 WL-2经4天发酵培养后发酵产物中α-檀香烯的质谱图；图B为菌株WL-2经4天发酵培养后发酵产物中 (Z)-α-檀香醇的质谱图。
图4是菌株WL-1和WL-2补料分批发酵生产檀香烯、檀香醇产量结果图；其中，图A为菌株WL-1 补料分批发酵生产檀香醇及其前体檀香烯的产量结果示意图；图B为菌株WL-2补料分批发酵生产(Z)-α- 檀香醇及其前体α-檀香烯的产量结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未 注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本 发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例中涉及的YPD培养基组成如下：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。
LPP1、DPP1基因的crRNA spacer序列由苏州泓迅生物科技有限公司合成；基因组DNA提取试剂 (DNAiso Reagent)购自宝日医生物技术有限公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase克隆试剂盒 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；pEASY-Blunt 载体购自全式金生物技术有限公司；Hiscript II Reverse Transcriptase试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公 司；Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM酵母转化试剂盒购自上海懋康生物科技有限公司； pEASY-Blunt载体购自全式金生物技术有限公司；pUC57-OptiSaSS购自苏州泓迅生物技术有限公司合成； ClonExpress II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；pSH65载体购自武汉淼灵生物科技有限公司；BsaΙ购自安诺伦生物科技 有限公司；pESC-LEU载体购自Addgene公司；pESC-URA载体购自Addgene公司；pCFB2796载体购自 Addgene公司；pCFB2988载体购自Addgene公司；pCRCT载体购自武汉淼灵生物科技有限公司；
Figure BDA0002291102350000061
DNA Polymerase试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
实施例1：酵母内源性基因、表达元件的克隆
1、酵母基因组的提取
(1)将酵母BY4741(购于ATCC)于5mL YPD培养基中培养16～24h，在4000rpm转速条件下离 心5min沉淀菌体，用移液枪将菌体吸入研钵中，立即加入适量的液氮至覆盖菌体，将菌体快速研磨至粉末 状；其中YPD培养基的配方为：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，博来霉素(zeocin)100 mg/L，20g/L琼脂粉。
(2)立即加入1mL DNAiso Reagent基因组DNA提取试剂(裂解液)覆盖菌体，将裂解液继续用研杵 研磨直至裂解液澄清透明，用移液枪将裂解液转移至离心管中。
(3)裂解液在4℃10000rpm的条件下离心10min，将上清转移到新的离心管内，加入500μL的无水 乙醇，涡旋混匀，室温4000rpm离心沉淀DNA，弃上清。
(4)在EP管内加入1mL 75％(v/v)的乙醇，重悬沉淀，12000rpm离心5min，弃上清，在室温条件 下放置2min，挥发尽残留乙醇，将DNA沉淀溶解在60μL ddH2O中。
2、PCR扩增酵母内源性基因和表达元件
本发明所有PCR扩增均采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase克隆试剂盒。
PCR反应体系为：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，2×Phanta Max buffer 10μL，dNTP 0.4μL，正反特异性引物各1μL(引物见表1)，DNA模板1μL，ddH2O 6.1μL。
PCR扩增反应条件为：预变性阶段，95℃3min；扩增循环阶段，95℃30s、55℃30s、72℃90s，32 个循环；彻底延伸阶段，72℃5min。
以上述获得的酵母基因组为模板，按上述体系和条件，分别克隆如下10个基因、5个启动子和5个终 止子：
tHMG1(tHMG1-F、tHMG1-R)、PGM2(PGM2-F、PGM2-R)、IDI1(IDI1-F、IDI1-R)、ERG8(ERG8-F、 ERG8-R)、ERG10(ERG10-F、ERG10-R)、ERG12(ERG12-F、ERG12-R)、ERG13(ERG13-F、ERG13-R)、 ERG19(ERG19-F、ERG19-R)、UPC2(UPC2-F、UPC2-R)、GAL4(GAL4-F、GAL4-R)；
其中，tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；PGM2的核苷酸序列见GenBank:NM_001182605.1； IDI1的核苷酸序列见GenBank:NM_001183931.1；ERG8的核苷酸序列见GenBank:NM_001182727.1；ERG10 的核苷酸序列见GenBank:NM_001183842.1；ERG12的核苷酸序列见GenBank:NM_001182715.1；ERG13 的核苷酸序列见GenBank:NM_001182489.1；ERG19的核苷酸序列见GenBank:NM_001183220.1；UPC2的 核苷酸序列见GenBank:NM_001180521.1；GAL4的核苷酸序列见GenBank:NM_001184062.1。
PHXT1(PHXT1-F、PHXT1-R)、PGAL1(PGAL1-F、PGAL1-R)、PPGK1(PPGK1-F、PPGK1-R)、PTDH3(PTDH3-F、PTDH3-R)、 PTEF1(PTEF1-F、PTEF1-R)、PTPI1(PTPI1-F、PTPI1-R)，其中，PHXT1的核苷酸序列见GenBank:CP036477.1，从 第292634位到第293756位；PGAL1的核苷酸序列见GenBank:MF084286.1，从第15722位到第16176位； PPGK1的核苷酸序列见GenBank:KF366479.1，从第789位到第1772位；PTDH3的核苷酸序列见GenBank CP020129.1，从第884060位到第884735位；PTEF1的核苷酸序列见GenBank:CP020138.1，从第700414位 到第700832位；PTPI1的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
TPYX212(TPYX212-F、TPYX212-R)、TADH1(TADH1-F、TADH1-R)、TCYC1(TCYC1-F、TCYC1-R)、TTDH2(TTDH2-F、 TTDH2-R)和TFBA1(TFBA1-F、TFBA1-R)终止子，其中，TPYX212的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；TADH1的核苷酸序列见GenBank:CP020137.1，从第159411位到第159575位；TCYC1的核苷酸序列见GenBank: MH453954.1，从第3883位到第4072位；TTDH2的核苷酸序列见GenBank:CP020132.1，从第459200位到第 459599位；TFBA1的核苷酸序列见GenBank:CP020133.1，从第326017位到第326416位。
3、DNA片段胶回收
PCR扩增产物使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，并依据产品说明书进行操作。
4、DNA片段连接pEASY-Blunt载体并测序
所有扩增的DNA片段均通过连接平末端pEASY-Blunt载体，转化DH5α菌株，通过菌落PCR挑选阳性 转化子测序，具体操作按照pEASY-Blunt载体产品说明书进行。
菌落PCR采用
Figure BDA0002291102350000071
DNA Polymerase试剂盒，PCR反应体系：Easy Taq聚合酶0.2μL，10×Easy Taq Buffer 1μL，M13通用引物-F(引物见下表1)10μM 0.3μL，M13通用引物-R(引物见表1)10μM 0.3μL， 二甲基亚砜(DMSO)1μL，dNTPs 2.5mM 0.8μL，ddH2O 6.4μL，沾取固体平板培养基上的部分菌体于PCR 体系中混匀。
PCR扩增条件为：预变形阶段，95℃5min；扩增循环阶段，95℃30s、50℃30s、72℃2min、35个 循环；彻底延伸阶段，72℃7min。
通过琼脂糖凝胶电泳确定阳性转化子，并通过测序确定所扩增的DNA片段碱基序列与目标序列一致。
5、UPC2定点突变得到UPC2-1
UPC2已经被确认是激活MVA途径和麦角甾醇途径的最主要的转录因子，同时还发现一个点突变体 UPC2-1可以在有氧条件下吸收胞外的甾醇，因此过表达UPC2-1可以上调MVA途径流量。UPC2-1的核苷 酸序列如SEQ ID NO.3所示。其具体步骤如下：
(1)以pEASY-Blunt-UPC2质粒(pEASY-Blunt-UPC2质粒由UPC2基因构建到pEASY-Blunt载体上制 备得到，具体参考实施例1中步骤4)为模板进行PCR扩增(引物见表1：上游引物UPC2-1-F和下游引物 UPC2-1-R)，得到PCR产物。其中，PCR扩增反应条件为：预变性阶段95℃3min；扩增循环阶段：95℃30s、 62℃30s、72℃2min，30循环；彻底延伸阶段，72℃5min。
(2)将PCR产物在37℃下用DpnΙ酶切1h，然后取1μL转化100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，轻 弹混匀，冰浴20～30min，然后将感受态细胞放入42℃水浴锅中热激60s，立即将其置于冰浴中冷却2min。 向感受态细胞中加入250μL NZY培养基；其中，所述NZY培养基的制备方法为：分别取酵母提取物5g、 Casein酪蛋白10g、无水硫酸镁1g、氯化钠10g，加去离子水定容至1L，pH值调至7.0，在121℃条件下 灭菌20min即得。在37℃，220rpm的恒温振荡培养箱中抚育60min。取200μL菌液进行涂板，在超净台 内将菌液吹干，放入37℃恒温生化培养箱中，倒置培养14～18h。
(3)通过菌落PCR挑选阳性转化子测序。
实施例2：植物源基因的克隆
1、RNA的提取
(1)取100mg檀香或者丹参植物样品(市购得到)加入到含有950μL Trizol和50μLβ-巯基乙醇的EP 管中，涡旋15s混匀，室温静置5min，在12000rpm，4℃条件下离心10min。
(2)离心完毕后，用移液枪吸取上清至含有200μL氯仿的EP管中，震荡混匀两分钟，在12000rpm、 4℃条件下离心15min。
(3)吸取步骤(2)离心得到的上层清液于新的EP管内，加入500μL异丙醇，在室温条件下静置10min， 在12000rpm，4℃条件下离心10min。
(4)离心完毕后，去掉上清液，向去上清后的EP管中加入1mL 75％(v/v)乙醇溶液，用移液枪轻轻 吹打混匀，在7500rpm，4℃条件下离心5min沉淀RNA，弃上清，在室温条件下将剩余的乙醇挥发干净。
(5)取35μL RNase-Free H2O溶解上述RNA样品，即得檀香或者丹参植物的RNA样品。
2、RNA反转录成cDNA克隆目的基因
采用Hiscript II Reverse Transcriptase试剂盒将RNA反转录成cDNA，具体操作根据试剂盒说明书进行。
以丹参cDNA为模板克隆SmFPPS(引物见表1：SmFPPS-F、SmFPPS-R)，以檀香cDNA为模板克隆 CYP736A167、SaCPR2基因(CYP736A167-F/CYP736A167-R、SaCPR2-F/SaCPR2-R)，其中，SmFPPS的核 苷酸序列见GenBank:HQ687768.1；CYP736A167的核苷酸序列见GenBank:KU169302.1；SaCPR2的核苷酸 序列见GenBank:KC842188.1。
具体克隆方法同实施例1中的步骤2、3和4。
表1.本发明克隆基因和表达元件引物
Figure BDA0002291102350000081
Figure BDA0002291102350000091
实施例3、CRISPR-Cas9系统敲除酿酒酵母BY4741的LPP1、DPP1基因
1、crRNA spacer核酸序列的设计和载体的构建
(1)通过对LPP1、DPP1基因序列进行分析，设计出靶位点序列，具体的crRNAspacer的设计方法根 据文献Huimin Zhao et al,ACS Synth.Biol.2015,4,585-594中记载的方法进行操作。其中，
LPP1、DPP1基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.1所述；
LPP1、DPP1基因的crRNA spacer序列由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
(2)将crRNA spacer序列利用BsaΙ进行酶切并连接到pCRCT载体上，得到pCRCT-LPP1-DPP1载体。
2、pCRCT载体转化酿酒酵母敲除目的基因
(1)将pCRCT-LPP1-DPP1载体利用Zymo Research Frozen-EZ YeastTransformation II KitTM酵母转化试 剂盒转化酿酒酵母BY4741，具体转化方法参照产品说明书。
(2)利用SD-URA缺陷平板培养基进行筛选，平板在30℃条件下培养五天。其中，SD-URA缺陷平 板培养基的配方为：YNB培养基6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×) 10mL/L。其中，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)的制备方法为：分别称取缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸 盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，色氨酸0.24g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖 氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，甲硫氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，丝氨酸2.25g，组氨酸0.12g，用ddH2O定 容到57mL即得。
(3)通过菌落PCR挑选阳性转化子，接于4mL SD-URA培养基中，在30℃、220rpm条件下摇床培 养。
(4)培养两天后取100μL菌液接于新鲜SD-URA培养基中继续表达两天。
(5)通过划板稀释挑选步骤(4)中的单菌落菌株提取基因组，扩增目的基因进行测序验证该基因已经 被敲除。
(6)利用YPD培养基传代培养5天丢失pCRCT-LPP1-DPP1，构建菌株BY4741-1；其中，YPD培养 基的配方为：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，博来霉素(zeocin)100mg/L，20g/L琼脂 粉。
实施例4：载体和模块的构建
1、重叠PCR构建模块
所有片段的连接均采用重叠PCR，具体步骤如下：
(1)构建模块1～6所需的DNA片段经过第一轮PCR扩增得到(第一轮PCR反应体系和条件同实施 例1步骤2)，通过引物在需要连接的DNA片段之间互相加上40～50bp的重叠碱基序列用于第二轮的重叠 PCR。
(2)将构建模块1～6中任何一个模块的DNA片段进行第二轮PCR反应，其中，第二轮PCR反应体系 为：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，2×Phanta Maxbuffer 10μL，dNTP(10mM)0.4μL，DNA片段1～9.1μL，加ddH2O补齐到20μL。第二轮PCR反应条件为：预变性阶段，95℃3min；扩增循 环阶段，95℃30s、60～70℃30s、72℃1～4min，10个循环；彻底延伸阶段，72℃5min。
(3)取第二轮PCR反应液作为第三轮PCR反应的模板；其中，第三轮PCR体系为：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，2×Phanta Max buffer 10μL，dNTP(10mM)0.4μL，模板1μL，正反 引物各1μL，ddH2O 6.1μL，总反应体系20μL。第三轮PCR反应条件为：预变性阶段，95℃3min；扩增循 环阶段，95℃30s、50～60℃30s、72℃1～4min，30循环；彻底延伸阶段，72℃5min。
(4)胶回收模块DNA片段，连接pEASY-Blunt载体测序。
按上述步骤构建以下6个模块：
(a)将HIS3、PHXT1顺序连接，构建模块HIS3-PHXT1，命名为模块1，其中第一轮PCR克隆PHXT1引 物为1-PHXT1-F、PHXT1-R，克隆HIS3引物为1-HIS3-F、1-HIS3-R；第三轮PCR引物为1-HIS3-F、PHXT1-R；
(b)将PGAL1、ERG8和TPYX212顺序连接，构建模块PGAL1-ERG8-TPYX212，命名为模块2，其中第一 轮PCR克隆PGAL1引物为PGAL1-F、2-PGAL1-R，克隆ERG8引物为2-ERG8-F、2-ERG8-R，克隆TPYX212引 物为2-TPYX212-F、TPYX212-R；第三轮PCR引物为PGAL1-F、TPYX212-R；
(c)将PPGK1、ERG10和TADH1顺序连接，构建模块PPGK1-ERG10-TADH1，命名为模块3，其中第一轮 PCR克隆PGAL1引物为PPGK1-F、3-PPGK1-R，克隆ERG10引物为3-ERG10-F、3-ERG10-R，克隆TADH1引物 为3-TADH1-F、TADH1-R；第三轮PCR引物为PPGK1-F、TADH1-R；
(d)将PTDH3、ERG12和TTDH2顺序连接，构建模块PTDH3-ERG12-TTDH2，命名为模块4，其中第一 轮PCR克隆PTDH3引物为PTDH3-F、4-PTDH3-R，克隆ERG12引物为4-ERG12-F、4-ERG12-R，克隆TTDH2引物为4-TTDH2-F、TTDH2-R；第三轮PCR引物为PTDH3-F、TTDH2-R；
(e)将PTEF1、ERG13和TCYC1顺序连接，构建模块PTEF1-ERG13-TCYC1，命名为模块5，其中第一轮 PCR克隆PTEF1引物为PTEF1-F、5-PTEF1-R，克隆ERG13引物为5-ERG13-F、5-ERG13-R，克隆TCYC1引物 为5-TCYC1-F、TCYC1-R；第三轮PCR引物为PTEF1-F、TCYC1-R；
(f)将PTPI1、ERG19和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1-ERG19-TFBA1，命名为模块6，其中第一轮PCR 克隆PTPI1引物为PTPI1-F、6-PTPI1-R，克隆ERG19引物为6-ERG19-F、6-ERG19-R，克隆TFBA1引物为6-TFBA1-F、 TFBA1-R；第三轮PCR引物为PTPI1-F、TFBA1-R。
本实施例中所述引物的核苷酸序列如表2所示。
表2.构建模块引物
Figure BDA0002291102350000101
Figure BDA0002291102350000111
2、通过酶切连接构建载体
(1)将pESC-LEU载体用BamHI/XhoI限制性内切酶线性化，酶切体系为：pESC-LEU载体1μg，限制 性内切酶BamHI/XhoI各0.5μL，10×Fast Digest Green Buffer 2μL，加水补齐到20μL体系。37℃酶切1h， 胶回收线性化载体。将OptiSaSS从pUC57-OptiSaSS上用BamHI/XhoI内切酶切下来，酶切体系如载体 pESC-LEU线性化酶切体系。
(2)将OptiSaSS通过T4连接酶插入载体pESC-LEU BamHI/XhoI酶切位点，得到连接产物。其中， 连接体系为：线性化的pESC-LEU 20～100ng，OptiSaSS 50～500ng，T4 DNA连接酶0.5μL，10×T4 DNA 连接酶缓冲液1μL，加水补齐到10μL体系。16℃反应过夜。
(3)16℃连接1h，将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养14～16h， 通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，即得含有TCYC1-OptiSaSS-PGAL1 DNA片段的重组载体，命名为pWL01。
按照上述方法将SanSyn基因构建到pESC-LEU载体上，即得PGAL1-SanSyn-TCYC1 DNA片段，命名为 pWL02。
3、通过同源重组构建载体
(1)将pESC-URA载体用EcoRI/SacI限制性内切酶线性化；其中，酶切体系为：pESC-LEU载体1μg， 限制性内切酶EcoRI/SacI各0.5μL，10×Fast Digest Green Buffer 2μL，加水补齐到20μL体系；37℃酶切1h， 胶回收线性化载体。
(2)以pEASY-Blunt-SaCPR2为模板(pEASY-Blunt-SaCPR2质粒由SaCPR2基因构建到pEASY-Blunt 载体上制备得到，具体参考实施例1中步骤4)克隆得到带有同源臂的SaCPR2基因(pWL03-SaCPR2-F、 pWL03-SaCPR2-R)，通过ClonExpress II One StepCloning Kit构建到载体pESC-URA的EcoRI/SacI位点； 16℃连接1h，得到连接产物，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养14～16h，通过 菌落PCR筛选和提取质粒测序，获得阳性重组质粒，进一步通过上述方法将SaCYP736A167 (pWL03-CYP736A167-F、pWL03-CYP736A167-R)构建到pESC-URA载体的BamHI/NheI位点，获得重组 质粒pWL03；其中，连接体系为：线性化的pESC-URA 50ng，SaCPR2 20ng，
Figure BDA0002291102350000112
II 1μL，5×CE II Buffer2μL，加ddH2O补齐到10μL。
pWL04、pWL05和pWL10的构建方法均同本实施例步骤3中的(1)～(2)所述；其中，克隆PGM2 的引物为：pWL04-PGM2-F/pWL04-PGM2-R，克隆tHMG1的引物为：pWL04-tHMG1-F/pWL04-tHMG1-R， 克隆UPC2-1的引物为：pWL04-UPC2-1-F/pWL04-UPC2-1-R，克隆IDI1的引物为：pWL10-IDI1-F/pWL10- IDI1-R，克隆SmFPPS的引物为：pWL10-SmFPPS-F/pWL10-SmFPPS-R。
4、整合载体的构建
(1)将pCFB2796载体用SfaΙ限制性内切酶线性化，于37℃酶切1h，然后胶回收线性化载体。其中， 酶切体系为：pCFB2796载体1μg，SfaΙ限制性内切酶0.5μL，10×Fast DigestGreen Buffer 2μL，加水补齐 到20μL体系；
(2)将tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1 DNA片段从pWL05载体上通过PCR扩增下来(tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-F、tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-R)。
(3)将tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1模块通过ClonExpress II One Step CloningKit构建到载体 pCfB2796的SfaΙ位点，连接体系为：线性化的pCFB2796 50ng，tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1模块100ng，
Figure BDA0002291102350000113
II 1μL，5×CE II Buffer 2μL，加ddH2O补齐到10μL。
(4)37℃连接30min，得到连接产物TCYC1-tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-TADH1-KIURA3，将连接产 物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养14～16h，通过菌落PCR挑选阳性转化子，即为整合载体 pWL06。
整合载体pWL07、pWL08和pWL09的构建方法如本实施例4的步骤(1)～(4)所述。其中，克隆 SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167的引物为：SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167-F、SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167-R；克隆PGAL1-OptiSaSS-TCYC1的引物为：PGAL1-OptiSaSS-F、PGAL1-OptiSaSS-R；克隆PGAL1-SanSyn-TCYC1的引物为：SanSyn-TCYC1-F、SanSyn-TCYC1-R。
本实施例中，构建载体所用到的引物分别如下表3所示。
表3.载体构建引物
名称 序列(5’-3’)
pWL03-SaCPR2-F GTAAGAATTTTTGAAAATTCGAATTCATGTCTCCGGCAACAGCCGTTAT
pWL03-SaCPR2-R GCGAAGAATTGTTAATTAAGAGCTCTTAGGACTCCAAGCGATAGGTTGG
pWL03-CYP736A167-F CAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCATGCAATTGAGCTCCGTCAAGC
pWL03-CYP736A167-R TCGGTTAGAGCGGATCTTAGCTAGCTCACCACACATCCCGTAAATACC
pWL04-PGM2-F GTAAGAATTTTTGAAAATTCGAATTCATGTCATTTCAAATTGAAACGGTTC
pWL04-PGM2-R GCGAAGAATTGTTAATTAAGAGCTCTTAAGTACGAACCGTTGGTTCTTCAG
pWL04-tHMG1-F CAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGCATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAGTC
pWL04-tHMG1-R CCTTGTAATCCATCGATACTAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGG
pWL04-UPC2-1-F CAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCATGAGCGAAGTCGGTATACAGAATC
pWL04-UPC2-1-R CTGTTCCATGTCGACGCCCGGGTCATAACGAAAAATCAGAGAAATTTG
pWL10-IDI1-F CAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCATGACTGCCGACAACAATAGTATG
pWL10-IDI1-R CGGTTAGAGCGGATCTTAGCTAGCTTATAGCATTCTATGAATTTGCCTGTC
pWL10-SmFPPS-F GTAAGAATTTTTGAAAATTCGAATTCATGGCGAATCTGAACGGAGAGTC
pWL10-SmFPPS-R GCGAAGAATTGTTAATTAAGAGCTCTTATTTCTGCCTCTTGTATATCTTGC
tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-F CTACCAACGGAATGCGTGCGATCGCTTAGGATTTAATGCAGGTGACGG
tHMG1-P<sub>GAL1</sub>-P<sub>GAL10</sub>-UPC2-1-R GAGCGGATGAATGCACGCGATCGCTCATAACGAAAAATCAGAGAAATTTG
SaCPR2-P<sub>GAL1</sub>-P<sub>GAL10</sub>-CYP736A167-F CTACCAACGGAATGCGTGCGATCGCTTAGGACTCCAAGCGATAGGTTGG
SaCPR2-P<sub>GAL1</sub>-P<sub>GAL10</sub>-CYP736A167-R GAGCGGATGAATGCACGCGATCGCTCACCACACATCCCGTAAATACCTTC
P<sub>GAL1</sub>-OptiSaSS-F GATCAATGAATATTAACATAGCTAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCT
P<sub>GAL1</sub>-OptiSaSS-R GTGCTCGCTGAGGACTTAATGCTAGCAGTACGGATTAGAAGCCGCC
SanSyn-T<sub>CYC1</sub>-F GTAATAGGATCAATGAATATTAACATAGCTAGCCTTCGAGCGTCCCAAAAC
SanSyn-T<sub>CYC1</sub>-R GCTCGCTGAGGACTTAATGCTAGCAGTACGGATTAGAAGCCGCCG
实施例5：模块整合酵母染色体构建工程酵母菌
1、BY4741-6菌株的构建
(1)将实施例4得到的TCYC1-tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-TADH1-KIURA3 DNA整合片段(即整合片 段A1)用限制性内切酶NotΙ从载体pWL06(按实施例4步骤2构建)上切下来，于37℃酶切2h，胶回 收。其中，酶切体系为：载体pWL06 5μg，内切酶NotΙ2μL，10×Fast DigestGreen Buffer 5μL，ddH2O 38μL。
(2)取5μL上述DNA整合片段A1用Zymo Research Frozen-EZ YeastTransformation II KitTM试剂盒转 化酿酒酵母BY4741-1(即将该模块整合到酵母BY4741-1染色体TY4位点)，用SD-URA平板培养基进行 筛选，构建菌株BY4741-2。其中，SD-URA平板培养基的制备方法为：分别取YNB培养基6.7g，葡萄糖 20g，琼脂粉20g，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)10mL，用蒸馏水定容至1L。
2、筛选标记的敲除
(1)将pSH65载体用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM试剂盒转化BY4741-2菌 株，用含有100μg/mL博来霉素的YPD培养基进行筛选。
其中，YPD平板培养基的配方为：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，博来霉素(zeocin) 100mg/L，20g/L琼脂粉。
(2)挑选单菌落用含有100μg/mL博来霉素的YPG培养基表达四天，通过划板稀释挑选单菌落，提 取基因组，通过PCR克隆出整合的DNA片段(引物：pCFB-F/pCFB-R)，通过测序找出筛选标记KIURA3 被敲除的菌株，用YPD培养基传代培养五天丢失pSH65质粒，得到菌株BY4741-3。其中，YPG培养基 的配置方法为：分别取酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖2g，半乳糖18g，博来霉素100mg，用蒸 馏水定容至1L。YPD平板培养基的配置方法为：分别取蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，博 来霉素(zeocin)100mg，20g琼脂粉，用蒸馏水定容至1L。
3、PHXT1启动子替换和GAL4基因的整合
(1)酵母体内多片段同源重组将模块1和模块8整合到BY474-3菌株的染色体的PERG9位点，按照“模 块8-模块1”的顺序，通过PCR给模块8的3'端和模块1的5'端加上50bp同源臂用于酵母体内同源重组， 同时通过PCR给模块8的5'端和模块1的3'端加上50bp同源臂用于整合PERG9位点。其中，克隆模块1 的引物为2-HIS3-F、PERG9-1-R，克隆模块8的引物为PERG9-8-F、PERG9-8-R。
(2)将模块1和模块8DNA片段用Zymo Research Frozen-EZ YeastTransformation II KitTM试剂盒转化 菌株BY4741-3，用SD-HIS平板筛选，30℃培养3～6天，得到菌株BY4741-4。
4、IDI1、SmFPPS和PGM2基因的整合
(1)酵母体内多片段同源重组模块7、模块9和MET15整合到BY474-4菌株的染色体的GAL80位 点，按照“模块7-模块9-MET15”的顺序，通过PCR给模块7的3'端和MET15的5'端加上50bp同源臂用 于酵母体内同源重组，同时通过PCR给相邻片段5'或者3'的加上50bp同源臂用于整合GAL80位点。其 中，克隆模块7的引物为GAL80-7-F、GAL80-7-R，克隆模块9的引物为GAL80-9-F、GAL80-9-R，克隆 MET15的引物为GAL80-MET15-F、GAL80-MET15-R。
(2)将模块7、模块9和MET15 DNA片段用Zymo Research Frozen-EZ YeastTransformation II KitTM试剂盒转化菌株BY4741-4，用SD-MET酵母缺陷型平板培养基筛选，30℃培养3～6天，得到菌株 BY4741-5。
5、ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因的整合
ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因的整合的方法如实施例6步骤2～3所述，整合位点为 NDT80位点，LEU2作为筛选marker，最终得到菌株BY4741-6。其中克隆模块2的引物为NDT80-2-F、 NDT80-2-R，克隆模块3的引物为PPGK1-F、NDT80-3-R，克隆模块4的引物为PTDH3-F、NDT80-4-R，克隆 模块5的引物为PTEF1-F、NDT80-5-R，克隆模块6的引物为PTPI1-F、NDT80-6-R，克隆LEU2的引物为 NDT80-LEU2-F、NDT80-LEU2-R；如下表4所示。
表4.模块整合酵母染色体引物
Figure BDA0002291102350000131
Figure BDA0002291102350000141
6、可合成檀香挥发油主要成分的酿酒酵母工程菌株的构建
(1)、可合成檀香挥发油主要成分的酿酒酵母工程菌株WL-1的构建：
1)将TCYC1-OptiSaSS-PGAL1-PGAL10-CYP736A167-TADH1-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3的DNA整合片 段(即整合片段A2)用限制性核酸内切酶NotΙ从载体pWL08(按照本发明实施例4的步骤4所述方法构 建)切下来，酶切体系为：载体pWL08 5μg，限制性核酸内切酶NotΙ2μL，10×Fast Digest Green Buffer 5μL， ddH2O 38μL；37℃酶切2h，胶回收。
2)取5μL上述DNA整合片段A2用Zymo Research Frozen-EZ YeastTransformation II KitTM试剂盒转化 酿酒酵母BY4741-6(即将该模块整合到酵母BY4741-6染色体TY1Cons2位点)，用SD-URA平板培养基 进行筛选，得到菌株WL-1。其中，SD-URA平板培养基的制备方法为：取YNB培养基6.7g，葡萄糖20g， 琼脂粉20g，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)10mL，定容至1L。
(2)可合成檀香挥发油主要成分的酿酒酵母工程菌株WL-2的构建
按照上述实验方法将TCYC1-SanSyn-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA 片段(即整合片段A3)用限制性核酸内切酶NotΙ从载体pWL09切下来，整合到酵母BY4741-6的染色体 TY1Cons2位点，即可构建得到菌株WL-2。
实施例6：发酵酵母菌株WL-1、WL-2生产檀香挥发油主要成分
1、WL-1、WL-2菌株发酵培养
(1)分别挑选实施例5得到的菌株WL-1、WL-2的单菌落于装有15mL YPD培养基的100mL摇瓶 中，在摇床中培养10～24h至OD值2～3，温度设置为30℃转速220～250rpm。
(2)将步骤(1)得到的WL-1、WL-2菌液分别接到三个含有100mL发酵培养基的1L摇瓶中，在 220～250rpm，30℃条件下培养36～48h至OD600 4～5。
(3)将上述300mL菌液都接到包含3L发酵培养基的5L的发酵罐中，温度控制在30℃，用氨水控 制pH维持在5.0，溶氧值控制30％，转速在300～1000rpm，通气量3～20L/min。
(4)待溶氧值达到60％时启动补料系统进行补料(即加入补料培养基)，使培养基内半乳糖的含量维 持在5g/L，发酵培养168h，得到发酵液。
其中，所述的YPD平板培养基的配置方法为：分别取蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g， 博来霉素(zeocin)100mg，20g琼脂粉，用蒸馏水定容至1L。
所述的发酵培养基通过如下方法制备得到：分别取10g酵母提取物，20g蛋白胨，5g硫酸铵，25g 半乳糖，10g葡萄糖，用蒸馏水定容至1L即得；
所述的补料培养基通过如下方法制备得到：分别取10g酵母提取物，20g蛋白胨，5g硫酸铵，200g 半乳糖，200g葡萄糖，用蒸馏水定容至1L。
2、产物的萃取与检测
分别取菌株WL-1和WL-2在24h、48h、72h、96h进行发酵培养获得的发酵液，分别向上述发酵液中 加入等体积的乙酸乙酯超声1h，静置24h，取有机层于干净的液相小瓶中，进行GC-MS检测；其中，所 用的仪器为安捷伦气质联用仪7890B-5977B。检测方法：进样体积1μL，溶剂延时11min，载气为氦气， 流速为1mL/min。色谱柱：HP-5MS。色谱条件：50℃，1min，20℃/min速率升温到133℃，0.5℃/min升 温到137℃，5℃/min升温至142℃，最后0.5℃/min升温到147℃。
通过产物分析可知，菌株WL-1、WL-2分别经发酵培养后均可以获得檀香烯、檀香醇等檀香挥发油主 要成分。其中，檀香烯、檀香醇在酵母内的生物合成途径如图1所示；菌株WL-1和WL-2经4天发酵培养 后发酵产物组成如图2所示；菌株WL-2经4天发酵培养后发酵产物中α-檀香烯和(Z)-α-檀香醇的质谱检测 结果如图3所示；图4为菌株WL-1和WL-2补料分批发酵生产檀香醇及其前体檀香烯的产量示意图。
从图中可以看出，将得到的酿酒酵母工程菌株WL-1进行4天发酵培养，可产生(Z)-α-檀香醇、(Z)-β- 檀香醇、(Z)-α-香柠烯醇、(Z)-epi-β-檀香醇、α-檀香烯、β-檀香烯、α-香柠檬烯和epi-β-檀香烯八种产物，总 产量可以达到1.6g/L，其中(Z)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇分别占总产物的35.7％和17.8％。将酿酒酵母工程菌 株WL-2进行4天发酵培养，可产生(Z)-α-檀香醇和α-檀香烯两种主要产物，其(Z)-α-檀香醇和α-檀香烯的总 产量可达1.4g/L。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背 离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本 发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
<160> 144
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> crRNA spacer
<400> 1
ccaaaacaat tggattggaa gactaagacc agattttcta gatcgttgcc aacctgttgc 60
cattggacac tttatttact gcaaaagatg tgtgtacgac taagaatgat cgttgccaac 120
ctgttgagtt ttagagctat gctgttttga atggtcccaa aactgatata ctggggtcat 180
caagactaaa ttcgatgttt tggcccctag gtaatctccg aatagaggaa taatatcgta 240
catagaccaa ttatcatgta ctggttttgg cccctaggta ccagttttag ag 292
<210> 2
<223> tHMG1
<400> 2
atggctgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta 60
caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa 120
agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat catctagtga ggaagatgat 180
tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta 240
ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300
ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360
gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420
ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480
tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540
ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600
atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660
gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720
gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780
catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840
gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900
gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960
aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020
actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080
ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140
gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200
aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260
tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320
caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380
aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440
tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500
gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560
tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1584
<210> 3
<223> UPC2-1
<400> 3
atgagcgaag tcggtataca gaatcacaag aaagcggtga caaaacccag aagaagagaa 60
aaagtcatcg agctaattga agtggacggc aaaaaggtga gtacgacttc aaccggtaaa 120
cgtaaattcc ataacaaatc aaagaatggg tgcgataact gtaaaagaag aagagttaag 180
tgtgatgaag ggaagccagc ctgtaggaag tgcacaaata tgaagttgga atgtcagtat 240
acaccaatcc atttaaggaa aggtagagga gcaacagtag tgaagtatgt cacgagaaag 300
gcagacggta gcgtggagtc tgattcatcg gtagatttac ctcctacgat caagaaggag 360
cagacaccgt tcaatgatat ccaatcagcg gtaaaagctt caggctcatc caatgattcc 420
tttccatcaa gcgcctctac aactaagagt gagagcgagg aaaagtcatc ggcccctata 480
gaggacaaaa acaatatgac tcctctaagt atgggcctcc agggtaccat caataagaaa 540
gatatgatga ataacttttt ctctcaaaat ggcactattg gttttggttc tcctgaaaga 600
ttgaattcag gtatcgatgg cttactatta ccgccattgc cttctggaaa tatgggtgcg 660
ttccaacttc agcaacagca gcaagtgcag cagcaatctc aaccacagac ccaagcgcag 720
caagcaagtg gaactccaaa cgagagatat ggttcattcg atcttgcggg tagtcctgca 780
ttgcaatcca cgggaatgag cttatcaaat agtctaagcg ggatgttact atgtaacagg 840
attccttccg gccaaaacta cactcaacaa caattacaat atcaattaca ccagcagctg 900
caattgcaac agcatcagca agttcagctg cagcagtatc aacaattacg tcaggaacaa 960
caccaacaag ttcagcaaca acaacaggaa caactccagc aataccaaca acattttttg 1020
caacagcagc aacaagtact gcttcagcaa gagcaacaac ctaacgatga ggaaggtggc 1080
gttcaggaag aaaacagcaa aaaggtaaag gaagggcctt tacaatcaca aacaagcgaa 1140
actactttaa acagcgatgc tgctacatta caagctgatg cattatctca gttaagtaag 1200
atggggctaa gcctaaagtc gttaagtacc tttccaacag ctggtattgg tggtgtttcc 1260
tatgactttc aggaactgtt aggtattaag tttccaataa ataacggcaa ttcaagagct 1320
actaaggcca gcaacgcaga ggaagctttg gccaatatgc aagagcatca tgaacgtgca 1380
gctgcttctg taaaggagaa tgatggtcag ctctctgata cgaagagtcc agcgccatcg 1440
aataacgccc aagggggaag tgctagtatt atggaacctc aggcggctga tgcggtttcg 1500
acaatggcgc ctatatcaat gattgaaaga aacatgaaca gaaacagcaa catttctcca 1560
tcaacgccct ctgcagtgtt gaatgatagg caagagatgc aagattctat aagttctcta 1620
ggaaatctga caaaagcagc cttggagaac aacgaaccaa cgataagttt acaaacatca 1680
cagacagaga atgaagacga tgcatcgcgg caagacatga cctcaaaaat taataacgaa 1740
gctgaccgaa gttctgtttc tgctggtacc agtaacatcg ctaagctttt agatctttct 1800
accaaaggca atctgaacct gatagacatg aaactgtttc atcattattg cacaaaggtc 1860
tggcctacga ttacagcggc caaagtttct gggcctgaaa tatggaggga ctacataccg 1920
gagttagcat ttgactatcc atttttaatg cacgctttgt tggcattcag tgccacccat 1980
ctttcgagga ctgaaactgg actggagcaa tacgtttcat ctcaccgcct agacgctctg 2040
agattattaa gagaagctgt tttagaaata tctgagaata acaccgatgc gctagttgcc 2100
agcgccctga tactaatcat ggactcgtta gcaaatgcta gtggtaacgg cactgtagga 2160
aaccaaagtt tgaatagcat gtcaccaagc gcttggatct ttcatgtcaa aggtgctgca 2220
acaattttaa ccgctgtgtg gcctttgagt gaaagatcta aatttcataa cattatatct 2280
gttgatctta gcgatttagg cgatgtcatt aaccctgatg ttggaacaat tactgaattg 2340
gtatgttttg atgaaagtat tgccgatttg tatcctgtcg gcttagattc gccatatttg 2400
ataacactag cttatttaga taaattgcac cgtgaaaaaa accagggtga ttttattctg 2460
cgggtattta catttccagc attgctagac aagacattcc tggcattact gatgacaggt 2520
gatttaggtg caatgagaat tatgagatca tattataaac tacttcgagg atttgccaca 2580
gaggtcaagg ataaagtctg gtttctcgaa ggagtcacgc aggtgctgcc tcaagatgtt 2640
gacgaataca gtggaggtgg tgatatgcat atgatgctag atttcctcgg tggcggatta 2700
ccatcgatga caacaacaaa tttctctgat ttttcgttat ga 2742
<210> 4
<223> SanSyn
<400> 4
atgtcaacac aacaagtttc atctgaaaat attgttagaa atgctgctaa ttttcatcca 60
aatatttggg gtaatcattt tttaacttgt ccatctcaaa ctattgattc ttggactcaa 120
caacatcata aagaattgaa agaagaagtt agaaaaatga tggtttctga tgctaataaa 180
ccagcacaaa gattaagatt gattgatact gttcaaagat tgggtgttgc ttatcatttt 240
gaaaaagaaa ttgatgatgc attagaaaaa attggtcatg atccatttga tgataaagat 300
gatttatata ttgtttcttt atgttttaga ttattaagac aacatggtat taaaatttct 360
tgtgatgttt ttgaaaaatt taaagatgat gatggtaaat ttaaagctag tttaatgaat 420
gatgttcaag gtatgttatc tttgtatgaa gcagctcatt tggctattca tggtgaagat 480
attttggatg aagctattgt ttttactaca actcatttaa aatctactgt ttctaattct 540
ccagttaatt ctacttttgc agaacaaatt agacattctt taagagttcc attgagaaaa 600
gctgttccaa gattagaatc tcgttatttt ttggatattt attctcgtga tgatttacat 660
gataaaactt tattaaattt tgctaaatta gattttaata ttttacaagc tatgcatcaa 720
aaagaagcta gtgaaatgac tagatggtgg agagattttg attttttgaa aaaattgcca 780
tatattagag atagagttgt tgaattatat ttttggattt tagttggtgt ttcttatcaa 840
ccaaaatttt ctactggtag aattttttta tctaaaatta tttgtttaga aactttagtt 900
gatgatacat ttgatgctta tggtacattt gatgaattgg ctatttttac agaagctgtt 960
acaagatggg atttaggtca tagagatgca ttgccagaat atatgaaatt tatttttaaa 1020
acattaattg atgtttattc tgaagctgaa caagaattag ctaaagaagg tagatcatat 1080
tctattcatt atgctattag atcatttcaa gaattagtta tgaaatattt ttgtgaagct 1140
aaatggttaa ataaaggtta tgttccatca ttggatgatt ataaatctgt ttcattaaga 1200
tcaatcggtt ttttaccaat cgctgttgct tcttttgttt ttatgggtga tattgcaaca 1260
aaagaagttt ttgaatggga aatgaataat ccaaaaatta ttattgcagc agaaacaatt 1320
tttagatttt tggatgatat tgcaggtcat agatttgaac aaaaaagaga acattcacca 1380
tcagcaatcg aatgttataa aaatcaacat ggtgtttcag aagaagaagc agttaaagca 1440
ttgtcattgg aagttgcaaa ttcatggaaa gatattaatg aagaattgtt gttgaatcca 1500
atggcaattc cattgccatt gttgcaagtt attttggatt tgtcaagatc agcagatttt 1560
atgtatggta atgcacaaga tagatttaca cattcaacaa tgatgaaaga tcaagttgat 1620
ttggttttga aagatccagt taaattggat gattaa 1656
<210> 5
<223> OptiSaSS
<400> 5
atggattctt ctactgctac tgctatgact gctcctttta ttgatccaac cgatcacgtt 60
aacttgaaaa ctgatactga tgcctccgaa aacagaagaa tgggtaatta caaaccctcc 120
atctggaact acgatttctt gcaatctttg gctacccatc acaacatcgt tgaagaaaga 180
catttgaagt tggccgaaaa gttgaagggt caagttaagt ttatgttcgg tgctccaatg 240
gaaccattgg ctaaattgga attggttgat gttgtgcaga gattgggttt gaaccatttg 300
ttcgaaaccg aaatcaaaga ggccttgttc tctatctaca aggatggttc taatggttgg 360
tggtttggtc acttgcatgc tacatctttg agattcagac tgttgagaca atgcggtttg 420
ttcattccac aagatgtttt caagaccttc caaaacaaga ccggtgaatt cgatatgaag 480
ttgtgcgata atgtcaaggg cttgttgtcc ttgtatgaag cttcttactt aggttggaag 540
ggtgagaaca ttttggatga agctaaagct ttcaccacca agtgtttgaa atctgcctgg 600
gaaaacattt ccgaaaaatg gttggctaag agagttaagc acgctttggc tttgccattg 660
cattggagag ttccaagaat tgaagctaga tggttcattg aagcttacga acaagaggct 720
aatatgaacc caactttgtt gaaattggcc aagttggatt tcaacatggt ccaatccatc 780
caccaaaaag aaattggtga attggcaaga tggtgggtta ctactggttt ggataagttg 840
gcttttgcca gaaacaactt gttgcaatcc tatatgtggt cttgcgctat tgcttctgat 900
ccaaagttta agttggccag agaaaccatt gtggaaatcg gttctgtttt gaccgttgtt 960
gatgatggtt atgatgtcta cggttccata gatgaattgg acttgtacac ctcttctgtc 1020
gaaagatggt cttgtgtcga aattgataag ttgccaaaca ccttgaagct gatcttcatg 1080
tctatgttca acaagaccaa cgaagttggt ttgagagttc aacacgaaag aggttacaac 1140
tctattccaa cctttattaa ggcctgggtt gaacaatgca agtcctatca aaaagaagct 1200
cgttggtttc acggtggtca tactccacca ttggaagaat attcattgaa cggcttggtt 1260
tccattggtt tccctttgtt gttgattaca ggttacgttg ctattgctga aaacgaagct 1320
gctttggaca aagttcatcc attgccagat ttgttgcact actcatcttt gttgtccaga 1380
ttgatcaacg acattggtac ttctccagac gaaatggcta gaggtgataa cttgaagtct 1440
atccattgct acatgaacga aactggtgct tctgaagaag ttgctagaga acatattaag 1500
ggtgtcatcg aagaaaactg gaagattttg aatcaatgct gcttcgacca atcgcaattt 1560
caagaaccat tcatcacctt caacctgaac tctgttagag gttctcattt cttctacgaa 1620
ttcggtgatg gtttcggtgt tactgattct tggacaaaag ttgacatgaa gtccgttttg 1680
atcgacccaa ttccattggg tgaagaatga 1710
<210> 6
<223> PTPI1
<400> 6
tcttcaagaa ttggggatct acgtatggtc attcttcttc agattccctc atggagaagt 60
gcggcagatg tatatgacag agtcgccagt ttccaagaga ctttattcag gcacttccat 120
gataggcaag agagaagacc cagagatgtt gttgtcctag ttacacatgg tatttattcc 180
agagtattcc tgatgaaatg gtttagatgg acatacgaag agtttgaatc gtttaccaat 240
gttcctaacg ggagcgtaat ggtgatggaa ctggacgaat ccatcaatag atacgtcctg 300
aggaccgtgc tacccaaatg gactgattgt gagggagacc taactacata gtgtttaaag 360
attacggata tttaacttac ttagaataat gccatttttt tgagttataa taatcctacg 420
ttagtgtgag cgggatttaa actgtgagga cctcaataca ttcagacact tctgacggta 480
tcaccctact tattcccttc gagattatat ctaggaaccc atcaggttgg tggaagatta 540
cccgttctaa gacttttcag cttcctctat tgatgttaca ctcggacacc ccttttctgg 600
catccagttt ttaatcttca gtggcatgtg agattctccg aaattaatta aagcaatcac 660
acaattctct cggataccac ctcggttgaa actgacaggt ggtttgttac gcatgctaat 720
gcaaaggagc ctatatacct ttggctcggc tgctgtaaca gggaatataa agggcagcat 780
aatttaggag tttagtgaac ttgcaacatt tactattttc ccttcttacg taaatatttt 840
tctttttaat tctaaatcaa tctttttcaa ttttttgttt gtattctttt cttgcttaaa 900
tctataacta caaaaaacac atacag 926
<210> 7
<223> TPYX212
<400> 7
tagggcccac aagcttacgc gtcgacccgg gtatccgtat gatgtgcctg actacgcatg 60
atatctcgag ctcagctagc taactgaata aggaacaatg aacgtttttc ctttctcttg 120
ttcctagtat taatgactga ccgatacatc cctttttttt tttgtctttg tctagctcca 180
gcttttgttc cctttagtga gggttaattc aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 240
gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 300
agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 360
aatggcgaat ggcgcgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt 420
acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc 480
ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 540
ttagggttcc gatttagtgg tttacggca 569
<210> 8
<223> 整合片段A1
<400> 8
tgttggaacg agagtaatta atagtgacat gagttgctat ggtaacaatc taatgcttac 60
atcgtatatt aatgtacaac tcgtatacgt ttaagtgtga ttgcgcctat tgcagaagga 120
atgttaaacg agaagctcag acaatactga agctgtgtta aagacctatt agttgaacat 180
gttatgctag cgagcgacct catgctatac ctgagaaagc aacctgacct acaggaaaga 240
gttactcaag aataagaatt ttcgttttaa aacctaagag tcactttaaa atttgtatac 300
acttattttt tttataactt atttaataat aaaaatcata aatcataaga aattcgctta 360
tttagaagtg tcaacaacgt atctaccaac gatttgaccc ttttccatct tttcgtaaat 420
ttctggcaag gtagacaagc cgacaacctt gattggagac ttgaccaaac ctctggcgaa 480
gaattgttaa ttaagagctc agatcttatc gtcgtcatcc ttgtaatcca tcgatactag 540
tttaggattt aatgcaggtg acggacccat ctttcaaacg atttatatca gtggcgtcca 600
aattgttagg ttttgttggt tcagcaggtt tcctgttgtg ggtcatatga ctttgaacca 660
aatggccggc tgctagggca gcacataagg ataattcacc tgccaagacg gcacaggcaa 720
ctattcttgc taattgacgt gcgttggtac caggagcggt agcatgcggg cctcttacac 780
ctaataagtc caacatggca ccttgtggtt ctagaacagt accaccaccg atggtaccta 840
cttcgatgga tggcatggat acggaaattc tcaaatcacc gtccacttct ttcatcaatg 900
ttatacagtt ggaactttca acattttgtg caggatcttg tcctaatgcc aagaaaacag 960
ctgtcactaa attagctgca tgtgcgttaa atccaccaac agacccagcc attgcagatc 1020
caaccaaatt cttagcaatg ttcaactcaa ccaatgcgga aacatcactt tttaacactt 1080
ttctgacaac atcaccagga atagtagctt ctgcgacgac actcttacca cgaccttcga 1140
tccagttgat ggcagctggt tttttgtcgg tacagtagtt accagaaacg gagacaacct 1200
ccatatcttc ccagccatac tcttctacca tttgctttaa tgagtattcg acacctttag 1260
aaatcatatt catacccatt gcgtcaccag tagttgttct aaatctcatg aagagtaaat 1320
ctcctgctag acaagtttga atatgttgca gacgtgcaaa tcttgatgta gagttaaaag 1380
cttttttaat tgcgttttgt ccctcttctg agtctaacca tatcttacag gcaccagatc 1440
ttttcaaagt tgggaaacgg actactgggc ctcttgtcat accatcctta gttaaaacag 1500
ttgttgcacc accgccagca ttgattgcct tacagccacg catggcagaa gctaccaaac 1560
aaccctctgt agttgccatt ggtatatgat aagatgtacc atcgataacc aaggggccta 1620
taacaccaac gggcaaaggc atgtaaccta taacattttc acaacaagcg ccaaatacgc 1680
ggtcgtagtc ataattttta tatggtaaac gatcagatgc taatacagga gcttctgcca 1740
aaattgaaag agccttccta cgtaccgcaa ccgctctcgt agtatcacct aattttttct 1800
ccaaagcgta caaaggtaac ttaccgtgaa taaccaaggc agcgacctct ttgttcttca 1860
attgttttgt atttccacta cttaataatg cttctaattc ttctaaagga cgtattttct 1920
tatccaagct ttcaatatcg cgggaatcat cttcctcact agatgatgaa ggtcctgatg 1980
agctcgattg cgcagatgat aaacttttga ctttcgatcc agaaatgact gttttattgg 2040
ttaaaactgg tgtagaagcc ttttgtacag gagcagtaaa agacttcttg gtgacttcag 2100
ttttcaccaa ttggtccatg cggccgccct ttagtgaggg ttgaattcga attttcaaaa 2160
attcttactt tttttttgga tggacgcaaa gaagtttaat aatcatatta catggcatta 2220
ccaccatata catatccata tacatatcca tatctaatct tacttatatg ttgtggaaat 2280
gtaaagagcc ccattatctt agcctaaaaa aaccttctct ttggaacttt cagtaatacg 2340
cttaactgct cattgctata ttgaagtacg gattagaagc cgccgagcgg gtgacagccc 2400
tccgaaggaa gactctcctc cgtgcgtcct cgtcttcacc ggtcgcgttc ctgaaacgca 2460
gatgtgcctc gcgccgcact gctccgaaca ataaagattc tacaatacta gcttttatgg 2520
ttatgaagag gaaaaattgg cagtaacctg gccccacaaa ccttcaaatg aacgaatcaa 2580
attaacaacc ataggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg gggtaattaa 2640
tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatgcaaaaa ctgcataacc 2700
actttaacta atactttcaa cattttcggt ttgtattact tcttattcaa atgtaataaa 2760
agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag aaaaaacccc 2820
ggatccatga gcgaagtcgg tatacagaat cacaagaaag cggtgacaaa acccagaaga 2880
agagaaaaag tcatcgagct aattgaagtg gacggcaaaa aggtgagtac gacttcaacc 2940
ggtaaacgta aattccataa caaatcaaag aatgggtgcg ataactgtaa aagaagaaga 3000
gttaagtgtg atgaagggaa gccagcctgt aggaagtgca caaatatgaa gttggaatgt 3060
cagtatacac caatccattt aaggaaaggt agaggagcaa cagtagtgaa gtatgtcacg 3120
agaaaggcag acggtagcgt ggagtctgat tcatcggtag atttacctcc tacgatcaag 3180
aaggagcaga caccgttcaa tgatatccaa tcagcggtaa aagcttcagg ctcatccaat 3240
gattcctttc catcaagcgc ctctacaact aagagtgaga gcgaggaaaa gtcatcggcc 3300
cctatagagg acaaaaacaa tatgactcct ctaagtatgg gcctccaggg taccatcaat 3360
aagaaagata tgatgaataa ctttttctct caaaatggca ctattggttt tggttctcct 3420
gaaagattga attcaggtat cgatggctta ctattaccgc cattgccttc tggaaatatg 3480
ggtgcgttcc aacttcagca acagcagcaa gtgcagcagc aatctcaacc acagacccaa 3540
gcgcagcaag caagtggaac tccaaacgag agatatggtt cattcgatct tgcgggtagt 3600
cctgcattgc aatccacggg aatgagctta tcaaatagtc taagcgggat gttactatgt 3660
aacaggattc cttccggcca aaactacact caacaacaat tacaatatca attacaccag 3720
cagctgcaat tgcaacagca tcagcaagtt cagctgcagc agtatcaaca attacgtcag 3780
gaacaacacc aacaagttca gcaacaacaa caggaacaac tccagcaata ccaacaacat 3840
tttttgcaac agcagcaaca agtactgctt cagcaagagc aacaacctaa cgatgaggaa 3900
ggtggcgttc aggaagaaaa cagcaaaaag gtaaaggaag ggcctttaca atcacaaaca 3960
agcgaaacta ctttaaacag cgatgctgct acattacaag ctgatgcatt atctcagtta 4020
agtaagatgg ggctaagcct aaagtcgtta agtacctttc caacagctgg tattggtggt 4080
gtttcctatg actttcagga actgttaggt attaagtttc caataaataa cggcaattca 4140
agagctacta aggccagcaa cgcagaggaa gctttggcca atatgcaaga gcatcatgaa 4200
cgtgcagctg cttctgtaaa ggagaatgat ggtcagctct ctgatacgaa gagtccagcg 4260
ccatcgaata acgcccaagg gggaagtgct agtattatgg aacctcaggc ggctgatgcg 4320
gtttcgacaa tggcgcctat atcaatgatt gaaagaaaca tgaacagaaa cagcaacatt 4380
tctccatcaa cgccctctgc agtgttgaat gataggcaag agatgcaaga ttctataagt 4440
tctctaggaa atctgacaaa agcagccttg gagaacaacg aaccaacgat aagtttacaa 4500
acatcacaga cagagaatga agacgatgca tcgcggcaag acatgacctc aaaaattaat 4560
aacgaagctg accgaagttc tgtttctgct ggtaccagta acatcgctaa gcttttagat 4620
ctttctacca aaggcaatct gaacctgata gacatgaaac tgtttcatca ttattgcaca 4680
aaggtctggc ctacgattac agcggccaaa gtttctgggc ctgaaatatg gagggactac 4740
ataccggagt tagcatttga ctatccattt ttaatgcacg ctttgttggc attcagtgcc 4800
acccatcttt cgaggactga aactggactg gagcaatacg tttcatctca ccgcctagac 4860
gctctgagat tattaagaga agctgtttta gaaatatctg agaataacac cgatgcgcta 4920
gttgccagcg ccctgatact aatcatggac tcgttagcaa atgctagtgg taacggcact 4980
gtaggaaacc aaagtttgaa tagcatgtca ccaagcgctt ggatctttca tgtcaaaggt 5040
gctgcaacaa ttttaaccgc tgtgtggcct ttgagtgaaa gatctaaatt tcataacatt 5100
atatctgttg atcttagcga tttaggcgat gtcattaacc ctgatgttgg aacaattact 5160
gaattggtat gttttgatga aagtattgcc gatttgtatc ctgtcggctt agattcgcca 5220
tatttgataa cactagctta tttagataaa ttgcaccgtg aaaaaaacca gggtgatttt 5280
attctgcggg tatttacatt tccagcattg ctagacaaga cattcctggc attactgatg 5340
acaggtgatt taggtgcaat gagaattatg agatcatatt ataaactact tcgaggattt 5400
gccacagagg tcaaggataa agtctggttt ctcgaaggag tcacgcaggt gctgcctcaa 5460
gatgttgacg aatacagtgg aggtggtgat atgcatatga tgctagattt cctcggtggc 5520
ggattaccat cgatgacaac aacaaatttc tctgattttt cgttatgacc cgggcgtcga 5580
catggaacag aagttgattt ccgaagaaga cctcgagtaa gcttggtacc gcggctagct 5640
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aatataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag gtctagagat cccaatacaa 5940
cagatcacgt gatcttttgt aagatgaagt tgaagtgagt gttgcaccgt gccaatgcag 6000
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cccttggcga aaagtcctct gccaacaatg atgatatctg atccaccact tacaacttcg 6240
tcgacggttc tgtactgctg acccaatgca tcgcctttgt cgtctaaacc tacacctggg 6300
gtcatgatta gccaatcaaa cccttcttct cttcctccca tatcgttctg agcaatgaac 6360
ccaataacga aatctttatc actctttgca atatcaacgg tacccttagt atattcaccg 6420
tgtgctagag aacccttgga agataattca gcaagcatca ataatcccct tggttctttg 6480
gtgacctctt gcgcaccttg tttcaagcca gcaacaatac cagcaccagt aaccccgtgg 6540
gcgttggtga tatcagacca ttctgcgata cggtaaacgc ccgatgtata ttgtaatttg 6600
actgtgttac cgatatcggc gaattttctg tcctcaaata tcaagaactt gtatttctct 6660
gccaatgctt tcaatggaac gacagtaccc tcataactga aatcatccaa gatatcaacg 6720
tgtgttttca aaaggcaaat gtatggaccc aacgtttcaa caagtttcaa tagctcatca 6780
gtcgaacgaa cgtcaagaga agcacacaaa ttggttttct tttcatccat taaacgtaaa 6840
agtttcgatg caaccggact tgcatgagtc tcagctctac tggtatatga ttttgtggac 6900
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ccaatcacaa ccacatctta gatagttgaa atgactttag ataacatcaa ttgagatgag 7020
cttaatcatg tcaaagctaa aagtgtcacc atgaacgaca attcttaagc aaatcacgtg 7080
atatagatcc acgaataacc accatttgat gctcgaggca agtaatgtgt gtaaaaaaat 7140
gcgttaccac catccaatgc agaccgatct tctacccaga atcacatata tttatgtacc 7200
gagtaccttt tttctatctt ccaattgctt ctcccatatg attgtctccg taagctcgaa 7260
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gtttagaaca taatcagttt atccatggtc tatctcttct tgtcgctttt tctcctcgat 7380
agaacctaaa taaaacgagc tctcgagaac ccttaatata acttcgtata atgtatgcta 7440
tacgaagtta ttaggtgata tcagatccac tagtggccta tgcacccaat tcgccctata 7500
gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 7560
ctggcgttac ccctgcagga ctagtgctga ggcattaatt gatcaggtag gtacatatat 7620
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<223> 整合片段A2
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tttgaaatat aaataacgtt cttaatacta acataactat aaaaaaataa atagggacct 360
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cgtgttgaac tctcaaacca acttcgttgg tcttgttgaa catagacatg aagatcagct 1080
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cgcaagacca catataggat tgcaacaagt tgtttctggc aaaagccaac ttatccaaac 1320
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aagcttcaat gaaccatcta gcttcaattc ttggaactct ccaatgcaat ggcaaagcca 1500
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caccggtctt gttttggaag gtcttgaaaa catcttgtgg aatgaacaaa ccgcattgtc 1740
tcaacagtct gaatctcaaa gatgtagcat gcaagtgacc aaaccaccaa ccattagaac 1800
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ttcatttgaa ggtttgtggg gccaggttac tgccaatttt tcctcttcat aaccataaaa 2460
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<223> 整合片段A3
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acgcaaatga tgagaaatag tcatctaaat tagtggaagc tgaaacgcaa ggattgataa 180
tgtaatagga tcaatgaata ttaacatagc tagccttcga gcgtcccaaa accttctcaa 240
gcaaggtttt cagtataatg ttacatgcgt acacgcgtct gtacagaaaa aaaagaaaaa 300
tttgaaatat aaataacgtt cttaatacta acataactat aaaaaaataa atagggacct 360
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aggatcgctt tgatgtttgt tcggtcaatg atactaagac cctcccgcga atccatgggc 3480
ttgttcatca ttgccagcaa cacatcaatg aagtctccat gttgttcatc atcatggtcc 3540
ttaatgtctt gcacgtgctc gtcgattatg acttccaaga tgtcgtcgaa agctttactt 3600
cctgacttta tgcgccgagt taatccctgt aggtcaaggg gcataaggaa tggaacataa 3660
tcccctatat tgaaagctcc cgccaactgc gctgcctcct ggatgacctc ctttagctta 3720
aacctctcat cgctacttcg cccgatcacc ataaggcaca ccatgttttc aatgacgttc 3780
gccaccctcg cgctcaaatt caccattttg tgtgccaccg aagcctcctt aagggactgc 3840
acgaacgatg ccacctcctt cttccttgtc cctgcgaaag aatcgatttt caccgtgttg 3900
agaagcttca cggtgcacag ccttcgcatg ttgcgccaat atgtaccata ctccgtcagg 3960
atgacgccct ttgtcccgta atggaagtag tccgcaactt ggagtctggg ccggctggcg 4020
aaaacgatat cgtgggtctt gaggacgagc tcggcggcct ccggagagga tatcacaaca 4080
gccggcacga gccccagcct cattgacatg atgggaccat acttcttggc caagttgtag 4140
aggctctggt gaggaagggt ccccaatatg tggatgtttc cgatgatcgg taaagcgggt 4200
ggaccgggag gtagattatt tcttttttgg cgccgccgca aaaggatgga tagccctagg 4260
gccacgagga gagtgaggat aacggctgtt gccggagaca tgaattcgaa ttttcaaaaa 4320
ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata atcatattac atggcattac 4380
caccatatac atatccatat acatatccat atctaatctt acttatatgt tgtggaaatg 4440
taaagagccc cattatctta gcctaaaaaa accttctctt tggaactttc agtaatacgc 4500
ttaactgctc attgctatat tgaagtacgg attagaagcc gccgagcggg tgacagccct 4560
ccgaaggaag actctcctcc gtgcgtcctc gtcttcaccg gtcgcgttcc tgaaacgcag 4620
atgtgcctcg cgccgcactg ctccgaacaa taaagattct acaatactag cttttatggt 4680
tatgaagagg aaaaattggc agtaacctgg ccccacaaac cttcaaatga acgaatcaaa 4740
ttaacaacca taggatgata atgcgattag ttttttagcc ttatttctgg ggtaattaat 4800
cagcgaagcg atgatttttg atctattaac agatatataa atgcaaaaac tgcataacca 4860
ctttaactaa tactttcaac attttcggtt tgtattactt cttattcaaa tgtaataaaa 4920
gtatcaacaa aaaattgtta atatacctct atactttaac gtcaaggaga aaaaaccccg 4980
gatccatgca attgagctcc gtcaagctaa tccctttgga tctcatgacg gctattttca 5040
acggcggtgg gagccccgcc ggctccgggg aggccctgtc gatgctgctg gagaatcggg 5100
aggtggtggt ggcgctcacg acgtcgctcg cggtgctcat cgggtgcgtg ttcgcgtacc 5160
tgtggcggtt ctcgagctcc cagaaggcgg tggcggcggc taagggcgta gaggttgcga 5220
ggaagccggt gatcgggaag gaatcggagg cggcggaggt ggatgacgga aagaagaagg 5280
tgaccatctt cttcgggacg cagactggaa cagccgaagg gttcgccaag gcgctggttg 5340
aggaggcaaa agcacgctat gagaaggcca tttttaaatt ggttgatttg gatgattatg 5400
ctgccgagga tgatgaatat gaggagaagt tgaaaaaaga gaaattcgct ttattctttt 5460
tagccacata tggagatggt gagcctactg acaatgcagc gaggttctat aaatggttta 5520
ctgaggaaaa tgaaagtgga gagtggctcc aaaagcttca gttcggagtg tttggccttg 5580
gcaacaggca atacgagcat ttcaacaagg ttgcaaaggt tgtggatgag attcttgctg 5640
agcaaggtgg gaagcgcctg gttccagtgg gtcttggaga tgatgatcaa tgcattgaag 5700
atgacttcac tgcatggcgt gaattagtgt ggcccgagtt ggataaattg ctcctagatg 5760
aggatgatgc aactgtttct accccttata ctgcttctgt acctgaatac cgggttgtat 5820
ttcatgattc tcctgatgat tatctgcaga agaactctag taatgcaaat ggtcattcga 5880
tgcatgatgc tcagcatcca tgcagggcta atgttgctgt gaggagggag cttcattcgc 5940
ctttatctga tcgttcttgc actcatctag aatttgacat tgctggaact ggacttgcgt 6000
atgaaacagg ggaccatgtt ggtgtgtgct gtgagaattt acctgaagtt gtggaagagg 6060
ctgaaagggt actgggtttg tcaccaggca tctacttttc catccatgct gataaagagg 6120
atggcacacc acttggaagt tccttgccac cactttttcc accatgtact ttaagaactg 6180
cactaactca acatgctgat cttctaagtt ttcctaaaaa ggctgcgttg cttgctttag 6240
cagctcatgc ttctgatcca agtgaagcgg ataggttgaa atatcttgca tctcctgcag 6300
gaaaggatga atatgcacag tgggttgttg caagtcagag aagccttcta gaagtaatgg 6360
ctgaattccc ttcggcgaag cccccacttg gagttttgtt tgctgcagtt gctccacgat 6420
tgcagccacg attctattcg atctcatcct ctccaaagat tgcaccatct aggatacatg 6480
ttacttgcgc attagtatat gataaaacac caactgggcg aattcacaag ggagtgtgct 6540
caacttggat gaagaatgcg atgccccggg aagaaagcca cgattgcagc tgggctccca 6600
tttttgttag gcaatctaat ttcaagctcc cttcaaatac atcggtgcct gtcatcatga 6660
ttggtcctgg cacggggttg gctcctttca ggggctttct acaggaaaga ttagcactga 6720
aagaagctgg agttgaactg ggacctgcaa tattattctt tgggtgcagg aaccgtaaaa 6780
tggattacat ttatgaggat gagttggcac actttgttga agccggtgcg ctctctgagt 6840
tgatcgtggc tttctcacgg gaaggaccag ccaaacagta tgtccagcat aagatgatgg 6900
aaaaggcctc agaaatctgg aacatgattt ccgatggagg ttatgtatat gtatgtggtg 6960
atgccaaagg catggccaaa gatgtccacc gggcgctcca tacaattgtt cacgaacagg 7020
gatctctaga caattccaag acagagagca tggtgaagaa tctccaaatg aatggaaggt 7080
atttacggga tgtgtggtga gcgatcgcgt gcattcatcc gctctaaccg aaaaggaagg 7140
agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag 7200
aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa 7260
cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaagatcg cgtcagctga 7320
agcttcgtac gctgcaggtc gacaaccctt aatgtcgaca acccttaata taacttcgta 7380
taatgtatgc tatacgaagt tattaggtct agagatccca atacaacaga tcacgtgatc 7440
ttttgtaaga tgaagttgaa gtgagtgttg caccgtgcca atgcaggtgg ctattagatt 7500
aaatatgtga tttgttctat taagtttcct gtataattac aaatgaataa cgaaatgaga 7560
caaagaagag aaccaatttt tacaagcatg gggagcgctg attctctttt ggtacgcttc 7620
ccatccagca tttctgtatc tttcaccttc aaccttagga tctctaccct tggcgaaaag 7680
tcctctgcca acaatgatga tatctgatcc accacttaca acttcgtcga cggttctgta 7740
ctgctgaccc aatgcatcgc ctttgtcgtc taaacctaca cctggggtca tgattagcca 7800
atcaaaccct tcttctcttc ctcccatatc gttctgagca atgaacccaa taacgaaatc 7860
tttatcactc tttgcaatat caacggtacc cttagtatat tcaccgtgtg ctagagaacc 7920
cttggaagat aattcagcaa gcatcaataa tccccttggt tctttggtga cctcttgcgc 7980
accttgtttc aagccagcaa caataccagc accagtaacc ccgtgggcgt tggtgatatc 8040
agaccattct gcgatacggt aaacgcccga tgtatattgt aatttgactg tgttaccgat 8100
atcggcgaat tttctgtcct caaatatcaa gaacttgtat ttctctgcca atgctttcaa 8160
tggaacgaca gtaccctcat aactgaaatc atccaagata tcaacgtgtg ttttcaaaag 8220
gcaaatgtat ggacccaacg tttcaacaag tttcaatagc tcatcagtcg aacgaacgtc 8280
aagagaagca cacaaattgg ttttcttttc atccattaaa cgtaaaagtt tcgatgcaac 8340
cggacttgca tgagtctcag ctctactggt atatgatttt gtggacatgg tgcaactaat 8400
tgacgggagt gtattgacgc tggcgtactg gctttcacaa aatggcccaa tcacaaccac 8460
atcttagata gttgaaatga ctttagataa catcaattga gatgagctta atcatgtcaa 8520
agctaaaagt gtcaccatga acgacaattc ttaagcaaat cacgtgatat agatccacga 8580
ataaccacca tttgatgctc gaggcaagta atgtgtgtaa aaaaatgcgt taccaccatc 8640
caatgcagac cgatcttcta cccagaatca catatattta tgtaccgagt accttttttc 8700
tatcttccaa ttgcttctcc catatgattg tctccgtaag ctcgaaattt ctaagttgga 8760
ttttaatctt cacgcaggat gacagttcga tgagcttctg aggagtgttt agaacataat 8820
cagtttatcc atggtctatc tcttcttgtc gctttttctc ctcgatagaa cctaaataaa 8880
acgagctctc gagaaccctt aatataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag 8940
gtgatatcag atccactagt ggcctatgca cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac 9000
gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccct 9060
gcaggacaga cgtcattagt gctgaggcat taattgatca taaaacggaa tgatgaataa 9120
tatttataga attgtgtaga attgcagatt cccttttatg gattcctaaa tcctcgagga 9180
gaacttctag tatattctgt atacctaata ttatagcctt tatcaacaat ggaatcccaa 9240
caattatctc aaaattcaca tatttctcaa gatctgcggc cg 9282
<210> 11
<223> MET15
<400> 11
agctcgtttt atttaggttc tatcgaggag aaaaagcgac aagaagagat agaccatgga 60
taaactgatt atgttctaaa cactcctcag aagctcatcg aactgtcatc ctgcgtgaag 120
attaaaatcc aacttagaaa tttcgagctt acggagacaa tcatatggga gaagcaattg 180
gaagatagaa aaaaggtact cggtacataa atatatgtga ttctgggtag aagatcggtc 240
tgcattggat ggtggtaacg cattttttta cacacattac ttgcctcgag catcaaatgg 300
tggttattcg tggatctata tcacgtgatt tgcttaagaa ttgtcgttca tggtgacact 360
tttagctttg acatgattaa gctcatctca attgatgtta tctaaagtca tttcaactat 420
ctaagatgtg gttgtgattg ggccattttg tgaaagccag tacgccagcg tcaatacact 480
cccgtcaatt agttgcacca tgccatctca tttcgatact gttcaactac acgccggcca 540
agagaaccct ggtgacaatg ctcacagatc cagagctgta ccaatttacg ccaccacttc 600
ttatgttttc gaaaactcta agcatggttc gcaattgttt ggtctagaag ttccaggtta 660
cgtctattcc cgtttccaaa acccaaccag taatgttttg gaagaaagaa ttgctgcttt 720
agaaggtggt gctgctgctt tggctgtttc ctccggtcaa gccgctcaaa cccttgccat 780
ccaaggtttg gcacacactg gtgacaacat cgtttccact tcttacttat acggtggtac 840
ttataaccag ttcaaaatct cgttcaaaag atttggtatc gaggctagat ttgttgaagg 900
tgacaatcca gaagaattcg aaaaggtctt tgatgaaaga accaaggctg tttatttgga 960
aaccattggt aatccaaagt acaatgttcc ggattttgaa aaaattgttg caattgctca 1020
caaacacggt attccagttg tcgttgacaa cacatttggt gccggtggtt acttctgtca 1080
gccaattaaa tacggtgctg atattgtaac acattctgct accaaatgga ttggtggtca 1140
tggtactact atcggtggta ttattgttga ctctggtaag ttcccatgga aggactaccc 1200
agaaaagttc cctcaattct ctcaacctgc cgaaggatat cacggtacta tctacaatga 1260
agcctacggt aacttggcat acatcgttca tgttagaact gaactattaa gagatttggg 1320
tccattgatg aacccatttg cctctttctt gctactacaa ggtgttgaaa cattatcttt 1380
gagagctgaa agacacggtg aaaatgcatt gaagttagcc aaatggttag aacaatcccc 1440
atacgtatct tgggtttcat accctggttt agcatctcat tctcatcatg aaaatgctaa 1500
gaagtatcta tctaacggtt tcggtggtgt cttatctttc ggtgtaaaag acttaccaaa 1560
tgccgacaag gaaactgacc cattcaaact ttctggtgct caagttgttg acaatttaaa 1620
gcttgcctct aacttggcca atgttggtga tgccaagacc ttagtcattg ctccatactt 1680
cactacccac aaacaattaa atgacaaaga aaagttggca tctggtgtta ccaaggactt 1740
aattcgtgtc tctgttggta tcgaatttat tgatgacatt attgcagact tccagcaatc 1800
ttttgaaact gttttcgctg gccaaaaacc ataattatac aggaaactta atagaacaaa 1860
tcacatattt aatctaatag ccacctgcat tggcacggtg caacactcac ttcaacttca 1920
tcttacaaaa gatcacgtga tctgttgtat tgggatc 1957
<210> 12
<223> LEU2
<400> 12
cttatatgcg tctatttatg taggatgaaa ggtagtctag tacctcctgt gatattatcc 60
cattccatgc ggggtatcgt atgcttcctt cagcactacc ctttagctgt tctatatgct 120
gccactcctc aattggatta gtctcatcct tcaatgctat catttccttt gatattggat 180
catactaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 240
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 300
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 360
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 420
tgagagtgca ccatatcgac tacgtcgtaa ggccgtttct gacagagtaa aattcttgag 480
ggaactttca ccattatggg aaatgcttca agaaggtatt gacttaaact ccatcaaatg 540
gtcaggtcat tgagtgtttt ttatttgttg tatttttttt tttttagaga aaatcctcca 600
atatcaaatt aggaatcgta gtttcatgat tttctgttac acctaacttt ttgtgtggtg 660
ccctcctcct tgtcaatatt aatgttaaag tgcaattctt tttccttatc acgttgagcc 720
attagtatca atttgcttac ctgtattcct ttactatcct cctttttctc cttcttgata 780
aatgtatgta gattgcgtat atagtttcgt ctaccctatg aacatattcc attttgtaat 840
ttcgtgtcgt ttctattatg aatttcattt ataaagttta tgtacaaata tcataaaaaa 900
agagaatctt tttaagcaag gattttctta acttcttcgg cgacagcatc accgacttcg 960
gtggtactgt tggaaccacc taaatcacca gttctgatac ctgcatccaa aaccttttta 1020
actgcatctt caatggcctt accttcttca ggcaagttca atgacaattt caacatcatt 1080
gcagcagaca agatagtggc gatagggtca accttattct ttggcaaatc tggagcagaa 1140
ccgtggcatg gttcgtacaa accaaatgcg gtgttcttgt ctggcaaaga ggccaaggac 1200
gcagatggca acaaacccaa ggaacctggg ataacggagg cttcatcgga gatgatatca 1260
ccaaacatgt tgctggtgat tataatacca tttaggtggg ttgggttctt aactaggatc 1320
atggcggcag aatcaatcaa ttgatgttga accttcaatg tagggaattc gttcttgatg 1380
gtttcctcca cagtttttct ccataatctt gaagaggcca aaagattagc tttatccaag 1440
gaccaaatag gcaatggtgg ctcatgttgt agggccatga aagcggccat tcttgtgatt 1500
ctttgcactt ctggaacggt gtattgttca ctatcccaag cgacaccatc accatcgtct 1560
tcctttctct taccaaagta aatacctccc actaattctc tgacaacaac gaagtcagta 1620
cctttagcaa attgtggctt gattggagat aagtctaaaa gagagtcgga tgcaaagtta 1680
catggtctta agttggcgta caattgaagt tctttacgga tttttagtaa accttgttca 1740
ggtctaacac taccggtacc ccatttagga ccagccacag cacctaacaa aacggcatca 1800
accttcttgg aggcttccag cgcctcatct ggaagtggga cacctgtagc atcgatagca 1860
gcaccaccaa ttaaatgatt ttcgaaatcg aacttgacat tggaacgaac atcagaaata 1920
gctttaagaa ccttaatggc ttcggctgtg atttcttgac caacgtggtc acctggcaaa 1980
acgacgatct tcttaggggc agacataggg gcagacatta gaatggtata tccttgaaat 2040
atatatatat attgctgaaa tgtaaaaggt aagaaaagtt agaaagtaag acgattgcta 2100
accacctatt ggaaaaaaca ataggtcctt aaataatatt gtcaacttca agtattgtga 2160
tgcaagcatt tagtcatgaa cgcttctcta ttctatatga aaagccggtt ccggcctctc 2220
acctttcctt tttctcccaa tttttcagtt gaaaaaggta tatgcgtcag gcgacctctg 2280
aaattaacaa aaaatttcca gtcatcgaat ttgattctgt gcgatagcgc ccctgtgtgt 2340
tctcgttatg ttgaggaaaa aaataatggt tgctaagaga ttcgaactct tgcatcttac 2400
gatacctgag tattcccaca gttaactgcg gtcaagatat ttcttgaatc aggcgcctta 2460
gaccgctcgg ccaaacaacc aattacttgt tgagaaatag agtataatta tcctataaat 2520
ataacgtttt tgaacacaca tgaacaagga agtacaggac aattgatttt gaagagaatg 2580
tggattttga tgtaattgtt gggattccat ttttaataag gcaataatat taggtatgtg 2640
gatatactag aagttctcct cgaccgtcga tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 2700
aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 2760
aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 2820
aaatcaaaag aataga 2836
<210> 13
<223> tHMG1-F
<400> 13
atggctgcag accaattggt gaaaac 26
<210> 14
<223> tHMG1-R
<400> 14
ttaggattta atgcaggtga cgg 23
<210> 15
<223> PGM2-F
<400> 15
atgtcatttc aaattgaaac gg 22
<210> 16
<223> PGM2-R
<400> 16
ttaagtacga accgttggtt cttc 24
<210> 17
<223> IDI1-F
<400> 17
atgactgccg acaacaatag tatgc 25
<210> 18
<223> IDI1-R
<400> 18
ttatagcatt ctatgaattt gcctgtc 27
<210> 19
<223> ERG8-F
<400> 19
atgtcagagt tgagagcctt cag 23
<210> 20
<223> ERG8-R
<400> 20
ttatttatca agataagttt ccgg 24
<210> 21
<223> ERG10-F
<400> 21
atgtctcaga acgtttacat tgtatc 26
<210> 22
<223> ERG10-R
<400> 22
tcatatcttt tcaatgacaa tagagg 26
<210> 23
<223> ERG12-F
<400> 23
atgtcattac cgttcttaac ttctg 25
<210> 24
<223> ERG12-R
<400> 24
ttatgaagtc catggtaaat tcgtg 25
<210> 25
<223> ERG13-F
<400> 25
atgaaactct caactaaact ttgttg 26
<210> 26
<223> ERG13-R
<400> 26
ttatttttta acatcgtaag atcttc 26
<210> 27
<223> ERG19-F
<400> 27
atgaccgttt acacagcatc c 21
<210> 28
<223> ERG19-R
<400> 28
ttattccttt ggtagaccag tctttg 26
<210> 29
<223> GAL4-F
<400> 29
gacagcattc gcccagtatt 20
<210> 30
<223> GAL4-R
<400> 30
tgctctatta acgttctact ttacac 26
<210> 31
<223> UPC2-F
<400> 31
atgagcgaag tcggtataca g 21
<210> 32
<223> UPC2-R
<400> 32
tcataacgaa aaatcagaga aatttg 26
<210> 33
<223> UPC2-1-F
<400> 33
gaatacagtg gaggtggtga tatgcatatg atgctaga 38
<210> 34
<223> UPC2-1-R
<400> 34
tctagcatca tatgcatatc accacctcca ctgtattc 38
<210> 35
<223> SmFPPS-F
<400> 35
atggcgaatc tgaacggaga g 21
<210> 36
<223> SmFPPS-R
<400> 36
ttatttctgc ctcttgtata tcttg 25
<210> 37
<223> CYP736A167-F
<400> 37
atgtctccag ctactgctgt tattttg 27
<210> 38
<223> CYP736A167-R
<400> 38
tcaggattcc agtctgtagg ttg 23
<210> 39
<223> SaCPR2-F
<400> 39
atgcaattga gctccgtcaa gc 22
<210> 40
<223> SaCPR2-R
<400> 40
tcaccacaca tcccgtaaat acc 23
<210> 41
<223> PHXT1-F
<400> 41
tgcaggtctc atctggaata t 21
<210> 42
<223> PHXT1-R
<400> 42
gattttacgt atatcaacta gttgacg 27
<210> 43
<223> PGAL1-F
<400> 43
agtacggatt agaagccgcc ga 22
<210> 44
<223> PGAL1-R
<400> 44
gggttttttc tccttgacgt taaag 25
<210> 45
<223> PPGK1-F
<400> 45
ggaagtacct tcaaagaatg ggg 23
<210> 46
<223> PPGK1-R
<400> 46
ttgttttata tttgttgtaa aaagtag 27
<210> 47
<223> PTDH3-F
<400> 47
tcgagtttat cattatcaat actgc 25
<210> 48
<223> PTDH3-R
<400> 48
tttgtttgtt tatgtgtgtt tattcg 26
<210> 49
<223> PTEF1-F
<400> 49
gcacacacca tagcttcaaa atg 23
<210> 50
<223> PTEF1-R
<400> 50
ttgtaattaa aacttagatt agattgc 27
<210> 51
<223> PTPI1-F
<400> 51
tcttcaagaa ttggggatct acg 23
<210> 52
<223> PTPI1-R
<400> 52
ctgtatgtgt tttttgtagt tatagatt 28
<210> 53
<223> TPYX212-F
<400> 53
tagggcccac aagcttacgc g 21
<210> 54
<223> TPYX212-R
<400> 54
tgccgtaaac cactaaatcg gaac 24
<210> 55
<223> TADH1-F
<400> 55
cgaatttctt atgatttatg atttttat 28
<210> 56
<223> TADH1-R
<400> 56
gagcgacctc atgctatacc tgag 24
<210> 57
<223> TCYC1-F
<400> 57
atccgctcta accgaaaagg aagg 24
<210> 58
<223> TCYC1-R
<400> 58
cttcgagcgt cccaaaacct tctc 24
<210> 59
<223> TTDH2-F
<400> 59
atttaactcc ttaagttact ttaatg 26
<210> 60
<223> TTDH2-R
<400> 60
gcgaaaagcc aattagtgtg atac 24
<210> 61
<223> TFBA1-F
<400> 61
gttaattcaa attaattgat atagttt 27
<210> 62
<223> TFBA1-R
<400> 62
gtaagctact atgaaagact ttacaaag 28
<210> 63
<223> M13通用引物-F
<400> 63
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 64
<223> M13通用引物-R
<400> 64
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 65
<223> 1-PHXT1-F
<400> 65
gcgtaaggag aaaataccgc atcatgcagg tctcatctgg aatataattc 50
<210> 66
<223> PHXT1-R
<400> 66
gattttacgt atatcaacta gttgacg 27
<210> 67
<223> 1-HIS3-F
<400> 67
cttaactatg cggcatcaga gcag 24
<210> 68
<223> 1-HIS3-R
<400> 68
gaattatatt ccagatgaga cctgcatgat gcggtatttt ctccttacgc 50
<210> 69
<223> PGAL1-F
<400> 69
agtacggatt agaagccgcc ga 22
<210> 70
<223> 2-PGAL1-R
<400> 70
cactgaaggc tctcaactct gacatgggtt ttttctcctt gacgttaaag 50
<210> 71
<223> 2-ERG8-F
<400> 71
ctttaacgtc aaggagaaaa aacccatgtc agagttgaga gccttcagtg 50
<210> 72
<223> 2-ERG8-R
<400> 72
gcgtaagctt gtgggcccta ttatttatca agataagttt ccggatc 47
<210> 73
<223> 2-TPYX212-F
<400> 73
gatccggaaa cttatcttga taaataatag ggcccacaag cttacgc 47
<210> 74
<223> TPYX212-R
<400> 74
tgccgtaaac cactaaatcg gaac 24
<210> 75
<223> PPGK1-F
<400> 75
ggaagtacct tcaaagaatg ggg 23
<210> 76
<223> 3-PPGK1-R
<400> 76
atacaatgta aacgttctga gacatttgtt ttatatttgt tgtaaaaagt 50
<210> 77
<223> 3-ERG10-F
<400> 77
actttttaca acaaatataa aacaaatgtc tcagaacgtt tacattgtat 50
<210> 78
<223> 3-ERG10-R
<400> 78
aaaatcataa atcataagaa attcgtcata tcttttcaat gacaatagag 50
<210> 79
<223> 3-TADH1-F
<400> 79
ctctattgtc attgaaaaga tatgacgaat ttcttatgat ttatgatttt 50
<210> 80
<223> TADH1-R
<400> 80
gagcgacctc atgctatacc tgaga 25
<210> 81
<223> PTDH3-F
<400> 81
tcgagtttat cattatcaat actgcc 26
<210> 82
<223> 4-PTDH3-R
<400> 82
cagaagttaa gaacggtaat gacattttgt ttgtttatgt gtgtttattc 50
<210> 83
<223> 4-ERG12-F
<400> 83
gaataaacac acataaacaa acaaaatgtc attaccgttc ttaacttctg 50
<210> 84
<223> 4-ERG12-R
<400> 84
attaaagtaa cttaaggagt taaatttatg aagtccatgg taaattcgtg 50
<210> 85
<223> 4-TTDH2-F
<400> 85
cacgaattta ccatggactt cataaattta actccttaag ttactttaat 50
<210> 86
<223> TTDH2-R
<400> 86
gcgaaaagcc aattagtgtg atac 24
<210> 87
<223> PTEF1-F
<400> 87
gcacacacca tagcttcaaa atg 23
<210> 88
<223> 5-PTEF1-R
<400> 88
caacaaagtt tagttgagag tttcatttgt aattaaaact tagattagat tgc 53
<210> 89
<223> 5-ERG13-F
<400> 89
gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg aaactctcaa ctaaactttg ttg 53
<210> 90
<223> 5-ERG13-R
<400> 90
ctccttcctt ttcggttaga gcggatttat tttttaacat cgtaagatct tc 52
<210> 91
<223> 5-TCYC1-F
<400> 91
gaagatctta cgatgttaaa aaataaatcc gctctaaccg aaaaggaagg ag 52
<210> 92
<223> TCYC1-R
<400> 92
cttcgagcgt cccaaaacct tctc 24
<210> 93
<223> PTPI1-F
<400> 93
tcttcaagaa ttggggatct acg 23
<210> 94
<223> 6-PTPI1-R
<400> 94
aacggatgct gtgtaaacgg tcatctgtat gtgttttttg tagttatag 49
<210> 95
<223> 6-ERG19-F
<400> 95
ctataactac aaaaaacaca tacagatgac cgtttacaca gcatccgtt 49
<210> 96
<223> 6-ERG19-R
<400> 96
actatatcaa ttaatttgaa ttaacttatt cctttggtag accagtcttt g 51
<210> 97
<223> 6-TFBA1-F
<400> 97
caaagactgg tctaccaaag gaataagtta attcaaatta attgatatag t 51
<210> 98
<223> TFBA1-R
<400> 98
gtaagctact atgaaagact ttacaaagaa c 31
<210> 99
<223> pWL03-SaCPR2-F
<400> 99
gtaagaattt ttgaaaattc gaattcatgt ctccggcaac agccgttat 49
<210> 100
<223> pWL03-SaCPR2-R
<400> 100
gcgaagaatt gttaattaag agctcttagg actccaagcg ataggttgg 49
<210> 101
<223> pWL03-CYP736A167-F
<400> 101
caaggagaaa aaaccccgga tccatgcaat tgagctccgt caagc 45
<210> 102
<223> pWL03-CYP736A167-R
<400> 102
tcggttagag cggatcttag ctagctcacc acacatcccg taaatacc 48
<210> 103
<223> pWL04-PGM2-F
<400> 103
gtaagaattt ttgaaaattc gaattcatgt catttcaaat tgaaacggtt c 51
<210> 104
<223> pWL04-PGM2-R
<400> 104
gcgaagaatt gttaattaag agctcttaag tacgaaccgt tggttcttca g 51
<210> 105
<223> pWL04-tHMG1-F
<400> 105
caaccctcac taaagggcgg ccgcatggac caattggtga aaactgaagt c 51
<210> 106
<223> pWL04-tHMG1-R
<400> 106
ccttgtaatc catcgatact agtttaggat ttaatgcagg tgacgg 46
<210> 107
<223> pWL04-UPC2-1-F
<400> 107
caaggagaaa aaaccccgga tccatgagcg aagtcggtat acagaatc 48
<210> 108
<223> pWL04-UPC2-1-R
<400> 108
ctgttccatg tcgacgcccg ggtcataacg aaaaatcaga gaaatttg 48
<210> 109
<223> pWL10-IDI1-F
<400> 109
caaggagaaa aaaccccgga tccatgactg ccgacaacaa tagtatg 47
<210> 110
<223> pWL10- IDI1-R
<400> 110
cggttagagc ggatcttagc tagcttatag cattctatga atttgcctgt c 51
<210> 111
<223> pWL10-SmFPPS-F
<400> 111
gtaagaattt ttgaaaattc gaattcatgg cgaatctgaa cggagagtc 49
<210> 112
<223> pWL10-SmFPPS-R
<400> 112
gcgaagaatt gttaattaag agctcttatt tctgcctctt gtatatcttg c 51
<210> 113
<223> tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-F
<400> 113
ctaccaacgg aatgcgtgcg atcgcttagg atttaatgca ggtgacgg 48
<210> 114
<223> tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-R
<400> 114
gagcggatga atgcacgcga tcgctcataa cgaaaaatca gagaaatttg 50
<210> 115
<223> SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167-F
<400> 115
ctaccaacgg aatgcgtgcg atcgcttagg actccaagcg ataggttgg 49
<210> 116
<223> SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167-R
<400> 116
gagcggatga atgcacgcga tcgctcacca cacatcccgt aaataccttc 50
<210> 117
<223> PGAL1-OptiSaSS-F
<400> 117
gatcaatgaa tattaacata gctagccttc gagcgtccca aaacct 46
<210> 118
<223> PGAL1-OptiSaSS-R
<400> 118
gtgctcgctg aggacttaat gctagcagta cggattagaa gccgcc 46
<210> 119
<223> SanSyn-TCYC1-F
<400> 119
gtaataggat caatgaatat taacatagct agccttcgag cgtcccaaaa c 51
<210> 120
<223> SanSyn-TCYC1-R
<400> 120
gctcgctgag gacttaatgc tagcagtacg gattagaagc cgccg 45
<210> 121
<223> pCFB-F
<400> 121
gatttccgaa gaagacctcg agtaag 26
<210> 122
<223> pCFB-R
<400> 122
gcgcgtaata cgactcacta tag 23
<210> 123
<223> 1-HIS3-F
<400> 123
cttaactatg cggcatcaga gcag 24
<210> 124
<223> PERG9-1-R
<400> 124
gctgccttca tctcgaccgg atgcaatgcc aattgtaata gctttcccat gattttacgt 60
atatcaacta gttgacg 77
<210> 125
<223> PERG9-8-F
<400> 125
gaaggcgtta tcggttttgg gtttagtgcc taaacgagca gcgagaacac gacagcattc 60
gcccagtatt 70
<210> 126
<223> PERG9-8-R
<400> 126
aatttatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag tgctctatta 60
acgttctact ttacactg 78
<210> 127
<223> GAL80-7-F
<400> 127
ccagcgtata caatctcgat agttggtttc ccgttctttc cactcccgtc tcaatatagc 60
aatgagcagt taagcg 76
<210> 128
<223> GAL80-7-R
<400> 128
ctctttcctg taggtcaggt tgctttctca ggtatagcat gaggtcgctc gagcgacctc 60
atgctatacc tg 72
<210> 129
<223> GAL80-9-F
<400> 129
gagcgacctc atgctatacc tgag 24
<210> 130
<223> GAL80-9-R
<400> 130
atctcttctt gtcgcttttt ctcctcgata gaacctaaat aaaacgagct cttcgagcgt 60
cccaaaacct tc 72
<210> 131
<223> GAL80-MET15-F
<400> 131
agctcgtttt atttaggttc tatcg 25
<210> 132
<223> GAL80-MET15-R
<400> 132
ccacgctcat ctatcagctc ttgctctgga atattattga aaaccattgc gatcccaata 60
caacagatca cgtg 74
<210> 133
<223> NDT80-2-F
<400> 133
tactaacctt tcattaaaga gaaataacaa tattataaaa agcgcttaaa agtacggatt 60
agaagccgcc gag 73
<210> 134
<223> NDT80-2-R
<400> 134
cagtggtact tgcaaaacaa gataagaccc cattctttga aggtacttcc tgccgtaaac 60
cactaaatcg g 71
<210> 135
<223> PPGK1-F
<400> 135
ggaagtacct tcaaagaatg ggg 23
<210> 136
<223> NDT80-3-R
<400> 136
aattatttac gtattctttg aaatggcagt attgataatg ataaactcga gagcgacctc 60
atgctatacc tgag 74
<210> 137
<223> PTDH3-F
<400> 137
tcgagtttat cattatcaat actgcc 26
<210> 138
<223> NDT80-4-R
<400> 138
tctggaagag taaaaaagga gtagaaacat tttgaagcta tggtgtgtgc gcgaaaagcc 60
aattagtgtg atac 74
<210> 139
<223> PTEF1-F
<400> 139
gcacacacca tagcttcaaa atg 23
<210> 140
<223> NDT80-5-R
<400> 140
gagggaatct gaagaagaat gaccatacgt agatccccaa ttcttgaaga cttcgagcgt 60
cccaaaacct tc 72
<210> 141
<223> PTPI1-F
<400> 141
tcttcaagaa ttggggatct acg 23
<210> 142
<223> NDT80-6-R
<400> 142
aatgggataa tatcacagga ggtactagac tacctttcat cctacataaa gtaagctact 60
atgaaagact ttacaaag 78
<210> 143
<223> NDT80-LEU2-F
<400> 143
tttatgtagg atgaaaggta gtctagtac 29
<210> 144
<223> NDT80-LEU2-R
<400> 144
tcgctgagat gacgcatagt tagaaggtga tcttcctcta ataataagag actcttgttc 60
caaactggaa caac 74

Claims (10)

1.一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，其特征在于，具有如下特点：以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1、GAL80基因，将酿酒酵母的ERG9基因内源性启动子替换成PHXT1启动子，过表达OptiSaSS和SanSyn中的至少一种基因，以及过表达ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、SmFPPS、tHMG1、UPC2-1、PGM2、GAL4、CYP736A167和SaCPR2基因；其中：
tHMG1和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；
PGM2基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
GAL4、IDI1、SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体GAL80位点；
ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；
OptiSaSS和SanSyn中的至少一种基因、CYP736A167和SaCPR2基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons2位点。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述的敲除LPP1、DPP1、GAL80基因为通过CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除。
4.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述的敲除LPP1、DPP1、GAL80基因通过如下步骤进行敲除：
S1.将LPP1、DPP1基因的crRNA spacer通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-LPP1-DPP1；其中，crRNA spacer的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2.将重组质粒pCRCT-LPP1-DPP1转化酿酒酵母，经过培养表达筛选，得到敲除LPP1、DPP1基因的菌株。
5.根据权利要求4所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，步骤S2中所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。
6.一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基因敲除：通过CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除LPP1、DPP1，其中所用的crRNAspacer的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；经过培养表达筛选，得到敲除LPP1、DPP1基因的菌株；
(2)载体构建：分别将OptiSaSS、SanSyn、CYP736A167、SaCPR2、PGM2、tHMG1、UPC2-1、IDI1和SmFPPS基因构建到相应载体上；
(3)模块构建：分别将ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因和相应的启动子、终止子顺序连接得到对应的基因模块；
(4)构建菌株：将上述相应的基因模块整合到酿酒菌株对应的染色体位点上即得高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌；其中：
tHMG1和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；
PGM2基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
GAL4、IDI1、SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体GAL80位点；
ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；
OptiSaSS和SanSyn中的至少一种基因、CYP736A167和SaCPR2基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons2位点。
7.权利要求6所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基因敲除：将如SEQ ID NO.1所示的crRNA spacer的核酸序列通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-LPP1-DPP1；然后将重组质粒pCRCT-LPP1-DPP1转化酿酒酵母，经培养筛选后即得敲除LPP1、DPP1基因的酵母菌株M；
(2)载体的构建：
(a)将OptiSaSS基因构建到pESC-LEU载体上，得到PGAL1-OptiSaSS-TCYC1 DNA片段，命名为pWL01；
(b)将SanSyn基因构建到pESC-LEU载体上，得到PGAL1-SanSyn-TCYC1 DNA片段，命名为pWL02；
(c)将CYP736A167和SaCPR2基因构建到pESC-URA载体上，得到SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167 DNA片段，命名为pWL03；
(d)将PGM2基因构建到pESC-URA载体上，得到PGAL10-PGM2-TADH1 DNA片段，命名为pWL04；
(e)将tHMG1和UPC2-1构建到载体pESC-URA上，得到tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1 DNA片段，命名为pWL05；
(f)将tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1 DNA片段从pWL05载体上扩增下来，并构建到pCFB2796载体上，得到TCYC1-tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-TADH1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL06；
(g)将SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167 DNA片段从pWL03载体上扩增下来，并构建到pCFB2988载体上，得到TCYC1-SaCPR2-PGAL1-PGAL10-CYP736A167-TADH1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL07；
(h)将PGAL1-OptiSaSS-TCYC1 DNA片段从pWL01载体上扩增下来继而构建到pWL07载体上，得到TCYC1-OptiSaSS-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL08；
(i)将PGAL1-SanSyn-TCYC1 DNA片段从pWL02载体上扩增下来继而构建到pWL07载体上，得到TCYC1-SanSyn-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段，命名为pWL09；
(j)将IDI1、SmFPPS基因构建到载体pESC-URA上，得到TCYC1-IDI1-PGAL1-PGAL10-SmFPPS-TADH1片段，命名为pWL10；
(3)模块的构建：
(a)将HIS3、PHXT1顺序连接，得到模块HIS3-PHXT1，命名为模块1；
(b)将PGAL1、ERG8和TPYX212顺序连接，得到模块PGAL1-ERG8-TPYX212，命名为模块2；
(c)将PPGK1、ERG10和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-ERG10-TADH1，命名为模块3；
(d)将PTDH3、ERG12和TTDH2顺序连接，得到模块PTDH3-ERG12-TTDH2，命名为模块4；
(e)将PTEF1、ERG13和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-ERG13-TCYC1，命名为模块5；
(f)将PTPI1、ERG19和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1-ERG19-TFBA1，命名为模块6；
(g)以pWL04载体为模板，通过PCR扩增得到模块PGAL10-PGM2-TADH1，命名为模块7；
(h)以酿酒酵母基因组为模板，通过PCR扩增得到PGAL4-GAL4-TGAL4，命名为模块8；
(i)以pWL06载体为模板，通过PCR扩增得到模块TCYC1-IDI1-PGAL1-PGAL10-SmFPPS-TADH1，命名为模块9；
(4)构建菌株M-6
(I)用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pWL06，得到DNA整合片段A1(即：TCYC1-tHMG1-PGAL1-PGAL10-UPC2-1-TADH1-KIURA3 DNA片段)；再将DNA整合片段A1整合到步骤(1)中得到的酵母菌株M的染色体TY4位点，得到菌株M-2；
(II)将pSH65载体转化菌株M-2，然后用含有博来霉素(zeocin)的YPD培养基进行表达筛选，通过划板稀释挑选单菌落，提取基因组，通过PCR克隆出整合的DNA片段，通过测序找出筛选标记KIURA3被敲除的菌株，用YPD传代培养五天丢失pSH65质粒，得到菌株M-3；
(III)将模块1和模块8共同转化菌株M-3，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株BYM-4；
(IV)将模块7、模块9和筛选标记MET15共同转化菌株M-4，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-5；
(V)将模块2～5和筛选标记LEU2共同转化M-5，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-6；
(5)构建菌株WL-1
用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pWL08，得到DNA整合片段A2(即：TCYC1-OptiSaSS-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段)；再将DNA整合片段A2整合到步骤(V)中得到的菌株M-6的染色体TY1Cons2位点，得到菌株WL-1，即为所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌；
(6)构建菌株WL-2
用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pWL09，得到DNA整合片段A3(即：TCYC1-SanSyn-PGAL1-TADH1-CYP736A167-PGAL10-PGAL1-SaCPR2-TCYC1-KIURA3 DNA片段)；再将DNA整合片段A3整合到步骤(V)中得到的菌株M-6的染色体TY1Cons2位点，得到菌株WL-2，即为所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌。
8.根据权利要求7所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述的酵母菌株M为酿酒酵母BY4741。
9.权利要求1～5任一所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌在制备檀香挥发油中的应用。
10.一种制备檀香烯和檀香醇的方法，其特征在于，通过将权利要求1～5任一所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌接种于发酵培养基中培养，待溶氧值达到60％时补加补料培养基，使培养基内半乳糖的含量维持在5g/L，即得檀香烯和檀香醇；
其中，所述的发酵培养基组份包括：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，5g/L硫酸铵，25g/L半乳糖，10g/L葡萄糖；
所述的补料培养基组份包括：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，5g/L硫酸铵，200g/L半乳糖，200g/L葡萄糖。
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