KR20220002889A - 고도로 특이적인 d-락테이트 옥시다제를 사용한 유기 폐기물 가공 - Google Patents

고도로 특이적인 d-락테이트 옥시다제를 사용한 유기 폐기물 가공 Download PDF

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Abstract

D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물, 특히 혼합 음식 폐기물을 가공하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. D-락테이트 옥시다제는 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거한다. 가공된 유기 폐기물은 광학적으로 순수한 L-락트산 생산과 같은, 산업 발효 공정에서 기질로 사용할 수 있다. 또한, 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 시스템 및 방법으로서, 유기 폐기물에 내인성으로 존재하는 D-락트산이 D-락테이트 옥시다제를 사용하여 제거되는 시스템 및 방법이 제공된다.

Description

고도로 특이적인 D-락테이트 옥시다제를 사용한 유기 폐기물 가공
본 발명은 D-락테이트 옥시다제를 이용하여 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하는 유기 폐기물(organic waste) 가공 시스템 및 방법에 관한 것이다. 가공된 폐기물은 광학적으로 순수한 L-락트산 생산(production)과 같은 산업 발효 공정에서 기질로 사용될 수 있다.
락트산 발효
락트산 발효, 즉 미생물 발효를 통해 탄수화물 공급원으로부터 락트산을 생산하는 것은 바이오 플라스틱 제조에서 빌딩 블록으로 락트산을 사용할 수 있는 가능성으로 인해 최근 몇 년 동안 관심을 받고 있다. 락트산은 중합되어 생분해성 및 재활용 가능한 폴리에스테르 폴리락트산 (PLA)을 형성할 수 있으며, 이는 석유로부터 제조된 플라스틱의 잠재적인 대체물로 고려된다. PLA는 음식 포장재, 일회용품, 섬유 및 위생 용품 산업의 섬유 등 다양한 제품의 제조에 사용된다.
발효 생물공정에 의한 락트산의 생산은 환경 문제, 비용 및 대부분의 산업적 적용에 요구되는 화학적 합성에 의해 거울상이성질체적으로 순수한 락트산을 생산하는 어려움을 포함하는 다양한 고려사항에서 화학적 합성 방법보다 선호된다. 통상적인 발효 공정은 통상적으로 탄수화물 발효의 주요 대사 최종 산물로서 락트산을 생산하는 락트산 생산 미생물에 의한 혐기성 발효를 기반으로 한다. PLA를 생산하기 위해서는 발효 과정에서 발생하는 락트산을 발효액으로부터 분리하여 다양한 공정을 거쳐 정제한 후, 정제된 락트산을 중합반응에 적용시킨다.
락트산은 키랄 탄소 원자를 가지므로 D- 및 L-락트산의 두 가지 거울상이성질체 형태로 존재한다. 산업적 적용에 적합한 PLA를 생산하기 위해서는 중합 공정에서 하나의 거울상이성질체만을 사용해야 한다. 불순물의 존재 또는 D- 및 L-락트산의 라세미 혼합물은 낮은 결정도 및 낮은 용융 온도와 같은 바람직하지 않은 특성을 갖는 중합체를 생산한다. 따라서, L-거울상이성질체 또는 D-거울상이성질체만을 생산하는 락트산 박테리아가 일반적으로 사용된다.
현재 이용가능한 상업적 공정에서, 락트산 발효를 위한 탄수화물 공급원은 통상적으로 옥수수 및 카사바 뿌리와 같은 전분 포함 재생산 공급원이다. 셀룰로스가 다량 함유된 사탕수수 버개스(bagasse)와 같은 추가 공급원이 또한 제안되었다. 일반적으로 락트산 박테리아는 글루코스 및 프룩토스와 같은 환원 당(reducing sugar)을 이용할 수 있지만 전분 및 셀룰로스와 같은 다당류를 분해하는 능력은 없다. 따라서, 이러한 다당류를 이용하기 위해서는 일반적으로 다당류를 분해하고 환원 당을 방출하기 위해 화학 처리와 조합하여 공정에 해당 효소를 첨가해야 한다.
제안된 락트산 발효를 위한 탄수화물의 추가 공급원은 혼합 음식 폐기물과 같은 복합 유기 폐기물이다. 이러한 유기 폐기물을 발효의 기질로 이용하는 것은 인간의 음식으로서 가치가 높은 원료를 이용하는 락트산 생산 공정에 비해 매우 유리하다. 혼합 음식 폐기물에는 일반적으로 다양한 비율의 환원 당 (글루코스, 프룩토스, 락토스 등), 전분 및 목질 섬유소 물질이 포함된다. 그러나 음식 폐기물에는 또한 광학적으로 순수한 락트산 (L- 또는 D-락트산)을 생산하기 위한 기질로 폐기물을 이용하기 위해 제거해야 하는 내인성 D,L-락트산 (예를 들어, 낙농 산물 유래)이 포함되어 있다.
문헌[Sakai et al. (2004) Journal of Industrial Ecology, 7 (3-4): 63-74]은 발효와 화학 공정을 조합하여 폴리-L-락테이트 (PLLA)를 생산하는 생활 음식 폐기물 재활용 시스템에 대해 보고한다. 문헌[Sakai et al.]의 공정에는 락트산 발효 단계 이전에 락트산을 탄소 공급원으로 소모하는 프로피오니박테리움 (Propionibacterium)이 음식 폐기물로부터 내인성 D,L-락트산을 제거하는 단계가 포함된다.
본 발명의 출원인에게 양도된 WO 2017/122197은 폐기물에 존재하는 락트산을 제거하고 복합 다당류를 분해하기 위해 유기 폐기물 가공에 유용한 셀룰라제, 헤미셀룰라제 및 아밀라제와 같은 다당류 분해 효소를 분비하도록 유전자 변형된 이중 작용 락트산 (LA)-이용 박테리아를 개시하고 있다.
D-락테이트 옥시다제
D-락테이트 옥시다제는 전자 수용체로서 O2를 사용하여 D-락테이트가 피루브산 및 H2O2로 산화되는 것을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 (FAD)를 촉매 활성의 보조 인자로 사용한다.
문헌[Sheng et al. (2015) Appl Environ Microbiol., 81 (12): 4098-110]은 D-락테이트에 대한 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)의 성장에 대한 효소적 기반을 연구하였다. 문헌[Sheng et al.]은 D-락테이트 옥시다제인 GOX2071을 확인하였다. 문헌[Sheng et al.]에 따르면, GOX2071은 바이오센서 및 바이오촉매 적용 분야에 유용할 수 있다.
문헌[Sheng et al. (2016) ChemCatChem, 8 (16)]은 글루코노박터 옥시단스의 D-락테이트 옥시다제 GOX2071을 사용하여 2-하이드록시카복실산을 (S)-2-하이드록시카복실산으로의 효소적 분해를 수행하였다.
문헌[Li et al. (2017) ACS Sustainable Chem. Eng., 5 (4): 3456-3464]은 옥수수 우린 물로부터 분리된 라세미 락테이트로부터 가치 있는 플랫폼 화학물질을 생산하기 위해 다양한 효소 전달계를 포함하는 시험관내 효소 시스템을 합성하기 위해 글루코노박터 옥시단스의 D-락테이트 옥시다제 (D-LOX), 페디오코쿠스 종 (Pediococcus sp.)의 L-락테이트 옥시다제 (L-LOX), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 피루베이트 데카복실라제, 소 간의 카탈라제를 사용하였다.
CN 104745544는 글루코노박터 옥시단스로부터의 D-락테이트 옥시다제 GOX2071 및 D-락트산의 검출에서의 그의 적용을 개시한다.
CN 106636022, CN 106701701, CN 106701702, CN 106701705 및
CN 106754793은 광학적으로 순수한 (S)-알파-하이드록시산 에스테르를 제조하는데 유용한 다양한 미생물로부터의 D-락테이트 옥시다제를 개시하고 있다.
음식 폐기물과 같은 유기 폐기물로부터의 D-락트산을 제거하기 위한 D-락테이트 옥시다제의 사용은 개시되거나 제안된 바 없다. 또한, 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하기 위해 유기 폐기물의 산업적 발효 공정에서 D-락테이트 옥시다제를 조합하는 것 또한 개시되거나 제안된 바 없다.
광학적으로 순수한 락트산의 생산과 같은 산업적 발효 공정에서 유기 폐기물이 기질로 사용될 수 있도록 유기 폐기물을 가공하기 위한 보다 비용 효과적이고 효율적인 시스템 및 방법이 필요하다.
본 발명은 선택적으로 하나 이상의 다당류 분해 효소와 함께 D-락테이트 옥시다제를 사용하여 상업적 규모로 유기 폐기물을 가공하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 D-락테이트 옥시다제를 사용하여 폐기물에 내인성으로 존재하는 D-락트산을 제거하는, 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 시스템 및 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유기 폐기물은 다양한 형태 및 공급원의 음식 폐기물뿐만 아니라 농업 폐기물, 산업 유기 폐기물 등을 포함한다. 본 발명에 따른 유기 폐기물은, 예를 들어 자연 발효 과정에서 유래된 내인성 D, L-락트산을 포함한다. 유기 폐기물은 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 이의 조합을 포함하는 복합 다당류를 추가로 포함한다.
본 발명은 음식 폐기물과 같은 유기 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기 위한 D-락테이트 옥시다제의 용도를 처음으로 개시한다.
본 발명은 부분적으로 D-락테이트 옥시다제가 정확한 조성은 알 수 없고 배치마다 다르며 가능한 억제제 및 효소에 부정적인 영향을 줄 수 있는 기타 요인을 포함하는 유기 폐기물, 특히 점성이 있고 고도로 복합적인 기질인 다양한 유형 및 공급원의 혼합 음식 폐기물과 같은 원료 기질에 대해 효과적으로 작용할 수 있다는 발견에 기반한다. 지금까지 D-락테이트 옥시다제를 사용한 실험은 완충 용액에서만 활성을 시험하였다.
본 발명은 또한 완충 용액과 비교하여 유기 폐기물에서 상기 효소가 놀랍게도 개선된 활성을 나타내고 효소가 활성이고 D-락테이트를 효과적으로 제거하는 더 넓은 범위의 조건을 특징으로 한다는 발견에 기반한다. 더욱 구체적으로, 상기 효소는 이전에 활성과 안정성을 상실하는 것으로 보고된 산성 pH 값과 더 넓은 온도 범위에서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은 유기 폐기물은 일반적으로 산성이고 또한 일반적으로 산성 pH에서 작용하는 아밀라제 및 셀룰라제와 같은 다당류 분해 효소에 의해 당화(saccharifying)되어야 하기 때문에 유기 폐기물을 기질로 사용하는 산업 발효 공정에 특히 유리한다. 따라서 상기 효소는 다양한 pH의 다양한 유기 폐기물의 산업적 가공 및 발효에 유용하다. 또한, 상기 효소는 잠재적으로 유기 폐기물로부터 락트산을 생산하는 공정의 다른 시점에서 사용될 수 있으며, 폐기물의 당화와 같은 다른 단계와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 D-락테이트 옥시다제가 D-락테이트에 비해 유의하게 과량의 L-락테이트가 존재하는 경우에도 D-락테이트를 효과적으로 제거한다는 발견에 기반한다. 이는 발효 전 또는 후에 효소를 사용할 수 있게 하여 산업적 이용에 있어 더 큰 유연성을 제공한다.
또한, D-락테이트 옥시다제가 글루코아밀라제와 같은 다당류 분해효소와 조합될 때 그 활성이 더욱 향상되어 다당류 분해 효소와 조합하지 않을 때 필요한 양과 비교하여 D-락테이트 옥시다제의 더 적은 양을 사용할 수 있음을 발견하였다. 또한 D-락테이트 옥시다제를 글루코아밀라제와 같은 다당류 분해효소와 조합하면 이 공정에는 더 낮은 정도의 기질 (유기 폐기물)의 희석이 요구될 수 있다. 특정 이론이나 작용 기전에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 다당류 분해 효소의 존재 하에 D-락테이트 옥시다제의 개선된 활성은 폐기물에 존재하는 다당류 (예를 들어, 전분)에서 가용성 당으로의 분해 시 폐기물의 감소된 점성에서 비롯되는 것으로 고려된다.
유리하게는, D-락테이트 옥시다제는 D-락트산에 대해 고도로 특이적이며, L-락트산은 실질적으로 상기 효소에 의해 소모되지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 공정에서는 유기 폐기물에 존재하는 내인성 L-락트산이 유지되고, 발효에 의해 생산된 L-락트산과 함께 하류 공정에서 정제되어 전체 L-락트산 발효 수율을 증가시킨다.
또한, 상기 효소는 매우 효율적인 방식으로 D-락테이트에서 피루베이트 (및 H2O2)로의 전환을 촉매하여 광학적으로 순수한 L-락트산 생산에 특히 중요한 D-락트산의 거의 완전 또는 심지어 완전한 제거를 가능하게 한다.
추가 이점으로서, 유기 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기 위한 D-락테이트 옥시다제의 사용은 앞서 기재된 바와 같이 락트산-이용 박테리아의 발효를 수행할 필요를 방지함으로써 운영 지출 (OPEX) 및 자본 지출 (CAPEX)을 포함하여 수반되는 비용을 유의하게 감소시킨다.
일 양상에 따르면, 본 발명은 유기 폐기물을 가공하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(i) 유기 폐기물을 제공하는 단계; 및
(ii) 유기 폐기물을 D-락테이트 옥시다제로 분해(digesting)하여 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하는 단계
를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 음식 폐기물, 생활 폐기물, 농업 폐기물, 식물 재료 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
일부 특정 실시양태에서, 유기 폐기물은 음식 폐기물이다. 본 발명에 따른 음식 폐기물은 식물 유래의 음식 폐기물을 포함한다. 본 발명에 따른 음식 폐기물은 가정 음식 폐기물, 상업 음식 폐기물 및 산업 음식 폐기물을 포함한다. 본 발명에 따른 식물 재료는 농업 폐기물 및 종이 폐기물과 같은 인공 산물을 포함한다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 옥시단스로부터 유래된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, D-락테이트 옥시다아제와 유기 폐기물의 접촉은 폐기물에서 D-락트산을 제거하기에 충분한 시간 동안 D-락테이트 옥시다아제가 활성이고 D-락트산을 효율적으로 제거하는 (즉, D-락트산을 피루브산 및 H2O2로 전환시키는) 조건 하에 수행된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "효소가 활성인 조건"은 소정의 산업적 공정에 충분한 수준에서 효소가 그의 촉매 활성을 효과적으로 수행하는 온도 및 pH와 같은 조건을 지칭한다. 이러한 조건은 또한 본 명세서에서 "적합한 조건"으로 지칭되며, 상기 용어는 최적 조건을 포함한다. 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 유기 폐기물 중 D-락테이트 옥시다제의 활성이 이 효소에 대해 이전에 보고된 조건과 비교하여 더 넓은 범위의 온도 및 pH를 특징으로 한다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 일부 실시양태에서, 온도 범위는 25 내지 60℃이다. 일부 실시양태에서, pH 범위는 5.5 내지 8이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 유기 폐기물로부터의 D-락트산을 지칭할 때 "제거"는 L-락트산을 생산하고 후속적으로 산업 적용에 적합한 폴리락트산으로 중합하는 하류 공정에 영향이 없도록 잔류량을 감소시키는 것을 지칭한다. "잔류량"은 발효 종료 시 총 락테이트 (L+D) 중 1% 미만의 락트산, 더욱 더 바람직하게는 0.5% 미만의 D-락트산 (w/w)을 나타낸다. 일부 특정 실시양태에서, D-락트산의 제거는 발효 종료 시 총 락테이트 중 0.5% 미만의 D-락트산 (w/w)으로의 감소이다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 25 내지 60℃의 범위의 온도에서 수행된다. 추가의 실시양태에서, 접촉은 37 내지 55℃의 범위의 온도에서 수행된다. 추가의 실시양태에서, 접촉은 45 내지 55℃의 범위의 온도에서 수행된다. 일부 특정 실시양태에서, 접촉은 55℃에서 수행된다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 5.5 내지 7의 범위의 pH에서 수행된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 6 내지 7의 범위의 pH에서 수행된다. 일부 특정 실시양태에서, 접촉은 pH=6에서 수행된다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 6 내지 48시간의 범위의 시간 기간 동안 수행된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 6 내지 12시간의 범위의 시간 기간 동안 수행된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 24 내지 48시간의 범위의 시간 기간 동안 수행된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 24 내지 36시간의 범위의 시간 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 유기 폐기물과 하나 이상의 당류 분해 효소의 접촉을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 유기 폐기물 내의 다당류를 분해하여 환원 당을 방출시키기 위해 (유기 폐기물의 당화) 유기 폐기물과 접촉되는 다당류 분해 효소이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 다당류 분해 효소는 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 특정 실시양태에서, 하나 이상의 다당류 분해 효소는 글루코아밀라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 유기 폐기물과 D-락테이트 옥시다제 및 글루코아밀라제의 접촉을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소, 예를 들어, 다당류 분해 효소와의 접촉, 및 D-락테이트 옥시다제와의 접촉은 부수적으로 (동시에) 수행된다. 이러한 실시양태에 따르면, D-락트산의 제거 및 유기 폐기물의 당화는 부수적으로 (동시에) 수행된다. 동시에 이루어지는 D-락트산 제거 및 당화는 동일한 pH 및 온도 범위에서 활성인 D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 다당류 분해 효소에 의해 가능하다. 따라서, 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 다당류 분해 효소는 동일한 pH 및 온도 범위에서 활성이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 다당류 분해 효소가 활성인 온도 및 pH에서 유기 폐기물과 D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 다당류 분해 효소의 접촉을 포함한다. 접촉은 폐기물로부터 D-락트산을 제거하고 적절한 수준의 가용성 환원 당을 수득하기에 충분한 시간 동안 수행된다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소, 예를 들어, 다당류 분해 효소와의 접촉 및 D-락테이트 옥시다제와의 접촉은 임의의 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 특정 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소, 예를 들어, 다당류 분해 효소와의 접촉은 D-락테이트 옥시다제와의 접촉 전에 수행된다.
다른 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 다당류 분해 효소는 상이한 pH 및/또는 온도 범위에서 활성이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (1) 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기에 충분한 시간 동안 D-락테이트 옥시다제의 활성에 적합한 제1 온도에서 유기 폐기물을 D-락테이트 옥시다제와 접촉시키는 단계; 및 (2) 하나 이상의 당류 분해 효소, 예를 들어 다당류 분해 효소의 활성에 적합한 제2 온도로 온도를 조정 (예를 들어, 증가)하고, 적절한 수준의 가용성 환원 당을 수득하기에 충분한 시간 동안 유기 폐기물과 하나 이상의 다당류 분해를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (1) 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기에 충분한 시간 동안 D-락테이트 옥시다제의 활성에 적합한 제1 pH에서 유기 폐기물을 D-락테이트 옥시다제와 접촉시키는 단계; 및 (2) 당류 분해 효소, 예를 들어 다당류 분해 효소의 활성에 적합한 제2 pH로 pH를 조정 (예를 들어, 감소)하고, 적절한 수준의 가용성 환원 당을 수득하기에 충분한 시간 동안 유기 폐기물과 하나 이상의 다당류 분해를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (1) 적절한 수준의 가용성 환원 당을 수득하기에 충분한 시간 동안 하나 이상의 당류 분해 효소의 활성에 적합한 제1 온도에서 유기 폐기물과 하나 이상의 당류 분해 효소, 예를 들어, 다당류 분해 효소를 접촉시키는 단계; 및 (2) D-락테이트 옥시다제의 활성에 적합한 제2 온도로 온도를 조정 (예를 들어, 증가)하고, 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기에 충분한 시간 동안 유기 폐기물과 D-락테이트 옥시다제를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (1) 적절한 수준의 가용성 환원 당을 수득하기에 충분한 시간 동안 하나 이상의 당류 분해 효소의 활성에 적합한 제1 pH에서 유기 폐기물과 하나 이상의 당류 분해 효소, 예를 들어, 다당류 분해 효소를 접촉시키는 단계; 및 (2) D-락테이트 옥시다제의 활성에 적합한 제2 pH로 pH를 조정 (예를 들어, 증가)하고, 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기에 충분한 시간 동안 유기 폐기물과 D-락테이트 옥시다제를 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 유기 폐기물을 가공하는 시스템을 제공하고, 상기 시스템은
(a) 유기 폐기물의 공급원; 및
(b) D-락테이트 옥시다제
를 포함하고,
D-락테이트 옥시다제는 유기 폐기물과 혼합되고 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거한다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 25 내지 60℃의 범위의 온도에서 유기 폐기물과 혼합된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 37 내지 55℃의 범위의 온도에서 유기 폐기물과 혼합된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 45 내지 55℃의 범위의 온도에서 유기 폐기물과 혼합된다. 일부 특정 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와의 혼합은 55℃에서 수행된다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 5.5 내지 7의 범위의 pH에서 유기 폐기물과 혼합된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 6 내지 7의 범위의 pH에서 유기 폐기물과 혼합된다. 일부 특정 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제와의 혼합은 pH=6에서 수행된다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 6 내지 48시간의 범위의 시간 기간 동안 유기 폐기물과 혼합된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 6 내지 12시간의 범위의 시간 기간 동안 유기 폐기물과 혼합된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 24 내지 48시간의 범위의 시간 기간 동안 유기 폐기물과 혼합된다. 추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 24 내지 36시간의 범위의 시간 기간 동안 유기 폐기물과 혼합된다.
일부 실시양태에서, 본 시스템은 유기 폐기물과 혼합되고 유기 폐기물 내의 다당류를 분해하여 환원 당을 방출시키는 (유기 폐기물의 당화) 하나 이상의 당류 분해 효소, 예를 들어, 다당류 분해 효소를 추가로 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본 시스템은 D-락테이트 옥시다제 및 글루코아밀라제를 포함한다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해 효소는 유기 폐기물과 부수적으로 (동시에) 혼합된다. 다른 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해 효소는 유기 폐기물과 임의의 순서로 순차적으로 혼합된다.
유리하게는, 이하에 예시된 바와 같이, 배지에 임의의 보조인자를 첨가하지 않아도 유기 폐기물로부터 D-락트산의 효과적인 제거가 관찰되었다. 따라서, 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제에 의한 유기 폐기물의 가공은 배지에 임의의 보조인자를 첨가하지 않고 수행된다. 일부 특정 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제에 의한 유기 폐기물의 가공은 FAD를 첨가하지 않고 수행된다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계; 및 (ii) L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계는 L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계 전에 수행된다.
다른 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계는 L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계 후에 수행된다.
추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계는 L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계와 동시에 수행된다.
본 발명에 따라 사용되는 유기 폐기물은 통상적으로 입자 크기의 감소 및 표면적의 증가, 및 선택적으로 폐기물 내의 내인성 박테리아의 불활성화를 포함하는 전처리를 거친 유기 폐기물이다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명에서 사용되는 유기 폐기물은 종이 또는 플라스틱 포장 재료와 같은 유기 및 무기 성분을 포함할 수 있는 혼합 음식 폐기물이다. 이러한 실시양태에 따르면, 전처리는 예를 들어 해머 밀 (hammer mill), 액화 프레스 (liquefying press), 회전 오거 (rotating auger) 또는 스크류 프레스 (screw press)에 의해 포장 재료를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 D-락테이트 옥시다제와 접촉하기 전에 불용성 입자로부터의 정화에 적용된다.
D-락테이트 옥시다제 (및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소)로 폐기물을 가공하기 전에 전처리를 수행한다. 일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 D-락테이트 옥시다제 (및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소)로 가공하기 전에 파쇄, 분쇄 및 멸균에 적용된다. 멸균은 예를 들어 고압 증기, UV 조사 또는 초음파 처리를 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 또한 D-락테이트 옥시다제 (및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소)로 가공하기 전에 물로 희석된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전처리는 유기 폐기물을 물로 희석하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 D-락테이트 옥시다제와 접촉하기 전에 물로 희석된다. 물과의 희석은 일반적으로 1:1 희석이다. 일반적으로 35% 내지 40%의 용해된 고체를 20% 내지 25%의 고체로 희석한다.
또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(i) 유기 폐기물을 제공하는 단계;
(ii) 유기 폐기물과 D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해 효소를 접촉시킴으로써, 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하고 폐기물 내의 당류를 분해하여 가용성 환원 당을 방출시키기 위해 유기 폐기물을 가공하는 단계;
(iii) L-락트산만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 가공된 유기 폐기물을 발효시켜 L-락트산을 수득하는 단계; 및
(iv) 발효액으로부터 L-락트산을 회수하는 단계
를 포함한다.
발효액으로부터 락트산을 회수하는 단계는 통상적으로 발효액로부터 락트산의 분리 및 락트산의 정제를 포함한다. 일부 실시양태에서, L-락트산은 발효액로부터 락테이트 염으로서 회수된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "락트산 회수"는 락트산 및 락테이트 염으로서 회수하는 것을 모두 포함한다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물을 D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해효소와 접촉시키는 단계 및 가공된 유기 폐기물을 L-락트산만을 생산하는 락트산-생산 미생물로 발효시키는 단계는 동시에 수행된다.
다른 실시양태에서, 유기 폐기물을 D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해 효소와 접촉시키는 단계는 가공된 유기 폐기물을 L-락트산만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 발효시키는 단계 전에 수행된다.
또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 시스템을 제공하고,
(a) 유기 폐기물의 공급원;
(b) D-락테이트 옥시다제; 및
(c) L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물
을 포함하고,
D-락테이트 옥시다제는 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하고, 락트산 생산 미생물은 유기 폐기물을 발효시켜 L-락테이트를 생산한다.
일부 실시양태에서, 본 시스템은 하나 이상의 당류 분해 효소를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 락트산 생산 미생물은 D-락테이트 옥시다제에 의한 D-락테이트의 제거 후 및 선택적으로 유기 폐기물 내의 당류의 분해 후에 유기 폐기물과 혼합된다.
다른 실시양태에서, 동시 발효, D-락테이트의 제거 및 선택적으로 당화를 수득하기 위해 락트산 생산 미생물은 D-락테이트 옥시다제 및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소과 동시에 유기 폐기물과 혼합된다.
추가의 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 락트산 생산 미생물에 의한 발효가 완료된 후 첨가된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 시스템은
(a) 유기 폐기물의 공급원;
(b) 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하기 위한 D-락테이트 옥시다제 및 선택적으로 유기 폐기물에 존재하는 당류를 분해하기 위한 하나 이상의 당류 분해 효소를 포함하는 가공 탱크(processing tank); 및
(c) L-락트산만을 생산하는 락트산 생산 미생물을 포함하는 발효 탱크
를 포함하고,
유기 폐기물은 가공 탱크에서 D-락테이트 옥시다제 및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소에 의해 가공되고 가공된 폐기물은 L-락트산의 생산을 위해 발효 탱크로 전달된다.
본 명세서에 기재된 각각의 가공 및 발효 탱크는 탱크 내부의 온도 및 pH를 제어 및 변형할 수 있고, 또한 혼합/교반이 가능하다.
본 발명의 시스템은 일반적으로 전처리 단위, 고체/액체 분리 단위, 종자 발효기 및 세척 단위와 같은 추가 작용 단위뿐만 아니라, 예를 들어 유기 폐기물을 가공 탱크로, 이어서 발효 탱크로 공급하기 위한 다양한 작용 단위를 연결하는 단위를 추가로 포함한다. 본 시스템은 또한 발효액로부터 L-락트산을 회수하기 위한 작용 단위을 포함할 수 있다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은 D-락테이트 옥시다제를 발현하는 핵산 작제물(nucleic acid construct)로서, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터(promoter)를 포함하는 적어도 하나의 조절 서열(regulatory sequence)에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 9에 제시된 바와 같은 D-락테이트 옥시다제를 암호화(encoding)하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 핵산 작제물은 서열번호 3에 제시된 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 9에 제시된 바와 같은 D-락테이트 옥시다제를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 핵산 작제물은 서열번호 4에 제시된 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 9에 제시된 바와 같은 D-락테이트 옥시다제를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 핵산 작제물은 서열번호 5에 제시된 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 9에 제시된 바와 같은 D-락테이트 옥시다제를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 작제물은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 이하의 설명, 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다.
도 1. 글루코노박터 옥시단스 유래의 재조합 D-락테이트 옥시다제에 의한 완충액 (A)에 용해된 순수한 D-락테이트 및 유기 폐기물 (B)에 존재하는 D-락테이트의 분해.
도 2. 상이한 농도의 D-락테이트 옥시다제에 의한 유기 폐기물에 존재하는 D-락테이트의 분해.
도 3. 물로 1:1 또는 4:1로 희석된 유기 폐기물에 존재하는 D-락테이트의 분해.
도 4. D-락테이트 옥시다아제와 글루코아밀라제의 조합.
도 5. 상이한 pH (A) 및 상이한 온도 (B)에서 유기 폐기물에 대한 D-락테이트 옥시다제의 활성.
도 6. 유기 폐기물의 원심분리 후 수득된 상청액에 대한 D-락테이트 옥시다제의 활성. (A) pH=6 또는 pH=7, 30℃; (B) pH=6 또는 pH=7, 55℃.
도 7. 락트산 발효 전 및 후의 유기 폐기물에 존재하는 D-락테이트의 분해. (A) 다른 농도의 D-락테이트 옥시다제와 함께 유기 폐기물의 24시간 인큐베이션; (B) 0.92 mg/ml의 D-락테이트 옥시다제와 함께 유기 폐기물을 인큐베이션한 후 시간 경과에 따른 D-락테이트의 변화; (C) 유기 폐기물의 원심분리 후 수득된 상청액과 함께 D-락테이트 옥시다제의 26시간 인큐베이션.
도 8. D-락테이트 옥시다제의 발현.
도 9. 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산된 정제된 D-락테이트 옥시다제와 비교하여 항시적 프로모터 하에 D-락테이트 옥시다제를 발현하는 E. 콜라이 (E. coli)의 박테리아 용해물에 의한 D-락테이트의 분해.
본 발명은 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기 위해 D-락테이트 옥시다제를 이용하는 유기 폐기물 가공 시스템 및 방법을 제공한다. 그 후 가공된 폐기물은 광학적으로 순수한 L-락트산 생산과 같은 산업 발효 공정의 기질로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하기 위해 유기 폐기물을 가공하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 유기 폐기물을 제공하는 단계; 및 유기 폐기물을 D-락테이트 옥시다제와 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명의 시스템 및 방법과 함께 사용하기 위한 유기 폐기물은 일부 실시양태에서 음식 폐기물, 생활 폐기물, 농업 폐기물, 식물 재료 및 이의 조합을 포함한다. 본 발명에 따른 음식 폐기물은 식물 유래의 음식 폐기물을 포함한다. 본 발명에 따른 음식 폐기물은 가정 음식 폐기물, 상업 음식 폐기물 및 산업 음식 폐기물을 포함한다. 유기 음식 폐기물은 채소 및 과일 잔류물, 식물, 조리된 음식, 단백질 잔류물, 도축 폐기물 및 이의 조합에서 유래할 수 있다. 산업 유기 음식 폐기물에는 공장 폐기물, 예컨대 부산물, 공장 불합격 제품, 시장 반품 또는 먹을 수 없는 음식 부분 (예를 들어, 껍질)의 장식이 포함될 수 있다. 상업 유기 음식 폐기물에는 쇼핑몰, 식당, 슈퍼마켓 등에서 나오는 폐기물이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 식물 재료는 농업 폐기물 및 종이 폐기물과 같은 인공 제품을 포함한다.
본 발명에 따른 유기 폐기물은 예를 들어 낙농 산물과 같은 자연 발효 공정에서 유래하는 내인성 D,L-락트산을 포함한다. 유기 폐기물은 통상적으로 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 이의 조합을 포함하는 복합 다당류를 추가로 포함한다.
혼합 음식 폐기물은 불균질하고 따라서 발효에 필요한 미네랄 및 비타민의 대부분을 포함할 것이기 때문에 이를 기질로 사용하는 것은 대규모 산업 발효에 특히 적합하다. 또한, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 낮은 화석 연료 사용량을 나타내고, 공급원료로 작물을 재배하기 위해 유의한 경작지를 사용하지 않으며, GHG 배출과 마찬가지로 물 사용량이 낮고, 더 나아가 수득되는 산물 생분해성이므로 현재 사용되는 방법에 비해 유리한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "락트산"은 화학식 CH3CH(OH)CO2H를 갖는 하이드록시카복실산을 지칭한다. 락트산 또는 락테이트 (하나의 양성자가 없는 락트산)이라는 용어는 락트산의 입체이성질체: L-락트산, D-락트산 또는 이의 조합을 지칭할 수 있다.
본 발명에 따라 가공되는 유기 폐기물은 내인성 D,L-락트산을 포함한다. 락트산을 산업적 적용에 적합한 폴리락트산으로 중합하기 위해 락트산은 광학적으로 적어도 약 95% 순수해야 하며, 바람직하게는 광학적으로 적어도 약 99% 순수해야 한다. 따라서, 유기 폐기물을 광학적으로 순수한 L-락트산 생산을 위한 기질로 이용하기 위해서는 락트산 발효 전에 적어도 부적절한 D-락트산을 선택적으로 제거하는 것이 필요하다. 유기 폐기물에서 적어도 부적절한 거울상이성질체의 제거는 공급원료의 총 당 함량에 대한 영향을 최소화하면서 수행되어야 한다.
본 발명은 D-락테이트 옥시다제로 유기 폐기물을 가공함으로써 이러한 요구를 가공한다.
"D-락테이트 옥시다제"는 전자 수용체로서 O2를 사용하여 D-락테이트에서 피루베이트 및 H2O2로의 산화를 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 (FAD)를 촉매 활성의 보조 인자로 사용한다. 본 발명에 따른 D-락테이트 옥시다아제는 통상적으로 가용성 D-락테이트 옥시다아제 (막 결합이 아님)이다. 유리하게는, 상기 효소는 유기 폐기물에 직접 작용하여 D-락트산을 제거한다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 종으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 옥시단스로부터 유래된다 (예를 들어, GenBank 수탁 번호: AAW61807 참조). 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 75% 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 75% 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
서열번호 1:
MPEPVMTASSASAPDRLQAVLKALQPVMGERISTAPSVREEHSHGEAMNASNLPEAVVFAESTQDVATVLRHCHEWRVPVVAFGAGTSVEGHVVPPEQAISLDLSRMTGIVDLNAEDLDCRVQAGITRQTLNVEIRDTGLFFPVDPGGEATIGGMCATRASGTAAVRYGTMKENVLGLTVVLATGEIIRTGGRVRKSSTGYDLTSLFVGSEGTLGIITEVQLRLHGRPDSVSAAICQFESLHDAIQTAMEIIQCGIPITRVELMDSVQMAASIQYSGLNEYQPLTTLFFEFTGSPAAVREQVETTEAIASGNNGLGFAWAESPEDRTRLWKARHDAYWAAKAIVPDARVISTDCIVPISRLGELIEGVHRDIEASGLRAPLLGHVGDGNFHTLIITDDTPEGHQQALDLDRKIVARALSLNGSCSGEHGVGMGKLEFLETEHGPGSLSVMRALKNTMDPHHILNPGKLLPPGAVYTG
D-락테이트 옥시다제를 암호화하는 글루코노박터 옥시단스로부터의 핵산 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다.
서열번호 2:
ATGCCGGAACCAGTCATGACCGCCTCTTCCGCCTCCGCTCCGGACCGCCTTCAGGCCGTTCTCAAAGCCCTCCAGCCCGTCATGGGTGAGCGGATCAGCACGGCACCCTCCGTTCGCGAAGAGCACAGCCACGGCGAGGCCATGAATGCCTCCAACCTGCCCGAGGCGGTGGTGTTTGCTGAAAGTACTCAGGATGTCGCAACCGTCCTGCGGCACTGCCATGAATGGCGCGTTCCGGTCGTGGCGTTCGGCGCTGGCACGTCCGTCGAAGGTCATGTCGTGCCGCCCGAACAGGCCATCAGCCTCGATCTGTCACGCATGACGGGGATCGTGGACCTGAACGCCGAGGATCTGGATTGCCGGGTCCAAGCCGGCATCACGCGCCAGACGCTGAATGTTGAAATCCGCGATACGGGCCTGTTCTTTCCGGTCGATCCGGGTGGGGAAGCTACGATCGGCGGTATGTGCGCCACCCGCGCCTCGGGCACGGCCGCCGTACGCTACGGCACGATGAAAGAAAATGTGCTGGGCCTGACGGTTGTTCTCGCGACCGGCGAAATCATCCGCACAGGTGGCCGCGTCCGCAAATCGTCCACCGGCTATGACCTGACATCGCTGTTCGTCGGCTCGGAAGGTACGCTCGGGATCATCACCGAAGTCCAGCTCCGTCTGCATGGGCGTCCAGACAGTGTTTCGGCCGCGATCTGCCAATTCGAAAGCCTGCATGACGCCATCCAGACTGCCATGGAAATCATCCAGTGCGGCATCCCCATCACCCGCGTGGAACTGATGGACAGCGTGCAGATGGCAGCTTCCATCCAGTATTCCGGCCTGAACGAATATCAGCCGCTGACCACGCTGTTTTTCGAGTTCACAGGCTCGCCCGCAGCGGTACGCGAGCAGGTCGAGACGACCGAAGCCATTGCGTCCGGCAATAACGGGCTTGGCTTTGCCTGGGCCGAAAGTCCCGAAGACCGCACCCGCCTCTGGAAAGCGCGGCATGACGCCTACTGGGCGGCCAAGGCCATCGTTCCGGATGCGCGCGTCATTTCCACAGACTGCATCGTCCCGATTTCCCGTCTGGGCGAACTGATCGAGGGCGTGCATCGCGATATCGAGGCCTCCGGCCTGCGCGCGCCCCTTCTGGGCCATGTGGGGGACGGCAATTTCCATACGCTCATCATCACGGACGACACCCCCGAAGGGCATCAGCAGGCCCTCGATCTGGACCGGAAGATCGTAGCCCGCGCCCTTTCGCTGAACGGGTCGTGCAGCGGGGAACATGGTGTCGGCATGGGCAAGCTGGAGTTTCTGGAAACCGAGCATGGGCCTGGAAGCCTCAGCGTGATGCGCGCCCTGAAGAACACGATGGATCCGCACCATATCCTCAATCCCGGCAAGCTCCTTCCGCCCGGTGCTGTTTACACGGGCTGA
본 발명에 따른 D-락테이트 옥시다제는 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 또는 진균에서 재조합 생산에 의해 수득될 수 있다.
D-락테이트 옥시다제의 예시적인 생산 시스템:
1) E. 콜라이 생산: 상기 효소는 비분비 단백질로 발현된다. 숙주 세포는 파괴되고 세포 파편은 예를 들어 여과에 의해 제거된다 (바이오매스는 락트산 생산을 위한 영양소로 공정에서 재활용될 수 있음). 상기 효소는 정제되거나 대안적으로 미정제 상청액이 그대로 사용된다.
2) 진균 또는 효모 생산 (예를 들어, 아스퍼길루스 니거 (Aspergillus niger), 마이셀리오프토라 서모필라 (Myceliophthora thermophila) 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서의 생산, 각각의 가능성은 별개의 실시양태를 나타냄): 상기 효소는 분비된 단백질로 발현된다. 숙주 세포는 예를 들어 여과에 의해 제거된다 (및 선택적으로 상기와 같이 재활용됨). 상기 효소는 정제되거나 대안적으로 미정제 효소 상청액이 그대로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "D-락테이트 옥시다제"는 D-락테이트 옥시다제를 재조합적으로 발현하는 미생물의 미정제 상청액, 예를 들어 D-락테이트 옥시다제를 발현하는 E. 콜라이, A. 니거, M. 서모필라 또는 피치아 파스토리스의 미정제 상청액 및 정제된 효소를 포함한다. 비-분비 단백질로서 D-락테이트 옥시다제를 발현하는 박테리아의 미정제 상청액은 또한 본 명세서에서 박테리아의 "용해물" 또는 "박테리아 용해물"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 D-락테이트 옥시다제를 발현시키기 위한, 특히 E. 콜라이에서 D-락테이트 옥시다제를 발현시키기 위한 핵산 작제물로서, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 9에 제시된 바와 같은 D-락테이트 옥시다제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "핵산 작제물"은 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 대상 단백질이 표적 숙주 세포에서 발현되도록 조립된 인공적으로 조립되거나 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 작제물은 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 적절한 조절 서열을 포함한다. 핵산 작제물은 정제 태그/펩타이드/단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 더 큰 작제물의 성분 또는 별도의 단편 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA), 리보뉴클레오타이드 (RNA) 및 이의 변형된 형태의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에 사용된다. 핵산 서열은 코딩 서열, 즉 단백질과 같은 세포의 최종 산물을 암호화하는 서열일 수 있다. 핵산 서열은 또한 예를 들어 프로모터와 같은 조절 서열일 수 있다.
용어 "조절 서열"은 프로모터와 같은 코딩 서열의 발현 (전사)을 제어하는 DNA 서열을 지칭한다.
"프로모터"라는 용어는 생체내 또는 시험관내에서 또 다른 DNA 서열의 전사를 제어하거나 유도하는 조절 DNA 서열에 관한 것이다. 일반적으로 프로모터는 전사된 서열의 5' 영역에 위치한다 (즉, 선행, 상류 위치). 프로모터는 그 전체가 천연 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 자연에 존재하는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 뉴클레오타이드 단편을 포함할 수 있다. 프로모터는 항시적 (즉, 프로모터 활성화가 유도제에 의해 조절되지 않으므로 전사율이 일정함) 또는 유도성 (즉, 프로모터 활성화가 유도제에 의해 조절됨)일 수 있다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 규정되어 있지 않고 일부 경우에는 완전히 규정될 수 없으므로 일부 변이의 DNA 서열은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 선택되는 핵산 서열이 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)와 인접하여 조절 요소가 선택되는 핵산 서열의 발현을 조절할 수 있게 하는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 D-락테이트 옥시다제가 포함된 탱크 (예를 들어, 반응기)에서 효소 활성에 최적 (또는 달리는 적합한) 조건 하에 락트산 발효 전에 혼합된다. 상기 효소와 혼합되는 유기 폐기물은 일반적으로 입자 크기 감소 및 선택적으로 멸균, 희석 및 포장재료 분리를 포함하는 전처리에 적용된 전처리된 유기 폐기물이다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 폐기물로부터 D-락트산을 제거하기에 충분한 시간 동안 발효 전에 유기 폐기물과 함께 인큐베이션된다. 다른 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제는 폐기물에 존재하는 D-락테이트의 부분적 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 락트산 발효 전에 유기 폐기물과 함께 인큐베이션되고, D-락테이트의 분해는 D-락테이트가 제거될 때까지 발효 동안 계속된다. 일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 D-락테이트 옥시다제와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 락트산 발효 전에 하나 이상의 당류 분해 효소와 추가로 혼합된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
추가의 실시양태에서, 동시에 D-락트산 제거 및 L-락트산 발효를 수득하기 위해, 유기 폐기물 (통상적으로 상기 기재된 바와 같이 전처리된 유기 폐기물)은 D-락테이트 옥시다제 및 L-락트산 생산 미생물이 포함된 탱크 (예를 들어, 반응기)에서 혼합된다.
추가 실시양태에서, 동시에 D-락트산 제거, 당화 및 L-락트산 발효를 수득하기 위해, 유기 폐기물 (통상적으로 상기 기재된 바와 같이 전처리된 유기 폐기물)은 D-락테이트 옥시다제, 하나 이상의 당류 분해 효소 및 L-락트산 생산 미생물이 포함된 탱크 (예를 들어, 반응기)에 혼합된다.
추가의 실시양태에서, D-락트산의 제거는 발효가 완료된 후에 수행된다. 일부 실시양태에서, 발효액은 발효 후 D-락테이트 옥시다제와 접촉하여 발효액로부터 D-락트산을 제거한다. 일부 실시양태에서, 발효 후, 발효액의 pH는 D-락테이트 옥시다제에 대해 최적 (또는 달리는 적합한) pH로 조정되고, D-락테이트 옥시다제는 발효액와 접촉하여 발효액으로부터 D-락테이트를 제거한다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 옥시다제에 의한 분해 반응은 범위 내의 임의의 값을 포함하여 5 내지 15시간 후, 예를 들어 5 내지 10시간 후에 중단된다. 분해 반응은 예를 들어 pH 또는 온도를 효소가 비활성인 값, 예를 들어 pH 4.5 및/또는 적어도 65℃의 온도로 변화시킴으로써 중단될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "당류 분해 효소"는 이당류 (bi-saccharide) (이당류 (di-saccharide)), 올리고당류, 다당류 및 당접합체를 포함하는 당류의 분해를 촉매하는 가수분해 효소 (또는 이의 효소 활성 부분)를 지칭한다. 당류 분해 효소는 글리코사이드 가수분해효소, 다당류 분해효소 및 탄수화물 에스테라제 (esterase)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 본 발명에 사용하기 위한 당류 분해 효소는 유기 폐기물, 예를 들어 음식 폐기물에 존재하는 당류 (예를 들어, 다당류)에 대해 활성인 것들로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 당류 분해 효소는 변형된 효소 (즉, 변형되어 해당 야생형 효소와 상이한 효소)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 개선된 활성 및/또는 안정성과 같은 효소의 개선된 특성 (들)을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 당류 분해 효소는 야생형 (WT) 효소이다.
광범위한 그룹의 당류 분해 효소는 표준 분류 시스템 (문헌[Cantarel et al. 2009 Nucleic Acids Res 37: D233-238])에 따라 효소 클래스 및 추가로 효소 패밀리로 나뉜다. 이러한 효소의 정보 및 업데이트된 분류는 탄수화물-활성 효소 (CAZy) 서버 (www.cazy.org)에서 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 당류 분해 효소 (들)는 다당류 분해 효소 (들)이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 다당류 분해 효소는 글리코사이드 가수분해효소이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 다당류 분해 효소는 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리코사이드 가수분해효소이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 일부 특정 실시양태에서, 하나 이상의 다당류 분해 효소는 글루코아밀라제이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 당류 분해 효소 (들)는 이당류 분해 효소 (들)이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 사용하기 위한 이당류 분해 효소는 락타제 및 인버타제 (invertase)로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 단일 당류 분해 효소가 사용된다. 다른 실시양태에서, 다수의 당류 분해 효소가 사용된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 당류 분해 효소는 박테리아 효소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 호열성 박테리아로부터 유래된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "호열성 박테리아"는 약 45℃ 초과, 바람직하게는 50℃ 초과의 온도에서 증식하는 박테리아를 나타낸다. 통상적으로, 본 발명에 따른 호열성 박테리아는 약 45℃ 내지 약 75℃, 바람직하게는 약 50 내지 70℃의 최적 성장 온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 호열성 박테리아는 클로스트리디움 종 (Clostridium sp.), 파에니바실루스 종 (Paenibacillus sp.), 서모비피다 푸스카 (Thermobifida fusca), 바실루스 종 (Bacillus sp.), 지오바실루스 종 (Geobacillus sp.), 크로모할로박터 종 (Chromohalobacter sp) 및 로도테르무스 마리누스 (Rhodothermus marinus)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 당류 분해 효소에 대한 호열성 박테리아 공급원의 비제한적인 예는 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 - 클로스트리디움 종 (예를 들어 클로스트리디움 서모셀룸 (Clostridium thermocellum)), 파에니바실루스 종, 서모비피다 푸스카 (Thermobifida fusca); 아밀라제 - 바실루스 종 (예를 들어 바실루스 스테아라서모필루스 (Bacillus stearothermophilus)), 지오바실루스 종 (예를 들어 지오바실루스 서모레오보란스 (Geobacillus thermoleovorans)), 크로모할로박터 종 및 로도테르무스 마리누스를 포함한다. 각 가능성은 별개의 실시양태이다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 중온성 박테리아로부터 유래된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "중온성 박테리아"는 약 20℃ 내지 45℃의 온도에서 증식하는 박테리아를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 중온성 박테리아는 클레브시엘라 종 (Klebsiella sp.), 코넬라 종 (Cohnella sp.), 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.), 아세티비브리오 셀룰로리티쿠스 (Acetivibrio cellulolyticus), 루미노코쿠스 알부스 (Ruminococcus albus); 바실루스 종 (Bacillus sp.) 및 락토바실루스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 당류 분해 효소에 대한 중온성 박테리아 공급원의 비제한적인 예는 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 - 클레브시엘라 종 (예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia)), 코넬라 종, 스트렙토마이세스 종, 아세티비브리오 셀룰로리티쿠스, 루미노코커스 알부스; 아밀라제 - 바실루스 종 (예를 들어, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 수브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis)), 락토바실루스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum)을 포함한다. 각 가능성은 별개의 실시양태이다. 당업자는 일부 중온성 박테리아 (예를 들어, 여러 바실루스 종)가 열안정성 효소를 생산한다는 것을 이해한다.
추가 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 진균 효소이다. 일부 실시양태에서, 진균은 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei), 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 페니실리움 펠루타눔 (Penicillium fellutanum) 및 서모마이세스 라누기노수스 (Thermomyces lanuginosus)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 당류 분해 효소를 위한 진균 공급원의 비제한적 예는 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 - 트리코더마 레에세이 (Trichoderma reesei), 후미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum); 아밀라제- 아스퍼길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 페니실리움 펠루타눔 (Penicillium fellutanum), 서모마이세스 라누기노수스 (Thermomyces lanuginosus)를 포함한다. 각 가능성은 별개의 실시양태이다.
하나 이상의 당류 분해 효소는 일반적으로 D-락테이트 옥시다제와 동시에 또는 순차적으로 외인성으로 첨가되어 유기 폐기물과 혼합된다. 대안적으로, 하나 이상의 당류 분해효소는 락트산 발효 단계에서 사용되는 락트산 생산 미생물로부터 발현 및 분비될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 당류 분해 효소는 상업적으로 입수가능하고/거나 재조합적으로 생산될 수 있다.
D-락테이트 옥시다제 및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소는 숙주 세포, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 분자로 형질전환된 미생물 세포에서 적절한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 이를 생산하는 미생물로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 미생물의 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 게놈 DNA는 증폭 전에 미생물 세포로부터 추출될 수 있다. 증폭 후, 증폭 산물은 단리되어 클로닝 벡터로 클로닝되거나 선택된 숙주 세포에서의 발현에 적합한 발현 벡터로 직접 클로닝될 수 있다. 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 단리 및 클로닝 시, 돌연변이 (들)는 하나 이상의 염기쌍에서 변형에 의해 도입될 수 있다.
적절한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 대안적인 방법은 포스포라미다이트 DNA 합성과 같은 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하는 것이다. 합성 유전자의 사용은 적절한 종 (예를 들어, E. 콜라이)에서 발현될 뉴클레오타이드의 최적화된 서열을 포함하는 인공 유전자의 생산을 가능하게 한다. 이렇게 생산된 폴리뉴클레오타이드는 그 다음 정제, 어닐링, 결찰, 증폭, 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해 및 적절한 벡터로의 클로닝 중 하나 이상을 포함하는 추가 조작에 적용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 초기에 클로닝 벡터에 결찰되거나 선택되는 숙주 세포에서의 발현에 적합한 발현 벡터에 직접 결찰될 수 있다.
당업자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 특정 아미노산 (들)을 암호화하기 위한 폴리뉴클레오타이드에 사용된 하나 이상의 코돈은 폴리뉴클레오타이드를 발현하기 위해 선택된 숙주 세포의 공지된 바람직한 코돈 사용에 따라 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 전사, 비번역 서열, 종결 신호, 리보솜 결합 부위, mRNA를 안정화하는 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 신호와 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함하는 비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 His-태그와 같이 정제를 용이하게 하는 대상 단백질에 융합된 태그 또는 마커를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 트롬빈 절단 부위와 같이 태그의 제거를 가능하게 하기 위해 태그 부분 및 대상 단백질 사이에 단백질 분해 절단 부위가 포함되는 것이 또한 편리할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 매우 다양한 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있는 매우 다양한 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 원핵생물 (예를 들어, 박테리아 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli)) 또는 진핵생물 (예를 들어, 진균 피키아 파스토리스)일 수 있다. 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 도입은 화학적 형질전환 (예를 들어, 염화칼슘 처리), 전기천공, 접합, 형질도입, 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 트랜스벡션 (transvection), 미세주입, 양이온성 지질-매개 형질감염, 스크랩 로딩 (scrape loading), 궤도 도입 (ballistic introduction) 및 감염과 같은 널리 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
적절한 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 선택은 형질전환되지 않은 세포에 독성인 선택 배지에서의 성장을 포함하는 표준 선택 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, E. 콜라이를 항생제 선택 제제를 포함하는 배지에서 성장시킬 수 있으며; 항생제 내성 유전자를 추가로 제공하는 발현 벡터로 형질전환된 세포를 선택 배지에서 성장시킬 수 있다.
적합한 숙주 세포의 형질전환 및 단백질 발현에 적합한 조건 하에 증식시, 대상 단백질은 형질전환된 세포의 세포 추출물에서 확인될 수 있다. 대상 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주는 SDS-PAGE를 사용하여 숙주에 의해 발현된 단백질을 분석하고 동일한 벡터로 형질전환되었지만 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 숙주로부터 수득한 SDS-PAGE 겔과 상기 겔을 비교함으로써 확인될 수 있다. 대상 단백질은 또한 적절한 항체를 사용한 면역블롯 분석, 전체 세포 추출물의 도트 블롯팅 (dot blotting), 제한된 단백질 분해, 질량 분광분석 및 이의 조합과 같은 다른 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다.
대상 단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 염 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 이의 조합을 포함하는 통상적인 방법에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 단리된 대상 단백질은 예를 들어 특정 활성과 같은 다양한 특성에 대해 분석될 수 있다.
상기 기재된 절차 및 기타 유용한 방법을 수행하기 위한 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
본 발명에 따른 단백질은 재조합 단백질의 생산 및 정제에 유리한 개시 코돈 (메티오닌 또는 발린)의 부재 하 및/또는 리더 (신호) 펩타이드의 부재 하에 생산 및/또는 사용될 수 있다. 본 명세서에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "핵산", "핵산 서열", "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상호혼용될 수 있다. 이 용어는 데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA), 리보뉴클레오타이드 (RNA) 및 별도의 단편 형태 또는 더 큰 작제물의 구성요소로서 이의 변형된 형태의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 천연 발생 염기, 당 및 공유 뉴클레오사이드간 연결로 구성된 올리고뉴클레오타이드뿐만 아니라, 각각의 천연 발생 부분과 유사하게 기능하는 비-천연 발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. DNA는 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 재조합 DNA 또는 상보적 DNA (cDNA)를 포함할 수 있다. RNA는 예를 들어 메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA) 또는 전달 RNA (tRNA)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 코딩 서열 (즉, 단백질 또는 펩타이드와 같은 세포 내의 최종 산물을 암호화할 수 있는 서열)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)일 수 있다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 혼용된다. 이 용어는 천연 발생 아미노산으로 구성된 아미노산 중합체 및 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 해당 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. "아미노산 서열"이라는 용어는 천연 발생 아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산 또는 합성 아미노산 중 어느 하나로 구성된 서열에 관한 것이다. 이 용어는 펩타이드 및 단백질뿐만 아니라, 펩타이드 및 단백질의 단편, 유사체, 유도체 및 조합에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 기준 서열에 "상동성"인 서열 (예를 들어, 핵산 서열 및 아미노산 서열)은 본 명세서에서 서열 간의 동일성 퍼센트를 지칭한다. 동일성 퍼센트는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 동일성 퍼센트는 서열의 전체 길이에 걸쳐 분배될 수 있다. 따라서, 상동성 서열은 예를 들어 돌연변이 (예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 또는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 절단, 치환, 결실 및/또는 추가)와 관련된 변이를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 효소의 경우, 상동체가 적어도 야생형과 유사한 목적에 유용한 정도로 야생형 효소의 특성 및 활성을 보유하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 가공은 통상적으로 유기 폐기물을 효소 (들)와 혼합하고 온도 및 pH와 같은 매개변수를 제어할 수 있게 하는 반응기 또는 다른 적합한 작용 단위과 같은 용기에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 D-락테이트 옥시다제 (및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소)와 접촉하기 전에 입자 크기 감소 및 선택적으로 멸균을 포함하는 전처리에 적용된다. 전처리는 예를 들어, 가압 증기에 의한 파쇄, 분쇄 및 멸균을 포함할 수 있다. 전처리는 또한 예를 들어 압출기, 초음파기, 파쇄기 또는 블렌더와 같은 폐기물 분쇄기를 사용하여 동일한 양의 물로 분쇄하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 전처리 후, D-락테이트 및/또는 가용성 환원 당의 양이 결정된다. 이러한 결정은 가용성 환원 당을 이용하는 하류 발효 공정에 유용할 수 있어 공급된 당의 농도를 제어할 수 있다.
일부 실시양태에서, D-락트산을 제거하고 선택적으로 당류를 가용성 환원 당으로 분해하기 위해 유기 폐기물을 가공한 후, 가공된 유기 폐기물은 락트산 생산 미생물에 의한 발효에 적용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 가공 후 가공된 폐기물은 락트산 생산을 위한 발효기로 직접 펌핑된다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 가공 후 가공된 폐기물은 발효 전에 불용성 입자를 제거하기 위해 고체/액체 분리와 같은 발효 전 추가 가공에 적용된다.
유기 폐기물은 일반적으로 락트산 생산 미생물에 필요한 질소 공급원 및 기타 영양소를 포함하지만, 이러한 영양소는 또한 필요에 따라 별도로 공급될 수 있다.
통상적으로, 발효 단계는 혐기성 또는 미호기성 조건 하에 수행된다. 발효 단계는 통상적으로 회분식, 유가식, 연속식 및 반연속식 발효로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
유기 폐기물의 환원 당 (폐기물에 원래 존재하는 환원 당 및 하나 이상의 당류 분해 효소의 작용에 의해 방출되는 것)은 락트산 생산 미생물에 의해 락트산으로 발효될 수 있다. L-락트산만을 생산하기 위해 사용되는 락트산 생산 미생물은 L-락트산 거울상이성질체만을 생산하는 미생물이다. 미생물은 자연적으로 L-락트산만을 생산할 수 있거나, 예를 들어 부적절한 D-락트산 거울상이성질체의 합성에 관여하는 하나 이상의 효소를 녹아웃시킴으로써 L-락트산만을 생산하도록 유전자 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가공 후, 가공된 유기 폐기물은 락트산 발효를 위해 별도의 반응기 (예를 들어, 발효기)로 전달된다.
다른 실시양태에서, 락트산 발효는 D-락테이트 옥시다제 및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소에 의한 유기 폐기물의 가공이 수행되는 동일한 반응기에서 수행될 수 있다.
LA 생산 미생물은 다양한 박테리아 (예를 들어, 락토바실루스 종 및 바실루스 종 포함) 및 진균을 포함한다. 통상적으로, 발효 단계는 회분식, 유가식, 연속식 또는 반연속식 발효를 사용하여 혐기성 또는 미호기성 조건 하에 수행된다.
회분식 발효에서는 탄소 기질 및 기타 성분을 반응기에 로딩하고, 발효가 완료되면 산물을 회수한다. pH 제어를 위한 중화제를 제외하고 반응이 완료되기 전에 다른 성분을 반응에 첨가하지 않는다. 접종물 크기는 일반적으로 반응기 액체 부피의 약 5 내지 10%이다. 발효는 실질적으로 일정한 온도 및 pH에서 유지되며, pH는알칼리, 탄산염 또는 암모니아와 같은 적절한 중화제를 첨가하여 유지된다.
유가식 발효에서, 기질은 발효액의 제거 없이 반응기에 연속적으로 또는 순차적으로 공급된다 (즉, 산물 (들)이 실행이 끝날 때까지 반응기에 남아 있음). 일반적인 공급 방법은 간헐적, 지속적, 주기적 공급 및 지수적 공급을 포함한다.
연속식 발효에서는 기질을 일정한 속도로 반응기에 연속적으로 첨가하고, 발효 산물을 연속적으로 회수한다.
반연속식 공정에서 배양액의 일부는 간격을 두고 회수되고 새로운 배지가 시스템에 첨가된다. 무한정 유지될 수 있는 반복적 유가식 배양은 반연속적인 공정의 또 다른 이름이다.
발효 동안, 수산화암모늄, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 또는 칼슘과 같은 염기를 첨가하여 락테이트 염의 형성과 함께 락트산을 중화함으로써 pH를 유지할 수 있다.
락트산 발효는 통상적으로 약 1 내지 3일 동안 또는 그 사이의 임의의 일 수, 예를 들어 1 내지 2일 동안 수행된다.
발효가 완료된 후, 락트산 (또는 락테이트 염)을 포함하는 액체를 원심분리에 의해 정화하거나 필터 프레스를 통과시켜 발효 액체로부터 고체 잔류물을 분리할 수 있다. 회전식 진공 증발기를 사용하여 여액을 농축할 수 있다.
액체로부터 락트산의 분리 및 정제는 증류, 추출, 전기투석, 흡착, 이온 교환, 결정화 및 이들 방법의 조합과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 문헌[Ghaffar et al. (2014), supra; 및 L
Figure pct00001
pez-Garz
Figure pct00002
n et al. (2014) Biotechnol Adv., 32 (5):873-904)]에 다수의 방법이 검토되어 있다. 대안적으로, 단일 단계에서 회수 및 락트산의 락타이드로의 전환이 사용될 수 있다 (문헌[Dusselier et al. (2015) Science, 349 (6243):78-80]).
일부 실시양태에서, 환원 당 및 당류의 관점에서 유기 폐기물의 조성은 예를 들어 글루코스 옥시다제, 헥소키나제 또는 프룩토스 결정을 위한 포스포글루코스 이성질화효소를 사용한 효소 분석 (비색, 형광)을 포함하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 가공하기 전에 결정될 수 있다. 대안적으로, HPLC 및/또는 환원 당 연속 센서를 사용할 수 있다. 총 당 분석은 예를 들어 페놀-황 분석에 의해 수행될 수 있다. 유기 폐기물의 조성, 예를 들어 전분, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 중 적어도 하나의 백분율은 유기 폐기물과 접촉될 하나 이상의 다당류 분해 효소를 선택하는데 사용될 수 있다.
D-락테이트 옥시다제 가공 후 D-락트산의 함량은, 예를 들어 특이적 D-락테이트 측정 키트 (Sigma)를 사용하여 측정할 수 있다.
PLA 재활용 공정
PLA 수지를 일반적으로 적절한 특성을 생산하기 위해 다른 재료와 혼합한다. PLLA 및 PDLA를 일반적으로 혼합하여 PLLLA/PDLA의 공중합체를 형성한다. PDLA는 결정화도, 용융 온도를 높이고 기타 물리적 특성을 향상시키는 핵 생산제로 사용된다.
PDLA의 혼입은 중합체를 (열적, 화학적 또는 효소적으로) 락트산 또는 락타이드 단량체로 가수분해하는 모든 PLA 재활용 공정에 대한 문제를 야기한다. 순수한 L-락테이트 또는 L-L-락타이드 입체이성질체를 생산하기 위해 이성질체를 분리할 필요가 있다.
음식 폐기물에서 PLA 공정으로, PLA 폐기물은 락트산 단량체로의 화학적, 열적 또는 효소적 가수분해에 의해 음식 폐기물과 혼입될 수 있고, D-락테이트 옥시다제를 포함하는 동일한 가공 탱크에 첨가될 수 있다. 그런 다음 효소는 폐기물에 자연적으로 존재하는 D-락트산 (폐기물통, 저장 및 운송의 자연 발효 부패 과정에서 발생) 및 PLA 폐기물로부터 재활용된 D-락테이트를 모두 제거한다. 이 방법은 새로운 장비 및 운영 비용 (사업, 시약)에 대한 막대한 투자 없이 시설의 락트산 역가 및 생산량을 크게 증가시키고 시설 기술 경제성을 향상시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "약"은 측정 가능한 값을 언급할 때 소정의 값으로부터 +/-10%, 바람직하게는 +/-5%, 더욱 바람직하게는 +/- 1% 및 여전히 더욱 바람직하게는 +/-0.1%의 변동을 포괄하는 의미이다.
"~를 포함하다", "~를 포함하는", "~를 포괄하다", "~를 포괄하는", "~를 갖는" 및 이의 접합체는 "~를 포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다. 용어 "~를 포함하다" 및 "~를 포함하는"은 일부 실시양태에서 각각 "~로 이루어지다" 및 "~로 이루어진"으로 제한된다. 용어 "~로 이루어진"은 "~를 포함하고 제한되는"을 의미한다. "~로 필수적으로 이루어진"이라는 용어는 추가 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 신규한 특성을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 조성물, 방법 또는 구조가 추가 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있음을 의미한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제공된다. 그러나 이는 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 명세서에 개시된 원리의 많은 변형 및 수정을 용이하게 고안할 수 있다.
실시예
실시예 1
글루코노박터 옥시단스로부터 재조합 D-락테이트 옥시다제의 생산
글루코노박터 옥시단스 균주 621H로부터의 D-락테이트 옥시다제 (DOX)를 암호화하는 pET30 플라스미드를 작제하였다. DOX를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 2)을 E. 콜라이에서의 발현에 유리하도록 변형시켰다. E. 콜라이에서의 발현을 위해 변형된 DOX 코딩 서열은 서열번호 9로 제시된다. 상기 효소를 His-태그와 함께 비분비 단백질로 발현시켰다.
에세리키아 콜라이 BL21 (DE3)/ pET30-dox 세포의 밤새 배양액을 카나마이신 (50 ug/ml)을 포함하는 1L TB 배지 (트립톤 12 g/l, 효모 추출물 24 g/l, 글리세롤 4 ml/l, KH2PO4-2.3 g/l, K2HPO4 -16.43 g/l)에서 0.1의 O.D600까지 접종하였다. 그런 다음 용기를 O.D600이 1.2에 도달할 때까지 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로 용기를 15℃로 옮기고 IPTG를 0.5 mM의 최종 농도로 첨가하여 효소의 발현을 유도하였다. 15℃에서 16시간 인큐베이션 후, 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 용해 완충액 (50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH=8)에 현탁시키고 초음파 처리에 의해 파괴하였다.
박테리아 용해물을 원심분리하고 생산된 상청액을 Ni 컬럼에 로딩하고 세척 완충액 (50 mM Tris-HCl, 10% 글리세롤, pH=8)으로 세척하였다. 단백질을 300 mM 이미다졸을 포함하는 세척 완충액으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 용해 완충액에 대해 투석하고 활성 평가까지 -80℃에 저장하였다.
실시예 2
재조합 D-락테이트 옥시다제에 의한 유기 폐기물에 존재하는 D-락테이트 및 순수한 D-락테이트의 분해
효소의 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 효소의 최적 pH는 7 내지 9 (pH=8에서 가장 좋은 활성을 보임)이고 최적 온도는 55℃라고 이전에 보고되었다 (문헌[Sheng et al. 2016, supra, Supporting Information, Fig S3]). 따라서 효소로 수행한 초기 실험은 55℃, pH=8에서 수행하였다.
먼저, 완충액에 용해된 순수한 D-락테이트로 활성을 시험하였다. 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 8.0을 포함하는 완충 용액에 용해된 1200 mg/L D-락테이트 용액을 효소 (0.58 mg/ml)와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 효소가 없는 완충액을 대조군으로 사용하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 0.58 mg/ml의 효소는 24시간의 인큐베이션 후에 이용 가능한 모든 D-락테이트를 실질적으로 소모하였다.
다음으로, D- 및 L-락트산을 모두 포함하는 유기 폐기물에 대해 효소의 활성을 시험하였다. 유기 폐기물은 제과 공정의 불량품, 과일, 채소, 도축 폐기물 (갈색 육 (dark meat)), 폐 낙농 산물이 포함된 혼합 음식 폐기물이다. 폐기물을 분쇄하고 물로 1:1 희석하고 효소 (0.35 mg/ml)와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 효소가 없는 폐기물을 대조군으로 사용하였다. 희석된 폐기물은 총 1250 mg/L 락테이트를 포함했으며 그 중 450 mg/L은 D-락테이트였다. 총 락테이트을 Reflectoquant® 락트산 시험 시스템 (Merck)을 사용하여 측정하였다. D-락테이트 함량을 특이적 D-락테이트 비색 키트 (Sigma)를 사용하여 측정하였다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 0.35 mg/ml의 효소는 폐기물 내 D-락테이트의 약 95%를 소모하였다: 폐기물 내 D-락테이트의 초기 농도는 450 mg/L이었고, 24시간 인큐베이션 후 효소의 농도는 26 mg/L에 불과하였다. 비록 유기 폐기물이 복합 점성 기질이고 정확한 조성은 알 수 없고, 효소에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 가능한 억제제 및 기타 요인이 있을 수 있고 활성에 필요한 보조 인자의 양을 알 수 없으며, 충분하지 않을 수 있을지만, 효소는 D-락테이트를 효과적으로 제거할 수 있었다.
다른 농도의 효소를 사용하여 유기 폐기물에 대한 효소의 활성을 추가로 시험하였다. 450 mg/L D-락테이트를 포함한 유기 폐기물 (물로 1:1로 희석 후)을 0.35, 0.26, 0.18, 0.09 또는 0.04 mg/ml와 같이 다양한 농도의 효소와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 효소가 없는 폐기물을 대조군으로 사용하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 0.35, 0.26, 0.18, 0.09 또는 0.04 mg/ml의 효소는 이용 가능한 D-락테이트의 각각 약 87%, 89%, 77%, 44% 또는 32%를 소모하였다. 이 실험에서 시험한 조건에서 24시간 후 폐기물에서 D-락테이트의 상당한 감소를 달성하기 위해 DOX의 0.26 mg/ml의 최소 농도가 필요하였다.
상기 실험에서, 효소를 첨가하기 전에 유기 폐기물을 물로 1:1로 희석하였다 (폐기물 400 μl를 물 400 μl로 희석하였음). 다음 실험에서는 물로 1:1 대 4:1로 희석된 폐기물에 대한 효소의 활성을 조사하였다. 4:1 희석을 400 μl의 폐기물과 100 μl의 물을 혼합하여 수득하였다. 효소 농도를 증가시키면서 24시간 인큐베이션 후 폐기물 내 D-락테이트의 양을 조사하였다. 결과는 도 3에 요약되어 있다. 도면에서 볼 수 있듯이 55℃에서 24시간 인큐베이션하면 0.27 mg/ml DOX의 농도가 1:1 희석 폐기물 내 D-락테이트의 약 90%를 소모하기에 충분했지만, 4:1로 희석된 폐기물에는 0.55 mg/ml가 필요하였다. 이러한 결과는 효소가 D-락테이트의 효율적인 소모를 위해 보다 희석된 환경이 필요함을 나타낼 수 있다. 또한 폐기물의 보다 효율적인 혼합이 필요함을 나타낼 수도 있다 (실험이 시험관에서 수행되었기 때문에 교반이 최적이 아닐 수 있음).
실시예 3
글루코아밀라제의 존재 하에 D-락테이트 옥시다제의 활성
다음 실험에 의해 글루코아밀라제 (GA)의 존재가 DOX의 활성에 어떻게 영향을 미치는지 조사하였다. 사용된 글루코아밀라제는 시판되는 아스퍼길루스 니거로부터의 글루코아밀라제이다.
물로 4:1로 희석된 유기 폐기물을 100 단위/ml GA의 존재 또는 부재 하에 0.18 mg/ml DOX와 함께 55℃ pH=8에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. pH=8이 GA에 이상적이지는 않지만 이 시점에서 DOX가 산성 pH에서 활성인지는 알려지지 않았다. 폐기물 내 D-락테이트의 초기 농도는 959 mg/L이었다. DOX를 GA와 함께 첨가하였을 때 154 mg/L D-락테이트가 튜브에 남아 있었으며 GA의 부재 하에는 274 mg/L이 남았다 (도 4). 이러한 결과는 DOX와 글루코아밀라제와 같은 다당류 분해 효소의 조합이 유리하고 DOX의 활성이 개선됨을 나타낸다. DOX가 글루코아밀라제와 같은 다당류 분해 효소와 조합될 때, 공정에는 더 낮은 정도의 기질 (유기 폐기물)의 희석이 요구되고 더 적은 양의 DOX를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 이론이나 작용 기전에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, GA의 존재 하에 DOX의 개선된 활성은 GA에 의해 폐기물에 존재하는 전분이 가용성 당으로 분해될 때 폐기물의 감소된 점성에서 비롯되는 것으로 고려된다.
실시예 4
상이한 pH 및 온도에서의 D-락테이트 옥시다제의 활성
위에서 언급한 바와 같이, 효소는 pH=8 및 55℃에서 가장 잘 작용하는 것으로 이전에 보고된 바 있다 (문헌[Sheng et al. 2016, Supporting Information, Fig S3]). pH와 관련하여 pH 7 미만에서는 효소의 활성과 안정성이 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 유기 폐기물은 일반적으로 폐기물통, 저장 및 운송 (pH 4 내지 5.5 범위)에서 자연적인 부패 과정으로 인해 산성이다. 또한, 유기 폐기물로부터 락트산을 생산하는 경우, 유기 폐기물을 일반적으로 산성 pH 값에서 활성인 아밀라제 및 셀룰라제와 같은 다당류 분해 효소에 의해 당화시킨다. 온도와 관련하여 일부 락트산 생산 과정은 중온성 박테리아에 의해 수행된다. 따라서 다양한 pH 및 온도에서, 효소가 활성/안정성을 잃는 것으로 보고된 pH 및 온도에서도 효소의 활성을 확인하기로 결정하였다.
먼저, 다양한 pH에서의 활성을 시험하였다. 이를 위해 폐기물을 pH=5, 6, 7 또는 8로 조정하고 0.27 mg/ml 효소를 첨가하고 55℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 결과는 도 5a에 요약되어 있다. 도면에서 보는 바와 같이 놀랍게도 pH=7, 및 pH=6에서도 효소가 D-락테이트를 효과적으로 제거함을 알 수 있었다. 사실상, 효소의 활성은 pH=8에서의 활성과 실질적으로 같았고, 더 산성인 pH로의 변화는 활성을 손상시키지 않았다. pH=5에서만 효소의 활성이 손상되었고 실질적으로 배지로부터 D-락테이트가 제거되지 않았다.
다음으로, 효소를 상이한 온도에서 시험하는 유사한 실험을 수행하였다. 효소 (0.27 mg/ml)를 폐기물에 첨가하고 3가지 다른 온도에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 결과는 도 5b에 요약되어 있다. 도면에서 보는 바와 같이 실험 종료 시 남아있는 D-락테이트의 양은 모든 실험 온도에서 거의 동일하게 나타났다.
추가 실험에서 다양한 온도 및 pH에서 유기 폐기물의 상청액에서 효소의 활성을 조사하였다. 첫 번째 실험에서는 폐기물을 원심분리 (9000 g 10분)한 후 pH를 pH 7.0 또는 pH 6.0으로 조정하고 30℃에서 효소 (0.27 mg/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 도 6a에 제시된 바와 같이 pH 6.0과 7.0에서 효소의 활성 경향은 30℃에서 매우 유사하였다. D-락테이트는 각각 60% 또는 75% 감소했으며 (각각 약 1800 mg/L에서 700 mg/L 또는 470 mg/L로) 이는 이 온도에서 pH 7.0이 약간 유리함을 나타낸다. 추가 실험에서, 폐기물을 원심분리 (9000 g 10분)한 후 pH를 pH 7.0 또는 pH 6.0으로 조정하고 55℃에서 효소 (0.27 mg/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 도 6b에 나타난 바와 같이 효소의 활성은 33℃에 비해 55℃에서 더 우수했으며 pH 6.0과 7.0에서 효소의 활성 경향은 매우 유사하였다. 폐기물의 모든 D-락테이트 (약 1800 mg/L)는 두 pH 값에서 모두 소모되었으며, 이는 이 온도에서 두 pH 값을 모두 사용할 수 있음을 나타낸다.
문헌[Sheng et al. supra]은 완충 용액 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 8.0)에서 분석을 수행하였다. 본 명세서에 기재된 pH 및 온도 결과는 완충 용액에서의 활성과 비교하여 유기 폐기물에서 효소의 개선된 활성을 보여주고, 이는 효소가 활성이고 D-락테이트를 효과적으로 제거하는 더 넓은 범위의 조건을 특징으로 한다. 이러한 결과는 효소가 다양한 pH의 다양한 유기 폐기물의 산업적 가공 및 발효에 유용하며, 또한 효소가 유기 폐기물로부터 락트산을 생산하는 공정에서 상이한 시점에서 폐기물의 당화와 같은 다른 단계와 조합하여 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 5
락트산 발효 전 및 후의 유기 폐기물에 존재하는 D-락테이트의 분해
다음 실험은 유기 폐기물을 발효 기질로 사용하여 15,000 리터 L-락트산 생산 라인에서 수득된 유기 폐기물에 대해 D-락테이트 옥시다제를 시험하였다. 유기 폐기물은 제과 공정 불량품 및 과일, 채소 및 우유의 시장 반품을 조합한 혼합 음식 폐기물였다. 폐기물을 혼합, 파쇄, 분쇄 및 증기 주입을 통해 전처리하였다.
D-락테이트 옥시다제의 활성을 발효 전 및 후의 두 시점에서 유기 폐기물로부터 채취한 샘플에 대해 시험하였다. 발효 전 D-락테이트 농도는 약 2200 mg/L였다. 발효 후 D-락테이트의 농도는 실질적으로 동일하게 유지되었다 (박테리아 접종 및 발효 중 pH 조절 시약과 같은 시약의 첨가 후 폐기물 희석으로 인해 약간 감소됨). 이 공정에서 L-락테이트 농도는 약 80,000 mg/L로 증가하였다. D-락트산과 비교하여 상당한 과량의 L-락트산의 존재 하에서 D-락테이트 옥시다제의 활성을 조사하는 것은 흥미로웠다.
2개의 샘플을 55℃에서 24시간 동안 상이한 농도의 D-락테이트 옥시다제와 함께 인큐베이션하였다. 0.92 mg/ml의 농도를 또한 유기 폐기물과 함께 9시간 인큐베이션에서 시험하였다. 발효 전 채취한 샘플을 pH 5.5로 조정하지 않고 D-락테이트 옥시다제와 함께 인큐베이션하였다. 발효 후 채취한 샘플의 pH는 6.4였다. 효소가 없는 샘플을 대조군으로 사용하였다. 효소와 함께 인큐베이션한 후 D-락테이트 농도를 측정하였다. 다양한 농도의 효소로 24시간 인큐베이션한 결과는 표 1 및 도 7a에 요약되어 있다. 도면은 대조군 반응 ("0" 효소)에서 D-락테이트 농도의 백분율로 결과를 나타낸다.
[표 1]
D-락테이트 옥시다제와 24시간 인큐베이션 후 D-락테이트 농도
Figure pct00003
발효 전에 채취한 샘플에서 0.92 mg/ml 농도의 효소는 24시간 인큐베이션 후 폐기물에 존재하는 D-락테이트를 효율적으로 소모할 수 있었으며 - D-락테이트 농도는 85% 감소하였다. 흥미롭게도, 발효 후 채취한 샘플에서 더 낮은 농도의 효소인 0.55 mg/ml가 폐기물에 존재하는 D-락테이트를 효과적으로 소모하고 24시간 후에 그 농도를 약 85% 감소시키기에 충분하였다. 발효 후 채취한 샘플에 대한 효소 활성이 개선된 것은 발효 후 폐기물이 발효 및 글루코아밀라제로 처리하기 전의 점성에 비해 점성이 더 작기 때문일 수 있다. 또한 발효 후 채취한 샘플은 pH=6.4로 발효 전 샘플의 pH=5.5에 비해 D-락테이트 옥시다제에 더 적합할 수 있었다. 효소와 함께 인큐베이션한 후 D-락테이트의 농도는 297 mg/ml이었고 발효 후 L-락테이트의 농도는 80,000 mg/ml였다. 따라서 D-락테이트 옥시다제는 D-락테이트의 양을 발효 종료시 총 락테이트의 0.5% 미만으로 감소시킬 수 있었다. 중요하게도, 효소는 D-락테이트에 비해 유의하게 과량의 L-락테이트가 존재하는 경우에도 상기와 같았다.
0.92 mg/ml의 D-락테이트 옥시다제를 사용한 폐기물 내 D-락테이트의 변화를 상기 논의된 24시간 측정에 더하여 9시간의 인큐베이션 후에 측정하였다. 도 7b는 0.92 mg/ml의 D-락테이트 옥시다제와 함께 인큐베이션한 후 시간 경과에 따른 D-락테이트의 변화를 보여준다. 도면은 시간=0에서 D-락테이트 농도의 백분율로 결과를 나타낸다. 발효 후 채취한 샘플과 함께 인큐베이션한 0.92 mg/ml 농도의 D-락테이트 옥시다제는 9시간 후에 이미 D-락테이트의 약 80%를 소모할 수 있었다.
추가 실험에서, D-락테이트 옥시다제의 활성을 제과 공정 불량품, 과일, 채소, 도축 폐기물 (갈색 육) 및 폐 낙농 산물을 포함하는 발효 기질로 사용된 혼합 음식 유기 폐기물의 다른 공급원에서 시험하였다. 폐기물을 혼합, 분쇄 및 멸균을 통해 전처리하였다. D-락테이트 옥시다제의 활성을 락트산 발효 전 및 후의 두 시점에서 유기 폐기물로부터 채취한 샘플에 대해 시험하였다. 이 실험에서 샘플을 원심분리 (9000 g, 10분)한 후 D-락테이트 옥시다제와 함께 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 효소 0.27 mg/ml를 상청액에 첨가하고 55℃에서 26시간 동안 인큐베이션하였다. D-락테이트의 농도를 인큐베이션 0, 4, 7, 14, 19 및 26시간째에 측정하였다.
발효 전에 채취한 샘플의 D-락테이트 농도는 대략 800 mg/L이었다. 발효 후 D-락테이트의 농도는 실질적으로 동일하게 유지되었다. 이 공정에서 L-락테이트 농도는 약 87,000 mg/L로 증가하였다. 다시 말하면, D-락트산과 비교하여 상당한 과량의 L-락트산의 존재 하에서 D-락테이트 옥시다제의 활성을 조사하는 것이 흥미로웠다.
효소와 함께 인큐베이션한 후 D-락테이트 농도를 측정하였다. 결과는 표 2 및 도 7c에 요약되어 있다. 도면은 시간=0에서 D-락테이트 농도의 백분율로 결과를 나타낸다.
[표 2]
D-락테이트 옥시다제와 함께 폐기물 상청액의 인큐베이션 후 D-락테이트 농도
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발효 전에 채취한 샘플에서 0.27 mg/ml 농도의 효소는 26시간 인큐베이션 후 폐기물에 존재하는 D-락테이트의 약 70%를 소모할 수 있었다. 흥미롭게도 발효 후 채취한 샘플에서 동일한 농도의 D-락테이트를 14시간 만에 소모할 수 있었다. D-락테이트 옥시다제와 함께 인큐베이션하기 전에 폐기물을 원심분리하였기 때문에, 점성 감소 외에도 발효가 완료된 후 다른 요인들이 활성을 향상시키는 것으로 보인다.
효소와 함께 인큐베이션한 후 D-락테이트의 농도는 224 mg/ml이며 발효 후 L-락테이트의 농도는 87,000 mg/ml이었다. 따라서 D-락테이트 옥시다제는 D-락테이트의 양을 발효 종료시 총 락테이트의 0.5% 미만으로 감소시킬 수 있었다. 다시 말하면, 효소는 D-락테이트에 비해 유의하게 과량의 L-락테이트가 존재하는 경우에도 상기와 같았다.
실시예 6
재조합 D-락테이트 옥시다제의 생산을 위한 개선된 프로토콜
실시예 1에 기재된 E. 콜라이 BL21 (DE3)/pET30-dox 세포의 밤새 배양액을 카나마이신 (50 μg/ml)을 포함하는 5 mL LB 배지에 접종하고 밤새 성장시켰다. 다음으로, 배양액 1 mL를 카나마이신이 포함된 TB 배지 (트립톤 12 g/l, 효모 추출물 24 g/l, 글리세롤 4 ml/l, KH2PO4-2.3 g/l, K2HPO4-16.43 g/l) 50 mL에 접종하고 O.D600이 1.2에 도달할 때까지 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 배양액을 15℃로 옮기고 IPTG를 0.5 mM의 최종 농도로 첨가하여 효소의 발현을 유도하였다. 15℃에서 20시간 인큐베이션한 후, 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 용해 완충액 (50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH=8)에 현탁하고 초음파 처리에 의해 파괴하였다.
세균 용해물을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상청액을 다시 9000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 생산된 펠렛과 상청액을 샘플 완충액과 혼합하고 끓인 다음 SDS-PAGE에서 시각화하였다. 단백질의 가용성 활성 형태는 상청액에 존재하며 비활성 단백질 응집물은 펠릿에 존재한다. 도 8에 도시된 바와 같이, 단백질의 대다수가 상청액에 존재하였으며, 이는 활성 가용성 형태에서의 단백질의 성공적인 발현을 나타낸다. 가용성 (상청액) 분획에서 단백질의 양은 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 달성된 것보다 유의하게 더 높았다.
미정제 상청액을 상기 기재된 바와 같이 D-락테이트의 분해에 대해 시험하였다.
실시예 7
항시적 프로모터를 사용한 글루코노박터 옥시단스로부터 재조합 D-락테이트 옥시다제의 생산
항시적 프로모터 하에 글루코노박터 옥시단스 균주 621H로부터 D-락테이트 옥시다제 (DOX)를 발현하는 pET30 플라스미드를 작제하였다. DOX를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 2)을 E. 콜라이에서의 발현에 유리하도록 변형시켰다. 변형된 서열은 서열번호 9로 제시된다. 효소를 His-태그와 함께 비분비 단백질로 발현시켰다.
유도성 T7 프로모터를 대체하여 DOX 코딩 서열의 상류에 클로닝된 하기 합성 프로모터 중 하나를 각각 포함하는 3가지 유형의 플라스미드를 작제하였다:
> 서열번호 3:
AAGCTGTTGTGACCGCTTGCTCTAGCCAGCTATCGAGTTGTGAACCGATCCATCTAGCAATTGGTCTCGATCTAGCGATAGGCTTCGATCTAGCTATGTAGAAACGCCGTGTGCTCGATCGCTTGATAAGGTCCACGTAGCTGCTATAATTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC
> 서열번호 4:
CTTGATAAGGTCCACGTAGCTGCTATAGTTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC
> 서열번호 5:
CCTGATAAGGTCCACAGTAGCTGCTATAATTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC
E. 콜라이에서의 발현을 위해 변형된 DOX를 암호화하는 핵산 서열을 상기 프로모터 각각과 함께 포함하는 핵산 작제물은 다음과 같이 제시된다:
- 서열번호 6 - 서열번호 3으로 제시된 프로모터 서열을 포함하는 핵산 작제물. 프로모터 서열은 서열번호 6의 위치 1 내지 190에 해당한다. DOX 코딩 서열은 서열번호 6의 위치 256 내지 1,692에 해당한다. 핵산 작제물은 N-말단 His-태그 및 위치 235 내지 255에서 His-태그의 상류에 Met 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
- 서열번호 7 - 서열번호 4로 제시된 프로모터 서열을 포함하는 핵산 작제물. 프로모터 서열은 서열번호 7의 위치 1 내지 69에 해당한다. DOX 코딩 서열은 서열번호 7의 위치 135 내지 1,571에 해당한다. 핵산 작제물은 N-말단 His-태그 및 위치 114 내지 134에서 His-태그의 상류에 Met 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
- 서열번호 8 - 서열번호 5로 제시된 프로모터 서열을 포함하는 핵산 작제물. 프로모터 서열은 서열번호 8의 위치 1 내지 70에 해당한다. DOX 코딩 서열은 서열번호 8의 위치 136 내지 1,572에 해당한다. 핵산 작제물은 N-말단 His-태그 및 위치 115 내지 135에서 His-태그의 상류에 Met 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
상기 핵산 작제물 각각은 프로모터 서열과 DOX 코딩 서열 사이에 리보솜 결합 부위를 추가로 포함한다.
각각의 플라스미드 유형에 대해, 플라스미드로 형질전환된 E. 콜라이 BL21 (DE3)의 밤새 배양액을 카나마이신 (50 ug/ml)을 포함하는 1L TB 배지 (트립톤 12 g/l, 효모 추출물 24 g/l, 글리세롤 4 ml/l, KH2PO4-2.3 g/l, K2HPO4 -16.43 g/l)에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 교반하였다. 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 용해 완충액 (50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH=8)에 현탁시키고 초음파 처리에 의해 파괴하였다.
항시적 프로모터 하에 D-락테이트 옥시다제를 발현하는 E. 콜라이의 박테리아 용해물을 D-락테이트의 분해에 대해 시험하였다. 대조군으로 실시예 1에서 생산된 D-락테이트 옥시다제 (0.27 mg/ml)를 사용하였다. 용해물을 총 반응 부피의 20% (v/v)로 첨가하였다: 효소를 포함하는 용해물 20 ul를 약 3,200 mg/L D-락테이트를 포함하는 완충액 80 ul pH=8에 첨가하고, 55℃에서 인큐베이션하였다. 활성을 총 25시간 동안 측정하였다. 결과는 도 9에 나와 있다. 25시간 후 실시예 1의 효소는 D-락테이트를 400 mg/L로 감소시킬 수 있었고, 박테리아 용해물은 단 6시간 후에 거의 모든 D-락테이트를 제거할 수 있었다 (170 mg/L).
실시예 8
동시 발효, 당화 및 D-락테이트 제거
A. 동시 공정: 글루코아밀라제 + DOX + 바실루스 코아글란스
폐기물 유량을 분쇄하고, 발효기에 첨가하고 멸균한다. 글루코아밀라제 (0.1 내지 1 gr/L), DOX (0.25 내지 0.65 mg/ml) 및 B. 코아굴란스 (10^6 내지 10^8 생존 박테리아 세포)를 50 내지 55℃의 온도 및 pH=5.5 내지 6.5에서 첨가한다. 글루코스 가능성 평가 및 초기 D-락테이트 농도 측정을 위해 발효기에 첨가하기 전에 폐기물로부터 샘플을 채취한다. 또한 샘플을 발효 공정 동안, 예를 들어 1 내지 10시간마다 또는 1 내지 5시간마다 채취하여 글루코스 및 총 락테이트 농도를 모니터링한다. 발효를 글루코스 농도가 0에 도달하고 총 락테이트 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 계속한다. 이 시점에서 목표까지 20 내지 48시간이 소요되고, D-락테이트 농도는 최종 총 락테이트의 0.5% 미만 수준으로 감소한다.
B. 동시 공정: "스파이크"에 첨가된 글루코아밀라제 + 바실루스 코아굴란스 + DOX
폐기물 유량을 분쇄하고, 발효기에 첨가하고 멸균한다. 글루코아밀라제 (0.1 내지 1 gr/L), DOX (0.1 내지 0.3 mg/ml) 및 B. 코아굴란스 (10^6 내지 10^8 생존 박테리아 세포)를 50 내지 55℃의 온도 및 pH=5.5 내지 6.5에서 첨가한다. 다섯 (5) 시간 후 DOX의 두 번째 투여량을 첨가한다 (0.1 내지 0.3 mg/ml). 5시간 후 DOX의 세 번째 투여량을 첨가한다. (0.1 내지 0.3 mg/ml). 5시간 후 DOX의 네 번째 투여량을 첨가한다 (0.1 내지 0.3 mg/ml). 글루코스 가능성 평가 및 초기 D-락테이트 농도 측정을 위해 발효기에 첨가하기 전에 폐기물로부터 샘플을 채취한다. 또한 샘플을 발효 공정 동안, 예를 들어 1 내지 10시간마다 또는 1 내지 5시간마다 채취하여 글루코스 및 락테이트 농도를 모니터링한다. 발효를 글루코스 농도가 0에 도달하고 총 락테이트 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 계속한다. 이 시점에서 목표까지 20 내지 48시간이 소요되고, D-락테이트 농도는 최종 총 락테이트의 0.5% 미만 수준으로 감소한다.
C. 발효 종료시 첨가된 DOX에 의한 동시 당화 및 발효
폐기물 유량을 분쇄하고, 발효기에 첨가하고 멸균한다. 글루코아밀라제 (0.1 내지 1 gr/L) 및 B. 코아굴란스 (10^6 내지 10^8 생존 박테리아 세포)를 50 내지 55℃의 온도 및 pH=5.5 내지 6.5에서 첨가한다. 글루코스 가능성 평가 및 초기 D-락테이트 농도 측정을 위해 발효기에 첨가하기 전에 폐기물로부터 샘플을 채취한다. 또한 샘플을 발효 공정 동안, 예를 들어 1 내지 10시간마다 또는 1 내지 5시간마다 채취하여 글루코스 및 총 락테이트 농도를 모니터링한다. 발효를 글루코스 농도가 0에 도달하고 총 락테이트 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 계속한다. 이 시점에서 목표까지 20 내지 48시간이 소요되고, 발효액을 원심분리 (9000 g, 10분)하고, 고체상을 따라낸다. DOX 효소를 액체 상청액에 첨가하고 (0.25 내지 0.65 mg/ml) 상청액을 10 내지 24시간 동안 50 내지 55℃ 및 pH=6 내지 7에서 인큐베이션한다. D-락테이트 농도가 총 락테이트의 0.5% 미만 수준으로 감소할 때까지 인큐베이션을 계속한다.
특정 실시양태에 대한 상기 기재내용은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 드러낼 수 있어 다른 연구자들이 현재의 지식을 적용함으로써 과도한 실험 없이 그리고 일반적인 개념에서 벗어나지 않고 이러한 특정 실시양태를 다양한 분야에 대해 용이하게 변형 및/또는 적용할 수 있으며, 따라서 이러한 적용 및 변형은 개시된 실시양태의 균등물의 의미 및 범위 내에서 이해되어야 하고 상기와 같이 의도된다. 본 명세서에 사용된 어구 또는 용어는 제한이 아니라 설명을 위한 것임을 이해해야 한다. 다양한 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 재료 및 단계는 본 발명에서 벗어남이 없이 다양한 대안적인 형태를 취할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> 3PLW Ltd. <120> PROCESSING ORGANIC WASTE USING A HIGHLY SPECIFIC D-LACTATE OXIDASE <130> PLW/007 PCT <150> US 62/831,758 <151> 2019-04-10 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 477 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <400> 1 Met Pro Glu Pro Val Met Thr Ala Ser Ser Ala Ser Ala Pro Asp Arg 1 5 10 15 Leu Gln Ala Val Leu Lys Ala Leu Gln Pro Val Met Gly Glu Arg Ile 20 25 30 Ser Thr Ala Pro Ser Val Arg Glu Glu His Ser His Gly Glu Ala Met 35 40 45 Asn Ala Ser Asn Leu Pro Glu Ala Val Val Phe Ala Glu Ser Thr Gln 50 55 60 Asp Val Ala Thr Val Leu Arg His Cys His Glu Trp Arg Val Pro Val 65 70 75 80 Val Ala Phe Gly Ala Gly Thr Ser Val Glu Gly His Val Val Pro Pro 85 90 95 Glu Gln Ala Ile Ser Leu Asp Leu Ser Arg Met Thr Gly Ile Val Asp 100 105 110 Leu Asn Ala Glu Asp Leu Asp Cys Arg Val Gln Ala Gly Ile Thr Arg 115 120 125 Gln Thr Leu Asn Val Glu Ile Arg Asp Thr Gly Leu Phe Phe Pro Val 130 135 140 Asp Pro Gly Gly Glu Ala Thr Ile Gly Gly Met Cys Ala Thr Arg Ala 145 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Polynucleotide <400> 9 atgcccgaac cagtaatgac agcttcaagc gcgagcgcgc cggatcgtct gcaagcggtt 60 ctgaaggcgc tgcagccggt gatgggtgaa cgtatcagca ccgcgccgag cgttcgtgag 120 gaacacagcc acggcgaggc gatgaacgcg agcaacctgc cggaagcggt ggtttttgcg 180 gagagcaccc aggatgtggc gaccgttctg cgtcactgcc acgaatggcg tgtgccggtg 240 gttgcgtttg gtgcgggcac cagcgttgaa ggtcacgtgg ttccgccgga gcaagcgatc 300 agcctggacc tgagccgtat gaccggcatt gtggatctga acgcggagga cctggattgc 360 cgtgttcagg cgggtatcac ccgtcaaacc ctgaacgtgg aaattcgtga caccggcctg 420 ttctttccgg ttgatccggg tggcgaggcg accatcggtg gcatgtgcgc gacccgtgcg 480 agcggtaccg cggcggtgcg ttacggcacc atgaaggaaa acgttctggg tctgaccgtg 540 gttctggcga ccggcgagat cattcgtacc ggtggccgcg tgcgtaaaag cagcaccggt 600 tatgacctga ccagcctgtt cgttggcagc gaaggtaccc tgggcatcat taccgaggtg 660 caactgcgtc tgcatggccg tccggacagc gttagcgcgg cgatctgcca atttgaaagc 720 ctgcacgatg cgattcagac cgcgatggag atcattcaat gcggtatccc gattacccgt 780 gtggaactga tggatagcgt tcagatggcg gcgagcatcc aatacagcgg tctgaacgaa 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Claims (46)

  1. 유기 폐기물(organic waste)을 가공하는 방법으로서, 상기 방법은
    (i) 유기 폐기물을 제공하는 단계; 및
    (ii) 유기 폐기물을 D-락테이트 옥시다제로 분해(digesting)하여 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유기 폐기물은 음식 폐기물, 생활 폐기물, 농업 폐기물, 식물 재료 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 유기 폐기물은 음식 폐기물인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans)로부터 유래되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 25 내지 60℃의 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 5.5 내지 7의 범위의 pH에서 수행되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, D-락테이트 옥시다제와 유기 폐기물의 접촉은 6 내지 48시간의 범위의 시간 기간 동안 수행되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 유기 폐기물 내의 당류를 분해하여 환원 당(reducing sugar)을 방출시키기 위해 하나 이상의 당류 분해 효소와 유기 폐기물을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 다당류 분해 효소인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 글루코아밀라제를 포함하는, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소와의 접촉 및 D-락테이트 옥시다제와의 접촉은 동시에 수행되는, 방법.
  12. 제8항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소와의 접촉 및 D-락테이트 옥시다제와의 접촉은 임의의 순서로 순차적으로 수행되는, 방법.
  13. 유기 폐기물을 가공하는 시스템으로서, 상기 시스템은
    (a) 유기 폐기물의 공급원; 및
    (b) D-락테이트 옥시다제
    를 포함하고,
    여기서, D-락테이트 옥시다제를 유기 폐기물과 혼합하고,
    유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하는, 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 유기 폐기물은 음식 폐기물, 생활 폐기물, 농업 폐기물, 식물 재료 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템.
  15. 제13항에 있어서, 유기 폐기물은 음식 폐기물인, 시스템.
  16. 제13항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 옥시단스로부터 유래되는, 시스템.
  17. 제16항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 25 내지 60℃의 범위의 온도에서 유기 폐기물과 혼합되는, 시스템.
  18. 제16항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 5.5 내지 7의 범위의 pH에서 유기 폐기물과 혼합되는, 시스템.
  19. 제13항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 6 내지 48시간의 범위의 시간 기간 동안 유기 폐기물과 혼합되는, 시스템.
  20. 제13항에 있어서, 유기 폐기물과 혼합되고 유기 폐기물 내의 당류를 분해하여 환원 당을 방출시키는 하나 이상의 당류 분해 효소를 추가로 포함하는, 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 다당류 분해 효소인, 시스템.
  22. 제20항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 글루코아밀라제를 포함하는, 시스템.
  23. 제20항에 있어서, D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해 효소는 유기 폐기물과 동시에 혼합되는, 시스템.
  24. 제20항에 있어서, D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해 효소는 유기 폐기물과 임의의 순서로 순차적으로 혼합되는, 시스템.
  25. 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    (i) D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계; 및
    (ii) L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계는 L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계 전에 수행되는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계는 L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계 후에 수행되는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, D-락테이트 옥시다제를 사용하여 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하는 단계는 L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 유기 폐기물을 발효시키는 단계와 동시에 수행되는, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 유기 폐기물은 음식 폐기물인, 방법.
  30. 제25항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 옥시단스로부터 유래된, 방법.
  31. 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    (i) 유기 폐기물을 제공하는 단계;
    (ii) 유기 폐기물과 D-락테이트 옥시다제 및 하나 이상의 당류 분해 효소를 접촉시킴으로써, 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하고 유기 폐기물 내의 당류를 분해하여 가용성 환원 당을 방출시키기 위해 유기 폐기물을 가공하는 단계;
    (iii) L-락트산만을 생산하는 락트산 생산 미생물로 가공된 유기 폐기물을 발효시켜 L-락트산을 수득하는 단계; 및
    (iv) 발효액으로부터 L-락트산을 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 유기 폐기물은 음식 폐기물인, 방법.
  33. 제31항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 옥시단스로부터 유래되는, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 글루코아밀라제를 포함하는, 방법.
  35. 제31항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소와의 접촉 및 D-락테이트 옥시다제와의 접촉은 동시에 수행되는, 방법.
  36. 제31항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소와의 접촉 및 D-락테이트 옥시다제와의 접촉은 임의의 순서로 순차적으로 수행되는, 방법.
  37. 제31항에 있어서, 단계 (ii) 및 단계 (iii)는 동시에 수행되는, 방법.
  38. 제31항에 있어서, 단계 (ii)는 단계 (iii) 전에 수행되는, 방법.
  39. 유기 폐기물로부터 L-락트산을 생산하는 시스템으로서,
    (a) 유기 폐기물의 공급원;
    (b) D-락테이트 옥시다제; 및
    (c) L-락테이트만을 생산하는 락트산 생산 미생물
    을 포함하고,
    여기서, D-락테이트 옥시다제는 유기 폐기물로부터 유래된 D-락트산을 제거하고, 락트산 생산 미생물은 유기 폐기물을 발효시켜 L-락테이트를 생산하는, 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소를 추가로 포함하는, 시스템.
  41. 제39항에 있어서,
    (a) 유기 폐기물의 공급원;
    (b) 유기 폐기물에 존재하는 D-락트산을 제거하기 위한 D-락테이트 옥시다제 및 선택적으로 유기 폐기물을 당화(saccharifying)하기 위한 하나 이상의 당류 분해 효소를 포함하는 가공 탱크(processing tank); 및
    (c) L-락트산만을 생산하는 락트산 생산 미생물을 포함하는 발효 탱크
    를 포함하고,
    여기서, 유기 폐기물은 가공 탱크에서 D-락테이트 옥시다제 및 선택적으로 하나 이상의 당류 분해 효소에 의해 가공되고, 가공된 폐기물은 L-락트산의 생산을 위해 발효 탱크로 전달되는, 시스템.
  42. 제39항에 있어서, 유기 폐기물은 음식 폐기물인, 시스템.
  43. 제39항에 있어서, D-락테이트 옥시다제는 글루코노박터 옥시단스로부터 유래되는, 시스템.
  44. 제40항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 글루코아밀라제를 포함하는, 시스템.
  45. D-락테이트 옥시다제를 발현하는 핵산 작제물(nucleic acid construct)로서, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터(promoter)를 포함하는 적어도 하나의 조절 서열(regulatory sequence)에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 9에 제시된 바와 같은 D-락테이트 옥시다제를 암호화(encoding)하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
  46. 제45항에 있어서, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 작제물.





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