CN113801815B - 一种产β-甘露聚糖酶的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产β‑甘露聚糖酶的菌株及其应用，可有效解决产β‑甘露聚糖酶及在制备甘露寡糖中的应用问题，本发明一种产β‑甘露聚糖酶的菌株WBT0011，分类命名为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.22575，保藏日期2021年5月20号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌株WBT0011能产β‑甘露聚糖酶，可实现在制备甘露寡糖中的应用。本发明菌株有效用于产β‑甘露聚糖酶的制备，该β‑甘露聚糖酶可有效用于制备甘露寡糖，制备和应用方法简单，绿色环保，可应用于饲料、食品添加剂等领域，能有效提高营养吸收率，具有广阔的应用前景。

Description

一种产β-甘露聚糖酶的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物，特别是一种产β-甘露聚糖酶的菌株及其应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶，又称β-1,4-D-甘露聚糖酶，是能够水解β-1,4-糖苷键的一种内切酶，在自然界广泛存在，特别是微生物来源居多，在细菌的芽孢杆菌属和真菌的曲霉属比较常见。β-甘露聚糖酶在饲料业、食品业及植物胶降解等行业应用较多，例如，在饲料业β-甘露聚糖酶可以帮助去除饲料中的抗营养因子甘露聚糖，将其转化为营养性更高、功能性更强的甘露寡糖，提高饲料的营养吸收率，提高饲喂效率。利用其降解植物胶的功能可以水解甘露聚糖生产甘露寡糖，甘露聚糖在植物中主要存在于种子胚乳中用于储存植物多糖，多来自于豆科植物瓜尔豆提取的瓜尔豆胶、南星科植物魔芋提取的魔芋胶以及豆科植物刺槐提取的刺槐豆胶等植物胶，一般是由甘露糖和葡萄糖或者甘露糖和半乳糖聚合而成。目前工业上甘露寡糖的制备主要是通过甘露聚糖酶解法进行，不同来源的甘露寡糖在结构和组成上有所不同，主要与β-甘露聚糖酶的来源及所用底物有关。在饲料业甘露寡糖能够促进动物肠道的消化吸收，调节动物肠道的微生态平衡，减少有害菌在肠道的定植和生长，维持有益菌的动态平衡。此外，甘露寡糖还能提高动物机体免疫力，减少疾病的发生和寄生虫的侵袭。通过分析国内甘露寡糖生产状况以后，发现工业利用酶解法制备甘露寡糖工艺尚不成熟，发现新的β-甘露聚糖酶产酶菌株并应用于甘露寡糖的生产具有重要意义，希望为进一步工业化生产甘露寡糖的工艺优化提供帮助，但至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种产β-甘露聚糖酶的菌株及其应用，可有效解决产β-甘露聚糖酶及在制备甘露寡糖中的应用问题。

本发明一种产β-甘露聚糖酶的菌株WBT0011，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.22575，保藏日期2021年5月20号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

该菌株WBT0011能产β-甘露聚糖酶，可实现在制备甘露寡糖中的应用。

本发明菌株是新筛选的一株菌株，有效用于产β-甘露聚糖酶的制备，该β-甘露聚糖酶可有效用于制备甘露寡糖，制备和应用方法简单，绿色环保，所制得的甘露寡糖可应用于饲料、食品添加剂等领域，能有效提高营养吸收率，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的魔芋胶水解质谱图。

图2为本发明的瓜尔豆胶水解质谱图。

具体实施方式

以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，一种产β-甘露聚糖酶的菌株WBT0011，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，

取河南济源猪场未满月新鲜仔猪粪便样品，称取1g样品用无菌水制成悬液，然后依次稀释成10^-4、10^-5、10^-6粪便稀释液，分别吸取100μL涂布于β-甘露聚糖酶筛选平板上，所述的β-甘露聚糖酶筛选平板：魔芋粉3g、蛋白胨6g、酵母粉1g、氯化钠0.5g、刚果红0.5g、氯化镁0.2g、磷酸二氢钾1g、琼脂18g，pH6.0，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，而后制备平板；于37℃恒温培养箱培养48h，观察透明圈，选择透明圈较为明显的菌株，筛选得到编号为WBT0011的菌株，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.22575，保藏日期2021年5月20号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1

本发明菌株WBT0011为产β-甘露聚糖酶的菌株，制备β-甘露聚糖酶的方法是，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将冻存保藏菌株WBT0011，接种于活化培养基中，37℃、180r/min培养24h；所述活化培养基为：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、pH7.4，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；

(2)种子培养：将上述活化菌种按照接种量1％接种于种子培养基中，37℃、180r/min培养24h；所述种子培养基为：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、pH7.3，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；

(3)发酵培养：将上述种子液按照接种量2％接种于β-甘露聚糖酶产酶培养基中，37℃、180r/min培养48h得到发酵酶液，而后在4℃、12000r/min条件离心10min，得到上清液即为β-甘露聚糖酶，酶活测定：

在37℃、pH5.5条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个β-甘露聚糖酶活力单位(U)，计算公式为：

β-甘露聚糖酶活力(U·mL^-1)

式中：A表示酶液的吸光度，A₀表示空白吸光度，K表示标准曲线斜率，b表示标准曲线截距，M表示D-甘露糖的摩尔质量，30表示酶解反应时间，1000表示单位换算系数，酶活力为3.8U/mL。

实施例2

β-甘露聚糖酶用于制备甘露寡糖的方法，包括以下步骤：

(1)底物的制备

准确称取10g魔芋胶，加入800mL的pH5..5的乙酸-乙酸钠缓冲液，不断搅拌并持续加热，至魔芋胶溶解完全，用pH5..5的乙酸-乙酸钠缓冲液定容为1L，制成1％魔芋胶溶液；

(2)粗酶液的制备

发酵结束后，吸取发酵液在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃去沉淀，所得上清液即为β-甘露聚糖酶液；

(3)酶解条件

将酶液和魔芋胶溶液按照1:10体积比混合，在50℃水浴反应12h，得到酶解粗产物。取1mL酶解粗产物在12000r/min、4℃条件离心10min，吸取上清，弃去沉淀，吸取上清液0.5mL加入0.5mL50％乙醇溶液混匀，在12000r/min、4℃条件离心10min吸取上清，弃去沉淀，得到甘露寡糖溶液；

(4)定性定量分析

用还原糖转化率代表酶液的水解效率，采用DNS法酶解产物还原糖进行定量，还原糖转化率(％)＝还原糖含量(g)/魔芋胶含量(g)；

甘露寡糖的定性分析采用三重四级杆质谱仪对甘露寡糖成分进行分析。具体条件如下：电离模式：电喷雾电离正离子模式，毛细管电压：3.0Kv，锥孔电压：15V，源温度：120℃，脱溶剂气温度：400℃，脱溶剂气流速：560L/h。

实施例3

β-甘露聚糖酶用于制备甘露寡糖的方法，包括以下步骤：

(1)底物的制备

准确称取10g瓜尔豆胶，加入800mL的pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，不断搅拌并持续加热，至魔芋胶溶解完全，用pH5..5的乙酸-乙酸钠缓冲液定容为1L，制成1％瓜尔豆胶溶液；

(2)粗酶液的制备

发酵结束后，吸取发酵液在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃去沉淀，所得上清液即为β-甘露聚糖酶液；

(3)酶解条件

将酶液和瓜尔豆胶溶液按照1:10体积比混合，在50℃水浴反应12h，得到酶解粗产物。取1mL酶解粗产物在12000r/min、4℃条件离心10min，吸取上清，弃去沉淀，吸取上清液0.5mL加入0.5mL50％乙醇溶液混匀，在12000r/min、4℃条件离心10min吸取上清，弃去沉淀，得到甘露寡糖溶液；

(4)定性定量分析

用还原糖转化率代表酶液的水解效率，采用DNS法酶解产物还原糖进行定量，还原糖转化率(％)＝还原糖含量(g)/魔芋胶含量(g)；

甘露寡糖的定性分析采用三重四级杆质谱仪对甘露寡糖成分进行分析。具体条件如下：电离模式：电喷雾电离正离子模式，毛细管电压：3.0Kv，锥孔电压：15V，源温度：120℃，脱溶剂气温度：400℃，脱溶剂气流速：560L/h。

本发明菌株是新筛选出的一株产β-甘露聚糖酶的菌株WBT0011，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，并经实地应用取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：

1、菌株的筛选

产β-甘露聚糖酶菌株WBT0011的筛选分离方法：取河南济源猪场未满月新鲜仔猪粪便样品，称取1g样品用无菌水制成悬液，然后依次稀释成10^-4、10^-5、10^-6粪便稀释液，分别吸取100μL涂布于β-甘露聚糖酶筛选平板上，于37℃恒温培养箱培养48h，观察透明圈，选择透明圈较为明显的菌株，筛选得到编号为WBT0011的菌株；所述β-甘露聚糖酶筛选平板为：魔芋粉3g、蛋白胨6g、酵母粉1g、氯化钠0.5g、刚果红0.5g、氯化镁0.2g、磷酸二氢钾1g、琼脂18g，pH 6.0，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，而后制备平板。

2、菌株的鉴定

(1)形态学观察

产β-甘露聚糖酶菌株呈乳白色菌落、近圆形、边缘略不整齐、无分泌物。

(2)生理生化分析

通过API生理生化鉴定试剂盒和其他生理生化实验，发现菌株能够分解甘露糖、蔗糖、明胶，不能分解淀粉、纤维素，甲基红、VP实验等结果为阳性，硝酸盐还原、亚硝酸盐还原等结果为阴性，具有多种酶活性，具体结果参见表1-表4.

表1 API 50CHB试剂盒测定碳源利用结果

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注：+表示阳性，-表示阴性

表2 氮源利用结果

注：+表示阳性，-表示阴性

表3 生化特征

注：+表示阳性，-表示阴性

表4 API ZYM酶活性反应

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经16S rDNA序列分析，利用细菌基因组提取试剂盒对WBT0011菌株的基因组进行提取。而后进行PCR，引物序列：27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反应体系50μL：ddH2O 21μL，1492R 1.5μL、27F 1.5μL，TaqMix酶25μL，样菌模板DNA1μL。PCR程序：94℃预变性4min，96℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环，72℃延伸10min。而后将PCR产物送华大基因公司测序，序列信息见序列表。将16S rDNA序列在NCBI官网的数据库进行BLAST比对，构建系统发育树，进行同源性比较分析，发现该菌株与沙福芽孢杆菌同源相近。结合形态学结果、生理生化结果及16S rDNA序列分析结果，确定其为沙福芽孢杆菌，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.22575，保藏日期2021年5月20号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

16S rDNA序列：

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3、对β-甘露聚糖酶活力的测定，测定公式为(以实施例1为例)：

β-甘露聚糖酶活力(U·mL^-1)

式中：A表示酶液的吸光度，A₀表示空白吸光度，K表示标准曲线斜率，b表示标准曲线截距，M表示D-甘露糖的摩尔质量，30表示酶解反应时间，1000表示单位换算系数，酶活力为3.8U/mL。

将沙福芽孢杆菌种子液按照接种量2％接种于β-甘露聚糖酶产酶培养基中，37℃、180r/min培养48h得到发酵酶液，而后在4℃、12000r/min条件离心10min，得到上清液即为β-甘露聚糖酶，按照上述公式测得β-甘露聚糖酶活力为3.8U/mL。

4、对利用菌株制备的产β-甘露聚糖酶应用于制备的甘露寡糖水解实验。

(1)底物的制备

准确称取10g魔芋胶，加入800mL的pH5..5的乙酸-乙酸钠缓冲液，不断搅拌并持续加热，至魔芋胶溶解完全，用pH5..5的乙酸-乙酸钠缓冲液定容为1L，制成1％魔芋胶溶液；

(2)粗酶液的制备

发酵结束后，吸取发酵液在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃去沉淀，所得上清液即为β-甘露聚糖酶液；

(3)酶解条件

将酶液和魔芋胶溶液按照1:10体积比混合，在50℃水浴反应12h，得到酶解粗产物。取1mL酶解粗产物在12000r/min、4℃条件离心10min，吸取上清，弃去沉淀，吸取上清液0.5mL加入0.5mL50％乙醇溶液混匀，在12000r/min、4℃条件离心10min吸取上清，弃去沉淀，得到甘露寡糖溶液；

(4)定性定量分析

用还原糖转化率代表酶液的水解效率，采用DNS法酶解产物还原糖进行定量，还原糖转化率(％)＝还原糖含量(g)/魔芋胶含量(g)；

甘露寡糖的定性分析采用三重四级杆质谱仪对甘露寡糖成分进行分析。具体条件如下：电离模式：电喷雾电离正离子模式，毛细管电压：3.0Kv，锥孔电压：15V，源温度：120℃，脱溶剂气温度：400℃，脱溶剂气流速：560L/h。上述步骤中得到的甘露寡糖溶液吸取0.5mL加入0.5mLMilli-Q超纯水混匀备用上样分析，分析结果如图1所示。表明魔芋胶水解产物有二糖、三糖、六糖、七糖、十一糖，说明魔芋胶水解较为完全。

5、对利用菌株制备的产β-甘露聚糖酶应用于制备的甘露寡糖水解实验。

(1)底物的制备

准确称取10g瓜尔豆胶，加入800mL的pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，不断搅拌并持续加热，至魔芋胶溶解完全，用pH5..5的乙酸-乙酸钠缓冲液定容为1L，制成1％瓜尔豆胶溶液；

(2)粗酶液的制备

发酵结束后，吸取发酵液在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃去沉淀，所得上清液即为β-甘露聚糖酶液；

(3)酶解条件

将酶液和瓜尔豆胶溶液按照1:10体积比混合，在50℃水浴反应12h，得到酶解粗产物。取1mL酶解粗产物在12000r/min、4℃条件离心10min，吸取上清，弃去沉淀，吸取上清液0.5mL加入0.5mL50％乙醇溶液混匀，在12000r/min、4℃条件离心10min吸取上清，弃去沉淀，得到甘露寡糖溶液；

(4)定性定量分析

用还原糖转化率代表酶液的水解效率，采用DNS法酶解产物还原糖进行定量，还原糖转化率(％)＝还原糖含量(g)/魔芋胶含量(g)；

甘露寡糖的定性分析采用三重四级杆质谱仪对甘露寡糖成分进行分析。具体条件如下：电离模式：电喷雾电离正离子模式，毛细管电压：3.0Kv，锥孔电压：15V，源温度：120℃，脱溶剂气温度：400℃，脱溶剂气流速：560L/h。上述步骤中得到的甘露寡糖溶液吸取0.5mL加入0.5mLMilli-Q超纯水混匀备用上样分析。分析结果如图2所示。结果表明，瓜尔豆胶降解产物有二糖、三糖、四糖、十糖，说明瓜尔豆胶水解较为完全，表明产品水解性能好。

6、在仔猪基础日粮中添加甘露寡糖实验。

为了探究在饲料中添加甘露寡糖对饲料营养吸收率的影响，选取72头7kg重长白猪断奶仔猪，设置饲喂基础日粮的对照组和在基础日粮中添加0.03％的甘露寡糖的实验组，每组3个重复，实验周期32天，饲喂方式为自由进食。结果表明，在饲喂相同基础日粮的基础上添加0.03％的甘露寡糖以后，实验组比对照组平均日增重高出0.047kg，提高10.14％(P<0.05)，说明添加甘露寡糖实验组对仔猪日增重有明显提高，在饲喂相同日粮的情况下提高了营养吸收率。

所述基础日粮是，玉米70.15％、豆粕22.0％、鱼粉5.0％、磷酸氢钙1％、石粉0.55％、食盐0.3％、仔猪预混料1％，预混料中含微量元素、维生素、消化酶、酸化剂(公知技术)。

实验资料表明，本发明方法简单，绿色无污染，甘露寡糖可应用于饲料、食品添加剂等领域，能有效提高营养吸收率，具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120> 一种产β甘露聚糖酶的菌株及其应用

<130> 2021

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)

<400> 1

tcagagtttg aatcctggct aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga 60

gcggacagaa gggagcttgc tcccggatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 120

aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccggag ctaataccgg atagttcctt 180

gaaccgcatg gttcaaggat gaaagacggt ttcggctgtc acttacagat ggacccgcgg 240

cgcattagct agttggtggg gtaatggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag 300

agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360

gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt 420

ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc gagagtaact gctcgcacct 480

tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540

ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc 600

tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggaa acttgagtgc 660

agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 720

cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 780

gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg 840

gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg 900

caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960

attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac cctagagata 1020

gggctttccc ttcggggaca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080

gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag 1140

ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1200

catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac aaagggctgc 1260

aagaccgcaa ggtttagcca atcccataaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa 1320

ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380

ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgcaacac ccgaagtcgg 1440

tgaggtaacc tttatggagc cagccgccga aggtggtcag aaggg 1485

Claims (2)

1.一种产β-甘露聚糖酶的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株WBT0011，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.22575，保藏日期2021年5月20号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述的产β-甘露聚糖酶的菌株WBT0011在制备β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，制备β-甘露聚糖酶的方法包括以下步骤：

(1)菌种活化：将冻存保藏菌株WBT0011，接种于活化培养基中，37℃、180r/min培养24h；所述活化培养基为：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、pH7.4，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；

(2)种子培养：将上述活化菌种按照接种量1％接种于种子培养基中，37℃、180r/min培养24h；所述种子培养基为：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、pH7.3，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；

(3)发酵培养：将上述种子液按照接种量2％接种于β-甘露聚糖酶产酶培养基中，37℃、180r/min培养48h得到发酵酶液，而后在4℃、12000r/min条件离心10min，得到上清液即为β-甘露聚糖酶，酶活测定：

在37℃、pH5.5条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个β-甘露聚糖酶活力单位(U)，计算公式为：

β-甘露聚糖酶活力(U·mL^-1)

式中：A表示酶液的吸光度，A₀表示空白吸光度，K表示标准曲线斜率，b表示标准曲线截距，M表示D-甘露糖的摩尔质量，30表示酶解反应时间，1000表示单位换算系数。

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