MX2014008181A - Celulas de levadura diseñadas por ingenieria genetica. - Google Patents

Celulas de levadura diseñadas por ingenieria genetica.

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Abstract

La presente invención se refiere a células de levadura que producen altos niveles de acetoacetil-CoA. También se refiere a un método para elaborar tales células de levadura y al uso de tales células de levadura en un método para producir productos derivados de acetil-CoA.

Description

CELULAS DE LEVADURA DISEÑADAS POR INGENIERIA GENETICA Cm o de la Invención La presente invención se refiere a células de levadura que producen altos niveles de acetil-CoA y acetoacetil-CoA. También se refiere a un método para elaborar tales células de levadura y al uso de tales células de levadura en un método para la producción de productos derivados de acetil-CoA.
Antecedentes de la Invención La biosíntesis de un amplio intervalo de productos naturales industrialmente interesados en células hospederas diseñadas por ingeniería (así llamadas fábricas de células) podría aprovechar el potencial comercial no realizado de estos recursos naturales. De este modo, existe un interés creciente en desarrollar fábricas de células de plataforma que puedan convertir de manera eficiente recursos baratos de carbono en así llamados metabolitos precursores que son entonces, además convertidos en el producto de interés. Uno de estos metabolitos clave es la acetil-CoA, que es usada como precursor para la producción de un amplio intervalo de productos industrialmente interesantes que incluyen isoprenoides (principalmente usados como saborizantes y fragancias, biodieseles, fármacos antimalariales y anticancerígenos, antibióticos, caucho, complementos de REF.: 249547 dieta, ingredientes alimenticios y vitaminas), policétidos (antibióticos, fármacos anticancerígenos e inmunosupresores) , lípidos (tales como complementos de dieta, farmacéuticos y biodieseles) , polihidroxialcanoatos y 1-butanol (Figura 1) .
En un estudio anterior, el diseño por ingeniería de la derivación de piruvato deshidrogenasa en Saccharomyces cerevisiae se mostró por mejorar el suministro de acetil-CoA e incrementar la producción del compuesto sesquiterpeno amorfadieno (Aíeta Eng 2007, 9: 160; WO 2007024718) . Esto se logró por la sobre-producción de una acetaldehídro deshidrogenasa e introducción de una variante de acetil-CoA sintetasa heterologa en Salmonella entérica en la célula hospedera.
Sin embargo, permanece una necesidad para incrementar además la producción de acetil-CoA, que cuando se cubre debe incrementar la producción de cualquier producto derivado de acetil-CoA deseado. La presente invención atiende este problema usando una estrategia combinada de empuje-tracción-bloqueo, de este modo proporcionando una fábrica de células de plataforma que puede ser usada para mejorar la producción de productos derivados de acetil-CoA. Esto es ejemplificado usando tres diferentes compuestos derivados de acetil-CoA.
Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto la invención proporciona una célula de levadura modificada por la sobreexpresión de una aldehido deshidrogenasa y una acetil-CoA sintetasa (ACS) , caracterizada porque un alcohol deshidrogenasa y una acetoacetil-CoA sintasa son además sobreexpresados .
En otro aspecto proporciona un método para elaborar una célula de levadura modificada que comprende sobre-expresar una aldehido deshidrogenasa y una acetil-CoA sintetasa (ACS) , caracterizado porque tal método además comprende sobre-expresar una alcohol deshidrogenasa y una acetoacetil-CoA sintasa.
En un aspecto adicional, proporciona un método para producir niveles incrementados de un producto derivado de acetil-CoA que comprende cultivar la célula de levadura de la invención, la cual es capaz de producir tal producto, bajo condiciones que conducen a la producción de tal producto.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Revisión simplificada del metabolismo de acetil-CoA en Saccharomyces cerevisiae . La acetil-CoA es un metabolito primario clave ubicado en tres diferentes compartimentos subcelulares : el citosol (C) , la mitocondria (A) , y el peroxisoma (B) . No existe transporte directo de acetil-CoA entre los tres compartimentos, y la biosíntesis de acetil-CoA en tres compartimentos involucra diferentes trayectorias metabólicas. En la mitocondria, la acetil-CoA se forma a partir de piruvato por el complejo de piruvato deshidrogenasa. En el citosol, la acetil-CoA se forma a partir de acetato por acetil-CoA sintasa. En el peroxisoma, la acetil-CoA puede ser formada a partir de tanto acetato (también por acetil-CoA sintasa, no mostrada) , como de ácidos grasos por ß-oxidación. En la mitocondria, el destino principal de acetil-CoA es la oxidación mediante el ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) . La acetil-CoA en el peroxisoma puede, mediante el ciclo de glioxilato (GYC) , ser convertida a ácidos orgánicos C4 (malato y ácido succínico) que pueden ser transferidos a la mitocondria por oxidación mediante la enzima málica y el ciclo TCA. El destino primario de acetil-CoA en el citosol es servir como precursor para los lípidos celulares (ácidos grasos y ergosterol) . Muchos productos biotecnológicos industrialmente interesantes son derivados de acetil-CoA y la biosíntesis de la mayoría de estos ocurre en el citosol. Una fábrica de células de levadura de plataforma para todos estos productos debe por lo tanto tener redirección del carbono hacia la acetil-CoA en el citosol.
Figura 2: Ilustración de la estrategia de ingeniería metabólica de empuje-tracción-bloqueo para mejorar la producción de acetil-CoA en el citosol (los 3 compartimentos celulares donde la acetil-CoA se ubica están representados como en la Figura 1) . Mediante la sobre -expresión del ALD6 endógeno, que codifica la acetaldehído deshidrogenasa dependiente de NADP, y la variante ACS heteróloga a partir de Salmonella entérica {ACSSE) I que codifica a acetil-CoA sintasa, se asegura que el flujo se dirija de acetaldehído a acetil-CoA en el citosol (la parte de empuje de la estrategia) . A través de la sobre-expresión adicional de ADH2, que codifica la alcohol deshidrogenasa, se asegura además que el etanol producido pueda ser convertido nuevamente a acetaldehído y a partir de ahí además a acetil-CoA (la parte de tracción de la estrategia) . La tracción de acetil-CoA en la dirección de trayectorias deseables se sobre-expreso ERGIO que codifica acetoacetil-CoA sintasa que cataliza la conversión de acetil-CoA a acetoacetil-CoA (AcAcCoA) , ya que este metabolito es un precursor común para los tres productos usados para evaluar la cepa de plataforma de acetil-CoA. Además de la sobre-expresión, las reacciones que involucran el consumo de acetil-CoA fueron suprimidas (la parte de bloqueo de la estrategia) . Esto involucra dos reacciones claves del ciclo de glioxilato (GYC) , es decir la citrato sintasa peroxisomal, codificada por CIT2 , y la sintasa málica citosólica, codificada por MLS1. El mapa de trayectoria en la figura es una vista simplificada del metabolismo, por ejemplo, la acetil-CoA usada por citrato sintasa en el peroxisoma es sintetizada ahí por Acsl de acetato.
Figura 3: Mapa de plásmidos pIYC05 y pIYC08.
Figuras 4A-4C: Mapa de plásmidos pICKOl, pAKOl y pPHB-pha y representaciones esquemáticas de las trayectorias biosintéticas reconstituidas de a-santaleno (4A) , 1-butanol (4B) y PHB (4C) .
Figuras 5A-5C: El diseño por ingeniería del metabolismo de acetil-CoA de levadura mejora la producción de a-santaleno (5A) , 1-butanol (5B) y polihidroxibutirato (PHB) (5C) . Las representaciones esquemáticas de las trayectorias biosintéticas reconstituidas se muestran en los paneles superiores. Las siguientes enzimas son derivadas de otros organismos: Sts, Clausena lansium; PhaA, PhaB, PhaC, Ralstonia eutropha; Hbd, Crt , AdhE2 , Clostridium beijerinckii; Ter, Treponema denticola . Una versión truncada del HMG1 endógeno (tHMGl) es sobreexpresada para la producción de -santaleno. Todas las cepas de S. cerevisiae diseñadas por ingeniería son descritas en el texto. Los cultivos se hicieron crecer en matraces sacudidos de 100 mi que contienen 20 mi de medio mínimo definido con 20 g/L de glucosa como la fuente de carbono, los niveles de a-santaleno se cuantificaron por GC-MS, los niveles de 1-butanol y PHB se cuantificaron por HPLC. El tHMSl, hidroximetilglutaril-CoA reductasa; Sts, a-santaleno sintasa; PhaA, acetil-CoA acetiltransferasa; PhaB, acetoacetil-CoA reductasa; PhaC, poli (3-hidroxibutirato) polimerasa; Hbd, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa; Crt, crotonasa; Ter, trans enoil-coA reductasa; AdhE2, butiraldehído deshidrogenasa/butanol deshidrogenasa .
Figura 6: La sobreexpresion de Adh2 y Ergio mejora además los tituladores de a-santaleno en células de levadura que co-expresan ACSSE Y ALD6. La comparación de acumulación de a-santaleno en cepas de levadura expresa: (i) una versión truncada del gen hidroximetilglutaril-CoA reductasa (tHMGl) y un gen de a-santaleño sintasa (Sts) (cepa SCIYC40) ; (ii) los genes tHMGl y Sts junto con los genes ACSSE Y AD6 (cepa SCIYC41) ; los genes tHMGl, Sts, ACSSE, ALD6 junto con Adh2 y ErglO (cepa SCIY42) .
Descripción Detallada de la Invención La célula de levadura de la presente invención tiene la ventaja sorprendente de producir niveles incrementados de acetil-CoA y acetoacetil-CoA, de este modo permitiendo la producción de niveles incrementados de productos útiles derivados a partir de ahí, tales como por ejemplo terpenoides, 1-butanol y polihidroxi butirato.
La célula de levadura puede ser cualquier tipo de células de levadura. Preferiblemente, la célula de levadura es capaz de producir etanol . Más preferiblemente se selecciona a partir de levadura de los géneros Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Hansenula , Debaryomyces, Mucor, Pichia y Torulopsis . Muy preferiblemente, es Saccharomyces cerevisiae .
La estrategia involucra un empuje de carbono a partir de etanol mediante acetaldehído a acetil-CoA citosólico. Esto se logra por la sobre expresión de una alcohol deshidrogenasa tal como el gen ADH2 endógeno en Saccharomyces cerevisiae y una aldehido deshidrogenasa tal como el gen ALD6 dependiente de NADP en Saccharomyces cerevisiae y una acetil-CoA sintasa tal como la variante ACS (L641P) de Salmonella entérica (ACSSE)¦ ACSSE contiene un punto de mutación que previene a la enzima de ser inhibida por acetilación [J Biol Chem 2005, 280:26200), y el uso de esta variante particularmente redirige eficientemente el flujo de acetaldehído a acetil-CoA en el citosol.
Para asegurar la tracción de acetil-CoA hacia los tres productos de interés, una acetil-CoA C-acetiltransferasa que cataliza la conversión de acetil-CoA a acetoacetil-CoA (AcAcCoA) es también sobre-expresada . La AcAcCoA es un precursor común para los tres productos usados para evaluar la cepa de plataforma de acetil-CoA. En S. cerevisiae, el gen ERGIO codifica una acetil-CoA C-acetiltransferasa .
En una modalidad preferida de la invención, la célula de levadura es además modificada por supresión de un gen que codifica una malato sintasa citosólica o un gen que codifica una citrato sintasa peroxisomal a partir del genoma de la célula de levadura. Tal supresión tiene la ventaja de evitar el consumo de acetil-CoA en el ciclo de glioxilato, así como de incrementar la disponibilidad de acetil-CoA para otras trayectorias, tales como aquellas que conducen a terpenoides, 1-butanol o polihidroxi butirato.
Para reducir además la pérdida de carbono a partir de la combinación del precursor de acetil-CoA, las reacciones que involucran el consumo de acetil-CoA son de este modo preferiblemente eliminadas. Esto involucra eliminar dos reacciones clave del ciclo del glioxilato (GYC), es decir una citrato sintasa peroxisomal y una malato sintasa citosólica codificada por CIT2 y por MLS1 en S. cerevisiae, respectivamente.
La célula de levadura de la invención puede ser elaborada por un método que comprende sobre-expresar una aldehido deshidrogenasa, una acetil-CoA sintetasa (ACS) , una alcohol deshidrogenasa y una acetoacetil-CoA sintasa.
En una modalidad preferida de la invención, el método además comprende suprimir un gen que codifica una malato sintasa citosólica o un gen que codifica una citrato sintasa peroxisomal a partir del genoma de la célula de levadura.
La aldehido deshidrogenasa, la ACS, la alcohol deshidrogenasa, la acetoacetil -CoA sintasa, la malato sintasa citosólica, la citrato sintasa peroxisomal y la célula de levadura son como se definen anteriormente y en cualquier modalidad de la invención que se refiere a la célula de levadura.
La sobre expresión de la aldehido deshidrogenasa, la ACS, la alcohol deshidrogenasa, la acetoacetil-CoA sintasa, se puede realizar usando vectores de expresión de levadura episomal o a través de integración genómica usando métodos bien conocidos en la técnica. Estos métodos son estándares pero pueden por ejemplo, llevarse a cabo como se describe en Methods in Yeast Genetics, 2005 Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory press.
Las supresiones del gen malato sintasa y citrato sintasa pueden ser realizadas usando cualquier método bien conocido por la persona experta en la técnica para supresión de gen, tal como por ejemplo un método de reemplazo de alelo a base de PCR, libre de clonación tal como se describe en Genome Res. 1997, 7:1174 o cualquiera de otros métodos de supresión de gen.
Cultivar las células de levadura de la invención bajo condiciones adecuadas, se pueden producir metabolitos secundarios. Preferiblemente, tales metabolitos son producidos a un nivel incrementado, es decir, se producen más metabolitos secundarios cuando la célula de levadura de la invención se cultiva que cuando la célula de levadura no transformada se cultiva.
La célula de levadura debe ser capaz de producir el metabolito secundario deseado. Esto significa que ya sea la célula de levadura es capaz de manera natural de producir tal metabolito secundario o, alternativamente, la célula de levadura es transformada con genes adicionales que son necesarios para la producción de tal metabolito. La modificación adicional de la célula de levadura como se describe anteriormente, tiene el efecto de incrementar el nivel del metabolito secundario producido por la célula de levadura no así modificada.
Por ejemplo, cuando el metabolito secundario es un terpenoide, la célula de levadura puede ser transformada para expresar o sobre-expresar una terpeno sintasa capaz de catalizar la conversión de un precursor de terpeno acíclico a tal terpenoide. Esto aplica para todos los precursores de terpeno acíclicos tales como por ejemplo, geranilpirofosfato, farnesilpirofosfato y geranilgeranilpirofosfato, dependiendo del terpenoide que está propuesto para ser producido. Los terpenoides son productos naturales conocidos por sus propiedades de sabor y fragancia, cosméticas, farmacéuticas y antimicrobianas. Estos compuestos son elaborados hasta de cinco unidades de carbono llamadas unidades de isopreno y son clasificados por el número de estas unidades presentes en su estructura. De este modo, los monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos son terpenos que contienen 10, 15 y 20 átomos de carbono, respectivamente. Los sesquiterpenos, por ejemplo, son ampliamente encontrados en el reino vegetal. Muchas moléculas de monoterpeno, sesquiterpeno y diterpeno se conocen por sus propiedades de sabor y fragancia y sus efectos cosméticos, medicinales y antimicrobianos. Más de 300 hidrocarburos de sesquiterpenos y se han identificado 3,000 sesquiterpenoides y muchas nuevas estructuras son identificadas cada año. Los extractos vegetales obtenidos por diferentes medios tales como destilación a vapor o extracción de solvente son usados como fuente de terpenos . Las moléculas de terpeno son a menudo usadas como tales, pero en algunos casos las reacciones químicas son usadas para transformar los terpenos en otras moléculas de alto valor. La mayoría de los terpenos en uso hoy día son productos naturales extraídos a partir de diversos organismos (plantas, organismos marinos, ... ) . Sin embargo, la mayoría de estos organismos de fuente no son susceptibles de cultivación a gran escala necesarios para producir cantidades comercialmente viables ni para manipulación genética para incrementar sus capacidades de producción. Además, muchos de estos productos naturales tienen estructuras complejas y son actualmente no accesibles por medios químicos.
Ejemplos de sesquiterpenos preferidos incluyen a-santaleno, patchulol, ß-santaleno, valenceno, cubebol, zizaeno, amorfa 4,11-dieno, humuleno, aristoloqueno, bergamoteno, zingibereno, farneseno, cariofileno, isodauceno, sesquithujeno, avermitilol, eudesmol , vetispiradieno, longifoleno, ciclocopacanfeno, isolongifoleno, germacreno, biciclogermacreno, bisabolol, germacradienol , hedicariol, barbateno, epi-cedrol, epi-aristoloqueno, sesquisabineno, cupreno, selineno, copaeno, macrocarpeno, cadinol , intermedeol, nerolidol, muurola-3 , 5-dieno, curcumeno y epi-beta santaleno. Sesquiterpenos más preferidos incluyen a-santaleno, patchulol, ß-santaleno, valenceno, cubebol, zizaeno, amorfa 4,11-dieno. Aún más preferiblemente, el sesquiterpeno es patchulol o a-santaleno.
Ejemplos de diterpenos preferidos incluyen esclareol, labdendiol y taxadieno. Ejemplos de monoterpenos preferidos incluyen limoneno, pineno, mirceno, canfeno, felandreno, terpinoleno, ocimeno, linalool, cineol, geraniol, terpineno, fenchol, careno, sabineno.
Otro ejemplo de un metabolito que puede ser elaborado usando el método de la invención es 1-butanol. 1-Butanol es considerado como un reemplazo de gasolina posible, debido a que tiene densidad de energía superior mientras es menos corrosivo y menos soluble en agua que el etanol .
Un ejemplo adicional de un metabolito que puede ser elaborado usando el método de la invención es polihidroxi butirato (PHB) . El PHB es un miembro de una familia de biopolímeros diodegradables comercialmente interesantes.
Las células de levadura de la invención pueden ser cultivadas en cualquier tipo de medio de crecimiento adaptado a tales especies de levadura. Tales medios son bien conocidos en la técnica y no garantizan una descripción más completa aquí, lo cual podría en cualquier caso no ser exhaustivo. El medio de crecimiento es preferiblemente también adaptado a los tipos de promotores usados para sobre-expresar los genes mencionados anteriormente. Por ejemplo, si los genes sobre-expresados están bajo el control del promotor regulado por glucosa el medio de crecimiento preferiblemente comprende glucosa .
E emplos La invención es ahora descrita en detalles adicionales por medio de los siguientes ejemplos.
Ej emplo 1 Cepas de Levadura y Medio Saccharomyces cerevisiae cepa CEN . PK113 - 11C (MATa SUC2 MAL2-80 ura3-52 his3-Al, amablemente proporcionada por P. Kotter, University of Frankfurt, Alemania) se usó como la cepa antecedente. Todas las cepas de levadura usadas en este estudio se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1 - Cepas de levadura usadas en este estudio y genotipos relevantes Nombre de la cepa Genotipos CEN.PK113-11C MATa SUC2 MAL2-8* ura3-52 his3-M SCIYC32 MATa. SUC2 MAL2- ura3-52 his3-Al cit2A SCIYC33 MATa SUC2 MA12-& um3-52 his3-M mhlÁ SCIYC40 CRN.PK113-11C pICKOl pIYC04 SCIYC42 CEN.PK113-11C pICKOl pIYCOS SCIYC45 SCIYC32 pICKOl pIYC08 SCIYC46 SCIYC33 pICKOl pIYCOS SCKK05 CEN.PK113-11C pPHB-pha pIYC04 SCKK06 CEN.PK113- 1C pPHB-pha pIYCOS SCKK09 SCIYC32 pPHB-pha pIYCOS SCKK10 SCIYC33 pPHB-pha pIYCOS SCAK00 CEN.PK113-11C pA l pIYC04 SCAK01 CEN.PK113-11C pAKl pIYCOS SCAK02 SCIYC33 pAKl pIYC08 SCAK03 SCIYC32 pAKl pIYCOS Las cepas de levadura diseñadas por ingeniería se seleccionaron en medio de dextrosa sintética (SD) (Metabolic Engineering 2009, 11:391) sin uracilo y/o histidina donde fuera apropiado. Las cepas de S. cerevisiae se hicieron crecer en medio mínimo definido (Yeast 1992, 8:501) con 20 g/L de glucosa. Para la producción de a-santaleno, se agregó un 10% (v/v) de dodecano sobrepuesto al cultivo a un OD60o de 1 para capturar a-santaleno en la fase orgánica.
E em lo 2 Plásmidos de Expresión de Levadura ALD6 , ACSSE, ADH2 y ERGIO Para proporcionar la expresión del gen en un cultivo a base de glucosa, todos los plásmidos de expresión de levadura se basan en dos vectores pSP-Gl y pSP-G2 que portan promotores constitutivos PIEFI Y resa (Yeast 2010, 27:955) (véase Tabla 2 para la lista de plásmidos usados en este estudio) .
Tabla 2 - Descripción de los plásmidos usados en este estudio Nombre Gen expresado Marcador pIYCÜ4 ninguno HIS3 pIYC05 PTEF,-ACSSE PPCKI-ALD6 HIS3 pIYC08 PTEFI-ACSSE PPGKI-ALDÓ PTEF!-ERG10 PHXTT HIS3 ADH2 pICKOl PTEFI-SÍS PpcKi-tHMGl URA3 pPHB pha PmFi-phaC PPGKrphaA ?t??,-phaB URA3 ????? PTEFi-adhE2 PpGKi-ter PTEFI-CTÍ PPGKi-hbd URA3 Con el fin de proporcionar sitios de reconocimiento de la enzima de restricción adicional corriente abajo de cada terminador (TADHI y TCyci, respectivamente) , el cásete de expresión completo se amplificó por PCR usando cebadores 17 y 18 (véase Tabla 3 para la lista de cebadores usados en este estudio) , se cortó con PvuII y se ligó nuevamente en el armazón del vector para generar pSP-GMl y pSP-GM2, respectivamente. El fragmento PvuII de pSP-GMl, que contiene el cásete promotor bidireccional PTEFI - PPGKI I se clonó subsecuentemente en los sitios PvuII de pESC-HIS (Stratagene) proporcionando pIYC04.
Tabla 3 - Cebadores usados para construcción de plásmidos (SEC ID O:l a 20) Número de Secuencia (5' a 3') cebador 1 CGCCGGATCCAAAACAATGACTAAGCTACACTTTGAC 2 CGCGCTCGAG'n'ACAACTTAATTCTGACAGC 3 TATTAGGCCGGCCCCGTGGAAATGAGGGGTATGC 4 GGCCGGCGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAAAACT 5 GCGCGGATCCAAAACAATGTCTATTCCAGAAACTCAA 6 GCGATCCGGAACGTCAAGACÜAAAAGTGAA 7 OCCGCGACTAGTAAAACAATGTCTCAGAACGTTT ACA 8 GCGGCCrGAGCTCTCATATCT TTCAATGACAAT 9 CTATCTTCCGOAGCACACACCATAGCTTC 10 TCTAAACGCCGGCGAATTGGAGOGACCTCATGC 11 AAACTCCTAGGCCGTGGAAATGAGGGGTA 12 GTCAAAGGCGCGCCACGTCAAGACGAAAAGT 13 TACAATTGCTAlTATTATCCTGC'rCAGTGGTACrr 14 TGGAATTGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAG 15 GAAGAACGCCGGCGGAGCGACCTCATGCTATACCTG 16 GTTGTTTCCGGATGTTACATGCGTACACGCÜTC 17 GAACAACAGC:TGGATAAAGGCGCGCCAAACGACCTAGGAATT GGAGCÜACCTCATGCTATAC 18 GAACAACAGCTGGATAAACGCCGGCGAAACGATCCGGAGGAT CTTCGAGCGTCCCAAAAC 19 GTTG ITGCGG CCGCAAAACA ATGTCAACTC AACAAGT TC ATCAG 20 GTTGTTTTAA TTAACTAATC GTCAAGCTTA ACGGG Los sitios de restricción están subrayados.
ALO6 (SEC ID NO: 42) se amplificó por PCR a partir de preparaciones de ADN cromosomal de S. cerevisiae CEN. PK113-5D ( MATa. SUC2 MAL2-8C ura3-52) usando el par de cebador 1 y 2. Usando estos cebadores, la secuencia de nucleótido 5'-AAAACA-3' (secuencia Kozak) se introdujo inmediatamente corriente arriba del codón de inicio de ALD6 para mejorar la eficiencia de la traducción (Nucleic Acids Res. 1987, 15:3581) . Esta estrategia se aplicó a todos los otros genes usados en este estudio. El gen de acetil-CoA sintetasa de Salmone1 la entérica {ACSSE) con una mutación L641P (J. Biol . Chem . 2005, 280:26200), ACSSE fue optimizado de codón (SEC ID NO: 52) y sintetizado por ADN 2.0 (Menlo Park, CA, USA) para expresión de alto nivel en levadura. Un fragmento de Bamñl/Xhol de 1.5-kb que contiene una secuencia Kozak y que codifica la secuencia de ALD6, y un fragmento de Notl/PacI de 2.0-kb que contiene una secuencia Kozak y ACSSE se insertaron secuencialmente en los sitios correspondientes de pIYC04, resultando en el plásmido pIYC05 (Figura 3) .
Para expresar el gen ADH2 bajo el control del promotor HXT7 a base de glucosa, una región promotora de 0.6-kb de HXT7 se amplificó por PCR de CEN.PK113-5D usando el par cebador 3 y 4. El producto amplificado se desdobló con BamHl/Fsel e introdujo en los sitios Banüíl y Fsel de pSP-GMl para reemplazar el promotor PGK1, proporcionando el plásmido pIYC06. Un fragmento de 1.5-kb que contiene la secuencia completa de 1,047 pb de ADH2 (SEC ID NO: 41) y la secuencia corriente abajo de 434 pb que incluye su terminador nativo se amplificó por PCR de CEN. PK113-5D usando cebadores 5 y 6. Del mismo modo, una región de 1.2-kb de ERGIO (SEC ID NO : 43) de CEN.PK113-5D se amplificó por PCR usando cebadores 7 y 8. El fragmento de BanHl/XhoI que contiene una secuencia Kozak y ADH2 , y el fragmento Spel/SacI de 1.2-kb que contiene una secuencia Kozak y ERGIO, se insertaron secuencialmente en los sitios correspondientes de pIYC06, resultando en el plásmido pIYC07.
Para sobre expresar ALD6, ACSSE, ADH2 y ERGIO de un plásmido único, se construyó entonces pIYC08. Un fragmento de 2.0-kb que contiene el promotor TEF1 , ERGIO, y el terminador ADH1 de pIYC07 se amplificó por PCR usando los cebadores 9 y 10 para introducir sitios rel / Kpn21. El ADN resultante se desdobló con MreI/Jpn2I e insertó en los sitios Mrel / ???2 I de pIYC05 para obtener el plásmido pIYC05-l. De manera similar, un cásete que contiene el promotor HXT7 , ADH2 y su terminador nativo de pIYC07 se amplificó por PCR usando los cebadores 11 y 12 para introducir dos sitios AscI . El producto amplificado se digirió con AscI y subsecuentemente se clonó en los sitios AscI de plYC05-l, proporcionando el plásmido pIYC08 (Figura 3) .
Ejemplo 3 Construcción de un vector de expresión de levadura ot- santaleno y tHMGl Para construir el vector de expresión ( + ) -a csantaleno, el ADNc de la santaleno sintasa (Sts) (SEC ID NO: 46) se amplificó por PCR a partir del plásmido Cont2B-27- ETlOl (documento WO 2009109597, número de acceso de GenBank : HQ452480) , usando cebadores 19 y 20, se cortó con Notl/PacI y se ligó en el vector pSP-Gl restringido de Notl/Pací (Yeast 2010, 27:954) . Subsecuentemente, el tHMGl fue amplificado por PCR usando ADN genómico de S. cerevisiae CEN.PK113-5D como plantilla y los cebadores 31 y 32, se cortó con BamHI/N el y se ligó en el mismo vector después de la restricción con BamHI and iV el (Nature 2006, 440:940) . Esto resultó en la formación del plásmido de expresión PICKOl (Figuras 4A-4C) .
Ejemplo 4 Construcción de un vector de expresión de la trayectoria de polihidroxibutirato La trayectoria de la biosíntesis de polihidroxibutirato se introdujo en S. cerevisiae cepa CEN.PK 113-11C usando plásmido de copias múltiples. La trayectoria de la biosíntesis de PHB involucra tres enzimas, ß-cetotiolasa codificada por phaA, acetoacetil-CoA reductasa codificada por phaB y PHA sintasa codificada por el gen phaC. PhaA (SEC ID NO: 53), phaB (SEC ID NO: 54) y phaC (SEC ID NO: 55) se sintetizaron y optimizaron de codón para la expresión en S. cerevisiae por el ADN 2.0 con base en las secuencias de los genes pha originales Ralstonia eutropha H16. PhaA y phaB se cloraron en los sitios Sacl/Spel y SalI/BamHI del plásmido pSP-G2 corriente abajo del promotor PGK1 y TEF1, respectivamente, para proporcionar pSP-GM2-phaAB. PhaC se clonó en los sitios Xhol/Kpnl de pSP-GM2 corriente abajo del promotor TEF1. El fragmento de phaC, promotor TEF1 y terminador CYC1 se amplificó usando el cebador 13 y 14 y se ligó a pSP-GM2 -phaAB en el sitio Miel, resultando en el plásmido pPHB-pha (Figuras 4A-4C) .
Ej emplo 5 Construcción de vectores de expresión de la trayectoria de butanol Se usaron dos plásmidos para expresar los genes de la trayectoria de butanol. Cuatro de los genes que codifican a butiraldehído deshidrogenasa, 3 -hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa , crotonasa y trans enoil-CoA reductasa se expresaron a partir de un plásmido, mientras el gen de tiolasa (ERGIO) se expresión de otro plásmido.
ERGIO de CEN.PK113-5D se clonó a partir de pIYC07 en pIYC04 bajo el promotor TEF1 usando Spel y SacI para proporcionar pCSOl.
Los genes que codifican la butiraldehído deshidrogenasa/butanoldeshidrogenasa (adhE2) , 3-hidroxibutiril -CoA deshidrogenasa (hbd) y crotonasa (crt) fueron de Clostridium beijerinckii . La trans enoil-CoA reductasa (ter) fue de Treponema denticola. Todos estos genes fueron optimizados de codón para altos niveles de expresión en levadura y sintetizados por ADN 2.0.
AdhE2 (SEC ID NO: 50) se clonó en pSP-GMl usando Notl y Pací bajo un promotor TEFl. Ter (SEC ID NO: 51) se clonó entonces en el mismo plásmido bajo un promotor PGKl u usando BamHI y N el . Esto resultó en el plásmido pAKO .
Crt (SEC ID NO: 48) se clonó en pSP-GMl usando Notl y Pací bajo un promotor TEFl, y hbd (SEC ID NO: 47) se clonó entonces en el mismo plásmido bajo un promotor PGKl usando Banfíl y Miel. Un cásete que contiene ambos genes y sus promotores se amplificó entonces a partir de este plásmido usando cebadores 15 y 16, los cuales contienen los sitios de restricción Kpn2I y rel. Este cásete se clonó entonces en pAKO, proporcionando pAKl (Figuras 4A-4C) .
Ej emplo 6 Supresión de c±t2 y mlsl La supresión del gen se realizó usando un método de reemplazo de alelo a base de PCR libre de clonación (Genome Res. 1997, 7: 1174). Para supresión de cit2 (SEC ID NO: 44), las regiones 5' y 3' del marco de lectura abierto cit2 se amplificaron individualmente a partir del ADN genómico de CEN.PK 113 -5D por PCR, usando los siguientes oligonucleótidos : CIT2 -UP-delantero, CIT2 -UP-reverso, CIT2-DOWN-delantero, CIT2 -DOWN-reverso (véase Tabla 4 para la l ista de cebadores usados para supres iones del gen) . El módulo de expres ión KanMX se ampl if icó en dos partes traslapantes a part ir del plásmido pUG6 ( Guldener et al . , 1996 ) , usando los ol igonuc leótidos : KanM -UP- delantero , KanMX- UP - reverso , KanM -DOWN- delantero , KanMX -DOWN- reverso .
Tabla 4 - Lista de cebadores usados en este estudio para supresiones cit02 y mlsl (SEC ID NO:21 a 32) Cebadores Secuencia (de 5' a 3') CIT2-UP-F ACCGTCTTATTTACACTCCG CIT2-UP-R GATCCCCGGGAATTGCCATGTGTTGATATTGTTCCC TGAA CIT2-DW-F GCAGGGATGCGGCCGCTGACCTACTTTTACACCCCTCTGC CIT2-DW-R TGATACTAACCTGACCCCTC MLS1-UP-F ATTCCCGCAGGGTAATAAA MLS1-UP-R GATCCCCGGGAATTGCCATGGATGATAGGAGCCCGACÍTC MLS1-DW-F GCAGGGATGCGGCCGCTGACTGCTrCGTTTCGTAGITAG MLS1-DW-R CTGGTGGTCTGTGGTTGTA KanMX-UP-F CATGGCAATTCCCGGGGATCAAGCTTCGTACGCTGCAGGT CG KanMX -UP-R CCATGAGTGACGACTGAATCCGG KanMX -DW-F GCAAAGGTAGCGTTGCCAATG KanMX -DW-R GTCAGCGGCCGCATCCCTGCCGACTCACTATAGG ÜAGACCXi Las secuenc ias subrayadas corresponden a los nucleótidos traslapantes .
Los f ragmentos CIT2 -UP/KanMX-UP y KanMX- DOWN/ CIT2 DOWN se fus ionaron entre sí mediante PCR . Los dos fragmentos de fusión se integraron en el genoma por recombinación homologa. Para el bucle de salida del módulo de expresión KanMX, se siguieron los siguientes procedimientos como se describe previamente (Guldener et al., 1996) . De manera subsecuente, los transformantes correctos fueron rayados nuevamente en un medio que contiene ácido 5-f luoroorót ico para el bucle de salida del plásmido pSH47 con el marcador URA3 y la reutilización de auxotrofia de uracilo. De este modo, se obtuvo la cepa SCIYC06 (MATa MAL2-8° SUC2 ura3-52 cit2 ::lox) .
El mismo procedimiento se usó para supresión de MLS1 (SEC ID NO: 45) . Los ol igonuc leot i dos usados para realizar las supresiones del gen MSL1 se listan en la Tabla 4.
La supresión de cada gen se verificó por PCR de diagnóstico, la cual se realizó usando el ADN genómico de cada gen como plantilla, y para cada uno de los dos pares de genes de los cebadores se usaron, uno hacia afuera del locus de integración y uno hacia dentro del fragmento integrado. Todos los cebadores usados para la confirmación de la cepa son listados en la Tabla 5.
Tabla 5 - Lista de cebadores usados en este estudio para confírmacion de la cepa (SEC ID NO: 33 a 40) Cebadores Secuencia (de 5' a 3') CIT2-UP-0 AACCAAACTACGGCATAC CIT2-UP-I CTGAGCGAGACGAAATAC CIT2-DW-I CTGCCTCGGTGAGTTTTC CIT2-DW-0 AGGAGCGTTCATCTTGGT MLS1-UP-0 CATCATTCAACTTTCCTCA MLS1-UP-I CTCAGTGGCAAATCCTAA MLS1-DW-I AGACTAAACTGGCTGACG MLS1-DW-0 TTCTTATACATTTCCTGACTG Finalmente, la cepa SCIYC32 (MATa SUC2 MAL2-8C ura.3-52 his3-Al cit2A) se construyó cruzando la cepa SCIYC06 (MATa SUC2 MAL2-8C ura3-52 cit2A) y CEN. PK110-10C {MAToc SUC 2 MAL2-8C his3-Al, amablemente proporcionado por P. Kótter) seguido por disección de tetrad. De manera similar, la cepa SCIYC33 (MATa SUC2 MAL2-8C ura3-52 his3-Al mlslA) se construyó cruzando la cepa SCIYC07 (MATa SUC2 MAL2-8C ura3-52 mlslA) y CEN. PK110-10C) seguido por disección.
Ejemplo 7 Construcción de las cepas de levaduras diseñadas por ingeniería para ot-santaleno, 1-butanol y producción de PHB Todas las transformaciones de las cepas de levadura se realizaron por el método de acetato de litio estándar {Nucleic Acids Res. 1992, 20: 1425). Tres a diez colonias de cada transformación se seleccionaron para la selección de los mejores transformantes producidos.
La cepa SCIYC40 que produce -santaleno se construyó transformando plásmidos pICKOl yd pIYC04 en la cepa CEN. PK113-11C seguida por la selección en placas SD-URA-HIS. Los plásmidos pICKOl y pIYC08 se co-transformaron en la cepa CEN. PK113-11C y se seleccionaron en placas SD-URA-HIS para la construcción de SCIYC42. De manera similar, estos dos plásmidos se co-transformaron en SCIYC32 y SCIYC33 resultando en SCIYC45 y SCIYC46, respectivamente.
Las cepas pAKYl, pAKY2 y pAKY3 que producen 1-butanol se construyeron transformando CEN. PK113-11C, SCIYC33 y SCIYC32 (respectivamente) con pIYC08 y pAKl . Las cepas pAKY4, pAKY5 y pAKY6 se construyeron transformando CEN.PK113-11C, SCIYC33 y SCIYC32 (respectivamente) con pCSOl y pAKl. La cepa pAYO se construyó transformando CEN. PK113 -11C con pIYC04 y pAKl . Las cepas se seleccionaron en placas SD-URA-HIS.
La cepa SCKK005 que produce PHB se construyó transformando los plásmidos pPHB-pha y pIYC04 en la cepa CEN. PK113-11C seguido por selección en placas SD-URA-HIS como control. Los plásmidos pPHB-pha y pIYC08 se constransfectaron en la cepa CEN. PK113 -11C para la construcción de SCKK006. De manera similar, estos dos plásmidos se co-transformaron en SCIYC32 y SCIYC33 resultando en SCKK009 y SCKK010, respectivamente.
Ejemplo 8 Métodos para la producción, purificación y análisis cuantitativo de ot-santaleno, 1-butanol y PHB Para ensayar la producción de a-santaleno, 1-butanol y PHB a partir de las diferentes cepas descritas anteriormente, cultivos de 20 mL se iniciaron en un matraz sin deflector de 100 mi inoculando una cantidad de pre-cultivo que resultó en una densidad óptica final de 0.02 a 600 nm (OD600) · Las cepas se hicieron crecer a 30°C con sacudimiento orbital de 180 r.p.m. en medio mínimo definido con la siguiente composición: 7.5 g/L de (NH4)2S04; 14.4 g/L de KH2P0 ; 0.5 g/L de MgS04»7H20; 2 ml/L de solución de metal indicador (por litro, pH 4.0: EDTA (sal de sodio), 15.0 g; ZnS04»7H20, 0.45 g; MnC12*2H20, 1 g; CoCl2»6H20, 0.3 g; CuS04«5H20, 0.3 g; Na2Mo04*2H20, 0.4 g; CaCl2«2H20, 0.45 g; FeS04»7H20, 0.3 g; H3B03, 0.1 g y KI , 0.10 g) . El pH del medio mineral se ajustó a 6.5 agregando 2 mM de NaOH y se sometió a autoclave de manera separada a partir de la solución de fuente de carbono. La glucosa se agregó a la concentración de 20 g/L. La solución de vitamina (por litro, pH 6.5: biotina, 0.05 g; ácido p-amino benzoico, 0.2 g; ácido nicotínico, 1 g; Ca-pantotenato, 1 g; piridoxina-HCl , 1 g; tiamina-HCl, 1 g y mio-inositol, 25 g) se filtró esterilizado y se agregó asépticamente al medio después de someterlo a autoclave a la concentración de 1 ml/L. Para preparar los pre-cultivos, los tubos de cultivo que contienen 5 mL de medio definido (como se describe anteriormente) se inocularon con una colonia individual de cepas de interés. Estos inóculos se cultivaron a 30°C con sacudimiento orbital de 220 r.p.m. a un OD60o de entre 1 y 2.
Para la producción de a-santaleno, 10% (v/v) de dodecano se agregó al cultivo principal a una ODSoo de 1 para capturar a-santaleno en la fase orgánica. Esta capa de dodecano se sometió a muestra y se diluyó en decano para la determinación de la producción de a-santaleno por GC-MS.
Se analizó a-santaleno por espectrometría de masas-cromatografía de gas (Thermo Scientific, altham, MA) equipado con una columna capilar SLB-5 ms (30 m, 0.25 mm i.d., 0.25 pm de espesor de película; Supelco, Bellefonte, PA, USA) . El gas portador fue helio a un flujo constante de 1.2 ml/min. Se usó un inyector sin división dividida en el modelo sin división. La temperatura inicial del horno fue 80 °C y la temperatura del inyector fue 250 °C. La temperatura del horno se incrementó a 120°C a una velocidad de 10°C/min y se incrementó subsecuentemente a 160°C a una velocidad de 3°C/min. Después la temperatura se elevó por un gradiente de 10°C/min a 270 °C y se mantuvo por 5 min a esta temperatura. Los espectros de masa completos se generaron por intervalo de m/ z de barrido dentro de 50-650 para identificación del metabolito. La cuant ificación de a-santaleno se llevó a cabo usando curvas estándares.
El PHB se analizó como se describe previamente (Appl . Environ. Microbiol . 1983, 46: 1339; Appl . Environ. Microbiol. 2006, 72:3412). Más de 10 mg de células se recolectaron a partir del cultivo por centrifugación (10 min, 5000 x g) . La pelotilla celular resultante se lavó una vez y se liofilizó. Las células secas se sometieron a ebullición en 1 mi de ácido sulfúrico concentrado por 60 min y después se diluyeron con 4 mi de 14 mM de H2S04. Las muestras se centrifugaron (15 min, 16,000 x g) para remover los desechos celulares, y el sobrenadante se analizó por cromatografía líquida de alta presión (Dionex-HPLC, Sunnyvale, CA) equipado con una columna de inclusión iónica Aminex HPX-87H (300 x 7.8 mm; Bio-Rad Hercules, CA) y detector UV. El PHB comercialmente disponible (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) , procesado en paralelo con las muestras, se usó como un estándar. El HPLC se operó a 60°C y una velocidad de flujo de 0.6 ml/min de 5 mM de H2S04.
Para analizar los niveles de 1-butanol, se recolectaron muestras a diferentes puntos de tiempo, se centrifugaron y filtraron. Las muestras se analizaron entonces por cromatografía líquida de alta presión (Dionex-HPLC, Sunnyvale, CA) equipada con una columna de inclusión iónica Aminex HPX-87H (300 x 7.8 mm; Bio-Rad Hercules, CA) y detector RI . El 1-butanol comercialmente disponible, se usó como un estándar. La HPLC se operó a 45°C y una velocidad de flujo de 0.6 ml/min de 5 mM de H2S04.
Ej emplo 9 Evaluación de la cepa de la plataforma acetil-CoA Con el fin de evaluar la cepa de la plataforma de acetil-CoA, la producción de ot-santaleno, el cual es un sesquiterpeno que se origina naturalmente y el precursor biosintético de un a-santalol, se evaluó un constituyente importante de aceite de sándalo. Como se muestra en la Figura 4A, el santaleno se deriva directamente en una etapa enzimática única a partir de farnesil difosfato (FPP) , el precursor biológico para sesquiterpenos . Para incrementar la producción de FPP, la trayectoria de mevalonato endógeno de levadura se desreguló por la sobreexpresión del dominio catalítico de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa 1 {tHMGl) {J Biol Chem 1999, 274:316171), previamente demostró resultó en un mejoramiento de la producción de isoprenoide en levadura (Nature 2006, 440:940) . Para superar las dificultades en la expresión de los genes de plantas en levadura, el ADNc de Sts que codifica a a-santaleno sintasa fue optimizada de codón por la expresión de alto nivel en S. cerevisiae . La cepa de levadura transgénica SCYC040 (Tabla 1) , como cepa de referencia, se transformó con el plásmido pIC Ol que contiene tHMGl y Sts. En un cultivo de matraz sacudido, 2.08 mg/L de a- santaleno se produjeron después de 48 h de crecimiento (Figura 5A) . Co-expresando pICKOl con el plásmido pIYC08 que expresa ALD6, ACSSE, ADH2 y ERGIO, la producción de -santaleno se incrementó a 3.65 mg/L (Figura 5A, cepa SCYC042) . Combinando la supresión de CIT2 y coexpresión con el plásmido pIYC08 resulta en la cepa SCYC045 capaz de producir 4.98 mg/L de a-santaleno (Figura 5A) . Además, cuando el plásmido pIYC08 se co-expresó en una cepa de supresión MLS1 que resulta en la cepa SCYC046, la producción de a-santaleno se incrementó además a 8.29 mg/L (Figura 5A) , lo cual representa un mejoramiento de 4 -veces comparado con la cepa de referencia. Para evaluar además la estrategia actual y compararla con trabajos previos publicados en la sobre expresión de ACSSE Y ALD6 (Metab Eng 2007, 9: 160), estos dos genes fueron co-expresados con el plásmido pICKOl (Figura 6, cepa SCIYC41) . Los resultados mostraron que la sobre-expresión adicional de ADH2 y ERGIO conduce a un 25% de incremento en tituladores finales de OÍ-santaleno (Figura 6, cepa SCIYC42) y junto con la estrategia de bloqueo, se logró un incremento de 2 a 4 veces en la producción de a-santaleno (Figura 5A) .
Después, la producción de 1-butanol se evaluó en la cepa de plataforma de acetil-CoA. El 1-Butanol ha sido en general considerado como un reemplazo de la gasolina posible, debido a que tiene densidad de energía superior mientras es menos corrosivo y menos soluble en agua que el etanol (Wat Chem Biol 2011, 11:262) . Las reacciones y enzimas correspondientes necesarias para la producción de 1-butanol a partir de acetil-CoA son resumidas en la Figura 4B. La trayectoria sintética se ensambló eligiendo una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (Hbd) que utiliza NADH como un cofactor, una crotonasa (Crt) y un butiraldehído bifuncional y butanol deshidrogenasa (AdhE2) de Clostridium beijerinckii {Microb Cell Fact 2008, 7:8), y una trans-enoil-CoA reductasa específica de crotonil-CoA dependiente de NADH (Ter) a partir de Treponema denticola {Nat Chem Biol 2011, 7:222) . Los genes que codifican estas enzimas fueron químicamente sintetizados para ser optimizados de codón y se clonaron en el plásmido episomal, proporcionando el plásmido pAKOl de la producción de 1-butanol (Figura 4B) . Para verificar la capacidad de la trayectoria ensamblada para producir 1-butanol, cultivos de S. cerevisiae que expresan estos genes exógenos se hicieron crecer en medio mínimo con 2% de glucosa. Se observaron 2.17 mg/L de 1-butanol (Figura 4B, cepa SCAK00) lo cual es similar a las cantidades previamente producidas en S. cerevisiae (21) . La trayectoria funcional fue entonces simultáneamente co-expresada con el plásmido pIYC08 que alberga a ALD6, ACSSS, ADH2 y ERGIO (Figura 5B, cepa SCAK01) , y se alcanzó un titulador de 1-butanol de 9.40 mg/L, el cual es un incremento de ~ -veces sobre la cepa de referencia sin el diseño por ingeniería de la trayectoria de acetil-CoA (Figura 5B) . Estos resultados demuestran que es importante asegurar la provisión eficiente del precursor de acetil-CoA para la producción de butanol. La evaluación adicional de este sistema de dos plásmidos en una cepa de supresión MLS1 (Figura 5B, cepa SCAK02) resultó en un incremento de 1.7 veces adicionales en la producción de 1-butanol a 14.04 mg/L. Cuando se combina la sobre-expresión con la supresión de CIT2 resulta en una cepa (Figura 5B, cepa SCAK03) capaz de producir 16.26 mg/L de 1-butanol, el nivel de producción es cercanamente 8 veces superior que el reportado previamente (Microb Cell Fact 2008, 7:8).
La cepa de plataforma de acetil-CoA fue finalmente examinada para la producción de PHB, un miembro de una familia de biopolímeros biodegradables comercialmente interesantes (Microbiol Mol Biol Rev 1999, 63:21). Para la producción de PHB en S. cerevisiae, la trayectoria sintética fue implementada por la transformación de una trayectoria de tres genes a partir de Ralstonia eutropha para la biosíntesis del monómero (phaA y phaB) y polimerización (PhaC) (J" Biol Chem 1989, 264: 15293; J" Biol Chem 1989, 264: 15298; J Biotechnol 2006, 124:561). Los genes optimizados de codón, sintéticos, que codifican phaA, pHaB y phaC fueron clonados en un vector de expresión individual, resultando en pPHB-pha (Figura 4C) . La expresión de la trayectoria sintética en la cepa de referencia resultó en una concentración de PHB de 13.39 mg/L después de 120 h de crecimiento en medio mínimo definido (Figura 5C, cepa SCKK005) . Cuando el plásmido pIYC08 que incluye ALD6, ACSSE, ADH2 y ERGIO fue co-expresado con el vector de producción de PHB, el PHB se acumuló a 240.99 mg/L, que representa un incremento de 18 veces comparado con la cepa de referencia (Figura 5 C, cepa SCKK006) (J" Biotechnol 2006, 124:561). La co-expresión simultánea de estos dos plásmidos en una cepa con ya sea la supresión CIT2 o supresión MLS1, sin embargo, no mejora la producción de PHB además, mostrando que la estrategia de bloqueo no funciona para la producción de PHB (Figura 5C, cepa SCKK09 y SCKK10) . Esto es probablemente debido al hecho de que en las fermentaciones de lote usadas aquí para evaluar la producción de PHB, el PHB es principalmente producido en la fase de etanol del cambio diauxíco. Las cepas que llevan las supresiones de CIT2 o MLS1 son incapaces de crecer en un compuesto de C2 tal como etanol y acetato como la única fuente de carbono, y estas cepas pueden por lo tanto no proporcionar la energía libre Gibbs necesaria y equivalentes redox para la producción de PHB en la fase de crecimiento de etanol.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: .
1. Una célula de levadura modificada por la sobreexpresión de una aldehido deshidrogenasa y una acetil-CoA sintetasa (ACS) , caracterizada porque una alcohol deshidrogenasa y una acetoacetil-CoA sintasa son además sobreexpresadas .
2. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un gen que codifica una citrato sintasa peroxisomal o un gen que codifica una malato sintasa citosólica ha sido suprimido a partir del genoma de la célula de levadura.
3. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque tal célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae .
4. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la aldehido deshidrogenasa es ALD6, la alcohol deshidrogenasa es ADH2, la acetoacetil-CoA sintasa es ERGIO, la citrato sintasa peroxisomal es CIT2 y la malato sintasa citosólica es MLS1.
5. Una célula de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la ACS contiene una mutación de punto que previene a la enzima de ser inhibida por acetilación.
6. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la ACS es la variante L614P a partir de Salmonella entérica.
7. Un método para elaborar una célula de levadura modificada que comprende la sobre-expresión de una aldehido deshidrogenasa y una acetil-CoA sintasa (ACS) , caracterizado porque además comprende sobre-expresar una alcohol deshidrogenasa y una acetoacetil-CoA sintasa.
8. Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende suprimir un gen que codifica una citrato sintasa peroxisomal o un gen que codifica una malato sintasa citosólica a partir del genoma de la célula de levadura.
9. Un método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque tal célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae .
10. Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la aldehido deshidrogenasa es ALD6, la alcohol deshidrogenasa es ADH2, la acetoacetil-CoA sintasa es ERGIO, la citrato sintasa peroxisomal es CIT2 y la malato sintasa citosólica es MLSl.
11. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la ACS es como se define de conformidad con la reivindicación 5 o 6.
12. Un método para producir niveles incrementados de un producto derivado de acetil-CoA, caracterizado porque comprende cultivar la célula de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la cual es capaz de producir tal producto, bajo condiciones que conducen a la producción de tal producto.
13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el producto se deriva de acetoacetil-CoA .
14. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque tal producto se selecciona a partir del grupo que consiste de terpenoides, 1-butanol y poli-hidroxi butirato.
15. Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque tal terpenoide es a-santaleno.
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