WO2021235419A1 - コーンハルを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents

コーンハルを用いたタンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2021235419A1
WO2021235419A1 PCT/JP2021/018709 JP2021018709W WO2021235419A1 WO 2021235419 A1 WO2021235419 A1 WO 2021235419A1 JP 2021018709 W JP2021018709 W JP 2021018709W WO 2021235419 A1 WO2021235419 A1 WO 2021235419A1
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WO
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culture
particle size
protein
producing
corn hull
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PCT/JP2021/018709
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French (fr)
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加川雄介
齋藤悠香
山田勝成
野口拓也
西山竜士
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東レ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein by Trichoderma filamentous fungus using corn hull.
  • Trichoderma filamentous fungi are known to have high protein production ability, and studies on protein production using the same filamentous fungi have been conducted. Trichoderma filamentous fungi are known to have a high ability to produce cellulase, which is classified as a saccharifying enzyme among proteins, using cellulose, lactose, cellobiose, etc. as inducers. Since ancient times, many studies have been conducted on the modification of genes that control cellulase production and the optimization of culture conditions.
  • Patent Document 1 discloses that by adding soybean hull, pulp, corn hull, etc. to the medium when culturing Trichoderma filamentous fungi, the productivity of protein is improved, and the productivity of cellulase is particularly improved. Has been done.
  • Non-Patent Document 1 describes a method of culturing Trichoderma filamentous fungus in a medium to which glucose or lactose is added.
  • the present inventors paid particular attention to cornhal as a substance for improving the protein productivity of Trichoderma filamentous fungi, and studied diligently.
  • the particle size distribution based on the volume obtained by the measurement method by the laser diffraction / scattering method is relative to the range of the particle size of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less. It has been found that when a corn hull pulverized product having a particle size peak is added to a medium and a Trichoderma filamentous fungus is cultured, the effect of improving protein productivity is high, and the present invention has been completed.
  • the present invention is composed of the following (1) to (9).
  • (1) In the volume-based particle size distribution obtained by the measurement method by the laser diffraction / scattering method, a medium containing a corn hull pulverized product having a relative particle amount peak in the range of a particle size of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less was used.
  • a method for producing a protein which comprises a step of culturing.
  • (2) The method for producing a protein according to (1), wherein the medium contains glucose and / or lactose.
  • (3) The method for producing a protein according to (1) or (2), wherein the culture method in the culture step is deep culture.
  • (4) A step of holding the culture solution obtained in the culture step at 25 ° C. or higher and 55 ° C.
  • the method for producing a protein according to any one of (1) to (3) which comprises.
  • a method for producing sugar which comprises a step of producing cellulase by the method for producing a protein according to (5) or (6), and a step of saccharifying cellulose-containing biomass using the cellulase obtained in the above step.
  • Trichoderma filamentous fungi are cultivated using a corn hull pulverized product having a relative particle size peak in the range of a particle size of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less. By doing so, it becomes possible to efficiently produce the protein.
  • the filamentous fungi of the genus Trichoderma which is a microorganism originally excellent in the ability to produce proteins, are relatively relative to a particle size of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less. It is characterized in that protein is efficiently produced by culturing with a corn hull ground product having a particle size peak.
  • the genus Trichoderma filamentous fungus used in the present invention is also referred to as the genus Hypocrea, but is described as the genus Trichoderma in the present specification.
  • the Trichoderma genus filamentous fungus used in the present invention is preferably Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma atroviride, Trichoderma longibrachiatum, and more preferably Trichoderma rees.
  • the Trichoderma filamentous fungus is not limited to the wild strain, and a mutant strain of the Trichoderma filamentous fungus improved so as to enhance the protein production ability can also be preferably used.
  • a mutant strain of Trichoderma filamentous fungus is subjected to mutation treatment with a mutant agent or ultraviolet irradiation, so that the viscosity of the culture solution at the time of culturing is lowered and the protein productivity is improved.
  • a genetically modified strain in which the viscosity of the culture solution when the strain is cultured using the gene recombination technique can be used, or a genetically modified strain in which the protein productivity is improved can also be used.
  • a mutant strain obtained by combining the above-mentioned mutant agent or mutation treatment by irradiation with ultraviolet rays and gene recombination technology may be used.
  • Trichoderma reesei Trichoderma parareesei (ATCC MYA-4777), which is an ancestor of Trichoderma reesei, and a known mutant strain derived from Trichoderma reesei, QM6a strain (NBRC3244) (NBRC3243) (NBRC3243) PC-3-7 strain (ATCC66589), QM9123 strain (NBRC31327), RutC-30 strain (ATCC56765), CL-847 strain (Enzyme. Microbiol.Technol., 10,341-346 (1988)), MCG77 strain (Biotechnol) Bioeng. Symp., 8, 89 (1978)), MCG80 strain (Biotechnol.
  • the QM6a strain, QM9414 strain, and QM9123 strain can be obtained from NBRC (NITE Biological Resource Center), and the PC-3-7 strain and RutC-30 strain can be obtained from ATCC (American Type Culture Collection).
  • Corn hull is a seed coat that covers corn seeds and is a part of corn seeds.
  • Corn hull also referred to as corn seed coat, corn fiber, corn feed, etc., is referred to herein as corn hull.
  • the corn hull used in the present invention is preferably one having less impurities other than corn hull such as protein and starch.
  • the corn hull may be prepared directly from corn seeds and used, or may be obtained as a by-product of the corn starch manufacturing process.
  • the corn hull pulverized product used in the present invention has a relative particle amount peak in the range of particle diameter of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less in the volume-based particle size distribution obtained by the measurement method by the laser diffraction / scattering method.
  • the corn hull crushed product having the relative particle amount peak of the characteristic may be referred to as the corn hull crushed product of the present invention in the present specification.
  • the crushed corn hull of the present invention can be prepared by crushing the corn hull.
  • the pulverization conditions may be either wet or dry.
  • a well-known crusher may be used for crushing cone hulls, specifically, roller mills or jet mills classified as fine crushers, hammer mills or pin mills classified as high-speed rotary crushers, and container-driven mills. Examples include rotary mills, vibration mills or planetary mills that are classified, and attritors and bead mills that are classified as ultra-fine grinders.
  • the corn hull crushed product crushed by the crusher may be measured by using the measuring method shown below, and the crushing conditions of the crusher may be adjusted so that the crushed product having the desired particle size can be obtained.
  • the value measured based on the laser diffraction / scattering method is used.
  • Ethanol is used as the dispersant of the sample used for the measurement, and a 680 nm semiconductor laser is used as the light source.
  • the specific measurement method is as follows. First, the crushed corn hull of the measurement sample is mixed with ethanol used as a dispersion medium, and the sample is treated with ultrasonic waves for 3 minutes or more so as to be uniform. Then, using the sample, the intensity distribution at each scattering angle is measured at the sensor part of the instrument, and the scattering pattern of the standard sample closest to the actually measured scattering pattern is used using the scattering patterns of various standard samples calculated in advance. The particle content of each particle size is calculated from the pattern, and the particle size distribution is obtained.
  • the measuring instrument used in the present invention for measuring based on the laser diffraction / scattering method may be any measuring instrument capable of detecting a particle size of 0.01 ⁇ m or more and 1 mm or less.
  • a laser diffraction type particle size distribution manufactured by Shimadzu Corporation may be used.
  • a measuring device "SALD-2000J" or the like may be used.
  • the particle size is measured at least twice, and the average value thereof is used as the measured value.
  • the corn hull crushed product of the present invention is a corn hull crushed product having a relative particle amount peak in the range of a particle diameter of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less in a volume-based particle size distribution obtained by a measurement method by a laser diffraction / scattering method, and is preferable.
  • having a relative particle amount peak in the above range means a state having the highest relative particle amount peak among the detected peaks in the above range.
  • there are a plurality of indexes indicating the size of the particles other than the above-mentioned relative particle size peak, but whether or not the crushed cone hull of the present invention is applicable is the volume obtained by the measurement method by the laser diffraction / scattering method. In the standard particle size distribution, it is judged whether or not the relative particle amount peak is present in the range of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less.
  • the size of a particle may be shown as an average particle size (sometimes referred to as an average particle size as a synonym for the average particle size), but the average particle size is a particle whose relative particle size peaks. Even if the corn hull crushed product has an average particle size of 70 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less, which does not match the diameter, the corn hull crushed product having no relative particle size peak in the same range corresponds to the corn hull crushed product of the present invention. do not.
  • the method for culturing Trichoderma filamentous fungi using the medium to which the corn hull crushed product of the present invention is added is not particularly limited, and for example, liquid culture using a centrifuge tube, a flask, a jar fermenter, a tank or the like, a plate or the like is used. It can be cultivated by the solid culture that has been used. Trichoderma filamentous fungi need to be cultured under aerobic conditions, and among these culture methods, a jar fermenter or a deep culture in which the cells are cultured while being aerated or stirred in a tank is particularly preferable.
  • the aeration amount is preferably 0.1 vvm or more and 2.0 vvm or less, more preferably 0.3 vvm or more and 1.5 vvm or less, and particularly preferably 0.5 vvm or more and 1.0 vvm or less.
  • the culture temperature is preferably 25 ° C. or higher and 35 ° C. or lower, and more preferably 25 ° C. or higher and 31 ° C. or lower.
  • the pH condition in the culture is preferably pH 3.0 or more and pH 7.0 or less, and more preferably pH 4.0 or more and pH 6.0 or less.
  • the culture time is, under the condition that the protein is produced, until a recoverable amount of protein is accumulated, and is usually about 24 hours or more and 288 hours or less, more preferably 36 hours or more and 240 hours or less.
  • the protein produced in the present invention is not particularly limited, but a protein secreted from the cells can be efficiently produced, and among them, an enzyme is preferable, and cellulase, amylase, invertase, chitinase, and pectinase are more preferable.
  • an enzyme is preferable, and cellulase, amylase, invertase, chitinase, and pectinase are more preferable.
  • saccharifying enzyme more preferably cellulase.
  • the culture solution may be separated into a solid solution and the protein contained in the liquid fraction may be recovered.
  • the solid-liquid separation may be performed by any method such as filtration or centrifugation, and a filter press, a screw decanter, a continuous centrifuge or the like can be used.
  • the culture solution obtained by culturing Trichoderma filamentous fungi in a medium containing corn hull cannot obtain a clear liquid fraction during solid-liquid separation, and when solid-liquid separation is performed using a filter membrane or a filter cloth.
  • the filtration time may become longer due to the blockage of the filter membrane or filter cloth, but these problems can be solved by holding the culture solution obtained in the present invention at a constant temperature as a pretreatment for solid-liquid separation. ..
  • a pretreatment for solid-liquid separation a treatment for keeping the culture solution at a constant temperature may be described as a heat insulating treatment.
  • the holding temperature of the heat insulating treatment is preferably 25 ° C. or higher and 55 ° C. or lower, more preferably 30 ° C. or higher and 55 ° C. or lower, and particularly preferably 40 ° C. or higher and 50 ° C. or lower.
  • the heat insulation treatment time should be about 5 to 30 hours as a guide.
  • the heat insulation treatment may be performed under static conditions, but when the amount of the culture solution is large, it is preferable to perform the heat insulation treatment while stirring so that the temperature of the culture solution becomes uniform. When stirring, it is preferable to gently stir so that the dissolved oxygen concentration in the culture solution does not increase. For example, when a 5 L jar fermenter (manufactured by Biot Co., Ltd.) is used, 50 rpm or more and 700 rpm or less are preferable, 100 rpm or more and 600 rpm are more preferable, and 200 rpm or more and 500 rpm or less are particularly preferable. In addition to stirring, it is preferable to carry out the heat insulating treatment under the condition that the dissolved oxygen concentration of the culture solution does not increase. For example, when the aeration is performed during the culture, the aeration function may be cut off and the heat insulating treatment may be performed.
  • the culture solution subjected to the heat insulation treatment can obtain a clear liquid fraction as compared with the culture solution not subjected to the heat insulation treatment.
  • filtration resistance can be suppressed even with a high-speed filtration method such as vacuum filtration, enabling efficient solid-liquid separation.
  • a plastic holder for vacuum filtration such as a polysulfone holder (manufactured by Advantec Co., Ltd.) may be used.
  • the filter cloth used for solid-liquid separation using the polysulfone holder for example, a polypropylene filter cloth can be used, and the air permeability is 0.5 mL / (min * cm 2 ) or more and 500 mL / (min * cm). 2 )
  • the following filter cloth may be used.
  • the solid-liquid separation may be performed after precoating the filter cloth with the filtration aid.
  • Diatomaceous earth or the like may be used as the filtration aid, and examples thereof include "radiolite” (manufactured by Showa Chemical Industry Co., Ltd.), and the grade of "radiolite” may be # 100 or higher and # 3000.
  • the filtration aid may be used by being mixed in advance with the culture solution after the heat insulating treatment.
  • the filtration aid may be added in an amount of about 1% by weight or more and 20% by weight or less with respect to the culture solution.
  • the liquid fraction obtained by solid-liquid separation of the culture solution obtained in the present invention may be further sterilized using an MF membrane or concentrated using a UF membrane, depending on the intended use.
  • the turbidity of the liquid fraction is calculated as Nephelometer Turbidimetry Unit (Nephelometer turbidity unit, NTU).
  • NTU Nephelometer Turbidity unit
  • a commercially available turbidity meter may be used for measuring the turbidity, and examples thereof include a portable turbidity meter 2100P type (manufactured by HACH).
  • the turbidity meter may be calibrated in advance using a second standard solution approved by the manufacturer, such as a formazine solution.
  • the turbidity of the liquid fraction is preferably 500 NTU or less, more preferably 300 NTU or less, still more preferably 200 NTU or less, and particularly preferably 100 NTU or less.
  • Cellulase which is a protein preferably produced in the present invention, contains enzymes having degrading activity against xylan, cellulose, hemicellulose and the like. Specific examples include cellobiose hydrase (EC 3.21.91), which produces cellobiose by hydrolyzing the cellulose chain, and endoglucanase (EC 3.2.1.4), which hydrolyzes from the central portion of the cellulose chain. ), ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.21) that hydrolyzes cellooligosaccharide and cellobiose, xylanase (EC 3.2.1.8) characterized by acting on hemicellulose and especially xylan, xylooligosaccharide.
  • EC hydrase EC 3.21.91
  • endoglucanase EC 3.2.1.4
  • ⁇ -glucosidase EC 3.2.1.21 that hydrolyzes cellooligosaccharide and cellobio
  • ⁇ -Xyloseidase (EC 3.2.1.37) that hydrolyzes the above can be mentioned.
  • cellulase is produced according to the present invention, the protein concentration and activity are improved, and the effect is particularly remarkable in ⁇ -glucosidase.
  • the protein concentration is measured as follows.
  • the culture solution obtained by culturing Trichoderma filamentous fungi by the method of the present invention is centrifuged at 15,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant is used as a protein solution.
  • Cellulase Quick Start Bloodford Protein Assay (manufactured by Bio-Rad) Add 5 ⁇ L of diluted cellulase solution to 250 ⁇ L, and measure the absorbance used at 595 nm after standing at room temperature for 15 minutes. Using bovine serum albumin solution as a standard solution, calculate the protein concentration contained in the saccharifying enzyme solution based on the calibration curve.
  • the protein solution may be treated as a cellulase solution.
  • ⁇ -Glucosidase activity is measured by the following method. First, 10 ⁇ L of an enzyme diluted solution is added to 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM 4-nitrophenyl- ⁇ -glucopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.), and the mixture is reacted at 30 ° C. for 10 minutes. Next, 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate is added and mixed well to stop the reaction, and the increase in absorbance at 405 nm is measured. Finally, the activity is calculated with the activity of liberating 1 ⁇ mol of 4-nitrophenol per minute as 1U.
  • the composition of the medium for culturing the Trichoderma filamentous fungus used in the present invention is not particularly limited as long as the medium composition is such that the Trichoderma filamentous fungus can produce a protein other than the corn hull ground product of the present invention.
  • a well-known medium composition of Trichoderma can be adopted.
  • the nitrogen source for example, polypeptone, gravy, CSL, soybean meal and the like can be used.
  • an inducer for producing a protein may be separately added to the medium.
  • the concentration of the corn hull pulverized product of the present invention added to the medium may be about 1% by weight or more and 50% by weight or less as the final concentration in the medium, preferably 5% by weight or more and 30% by weight or less, and more preferably 5. It is 25% by weight or more and 25% by weight or less.
  • the medium may contain glucose and / or lactose, and it is preferable that both glucose and lactose are contained.
  • the amount of glucose and / or lactose added to the medium may be about 1 g / L, respectively.
  • Glucose and / or lactose may be added during the culture using the corn hull ground product of the present invention.
  • the state of glucose and / or lactose may be liquid or solid, but it is preferable to prepare and use a sugar solution by dissolving it in water or the like.
  • glucose and / or lactose is added in the middle of culturing using the corn hull pulverized product of the present invention, it is preferable to add 10 g or more of glucose and / or 1 g or more of lactose to 1 L of the culture solution per 24 hours of culturing. , 25 g or more of glucose and / or 2.5 g or more of lactose is more preferable, and 50 g or more of glucose and / or 5 g or more of lactose is particularly preferable.
  • the ratio of glucose to lactose of the mixed sugar added from the middle of the culture using the corn hull pulverized product of the present invention is preferably an equal amount or a larger amount of glucose than the amount of lactose.
  • the timing for starting the addition of the liquid sugar is preferably 144 hours from the start of the culture, more preferably 72 hours from the start of the culture, and particularly preferably 48 hours from the start of the culture.
  • the sugar may be added once, multiple times, or continuously.
  • an inducing substance that induces the production of cellulase such as cellulose or xylan may be further added to the medium.
  • biomass containing cellulose or xylan may be added as an inducer.
  • biomass containing celrol and xylan include plants such as seed plants, fern plants, moss plants, algae, and aquatic plants, as well as waste building materials. Seed plants are classified into gymnosperms and angiosperms, both of which can be preferably used.
  • Angiosperms are further classified into monocotyledonous plants and dicotyledonous plants, and specific examples of monocotyledonous plants include bagus, switchgrass, napiergrass, elianthus, corn stover, corn cob, rice straw, and straw.
  • dicotyledonous plants beet pulp, eucalyptus, nara, white hippopotamus and the like are preferably used.
  • pretreated biomass may be used as the biomass containing cellulose and xylan.
  • the pretreatment method is not particularly limited, and for example, known methods such as acid treatment, sulfuric acid treatment, dilute sulfuric acid treatment, alkali treatment, hydrothermal treatment, subcritical treatment, pulverization treatment, and steaming treatment can be used. Pulp may be used as the biomass containing such pretreated cellulose and xylan.
  • the culture solution containing the cells can be used as it is as the enzyme solution without removing the cells from the culture solution obtained by culturing the corn hull crushed product of the present invention and Trichoderma filamentous fungi, but the protein lysate.
  • the cellulose-containing biomass can be saccharified to produce sugar by using the cellulase.
  • the cellulase obtained by culturing the mutant strain has a particularly high activity of ⁇ -glucosidase as compared with the cellulase obtained by culturing the parent strain before the introduction of the mutation, the cellulose-containing biomass is efficiently decomposed. Therefore, a sugar solution having a high glucose concentration can be obtained, and more sugar can be obtained.
  • the same biomass as the cellulose-containing biomass described as the inducer or the pretreated biomass may be used as the saccharification target.
  • the conditions of the saccharification reaction are not particularly limited, but the temperature of the saccharification reaction is preferably in the range of 25 ° C. or higher and 60 ° C. or lower, and more preferably in the range of 30 ° C. or higher and 55 ° C. or lower.
  • the time of the saccharification reaction is preferably in the range of 2 hours or more and 200 hours or less.
  • the pH of the saccharification reaction is preferably in the range of pH 3.0 or more and pH 7.0 or less, and more preferably in the range of pH 4.0 or more and pH 6.0 or less. In the case of cellulase derived from Trichoderma filamentous fungus, the optimum pH for the reaction is 5.0. Further, since the pH changes in the process of hydrolysis, it is preferable to add a buffer solution to the reaction solution or use an acid or an alkali to maintain a constant pH.
  • the saccharified solution can be filtered with an ultrafiltration membrane or the like and recovered on the non-permeable side. You may remove it.
  • the recovered enzyme can be used again for the saccharification reaction.
  • Protein concentration measurement reagent Quick Start Bladeford Protein Assay (manufactured by Bio-Rad) Measurement conditions Measurement temperature: Room temperature Protein concentration measurement Reagent: 250 ⁇ L Filamentous fungus culture solution: 5 ⁇ L Reaction time: 5 minutes Absorbance: 595 nm Standard product: BSA.
  • Reaction time 10 minutes
  • Reaction terminator 2M sodium carbonate 10 ⁇ L
  • Absorption rate 405 nm.
  • Dispersion medium Primary ethanol Dispersion medium Usage amount: 10 mL Cell: batch cell Sonication processing conditions: Transmission frequency 40 kHz, 3 minutes.
  • ⁇ Test Example 1 Volume-based particle size distribution measurement of crushed corn hulls A to F by laser diffraction / scattering method Materis Co., Ltd. was requested to crush corn hull (manufactured by Taiohjima Ryushu Agricultural Products Processing Co., Ltd.) and corn hull. A pulverized product was prepared. The particle size of five types of crushed cone hulls was measured by the method of Reference Example 3, and in the volume-based particle size distribution obtained by the measurement method by the laser diffraction / scattering method, the particle size was 34.3 ⁇ m and the particle size was 41.9 ⁇ m. It was confirmed that the particle size peak was 114.5 ⁇ m, the particle size was 171.2 ⁇ m, and the particle size was 256.0 ⁇ m.
  • the corn hull crushed product having a relative particle amount peak at a particle size of 34.3 ⁇ m is changed to corn hull crushed product A
  • the corn hull crushed product having a relative particle amount peak at a particle size of 41.9 ⁇ m is changed to corn hull crushed product B and a particle size of 114.5 ⁇ m.
  • the corn hull crushed product having a relative particle amount peak is corn hull crushed product C
  • the corn hull crushed product having a relative particle amount peak at a particle size of 171.2 ⁇ m is corn hull crushed product D
  • corn hull crushed product E The product is referred to as corn hull crushed product E, and the corn hull crushed product having a relative particle amount peak at a particle diameter of 76.6 ⁇ m is referred to as corn hull crushed product F.
  • the particle size distribution of the corn hull crushed products A to E is shown in FIG. 1, and the particle size distribution of the corn hull crushed product F is shown in FIG.
  • the corn hull crushed product D is the same crushed product as the corn hull crushed product having an average particle size of 100 ⁇ m disclosed in Comparative Example 1 of International Publication No. 2018/159573.
  • Example 1 Batch culture using corn hull crushed product C (preculture)
  • the spores of Trichoderma reesei PC-3-7 strain (ATCC # 66589) were diluted with physiological saline to 1.0 ⁇ 10 7 / mL, and 1 mL of the diluted spore solution was diluted with 1 mL of the diluted spore solution in a flask with a 500 mL baffle shown in Table 1.
  • the cells were inoculated into 100 mL of preculture medium placed in the medium, and cultured in a shaking incubator at 28 ° C. and 120 rpm for 72 hours.
  • a main culture medium having the composition shown in Table 2 was prepared so that the corn hull pulverized product C prepared in Test Example 1 was 100 g / L, and a micro jar fermenter (Bio-Jr. 8, manufactured by Biot Co., Ltd.) was used. Deep cultures were examined using each.
  • the main culture was carried out by inoculating 10 mL of the preculture solution of the Trichoderma reesei PC-3-7 strain into 100 mL of the main culture medium.
  • the culture conditions after inoculating the preculture solution into the main culture medium, deep culture was performed for 96 hours under the culture conditions of 28 ° C., 900 rpm, and an aeration rate of 100 mL / min while controlling the pH to 5.
  • the protein concentration of cellulase was measured in.
  • the protein concentration contained in the culture medium obtained by culturing using the medium containing the corn hull pulverized product A was 9.0 g / L
  • the culture obtained by culturing using the medium containing the corn hull pulverized product B was 9.1 g / L
  • the protein concentration contained in the culture solution obtained by culturing using the medium containing the corn hull pulverized product D was 8.0 g / L
  • the corn hull pulverized product E was contained.
  • the protein concentration contained in the culture broth obtained by culturing using the medium was 7.2 g / L.
  • Table 3 The results are shown in Table 3.
  • Example 2 Batch culture using corn hull pulverized product C and addition culture of glucose and lactose (preculture) Trichoderma reesei PC-3-7 strain (ATCC # 66589) spores were diluted with physiological saline to 1.0 ⁇ 10 7 / mL, and 2.5 mL of the diluted spore solution was added to the 1 L baffle shown in Table 1. Inoculate the 250 mL preculture medium in the attached flask and inoculate. Incubation was carried out in a shaking incubator at 28 ° C. and 120 rpm for 72 hours.
  • Collecting culture medium 20 mL of the culture solution was collected at each time point from the start of the culture. A part of the collected culture broth was centrifuged at 15,000 ⁇ g for 10 minutes under the condition of 4 ° C. to obtain a supernatant. The supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and the obtained filtrate was used as a cellulase solution in the following experiments.
  • Example 3 Batch culture using corn hull crushed product F and additional culture of glucose and lactose A batch culture test was performed under the same conditions as in Example 1 except that corn hull crushed product F was used. After the culture test, a sample was prepared by the same method as in Example 1 and measured under the conditions of Reference Examples 1 and 2. As a result, in the batch culture using the corn hull ground product F, the protein concentration of cellulase in the culture solution 96 hours after the start of the culture was 9.4 g / L, and the activity of ⁇ -glucosidase was 2.5 U / mL. .. The results are shown in Table 3.
  • Example 2 A glucose and lactose addition culture test was performed under the same conditions as in Example 2 except that the corn hull crushed product F was used. After the culture test, a sample was prepared by the same method as in Example 2 and measured under the conditions of Reference Example 1. As a result of determining the relative value of the maximum protein concentration of the glucose and lactose addition culture to the protein concentration in the batch culture, it was found that the protein concentration was improved by 3.4 times. The results are shown in Table 5.
  • Example 4 Insulation treatment Solid-liquid separation using a culture solution (heat insulation treatment) The culture was carried out under the conditions of Example 2, and the pH control and aeration, which are the culture control of the 5L jar fermenter, were turned off 96 hours after the start of the culture. A part of the culture broth was collected from the culture tank and subjected to solid-liquid separation treatment. The remaining culture broth was kept warm for 12 hours by setting the stirring speed of the culture tank to 400 rpm and the temperature to 40 ° C. or 50 ° C.

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Abstract

レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物を含む培地を用いて、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養することにより、タンパク質を効率よく製造することが可能となる。

Description

コーンハルを用いたタンパク質の製造方法
　本発明は、コーンハルを用いたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌によるタンパク質の製造方法に関する。
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、高いタンパク質製造能を有していることが知られており、同糸状菌を用いたタンパク質の製造の検討が行われてきた。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、セルロース、ラクトース、セロビオースなどを誘導物質として、タンパク質の中でも特に糖化酵素に分類されるセルラーゼを製造する能力が高いことで知られており、タンパク質の製造量を強化するため、古くよりセルラーゼ製造を制御する遺伝子の改変、培養条件の最適化などの検討が多々行われている。
　特許文献１には、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養する際に、培地に大豆ハル、パルプ、コーンハル等を添加することで、タンパク質の生産性が向上し、特にセルラーゼの生産性が向上することが開示されている。
　また、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌のセルラーゼの製造量を向上させる方法として、非特許文献１では、グルコースやラクトースを添加した培地でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養する方法が記載されている。
国際公開第２０１８／１５９５７３号
Ａｎｔｏｎｅｌｌａ　Ａ，Ｒｕｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ａｎｄ　ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｆｕｎｇｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ　１４，２０１３，Ｐ２３０－２４９
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を用いて、タンパク質の生産性をより高める方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌のタンパク質生産性を向上させる物質として特にコーンハルに着目し、鋭意検討した。その結果、コーンハルを粉砕して調製した様々な粒子径のコーンハルの粉砕物のうち、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物を培地に添加してＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養すると、タンパク質の生産性の向上効果が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（９）で構成される。
（１）レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物を含む培地を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（２）前記培地がグルコースおよび／またはラクトースを含む、（１）に記載のタンパク質の製造方法。
（３）前記培養工程の培養方法が深部培養である、（１）または（２）に記載のタンパク質の製造方法。
（４）前記培養工程で得られた培養液を２５℃以上５５℃以下に保持する工程、および、前記保持工程後の培養液を固液分離して、液体画分から前記タンパク質を回収する工程を含む、（１）～（３）のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
（５）前記タンパク質がセルラーゼである、（１）～（４）のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
（６）前記セルラーゼが、少なくとも４－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシドを分解するβ－グルコシダーゼ活性を示す、（５）に記載のタンパク質の製造方法。
（７）（５）または（６）に記載のタンパク質の製造方法によりセルラーゼを製造する工程および前記工程で得られたセルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
（８）レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有する、コーンハル粉砕物。
（９）（８）に記載のコーンハル粉砕物を含む、培地。
　本発明は、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養することにより、タンパク質を効率よく製造することが可能となる。
レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準のコーンハル粉砕物Ａ～Ｅの粒度分布結果。 レーザー回析・散乱法による測定方法で得られた体積基準のコーンハル粉砕物Ｆの粒度分布結果。
　本発明は、もともとタンパク質の製造能に優れる微生物であるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、特に粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物と共に培養することにより、効率的にタンパク質の製造することを特徴としている。
　本発明で用いるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、Ｈｙｐｏｃｒｅａ属とも呼ばれるが、本明細書中ではＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属と記載する。本発明で用いるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、具体的にはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍが好ましく、より好ましくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉである。また、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、野生株に制限されず、タンパク質製造能が高まるように改良されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の変異株も好ましく用いることができる。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の変異株には、変異剤や紫外線照射などで変異処理を施すことで、培養した際の培養液の粘度が低下したり、タンパク質の生産性が向上したりした変異株を利用することができる。また、遺伝子組換え技術を用い、菌株を培養した際の培養液の粘度が低下した遺伝子組換え株や、タンパク質の生産性が向上した遺伝子組換え株も利用することができる。また、前記の変異剤や紫外線照射などによる変異処理と遺伝子組換え技術を組み合わせて得られた変異株を用いてもよい。
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの具体例は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの先祖にあたるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐａｒａｒｅｅｓｅｉ（ＡＴＣＣ　ＭＹＡ－４７７７）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ－８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．,１０，３４１－３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．,８，８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．,１２，４５１－４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ－３－７株、ＲｕｔＣ－３０株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。
　コーンハルとは、トウモロコシ種子を覆う種皮であり、トウモロコシ種子の一部である。コーンハルは、トウモロコシ種皮、コーンファイバー、コーンフィードなどとも呼ばれるが、本明細書中ではコーンハルと記載する。本発明で用いるコーンハルは、タンパク質やでんぷんなどのコーンハル以外の夾雑物が少ない物が好ましい。コーンハルは、トウモロコシの種子から直接調製して用いてもよいし、コーンスターチの製造過程の副産物として得られたものを用いることもできる。
　本発明で用いるコーンハル粉砕物は、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有する。以降、当該特徴の相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物を、本明細書中では、本発明のコーンハル粉砕物と記載する場合がある。
　本発明のコーンハル粉砕物は、コーンハルを破砕して調製することができる。粉砕条件は、湿式または乾式のどちらの条件でもよい。コーンハルの粉砕には周知の粉砕機を用いればよく、具体的には、微粉砕機に分類されるローラーミルまたはジェットミル、高速回転粉砕機に分類されるハンマーミルまたはピンミル、容器駆動型ミルに分類される回転ミル、振動ミルまたは遊星ミル、超微粉砕機に分類されるアトライターやビーズミルが挙げられる。粉砕機で粉砕したコーンハル粉砕物は、以下に示す測定方法を用いて測定し、目的の粒子径を有する粉砕物が得られるように、粉砕機の粉砕条件を調整すればよい。
　本発明のコーンハル粉砕物の粒子径は、レーザー回折・散乱法に基づいて測定した値を用いる。測定の際に用いる試料の分散剤にはエタノールを、光源には６８０ｎｍの半導体レーザーを用いる。具体的な測定方法は以下の通りである。まず、分散媒として用いるエタノールへ測定試料のコーンハル粉砕物を混合し、均一になるよう超音波で３分以上処理した物を測定用サンプルとする。そして、そのサンプルを用い、機器のセンサー部分で各散乱角度での強度分布を測定し、予め計算されている種々の標準試料の散乱パターンを用いて、最も実測の散乱パターンに近い標準試料の散乱パターンから各粒子径の粒子含有量を計算し、粒子径分布を求める。
　本発明で用いるレーザー回折・散乱法に基づいて測定する測定器は、０．０１μｍ以上１ｍｍ以下の粒子径を検出可能な測定器であればよく、例えば、株式会社島津製作所製レーザー回折式粒度分布測定装置“ＳＡＬＤ－２０００Ｊ”などを用いればよい。また、粒子径の測定は少なくとも２回以上行い、その平均値を測定値とする。
　本発明のコーンハル粉砕物は、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物であり、好ましくは粒子径７０μｍ以上１４０μｍ以下の範囲、より好ましくは粒子径７０μｍ以上１３０μｍ以下の範囲、さらに好ましくは粒子径７０μｍ以上１２０μｍ以下の範囲、特に好ましくは７５μｍ以上１２０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物である。本発明において、前記の範囲に相対粒子量ピークを有するとは、前記の範囲に、検出されたピークのうち一番高い相対粒子量ピークを有している状態を指す。ここで、前記の相対粒子量ピーク以外にも粒子の大きさを示す指標が複数あるが、本発明のコーンハル粉砕物に該当するかどうかは、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するかどうかで判断する。例えば、粒子の大きさを平均粒子径（平均粒子径と同義の用語として平均粒径の名称で示される場合もある）として示す場合があるが、平均粒子径が相対粒子量がピークとなる粒子径と一致するわけではなく、平均粒子径が７０μｍ以上１５０μｍ以下のコーンハル粉砕物であっても、同範囲に相対粒子量ピークを有さないコーンハル粉砕物は、本発明のコーンハル粉砕物には該当しない。
　本発明のコーンハル粉砕物を添加した培地を用いたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養方法は特に限定されず、例えば、遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、好気的条件で培養する必要があり、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１ｖｖｍ以上２．０ｖｖｍ以下が好ましく、０．３ｖｖｍ以上１．５ｖｖｍ以下がより好ましく、０．５ｖｖｍ以上１．０ｖｖｍ以下が特に好ましい。培養温度は、２５℃以上３５℃以下が好ましく、２５℃以上３１℃以下がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０以上ｐＨ７．０以下が好ましく、ｐＨ４．０以上ｐＨ６．０以下がより好ましい。培養時間は、タンパク質が製造される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで行い、通常、２４時間以上２８８時間以下程度であり、３６時間以上２４０時間以下がより好ましい。
　本発明で製造するタンパク質は特に制限はないが、菌体外に分泌されるタンパク質を効率的に製造することができ、中でも好ましくは酵素であり、より好ましくはセルラーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼなどの糖化酵素であり、さらに好ましくはセルラーゼである。
　本発明で得られた培養液から、タンパク質を回収する場合は、培養液を固液分離し液体画分に含まれるタンパク質を回収すればよい。固液分離はろ過や遠心分離など任意の方法で行えばよく、フィルタープレス、スクリューデカンタ、連続遠心分離機などを用いることができる。
　コーンハルを含む培地でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養して得られる培養液は、固液分離の際に清澄な液体画分が得られなくなる、また、ろ過膜またはろ布を用いて固液分離する際にろ過膜またはろ布の閉塞によりろ過時間が長くなる場合があるが、これらの課題は、固液分離の前処理として、本発明で得られた培養液を一定温度で保持することで解決できる。なお、本明細書中では、固液分離の前処理として、培養液を一定温度に保持する処理を保温処理と記載する場合がある。
　保温処理の保持温度は、好ましくは２５℃以上５５℃以下、より好ましくは３０℃以上５５℃以下、特に好ましくは４０℃以上５０℃以下である。
　保温処理の処理時間は、５時間～３０時間程度を目安に行えばよい。
　保温処理は静置条件で行ってもよいが、培養液の液量が多い場合には、培養液の温度が均一になるよう、撹拌しながら行うことが好ましい。撹拌する際には、培養液中の溶存酸素濃度が高まらないように穏やかに撹拌することが好ましい。例えば、５Ｌジャーファーメンター（株式会社バイオット製）を用いた場合では、５０ｒｐｍ以上７００ｒｐｍ以下が好ましく、１００ｒｐｍ以上６００ｒｐｍがより好ましく、２００ｒｐｍ以上５００ｒｐｍ以下が特に好ましい。撹拌以外にも培養液の溶存酸素濃度が高まらない条件で保温処理をすることが好ましく、例えば、培養時に通気を行っている場合には、通気機能を遮断して保温処理をすればよい。
　保温処理を行った培養液は、保温処理をしていない培養液に比べて清澄な液体画分を得ることが可能となる。また、減圧ろ過などの高速ろ過方法でもろ過抵抗を抑えられ、効率的な固液分離が可能となる。減圧ろ過を行う際には、ポリサルホンホルダー（株式会社アドバンテック製）などの減圧ろ過用プラスチックホルダーを利用すればよい。
　ポリサルホンホルダーを用いて固液分離する際に使用するろ布は、例えばポリプロピレン製のろ布を使用することができ、通気度が０．５ｍＬ／（ｍｉｎ＊ｃｍ２）以上５００ｍＬ／（ｍｉｎ＊ｃｍ２）以下程度のろ布を用いればよい。その際、ろ過助剤をろ布にコートをするプリコートをしてから固液分離をしてもよい。ろ過助剤には珪藻土などを用いればよく、例えば“ラヂオライト”（昭和化学工業株式会社製）を挙げることができ、“ラヂオライト”のグレードは、＃１００以上＃３０００程度を用いればよい。ろ過助剤は、保温処理後の培養液と予め混合して用いてもよい。ろ過助剤と保温処理後の培養液と予め混合して用いる場合は、ろ過助剤を培養液に対して１重量％以上２０重量％以下程度で添加すればよい。
　その他、保温処理を静置で行った場合や、保温処理後の培養液を静置した場合には、上方に固形成分が、下方に液体成分が分離されるため、下方の液体画分を採取することで固液分離を行うこともできる。
　本発明で得られた培養液を固液分離して得られた液体画分は、用途に応じてさらにＭＦ膜を使って除菌を行ったり、ＵＦ膜を使って濃縮したりすればよい。
　前記液体画分の濁度は、Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ　Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ　Ｕｎｉｔ（比濁法濁度単位、ＮＴＵ）として算出する。濁度の測定には、市販の濁度計を使用すればよく、例えば、携帯用濁度計２１００Ｐ型（ＨＡＣＨ社製）などが挙げられる。濁度計は、予めホルマジン溶液などメーカー承認の第二標準液を用いて校正を行えばよい。
　前記液体画分の濁度は、好ましくは５００ＮＴＵ以下、より好ましくは３００ＮＴＵ以下、さらに好ましくは２００ＮＴＵ以下、特に好ましくは１００ＮＴＵ以下である。
　本発明で好ましく製造されるタンパク質であるセルラーゼには、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ　３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．３７）などが挙げられる。本発明によりセルラーゼを製造する場合、、タンパク質濃度や活性が向上し、特に、β－グルコシダーゼに当該効果が顕著に表れる。
　本発明において、タンパク質濃度は以下の通り測定を行う。本発明の方法でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養することにより得られた培養液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をタンパク質溶液とする。セルラーゼＱｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　プロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で１５分間静置後の５９５ｎｍで用いる吸光度を測定する。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいて糖化酵素溶液に含まれるタンパク質濃度を算出する。また、セルラーゼのタンパク質濃度を測定する場合には、当該タンパク質溶液をセルラーゼ溶液として取り扱えばよい。
　β－グルコシダーゼ活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭの４－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させる。次に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌの４－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして活性を算出する。
　本発明で用いるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養する培地の組成は、本発明のコーンハル粉砕物以外に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌がタンパク質を製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の周知の培地組成を採用することができる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを用いることができる。また、培地には、タンパク質を製造させるための誘導物質を別途添加してもよい。
　前記培地に添加する本発明のコーンハル粉砕物の濃度は、培地への終濃度として１重量％以上５０重量％以下程度であればよく、好ましくは５重量％以上３０重量％以下、より好ましくは５重量％以上２５重量％以下である。
　また、前記培地にはグルコースおよび／またはラクトースが含まれていてもよく、グルコースおよびラクトースが両方含まれていることが好ましい。グルコースおよび／またはラクトースを培地への添加量は、それぞれ１ｇ／Ｌ程度であればよい。
　グルコースおよび／またはラクトースは、本発明のコーンハル粉砕物を用いた培養の途中で添加してもよい。この場合、グルコースおよび／またはラクトースの状態は液体でも固体でもよいが、水などに溶解させて糖液を調製して用いることが好ましい。本発明のコーンハル粉砕物を用いた培養の途中からグルコースおよび／またはラクトースを追加する場合には、培養２４時間あたり培養液１Ｌに対して、グルコース１０ｇ以上および／またはラクトース１ｇ以上添加することが好ましく、グルコース２５ｇ以上および／またはラクトース２．５ｇ以上添加することがより好ましく、グルコース５０ｇ以上および／またはラクトース５ｇ以上添加することが特に好ましい。
　また、本発明のコーンハル粉砕物を用いた培養の途中から添加する混合糖のグルコースとラクトースの比率は、等量または、ラクトース量よりもグルコース量を多く添加することが好ましい。また、液糖の添加を開始するタイミングは、培養開始から１４４時間までが好ましく、培養開始から７２時間までがより好ましく、培養開始から４８時間までが特に好ましい。糖の添加は、一回でもよいし、複数回でもよいし、連続的に添加してもよい。
　本発明によりセルラーゼを製造する場合には、前記培地にさらにセルロースや、キシランなどのセルラーゼの製造を誘導する誘導物質を添加してもよい。また、セルロースやキシランは、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導物質として添加してもよい。セルロールやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類されるが、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としては、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが好ましく用いられる。
　また、セルロースやキシランを含むバイオマスは、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロールやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。
　また、本発明のコーンハル粉砕物とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養した培養液から菌体を除去せずに、菌体を含んだ培養液をそのまま酵素液として使用することもできるが、タンパク質の溶解液として利用する場合には、培養液中でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌が生育できないように処理することが好ましい。菌体が生育できないように処理する方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。
　また、製造対象であるタンパク質がセルラーゼの場合には、当該セルラーゼを用いて、セルロース含有バイオマスを糖化して、糖を製造することができる。また、前記変異株を培養して得られるセルラーゼは、前記変異導入前の親株を培養して得られるセルラーゼと比較して特にβ－グルコシダーゼの活性が高いため、効率的にセルロース含有バイオマスを分解してグルコース濃度の高い糖液を得ることができ、より多くの糖を得ることができる。
　また、前記誘導剤として記載したセルロースを含むバイオマスと同様のバイオマスや、前処理されたバイオマスを糖化対象として用いてもよい。
　糖化反応の条件は、特に限定されないが、糖化反応の温度は、２５℃以上６０℃以下の範囲であることが好ましく、特に３０℃以上５５℃以下の範囲であることがより好ましい。糖化反応の時間は、２時間以上２００時間以下の範囲であることが好ましい。糖化反応のｐＨは、ｐＨ３．０以上ｐＨ７．０以下の範囲が好ましく、ｐＨ４．０以上ｐＨ６．０以下の範囲であることがさらに好ましい。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼの場合、その反応最適ｐＨは５．０である。さらに、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。
　糖化液から酵素を分離回収する場合には、糖化液を限外ろ過膜などでろ過し、非透過側に回収することができる、必要に応じてろ過の前工程として、糖化液から固形分を取り除いておいてもよい。回収した酵素は、再び糖化反応に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
　＜参考例１＞タンパク質濃度測定条件
タンパク質濃度測定試薬：Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）
測定条件
測定温度：室温
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
糸状菌の培養液：５μＬ
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。
　＜参考例２＞セルラーゼの活性の測定条件
　（β－グルコシダーゼ活性の測定条件）
基質：４－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）
反応液：１ｍＭの４－ニトロフェニル－β－グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。
　＜参考例３＞粒度分布の測定条件
　（前処理）
分散媒：１級エタノール
分散媒使用量：１０ｍＬ
セル：回分セル
超音波処理条件：発信周波数４０ｋＨｚ、３分間。
　（粒度分布測定）
装置：レーザー回折式粒度分布測定装置　ＳＡＬＤ－２０００Ｊ（株式会社島津製作所製）
光源：半導体レーザー（波長：６８０ｎｍ）
センサー：７６素子回折／散乱光センサー
測定温度：２２～２５℃
粒子の複素屈折率：２．００～０．２０ｉ（装置マニュアル中の標準屈折率の値）
粒子計測範囲：０．０３～７００μｍ
測定ｎ数：２（測定液を替えて２回測定し平均値を用いた）。
　＜試験例１＞コーンハル粉砕物ＡからＦのレーザー回折・散乱法による体積基準の粒度分布測定
　コーンハル（泰皇島流涌農産品加工有限公司製）をマテリス株式会社に依頼して破砕し、コーンハル粉砕物を調製した。５種類のコーンハル粉砕物を、参考例３の方法で粒子径を測定し、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径３４．３μｍ、粒子径４１．９μｍ、粒子径１１４．５μｍ、粒子径１７１．２μｍ、粒子径２５６．０μｍに相対粒子量ピークを有することを確認した。
　以降、粒子径３４．３μｍに相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物をコーンハル粉砕物Ａ、粒子径４１．９μｍに相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物をコーンハル粉砕物Ｂ、粒子径１１４．５μｍに相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物をコーンハル粉砕物Ｃ、粒子径１７１．２μｍに相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物をコーンハル粉砕物Ｄ、粒子径２５６．０μｍに相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物をコーンハル粉砕物Ｅ、粒子径７６．６μｍに相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物をコーンハル粉砕物Ｆと呼称する。コーンハル粉砕物Ａ～Ｅの粒度分布を図１に、コーンハル粉砕物Ｆの粒度分布を図２に示す。
　なお、コーンハル粉砕物Ｄは、国際公開第２０１８／１５９５７３号の比較例１で開示されている平均粒径１００μｍのコーンハル粉砕物と同じ粉砕物である。
　＜実施例１＞コーンハル粉砕物Ｃを用いたバッチ培養
　（前培養）
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液１ｍＬを表１に示した５００ｍＬバッフル付きフラスコへ入れた１００ｍＬの前培養培地へ植菌させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（本培養）
　試験例１で調製したコーンハル粉砕物Ｃを１００ｇ／Ｌになるように、表２で示した組成の本培養培地を調製し、マイクロジャーファーメンター（Ｂｉｏ－Ｊｒ．８、株式会社バイオット製）を用い、それぞれ深部培養検討を行った。
　本培養は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＰＣ－３－７株の前培養液１０ｍＬを、本培養培地１００ｍＬに接種して行った。
　培養条件は、本培養培地に前培養液を接種後、２８℃、９００ｒｐｍ、通気量１００ｍＬ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５に制御しながら深部培養を９６時間行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（培養液の採取）
　培養開始９６時間後に１ｍＬ培養液を採取した。培養液を１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液をタンパク質溶液およびセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いた。
　（タンパク質濃度の測定）
　参考例１で記載した手法を用い、培養開始９６時間目の培養液におけるセルラーゼのタンパク質濃度を測定した。その結果、培養液に含まれるタンパク質濃度は９．６ｇ／Ｌであった。
　（β－グルコシダーゼ活性の測定）
　参考例２の条件で、培養途中に採取した培養液におけるセルラーゼの活性として、β－グルコシダーゼの活性をそれぞれ測定した。活性は、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定し、１分間あたり１μｍｏｌの基質を遊離する活性を１Ｕとして算出した。その結果、コーンハル粉砕物Ｃを用いた培養で得られた培養液の活性は２．５Ｕ／ｍＬであった。結果を表３に示す。
　＜比較例１＞コーンハル粉砕物Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅを用いたバッチ培養
　（タンパク質濃度の測定）
　試験例１で調製したコーンハル粉砕物Ａ、Ｂ、Ｅを用いた以外は、実施例1と同様の条件操作で、バッチ培養試験を行った。培養時間は、コーンハル粉砕物ＡまたはＢを用いた培養では、９６時間、コーンハル粉砕物ＤまたはＥを用いた培養試験では、培養液中のタンパク質濃度が低かったため、１２０時間まで培養を延長した。その後、参考例１で記載した手法を用い、コーンハル粉砕物Ａ、Ｂを用いた培養においては培養開始９６時間目、コーンハル粉砕物Ｄ、Ｅを用いた培養においては培養開始１２０時間目の培養液におけるセルラーゼのタンパク質濃度を測定した。その結果、コーンハル粉砕物Ａを含む培地を用いて培養して得られた培養液に含まれるタンパク質濃度は９．０ｇ／Ｌ、コーンハル粉砕物Ｂを含む培地を用いて培養して得られた培養液に含まれるタンパク質濃度は９．1ｇ／Ｌ、コーンハル粉砕物Ｄを含む培地を用いて培養して得られた培養液に含まれるタンパク質濃度は、８．０ｇ／Ｌ、コーンハル粉砕物Ｅを含む培地を用いて培養して得られた培養液に含まれるタンパク質濃度は７．２ｇ／Ｌであった。結果を表３に示す。
　（β－グルコシダーゼ活性の測定）
　参考例２の条件で、培養途中に採取した培養液におけるセルラーゼの活性として、β－グルコシダーゼの活性をそれぞれ測定した。活性は、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定し、１分間あたり１μｍｏｌの基質を遊離する活性を１Ｕとして算出した。その結果、コーンハル粉砕物Ａの培養液における活性は２．１Ｕ／ｍＬ、コーンハル粉砕物Ｂの培養液における活性は２．０Ｕ／ｍＬ、コーンハル粉砕物Ｄの培養液における活性は１．７Ｕ／ｍＬ、コーンハル粉砕物Ｅにおける活性は１．２Ｕ／ｍＬであった。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜実施例２＞コーンハル粉砕物Ｃを用いたバッチ培養とグルコースおよびラクトースの添加培養
　（前培養）
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを表１に示した１Ｌバッフル付きフラスコへ入れた２５０ｍＬの前培養培地へ植菌させ、
振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行った。
　（本培養）
　試験例１で調製したコーンハル粉砕物Ｃを１００ｇ／Ｌになるように用い、表２で示した組成の本培養培地を調製し、５Ｌジャーファーメンター（株式会社バイオット製）を用い、深部培養を行った。
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＰＣ－３－７株の前培養液２００ｍＬをコーンハル粉砕物Ｃがそれぞれ添加された本培養培地２Ｌに接種した。前培養は、試験例１と同様に行った。本培養の培養条件は、本培養培地に前培養培地を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら２４０時間の深部培養を行った。
　（本培養途中におけるグルコースおよびラクトースの添加）
　本培養開始１０時間目に、表４で示したグルコースおよびラクトースの液糖培地を１日につき本培養液へ２５０ｍＬずつ培養開始２４０時間目まで添加し続けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（培養液の採取）
　培養開始より経時的に各時点で２０ｍＬの培養液を採取した。採取した培養液の一部は、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いた。
　（タンパク質濃度の測定）
　コーンハル粉砕物Ｃを用いて培養した培養液より経時的に採取したタンパク質濃度を、参考例１の条件で測定し、実施例１のバッチ培養におけるタンパク質濃度に対する本実施例２の最大タンパク質濃度の相対値を求めた結果、タンパク質濃度が３．３倍向上した。結果を表５に示す。
　＜実施例３＞コーンハル粉砕物Ｆを用いたバッチ培養とグルコースおよびラクトースの添加培養
　コーンハル粉砕物Ｆを用いた以外は、実施例１と同様の条件操作でバッチ培養試験を行った。培養試験後、実施例１と同様の方法でサンプルを調製し、参考例１と２の条件で測定した。その結果、コーンハル粉砕物Ｆを用いたバッチ培養では、培養開始９６時間目の培養液におけるセルラーゼのタンパク質濃度は９．４ｇ／Ｌであり、β－グルコシダーゼの活性は２．５Ｕ／ｍＬであった。結果を表３に示す。
　コーンハル粉砕物Ｆを用いた以外は、実施例２と同様の条件操作でグルコースおよびラクトースの添加培養試験を行った。培養試験後、実施例２と同様の方法でサンプルを調製し、参考例１の条件で測定した。バッチ培養におけるタンパク質濃度に対するグルコースおよびラクトースの添加培養の最大タンパク質濃度の相対値を求めた結果、タンパク質濃度が３．４倍向上したことがわかった。結果を表５に示す。
　＜比較例２＞コーンハル粉砕物Ａ、Ｂ、Ｄを用いたバッチ培養とグルコースおよびラクトースの添加培養
　コーンハル粉砕物Ａ、Ｂ、Ｄを用いた以外は、実施例２と同様の条件操作で培養試験を行った。培養試験後、実施例２と同様の方法でサンプルを調製し、参考例１の条件で測定し、比較例１のバッチ培養におけるタンパク質濃度に対する液糖添加培養時の最大タンパク質濃度の相対値を求めた。その結果、コーンハル粉砕物ＡまたはＢを用いた場合は共に２．６、コーンハル粉砕物Ｄを用いた場合は１．８であった。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　＜実施例４＞保温処理培養液を用いた固液分離
　（保温処理）
　実施例２の条件にて培養を行い、培養開始後９６時間目にて５Ｌジャーファーメンターの培養制御であるｐＨ制御と通気を切った。培養槽から培養液の一部を採取して、固液分離処理を行った。また、残りの培養液は、培養槽の撹拌数を４００ｒｐｍ、温度を４０℃または５０℃に設定し、１２時間の保温処理を行った。
　（固液分離処理）
　ポリサルホンホルダー　ＫＰ－４７Ｓ（株式会社アドバンテック製）にポリプロピレン製からなるろ布（日立造船株式会社製）をセットし、そこに１０％（ｗ／ｖ）になるよう“ラヂオライト”＃７００（昭和化学工業株式会社製）を添加したＲＯ水を添加後、減圧してプリコート層を形成した。そして、保温処理培養液２０ｍＬに“ラヂオライト”＃７００を１ｇ添加して充分に混合した溶液を添加し、減圧して固液分離した。
　（濁度測定）
　固液分離して得られたろ液２０ｍＬを、携帯用濁度計２１００Ｐ型（ＨＡＣＨ社製）を使って濁度を測定した。その結果、保温処理を行わなかった場合は、ＮＴＵが８０４であったのに対して、保温処理が４０℃の条件ではＮＴＵが３０３、５０℃の条件ではＮＴＵが９０であり、保温処理によってろ液の濁度が顕著に低くなり、より清澄な液体画分が得られた。
　＜まとめ＞
　表３および表５に示した実施例および比較例の結果から、レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有する本発明のコーンハル粉砕物を添加してＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養した場合、それ以外の粒子径のコーンハル粉砕物を用いた培養よりも、培養液中のβ－グルコシダーゼの活性や、タンパク質濃度が高くなり、タンパク質の生産性が向上した。また、培養の途中でグルコースおよびラクトースを添加した培養試験では、グルコースやラクトースを添加して培養することによる培養液中のタンパク質濃度の向上効果も本発明のコーンハル粉砕物を用いた場合、特に高く示された。

Claims (9)

  1. 　レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有するコーンハル粉砕物を含む培地を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
  2. 　前記培地がグルコースおよび／またはラクトースを含む、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
  3. 　前記培養工程の培養方法が深部培養である、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
  4. 　前記培養工程で得られた培養液を２５℃以上５５℃以下に保持する工程、および前記保持工程後の培養液を固液分離して、液体画分から前記タンパク質を回収する工程を含む、請求項１～３のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
  5. 　前記タンパク質がセルラーゼである、請求項１～４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
  6. 　前記セルラーゼが、少なくとも４－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシドを分解するβ－グルコシダーゼ活性を示す、請求項５に記載のタンパク質の製造方法。
  7. 　請求項５または６に記載のタンパク質の製造方法によりセルラーゼを製造する工程および前記工程で得られたセルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
  8. 　レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において、粒子径７０μｍ以上１５０μｍ以下の範囲に相対粒子量ピークを有する、コーンハル粉砕物。
  9. 　請求項８に記載のコーンハル粉砕物を含む、培地。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023171644A1 (ja) 2022-03-08 2023-09-14 東レ株式会社 ろ過助剤、ろ過処理方法およびセルラーゼの製造方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011115039A1 (ja) * 2010-03-15 2011-09-22 東レ株式会社 糖液の製造方法およびその装置
WO2011115040A1 (ja) * 2010-03-15 2011-09-22 東レ株式会社 糖液の製造方法およびその装置
WO2013151093A1 (ja) * 2012-04-04 2013-10-10 花王株式会社 有機酸の製造方法
JP2016106538A (ja) * 2014-12-03 2016-06-20 東レ株式会社 トリコデルマ・リーセイ変異株およびそれを用いたセロビオハイドラーゼの製造方法
WO2018159573A1 (ja) * 2017-02-28 2018-09-07 東レ株式会社 糖化酵素の製造方法およびオリゴ糖の製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011115039A1 (ja) * 2010-03-15 2011-09-22 東レ株式会社 糖液の製造方法およびその装置
WO2011115040A1 (ja) * 2010-03-15 2011-09-22 東レ株式会社 糖液の製造方法およびその装置
WO2013151093A1 (ja) * 2012-04-04 2013-10-10 花王株式会社 有機酸の製造方法
JP2016106538A (ja) * 2014-12-03 2016-06-20 東レ株式会社 トリコデルマ・リーセイ変異株およびそれを用いたセロビオハイドラーゼの製造方法
WO2018159573A1 (ja) * 2017-02-28 2018-09-07 東レ株式会社 糖化酵素の製造方法およびオリゴ糖の製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023171644A1 (ja) 2022-03-08 2023-09-14 東レ株式会社 ろ過助剤、ろ過処理方法およびセルラーゼの製造方法

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