KR20120014815A - 섬유소 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스 또는 이의 배양액을 함유하는 사료 첨가제 - Google Patents

섬유소 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스 또는 이의 배양액을 함유하는 사료 첨가제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 섬유소 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제에 관한 것으로, 섬유소 중 특히 자일란(xylan)에 대해 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP) 또는 배양액을 유효성분으로 함유함으로써 이를 섭취한 가축의 생산량을 증가시키면서, 사료요구율을 감소시켜 궁극적으로 사료효율을 증가시키는 효과를 발휘한다.

Description

섬유소 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스 또는 이의 배양액을 함유하는 사료 첨가제{Feed additive containing Bacillus pumilus or its culture solution with capacity of cellulose-decomposition}
본 발명은 사료첨가제에 관한 것으로 더욱 상세하게는 섬유소 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다.
사료 산업의 한계성 및 식품 안전성에 대한 소비자의 요구 증대에 따라 항생제 대체제인 생균제와 면역증강제의 개발이 촉진되고 있다.
생균제는 항생제 대체물질로서 많은 연구가 이루어져 왔으며, 동물약품과 사료보조제로 사용되고 있다. 세균으로는 유산균류(락토바실러스 속 균, 비피도바실러스 균 속)와 바실러스 속 균, 스트렙토코커스 속 균 등이 연구되어 실제 상용화되어 있으며, 곰팡이로는 효모, 황국균(아스퍼질러스 속 균)이 활용되고 있다.
생균제 산업과 함께 근래에 축산 산업에서 연구되고 있는 물질로는 올리고당이 있는데, 이 물질은 장내에서 병원균의 증식을 억제하는 생균제의 기능과 함께 유용 미생물의 영양원으로 활용됨에 따라 그 활용성이 크다. 올리고당 류에는 MOS(Mannan-oligosaccharide), FOS(Fructo-oligosaccharide), 키토산 올리고당(Chitosan Oligo Saccharide) 등이 있다.
한편, 효소제는 내생성 소화효소에 의해 분해되기 어려운 저장성 탄수화물과 단백질의 이용성을 높일 수 있다. 가축사료의 가장 기본이 되는 곡류는 섬유성 다당류, 셀룰로스, 펙틴, 헤미셀룰로스, 글리코프로틴, 리그닌, 비전분성 다당류 등에 의해 영양적 가치가 낮아지는데, 효소를 활용할 경우 전분, 단백질 및 지방과 같은 영양소의 이용률을 개선시킬 수 있고, 이로 인해 사료의 이용성을 높여 생산성을 증대시킬 수 있다. 특히 어린 가축의 소화 장애를 막을 수 있어 그 활용성이 높다고 할 수 있다. 현재 상용화되고 있는 효소제로는 파이테아제, 자일라나제, 베타글루카나제 등이 있으며, 전분의 이용성을 높이기 위해 아밀라제를 사료에 첨가하기도 한다.
오늘날의 가축들은 주로 곡물을 원료로 한 사료와 섬유질이 풍부한 조사료를 먹는데, 셀룰라아제(cellulase)와 자일라나제(xylanase)는 초식성 가축에 중요한 소화효소로서 작용한다. 가축들이 사료를 섭취하였을 때 이들 효소는 소화 및 흡수율을 높여 사료의 효율을 증대시키는 작용을 한다.
셀룰라아제(cellulase)는 반추위 가축에 있어서 중요한 효소로서, 셀룰로스의 β-1, 4 글리코시드 결합을 가수분해하여 셀로비오스를 생기게 하는데, 곰팡이, 세균, 고등식물, 연체동물 등에 많이 존재한다.
자일라나제(xylanase)는 농가 부산물인 볏짚, 옥수수 줄기, 보리 짚, 기타 식물체에 존재하는 헤미셀룰로오스의 주요 성분인 β-1,4-D-자일란을 임의로 가수분해하여 자일로비오스(xylobiose)나 자일로트리오스(xylotriose) 등의 자일로올리고당의 생성반응을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 맥아나 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 트리코데르마(Trichoderma sp.) 등의 곰팡이와 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.), 바실러스(Bacillus sp.) 등의 세균으로부터 생산된다.
본 발명은 섬유소를 분해할 수 있는 미생물로서 특히 자일란(xylan)을 분해할 수 있는 미생물을 분리한 후, 이를 이용한 사료첨가제로 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 자일란 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제를 제공한다.
이하, 본 발명의 과제의 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
가축이 섭취하는 사료의 가장 기본이 되는 것은 곡류로, 곡류는 섬유성 다당류, 셀룰로스, 펙틴, 헤미셀룰로스, 글리코프로틴, 리그닌, 비전분성 다당류를 포함하는데, 이들 성분으로 인해 곡류의 영양적 가치는 낮아진다.
본 발명은 상기와 같이 영양적 가치를 낮추는 섬유소 등의 분해 효율을 높여 가축의 소화장애를 방지하고, 영양적 가치를 증대시키기 위해 섬유소 분해가 용이한 균주를 분리하고자 하였는데, 국내 토양환경으로부터 섬유소 특히 자일란(xylan) 분해능이 우수한 A5-1 균주를 분리하였다.
분리한 A5-1 균주의 염기서열을 분석한 결과, 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)임을 확인하였고, 분리된 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1을 2010년 1월 12일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, KCTC 11620BP의 기탁번호를 부여받았다.
한편, 본 발명의 하기 실험예에서는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 섬유소 분해 기작을 확인하기 위해 배지에 자일란(xylan)을 농도별로 첨가하고 배양한 후, 자일라나제(xylanase)의 생산량을 확인하였는데, 자일란의 첨가 농도가 증가할수록 자일라나제의 생산량도 증가됨을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 자일란의 첨가에 의해 자일라나제의 생산이 유도됨을 확인시켜 주는 결과이다.
또한, 하기 본 발명의 실험예에서는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 최적배양조건을 확립하기 위해 실험을 수행하였는데, 배지에 글루코스(glucose) 및 K2HPO4를 첨가하면 배양 초기보다 후기에 많은 효소가 생성됨을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명에서 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 배양액을 함유하는 사료 첨가제를 제조하여 이를 양돈농가 대상으로 사양시험을 실시한 결과, 사료 첨가제를 섭취한 시험구에서 일당 증체량의 향상이 확인되었고, 사료요구율은 감소했으며, 사료효율은 증가하는 결과를 나타냈다.
한편, 본 발명의 사료 첨가제는 바람직하게 제오라이트, 향미제, 유카추출물 및 활성탄을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 조성은 가장 바람직하게 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 배양액 80~85 중량%, 제오라이트 12~18 중량%, 향미제 0.5~1.5 중량%, 유카추출물 0.1~1.1 중량% 및 활성탄 0.1~1.0 중량%로 조성될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 사료 첨가제는 섬유소 중, 특히 자일란(xylan)에 대해 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP) 또는 배양액을 유효성분으로 함유하기 때문에, 이를 섭취한 가축의 생산량을 증가시킬 수 있고, 사료요구율을 감소시켜 궁극적으로 사료효율을 증가시키는 효과를 발휘한다.
도 1은 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1의 배양 배지에 첨가된 자일란(xylan)의 농도에 따라 변화하는 자일라나제(xylanase)의 활성을 흡광도로 측정한 결과이다.
도 2는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1의 배양 배지에 첨가된 성분들에 따라 자일라나제(xylanase)의 활성이 변화됨을 흡광도로 측정한 결과이다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 균주 선발 및 동정
본 실시예에서는 섬유소, 특히 자일란(xylan) 분해능이 우수한 균주를 분리 및 선발하고자 하였다. 국내 토양과 청국장 제품에서 분리한 세균들 중에서 섬유소 분해능이 양호한 균을 사용하였다.
균을 분리하기 위하여 LB 배지(트립톤(tryptone) 1g, 이스트 추출액(yeast extract) 0.5g, NaCl 0.5g, D.W. 100ml)를 사용하였다.
실험 결과, 국내 토양과 청국장 등 시료에서 섬유소 분해 세균으로 자일란(xylan)을 잘 분해하는 A5-1균주를 선발하였다.
선발된 A5-1균주는 API 50CHB kit에서의 동정시험 결과 탄수화물 이용 패턴(pattern)을 보였으며(표 1), 이 자료를 Biomeriux회사에서 제공하는 Apiweb을 통하여 분석한 결과, A5-1 균주는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)균으로 나타났다.
탄수화물 결과 탄수화물 결과
글리세롤(Glycerol) - 살리신(Salicin) +
에리스리톨(Erythritol) - 셀로비오스(Cellobiose) +
D-아라비노스(D-Arabinose) - 말토스(Maltose) -
L-아라비노스(L-Arabinose) + 락토스(Lactose) -
리보스(Ribose) + 멜리비오스(Melibiose) -
D-자이로스(D-Xylose) + 수크로스(Sucrose) +
L-자이로스(L-Xylose) - 트레할로스(Trehalose) +
아도니톨(Adonitol) - 이눌린(Inulin) -
β-메틸-D-자이로사이드
(β-Methyl-D-xyloside)		 - 멜레치토스(Melezitose) -
갈락토스(Galactose) - 라피노스(Raffinose) -
글루코스(Glucose) + 스타치(Starch) -
프락토스(Fructose) + 글리코겐(Glycogen) -
만노스(Mannose) + 자이리톨(Xylitol) -
소르보스(Sorbose) - 겐티오비오스(Gentiobiose) -
람노스(Rhamnose) - D-튜라노스(D-Turanose) -
덜시톨(Dulcitol) - D-릭소스(D-Lyxose) -
이노시톨(Inositol) - D-타가토즈(D-Tagatose) +
만니톨(Mannitol) + D-퓨코스(D-Fucose) -
솔비톨(Sorbitol) - L-퓨코스(L-Fucose) -
α-메틸-D-a만노사이드
(α-Methyl-D-mannoside)		 + D-아라비톨(D-Arabitol) -
α-메틸-D-글루코사이드
(α-Methyl-D-glucoside)		 - L-아라비톨(L-Arabitol) -
N-아세틸 글로코사민
(N-acetyl glucosamine)		 + 글루코네이트(Gluconate) -
아미글다린(Amygdalin) + 2-케토-글루코네이트
(2-Keto-gluconate)		 -
알부틴(Arbutin) + 5-케토-글루코네이트
(5-Keto-gluconate)		 -
에스쿨린(Esculin) +
분리된 A5-1 균주를 2010년 1월 12일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 11620BP의 기탁번호를 부여받았다.
실시예 2: 섬유소 분해 효소 생산 기작의 확인
A5-1 균주를 LB 액체 배지에서 하룻밤 동안 전배양한 다음, 자일란(xylan)을 0, 0.25, 0.5, 1.0% 첨가한 M9 배지에 2%로 접종하여 본배양을 24시간 진행하고, 배양액을 원심분리 하였다. 이어서 얼음이 채워진 워터 배스(water bath)에서 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 포화도 75% 정도로 가하여 세게 저어서 단백질 효소 성분을 침전시켰으며, 하룻밤 동안 냉장 보관하고, 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전된 효소 성분을 모았다. 침전물에 pH 7.0의 50mM 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)를 가하여 잘 녹인 것을 효소액으로 사용하였으며, 대체적으로 약 30배 정도 농축되었다.
1%의 자일란(xylan) 액을 기질로 하고 여기에 1/10 양의 상기 효소액을 첨가하여 잘 섞은 후, 37℃ 항온기에서 반응을 4시간 진행시킨 후, 디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid) 시약으로 처리하여 575nm의 파장에서 흡광도를 구하였다.
바실러스 푸밀러스(B. pumilus) A5-1 균주를 대상으로 하여 얻은 효소액의 경우, 도 1과 같이 자일란(xylan)을 첨가하여 배양할수록 높은 흡광도를 보여 자일라나제(xylanase)가 많이 생산됨을 알 수 있었다.
이로부터 A5-1 균주의 자일라나제(xylanase)가 기질인 자일란(xylan)에 의해서 유도되는 것으로 판단할 수 있었다.
실시예 3: 최적 배양조건 확립
바실러스 푸밀러스(B. pumilus) A5-1 균주의 섬유소 분해능을 최대로 생산할 수 있는 배양조건을 찾기 위하여 대두박(soy bean meal) 2%와 이스트 추출액(yeast extract) 0.5%를 기본으로 하여 글루코스(glucose) 1%와 KH2PO4나 K2HPO4를 0.5% 첨가하여 배지를 제조하였다. 전배양한 균을 접종하고 시간별로 배양하면서 배양액을 취하여 디나이트로살리실산(dinitrosalicylic acid)법을 이용하여 자일라나제(xylanase) 활성을 측정하였다.
배양 조건은 30℃를 기준으로 하여 변화시켜 보았으며, 진탕속도를 100rpm에서부터 300rpm 까지 다양하게 조절하였고, 시간별로 진탕배양한 배양액을 수거하여 원심분리하고 원액을 쓰거나, 동결건조를 통해 농축하거나, 얼음 상에서 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 75% 포화도로 첨가하여 농축한 시료를 가지고 페이퍼 디스크(paper disk) 법을 이용해서 평판배지에서의 섬유소 분해능을 조사하였다.
측정결과(도 2), 글루코스(glucose)를 첨가하면 배양 초기보다 후기에 많은 효소가 생성되었고, K2HPO4를 첨가한 경우가 활성이 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 4: 사료첨가제 제조
상기에서 분리된 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 배양액을 재료로 하여 축산용 사료첨가제를 시제품으로 제조하였는데 그 조성비는 표 2와 같았다.
성 분 함 량(%)
바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 배양액 82.9
제오라이트 15.0
향미제 1.0
유카추출물 0.6
활성탄 0.5
바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 배양액을 쌀겨 성분에 흡착시켜 45℃ 조건에서 열풍 건조한 후, 수득된 배양액 건조물과 상기 제오라이트, 향미제, 유카 추출물, 활성탄을 혼합한 후, 분쇄하여 사료 첨가제를 제조하였다.
상기한 방법으로 제조한 사료첨가제를 괴산군 소재의 김규운 양돈농가에 의뢰하여 사양시험을 실시하였다. 시험기간은 2009년 12월 18일부터 2010년 1월 15일까지 4주에 걸쳐 실시하였다. 각 비육돈 10 두 씩 정하여 대조구와 급여구로 나누어 사료에 사료첨가제를 0.2% 수준으로 첨가하여 섭식 정도 및 생 체중 변화를 보았으며, 이를 토대로 사료효율을 비교하였다.
제공한 시험사료의 성분표는 표 3과 같았으며, 이 중에서 조섬유의 함량은 6.0% 이상이었다.
성 분 함 량(%)
조단백질(CP) 16.0 이상
조지방 3.5 이상
조섬유 6.0 이상
조회분 9.0 이상
칼슘 0.75 이상
인 1.3 이상
라이신 0.9 이상
가수화 조단백질(DCP) 14.0 이상
가수화 에너지(DE) 3.5Mcal/kg
시험기간 동안 혹한에 의한 비육돈들의 운동량 부족과 이로 인한 식욕감퇴 등으로 곤란을 겪기도 하였으나, 표 4와 같은 사양성적을 얻을 수 있었다.
구분 대조구 급여구 비고
개시체중(kg) 430.5 419
종료체중(kg) 563 555.5
일당증체량(kg/일/두) 0.914 0.941 ▲2.95%
사료섭취량(kg/일/두) 2.546 2.546
사료요구율 2.768 2.705 ▼2.99%
사료효율 0.359 0.370 ▲3.06%
시험기간이 종료된 후 체중을 측정한 결과, 체중이 꾸준히 증가하였으며, 이를 시험기간으로 나누어 보면 일당 증체량이 급여구에서 2.95%의 향상을 보였다.
사료 요구율은 동일한 양의 사료를 제공한 결과이므로 이를 일당증체량으로 나누어 계산하면 급여구에서 2.99% 감소하였고, 이를 역으로 환산한 사료효율은 반대로 3.05% 개선된 것으로 나타났다.
한국생명공학연구원 KCTC11620 20100112

Claims (3)

  1. 섬유소 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사료 첨가제는,
    제오라이트, 향미제, 유카추출물 및 활성탄을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제
  3. 제2항에 있어서,
    상기 사료 첨가제는,
    바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) A5-1 (KCTC 11620BP)의 배양액 80~85 중량%, 제오라이트 12~18 중량%, 향미제 0.5~1.5 중량%, 유카추출물 0.1~1.1 중량% 및 활성탄 0.1~1.0 중량%로 조성되는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제
KR1020100077016A 2010-08-10 2010-08-10 섬유소 분해능이 있는 바실러스 푸밀러스 또는 이의 배양액을 함유하는 사료 첨가제 KR20120014815A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103468618A (zh) * 2013-09-25 2013-12-25 上海交通大学 具有解磷能力的纤维素降解细菌及其应用
KR20140083491A (ko) * 2012-12-26 2014-07-04 대한민국(농촌진흥청장) 흰코뿔소 유래 바실러스 푸밀러스 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제
CN111849802A (zh) * 2020-06-11 2020-10-30 山东华昌动物保健品有限公司 一种含有麟凤兰提取物的复合菌剂及其应用

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