CN111621447A - 一株解淀粉芽孢杆菌ws3-1在防治花生白绢病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌WS3‑1在防治花生白绢病中的应用，有效解决花生白绢病的防治，保证花生丰产丰收的问题，该解淀粉芽孢杆菌WS3‑1在拮抗花生白绢病中的应用及在制备拮抗花生白绢病菌无菌发酵液中的应用；无菌发酵液是将活化的解淀粉芽孢杆菌WS3‑1接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、无光照摇培3d，细菌发酵液离心，过滤除去菌体，得无菌发酵液；本发明解淀粉芽孢杆菌WS3‑1对花生白绢病菌的拮抗作用明显，其发酵滤液对白绢病菌的生长具有强烈的抑制作用，花生白绢病病菌经WS3‑1处理后，菌丝出现膨大、分叉、断裂，不能继续生长，对花生白绢病具有很好的生防作用，培养条件简单、易保存，易于工业化生产。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌WS3-1在防治花生白绢病中的应用

技术领域

本发明涉及微生物，特别是一株解淀粉芽孢杆菌WS3-1在防治花生白绢病中的应用。

背景技术

花生白绢病是花生上发生的一种重要土传真菌性病害，在美国和印度等主要花生生产国家发生普遍。白绢病在我国多数花生产区均有发生，近十年来由于耕作制度改变、高产新品种大面积推广和气候条件的改变，发生为害逐年加重，已发展为花生上重要病害之一，成为制约花生产量和质量的重要因素，年经济损失达150亿元以上。花生白绢病是由齐整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）引起的一种世界范围内普遍发生的真菌病害，尤以温暖地区更为严重。我国各大花生种植区都有白绢病的发生，2004年山东省临沂市花生白绢病的发病面积达6万公顷，造成直接经济损失9000万元。2007年辽宁省兴城市首次有花生白绢病的报道，发病株率为10%～40%，轻者减产50%，重者绝收。2010年，郑州中牟、开封等地白绢病危害严重，发病较重地块，病株率在80%以上，更严重地块，甚至颗粒无收。目前对花生白绢病的防治还只是停留在传统的化学防治层面，化学药物的大量使用不仅污染环境、破坏生态平衡，而且使病原菌也逐渐产生了抗药性，其防治效果正在逐渐减弱，所以各国开始研究对花生白绢病的生物防治方法。由于细菌的培养简便、生长繁殖快等特点，使生防细菌在生防微生物的研究中占有重要的地位。目前已报道的防治花生白绢病的生防细菌种类主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）等。但是采用解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病进行生物防治至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株解淀粉芽孢杆菌WS3-1在防治花生白绢病中的应用，可有效解决花生白绢病的防治，保证花生丰产丰收的问题。

本发明解决的技术方案是，一株解淀粉芽孢杆菌WS3-1，对花生白绢病菌具有高效拮抗作用，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

该解淀粉芽孢杆菌WS3-1在拮抗花生白绢病中的应用及在制备拮抗花生白绢病菌无菌发酵液中的应用；所述的无菌发酵液是将活化的的解淀粉芽孢杆菌WS3-1接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、无光照下摇培3d，细菌发酵液离心，过滤除去菌体，得无菌发酵液；

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病菌的拮抗作用明显，其发酵滤液对白绢病菌的生长具有强烈的抑制作用，花生白绢病病菌经WS3-1处理后，其菌丝出现膨大、分叉、断裂现象，不能继续生长，对花生白绢病具有很好的生防作用，并且WS3-1培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1是本发明解淀粉芽孢杆菌WS3-1的菌落图。

图2是本发明解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病的平板拮抗效果图。

图3是本发明解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病菌菌丝的抑制作用图。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明一株解淀粉芽孢杆菌WS3-1，从污水中分离获得，具有较强的生存能力。该菌在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48h，菌落呈圆形，稍微隆起，颜色为淡乳白色，不透明，表面较粗糙。细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，芽孢卵圆形，中生或近中生。菌株WS3-1的生理生化特征为：接触酶反应阳性，明胶水解阳性，淀粉水解阳性，卵磷脂酶反应阴性，吲哚试验阴性，甲基红试验阳性，V-P反应阳性，柠檬酸盐利用试验阴性。将WS3-1的16S rDNA序列（SEQ ID NO.1所示）与Gen Bank中的序列进行BLAST比对，与WS3-1菌株相似性最高的是Bacillus amyloliquefaciens，同源性达到99％。将比对获得的同源序列和测定序列运用Clustal X软件进行多重序列的同源性分析，然后利用MEGA6.05软件构建系统进化树。由构建的系统进化树可以看出，WS3-1与Bacillus amyloliquefaciens同属一个遗传分枝。结合细菌的形态特征和生理生化试验最终确定菌株WS3-1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），对花生白绢病菌具有高效拮抗作用，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 19013，保藏日期为2019年11月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该解淀粉芽孢杆菌WS3-1在拮抗花生白绢病中的应用及在制备拮抗花生白绢病菌无菌发酵液中的应用；所述的无菌发酵液是将活化的的解淀粉芽孢杆菌WS3-1接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL中，于30℃、无光照下以200r/min转速摇培3d，细菌发酵液于10000r/min、4℃下离心20min，再用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，滤去菌体，得无菌发酵液。

该无菌发酵液在拮抗花生白绢病菌菌丝生长中的应用，花生白绢病菌菌丝经无菌发酵液处理后，菌丝出现膨大、分叉、断裂现象，不能继续生长，从而达到对花生白绢病具有很好的生防作用。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病菌的拮抗作用明显，其发酵滤液对白绢病菌的生长具有强烈的抑制作用，抑菌率达到90%以上，病菌经WS3-1处理后，其菌丝出现膨大、分叉、断裂现象，不能继续生长，对花生白绢病具有很好的生防作用，并且WS3-1培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。有关实验资料如下：

实验例1：解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病菌的平板拮抗作用

将活化的解淀粉芽孢杆菌WS3-1菌株划线接种于PDA平板两侧，再将花生白绢病菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取菌饼，点接于平板中央，以只接病原菌为对照，每个处理3个重复。25℃恒温培养箱中培养，待对照接近长满整个平板时，观察白绢病菌生长状态及抑菌带的有无，并记录其宽度。试验结果表明解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病菌有强烈的拮抗作用，其抑菌直径超过了15mm（图2）。实验中还发现靠近解淀粉芽孢杆菌WS3-1一侧的病原菌菌丝不能正常生长，菌丝在培养基上不能扩展。

实验例2：解淀粉芽孢杆菌WS3-1发酵滤液对花生白绢病菌生长的影响

将活化的的解淀粉芽孢杆菌WS3-1接入含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中于30℃和无光照条件下以200r/min转速摇培，将摇培3d后的细菌发酵液于10000r/min、4℃条件下离心20min后，再用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器将菌体过滤后，所得的滤液即为无菌发酵滤液。按发酵滤液︰PDA等于1︰4的比例混合倒平板，以不接菌的培养基代替无菌发酵滤液为对照。将活化好的病原真菌菌饼点接于平板中央。每个处理设置3个重复，25℃恒温培养箱中培养。待对照接近长满整个平板时，测定滤液对花生白绢病菌的抑菌率。计算公式如下：抑菌率（%）=[(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌块直径)]×100%。试验结果表明解淀粉芽孢杆菌WS3-1的发酵滤液对花生白绢病菌的生长具有强烈的抑制作用，抑菌率达到90%以上，是一株具有很大潜力的生防菌株。

实验例3：解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病菌菌丝的拮抗作用

将解淀粉芽孢杆菌WS3-1接入含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中于30℃和无光照条件下以200r/min转速摇培24h，备用。将活化的白绢病菌打孔取直径5mm接种到PDA固体平板中央，然后在距离平板中央3.5cm处打孔，加入20μL活化的WS3-1菌液，对照孔里加入20μL的无菌液体培养基。30℃培养3d后，观察WS3-1菌株对花生白绢病菌的抑制作用；挑取白绢病菌的菌落边缘菌丝于空白PDA培养基上培养，同时在光学显微镜下镜检。试验结果显示，白绢病菌受WS3-1处理后菌丝形态出现异常，抑制作用表现为菌丝膨大、分叉（图3，左图为对照，右图为处理）。挑取畸形的边缘菌丝于PDA培养基上培养，不能正常生长。说明解淀粉芽孢杆菌WS3-1对白绢病菌菌丝具有明显的抑制作用。

实验例4：解淀粉芽孢杆菌WS3-1发酵滤液抗菌物质稳定性测定

（1）热稳定性测定：将解淀粉芽孢杆菌WS3-1发酵滤液分别在40℃、60℃、80℃、100℃处理1小时和在121℃处理20min，按实验例2的方法测定不同温度处理下WS3-1发酵滤液对花生白绢病菌的抑菌活性，以未经处理的发酵滤液和不接菌的液体培养基分别作为阳性对照和空白对照，每个处理重复 3 次。结果表明，解淀粉芽孢杆菌WS3-1发酵滤液经40℃、60℃、80℃处理后，其对白绢病菌的抑菌率仍达到90%以上，与未经处理的发酵滤液活性相当。经100℃和121℃处理后，抑菌活性开始有所下降。说明解淀粉芽孢杆菌WS3-1发酵滤液中的抑菌物质具有较好的热稳定性。

（2）pH稳定性测定：用 1mol/L HCl 和 1mol/L NaOH 将WS3-1发酵滤液pH分别调至3、4、5、6、7、8、9、10，过夜静置后离心取上清，上清过0.22μm滤膜后，测定经不同pH处理的发酵滤液的抑菌活性，分别以上述相同pH下的液体培养基和未经酸碱处理的发酵滤液（原pH为 8.5）作为空白对照和阳性对照，每个处理重复 3 次。结果表明，在pH为 7-10的发酵滤液对白绢病菌具有较强的抑菌率，与未经酸碱度处理的发酵滤液稀释液无显著差异，说明发酵滤液中具有抗菌活性的物质受碱性条件影响较小。在 pH 为 3-6 的发酵滤液中，其抑菌率显著低于未经酸碱度处理的发酵滤液，说明在酸性条件下发酵滤液中具有杀线活性的物质易失活。因此表明，解淀粉芽孢杆菌WS3-1发酵滤液中具有抗菌活性的物质在碱性条件下是比较稳定的。

（3）紫外线稳定性测定：将WS3-1发酵滤液静置于紫外 灯下照射, 波长 254nm,功率 36W, 高度为 25cm , 照射时间为 1h、2h、4h、8h。处理完毕后，测定不同处理下WS3-1发酵滤液的抑菌活性，以未经处理的发酵滤液和不接菌的液体培养基分别作为阳性对照和空白对照，每个处理重复 3 次。结果表明，WS3-1发酵滤液经紫外照射处理后，其抑菌活性与未经紫外处理的发酵滤液相当。说明解淀粉芽孢杆菌WS3-1发酵滤液的活性物质具有较强的抗紫外线分解能力。

总之，试验表明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病菌的拮抗作用明显，其发酵滤液对白绢病菌的生长具有强烈的抑制作用，抑菌率达到90%以上，病菌经WS3-1处理后，其菌丝出现膨大、分叉、断裂现象，不能继续生长。同时，WS3-1发酵滤液抗菌物质具有较强的热稳定性、pH稳定性和紫外线稳定性，在以后的实际应用中不会受极端自然条件的影响。可见解淀粉芽孢杆菌WS3-1对花生白绢病具有很好的生防作用，并且WS3-1培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，有效用于防治花生白绢病，保证花生丰产丰收，开发应用前景广阔，经济和社会效益巨大。

Claims (3)

1.一株解淀粉芽孢杆菌WS3-1在拮抗花生白绢病中的应用，所述的解淀粉芽孢杆菌WS3-1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 19013，保藏日期为2019年11月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌WS3-1在制备拮抗花生白绢病菌无菌发酵液中的应用，所述的无菌发酵液是，将活化的的解淀粉芽孢杆菌WS3-1接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL中，于30℃、无光照下以200r/min转速摇培3d，细菌发酵液于10000r/min、4℃下离心20min，再用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，滤去菌体，得无菌发酵液。

3.权利要求2所述的无菌发酵液，其特征在于，该无菌发酵液在拮抗花生白绢病菌菌丝生长中的应用。

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