CN112322559A - 一株花生内生细菌枯草芽孢杆菌f-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株花生内生细菌枯草芽孢杆菌F‑1及其应用，对花生白绢病菌具有高效拮抗作用，其解决的技术方案是，本发明所述花生内生细菌枯草芽孢杆菌F‑1，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20856，保藏日期为2020年10月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，本发明的枯草芽孢杆菌F‑1，是一株花生内生细菌，其无菌发酵液对花生白绢病菌具有很强的抑制作用，抑菌率达到91.66%。室内条件下，该菌对花生白绢病的防治效果达到77%，具有很好的应用前景。

Description

一株花生内生细菌枯草芽孢杆菌F-1及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是一株花生内生细菌枯草芽孢杆菌F-1及其应用。

背景技术

花生(Arachis hypogaea Linn.)是全球范围内最重要的油料作物之一，有很高的食用价值和经济价值，在我国的种植历史已有上百年。近年来，随着我国花生种植面积的急剧扩大，以及高产、抗病新品种的不断推广，导致花生病害逐年加重。特别是花生白绢病的肆虐，已经对我国花生产业造成了严重的破坏。花生白绢病是世界范围内花生上发生的一种重要的枯萎型真菌病害，已经对美国、阿根廷、印度、日本等国家的花生产业造成了巨大的经济损失，该病病原菌的无性世代是半知菌亚门齐整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)，有性世代为罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)。目前对花生白绢病的防治方法主要包括轮作、培育抗性品种以及使用化学药剂，但防治效果都不理想。同时化学药物的大量使用不仅污染环境、破坏生态平衡，而且使病原菌也逐渐产生了抗药性，寻求安全高效的生物防治办法迫在眉睫。但是关于白绢病菌的研究报道和生防菌种还是十分有限，亟待进一步研究。

利用内生细菌防治植物病害一直是国内外的研究热点，以前绝大多数植物病害生防菌是从土壤或植物根际土壤微生物中分离筛选得到的，但由于这些土壤微生物易受外界条件的影响，并难于在与土壤、植物根际或叶围习居微生物的竞争中长期占优势，因而极大地影响了其实用价值。而植物内生细菌作为生防因子有很多优点：它们分布于植物的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物组织的保护，不受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线风雨等的影响，具有稳定的生态环境。因此，内生细菌相对于其它细菌更易发挥生防作用。近年来的研究表明，植物体是一个复杂的微生态系统，几乎所有健康植物体内均含有内生细菌。这些内生细菌对植物不仅具有促生作用，还具有内生固氮和防治病害等多方面的生物学作用。许多学者认为，内生细菌作为植物病害生物防治的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株花生内生细菌枯草芽孢杆菌F-1及其应用，对花生白绢病菌具有高效拮抗作用。

本发明解决的技术方案是，本发明所述花生内生细菌枯草芽孢杆菌F-1，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20856，保藏日期为2020年10月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述的枯草芽孢杆菌F-1在制备拮抗花生白绢病菌无菌发酵液中的应用，所述的无菌发酵液是，将活化的的枯草芽孢杆菌F-1接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL中，于30℃、无光照下以200r/min转速摇培3d，细菌发酵液于10000r/min、4℃下离心20min，再用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，滤去菌体，得无菌发酵液。

所述的枯草芽孢杆菌F-1对花生白绢病菌存在拮抗作用。

所述的枯草芽孢杆菌F-1无菌发酵液对白绢病菌菌丝生长具有抑制作用。

所述的枯草芽孢杆菌F-1可以有效防治花生白绢病。

本发明的枯草芽孢杆菌F-1，是一株花生内生细菌，其无菌发酵液对花生白绢病菌具有很强的抑制作用，抑菌率达到91.66％。室内条件下，该菌对花生白绢病的防治效果达到77％，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明枯草芽孢杆菌F-1对白绢病菌的拮抗作用。

图2为本发明枯草芽孢杆菌F-1在室内条件下对花生白绢病的防治效果。

具体实施方式

以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明花生内生细菌枯草芽孢杆菌F-1是从河南省汝南县花生产区的健康花生植株体内分离得到的一株对花生白绢病菌具有高效拮抗活性的内生细菌。该菌在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48h，菌落表面干燥褶皱，不透明，微黄色，边缘不规则或近圆形。菌体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阳性，有芽孢。菌株F-1的生理生化特征为：接触酶反应阳性，明胶水解阳性，淀粉水解阳性，卵磷脂酶反应阳性，吲哚试验阴性，甲基红试验阳性，V-P反应阴性，柠檬酸盐利用试验阴性。将F-1的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1所示) 与Gen Bank中的序列进行BLAST比对，与F-1菌株相似性最高的是Bacillus subtilis，同源性达到99％。将比对获得的同源序列和测定序列运用Clustal X软件进行多重序列的同源性分析，然后利用MEGA6.05软件构建系统进化树。由构建的系统进化树可以看出，F-1与Bacillus subtilis同属一个遗传分枝。结合细菌的形态特征和生理生化试验最终确定菌株 F-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20856，保藏日期为2020年10月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

一、枯草芽孢杆菌F-1对白绢病菌的拮抗作用

将活化的枯草芽孢杆菌F-1菌株划线接种于PDA平板两侧，再将花生白绢病菌的PDA 平板培养物用直径5mm的打孔器打取菌饼点接于平板中央，以只接病原菌为对照，每个处理 3个重复。25℃恒温培养箱中培养，待对照平板菌丝长满整个平板时，观察白绢病菌生长状态及抑菌带的有无，并记录其宽度。试验结果表明枯草芽孢杆菌F-1对花生白绢病菌有强烈的拮抗作用，其抑菌带宽度超过了20mm(图1)。

二、枯草芽孢杆菌F-1无菌发酵液对白绢病菌菌丝生长的影响

将活化的枯草芽孢杆菌F-1接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基100m L中，于30℃、无光照下以200r/min转速摇培3d，细菌发酵液于10000r/min、4℃下离心20min，再用滤膜孔径为 0.22μm的细菌过滤器过滤，滤去菌体，得无菌发酵液，将无菌发酵液分别稀释2倍、4倍后，按照发酵液：PDA为1:4的比例混合，制成带毒平板，然后将活化好的5mm病原真菌菌饼点接于平板中央。以不接菌的NB液体培养基代替无菌发酵滤液为对照。每个处理设置3个重复，25℃恒温培养箱中培养。待对照长满整个平板时，计算F-1无菌发酵液原液、2倍和4 倍稀释液对花生白绢病菌的抑菌率。计算公式如下：抑菌率(％)＝[(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌饼直径)]×100％。

结果表明，枯草芽孢杆菌F-1无菌发酵液能显著抑制白绢病菌菌丝的生长，随着稀释倍数的升高，抑菌活性逐渐下降(表1)。其无菌发酵液原液对病菌的抑制率达到91.66％，2倍和4倍稀释滤液对病菌仍有61.84％和35.47％的抑制率。

表1枯草芽孢杆菌F-1无菌发酵液对白绢病菌的抑制作用

三、枯草芽孢杆菌F-1对花生白绢病的室内防效

将灭菌后的土壤装在塑料盆中，把提前催芽的花生种子播于盆中。花生出苗后，于开花期接种花生白绢病菌，即直接把病原真菌接种到土壤中，然后将50mL枯草芽孢杆菌F-1发酵原液灌入花生根部，以浇灌50mL无菌水作对照，每个处理10株花生。28d后，采取病情指数法进行防治效果测定，花生白绢病分级标准见表2。

病情指数＝∑(各级病根数×各级代表值)/(调查总根数×最高级代表值)×100

防治效果/％＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100

表2花生白绢病病情分级标准

结果表明(表3)，单独接种白绢病原菌的花生植株发病严重，感病率为90％，病情指数达到70(图2左)。而接种枯草芽孢杆菌F-1发酵液能明显降低花生的感病率和病情指数，两者分别为30％和16，对花生白绢病的防效达到77％(图2右)。

表3枯草芽孢杆菌F-1对花生白绢病的防治效果

处理	感病率/％	病情指数	防治效果/％
				接种F-1发酵液	30	16	77
接种无菌水	90	70	0

本发明的枯草芽孢杆菌F-1是一株花生内生细菌，具有较强的竞争能力和定殖能力。枯草芽孢杆菌F-1对花生白绢病菌拮抗作用明显，其无菌发酵液对白绢病菌菌丝生长具有较强的抑制效果，对花生白绢病具有很好的生防作用，并且F-1培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

序列表

<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司；河南省科学院

<120> 一株花生内生细菌枯草芽孢杆菌F-1及其应用

<130> 100

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1333

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 60

cgggaaaccg gggctaataa cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa cataaaaggt 120

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 180

ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 240

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 300

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 360

gaagaacaag taccgttcga atagggcggt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 420

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 480

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 540

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 600

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 660

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 720

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 780

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 840

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 900

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 960

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1080

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1140

cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1200

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1260

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1320

tcacaccacg aga 1333

Claims (4)

1.一株花生内生细菌枯草芽孢杆菌F-1，其特征在于，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo. 20856，该菌株的16S rDNA 基因序列如SEQ ID NO1 所示。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌F-1，其无菌发酵液在拮抗花生白绢病菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌F-1无菌发酵液在拮抗花生白绢病菌中的应用，其特征在于，所述的无菌发酵液是将活化的的枯草芽孢杆菌F-1接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL中，于30℃、无光照下以200r/min转速摇培3d，细菌发酵液于10000r/min、4℃下离心20min，再用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，滤去菌体，得无菌发酵液。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌F-1在防治花生白绢病中的应用。

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