CN111685243B - 一种复合预混合饲料及其在水产养殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种包含地衣芽孢杆菌的复合预混合饲料，并提供了其在水产养殖中的应用。所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2020090，能够改善鱼体的糖代谢水平，提高水产动物的免疫力，提高饲料消化利用，促进水产动物生长，可广泛应用于水产饲料领域。

Description

一种复合预混合饲料及其在水产养殖中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种包含地衣芽孢杆菌的复合预混合饲料及其在水产养殖中的应用。
背景技术
益生菌，作为饲料添加剂，可替代抗生素，增强动物免疫力，促进健康和生长，提高饲养效率，降低饲养成本，同时降低动物产品抗生素残留，抑制耐药性病原菌的发展。在众多益生菌中，芽孢杆菌是目前应用最广泛的菌之一，因其具有提高饲料转化率、增强动物机体免疫力、改善动物肠道健康等作用，芽孢杆菌被应用于越来越多的动物生产领域。
与陆生动物不同，水产动物为变温动物，其体温随着所处环境温度的变化而变化，基本接近环境温度。水产养殖对饲料的营养需求、配方组成和加工工艺的要求均与畜禽动物有所差别，从而导致了益生菌的开发与应用也具有一定的特殊性。例如，蛋白质、脂肪、碳水化合物三大能源物质中，鱼类对脂肪、蛋白质的消化率与畜禽基本相当，碳水化合物是最廉价的能源物质，适量添加可起到节约蛋白质和脂肪的作用，但是，许多鱼类对生淀粉的消化率仅20-40%，远低于畜禽对淀粉的消化率。加工工艺上，水产动物饲料要求粉碎得更细，饲料制粒温度更高，压缩比更大，生产出的颗粒饲料要求更紧密。这些差别要求我们开发水产动物专用益生菌制剂。
我国是世界上最大的水产养殖国家，贡献了超过全球水产养殖量的70%。水产专用益生菌的研发和广泛应用，不仅具有十分重要的经济效益，也具有显著的生态效益和社会效益。水产动物生活在水环境中，其体内微生物菌群组成受自身机体内在因素的影响，并且容易随着来自外界环境与食物中的微生物而发生改变。针对水产动物的生理特点、营养需求，以及水产饲料加工工艺的特殊性，合理进行益生菌配伍，并在实践中正确使用，才能更好得发挥其作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种包含地衣芽孢杆菌的复合预混合饲料，并提供了其在水产养殖中的应用。所述的复合预混合饲料，能够改善鱼体的糖代谢水平，提高水产动物的免疫力，提高饲料消化利用，促进水产动物生长，可广泛应用于水产饲料领域。
一种复合预混合饲料，包含益生菌、益生元、维生素、微量元素和载体。
所述的益生菌为地衣芽孢杆菌DN01（Bacillus licheniformis DN01），已于2020年4月29日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO: M 2020090。
所述的益生元为低聚木糖和低聚果糖。
进一步优选，低聚木糖和低聚果糖的质量比为3-5:1。
所述复合维生素由维生素A、维生素D、维生素K和叶酸组成。
进一步优选，所述复合维生素中维生素A、维生素D、维生素K和叶酸的质量比为3-5：1.5-2.5：6-10：0.75-1。
所述微量元素由硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、亚硒酸钠组成。
进一步优选的，所述微量元素中硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、亚硒酸钠的质量比为2.5-5：3-6：6-12：0.5-1。
所述载体为稻壳粉。
所述复合预混合饲料中各组分及其含量分别为：地衣芽孢杆菌DN01菌粉5-10g，低聚木糖15-30g/kg，低聚果糖5-6g/kg，维生素A 6-10g/kg，维生素D 3-5g/kg、维生素K 12-20g/kg、叶酸1.5-2g/kg，硫酸亚铁5-10g/kg，硫酸锌6-12g，硫酸锰12g，亚硒酸钠1-2g，稻壳粉887-913.5g。
进一步优选的，所述复合预混合饲料中各组分及其含量分别为：地衣芽孢杆菌DN01菌粉10g，低聚木糖15g，低聚果糖5g，维生素A 6g，维生素D 4g、维生素K 20g、叶酸1.5g，硫酸亚铁6g，硫酸锌10g，硫酸锰16g，亚硒酸钠2g，稻壳粉904.5g。
所述地衣芽孢杆菌DN01菌粉的活菌量为1010 CFU /g。
本发明还提供了上述复合预混合饲料在水产饲料中的应用。
本发明的有益效果
本发明筛选到的地衣芽孢杆菌DN01在液体培养条件下产淀粉酶能力很强。培养40h时淀粉酶活力最高达2417.5 U/ml。该菌株可以高效降解淀粉产生乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸等短链脂肪酸，其中乙酸含量最高为1.54g/L，丁酸含量也高达1.34 g/L。饲喂地衣芽孢杆菌DN01的实验组鲫鱼表观消化率提高了22.5%，同时，肝糖原和肌糖原的储存量降低了42.3%和40.5%，血糖和胰岛素含量也降低了43.7%和27.8%；地衣芽孢杆菌DN01的添加使得鱼体糖代谢关键酶较为活跃，显著加强了鱼体对碳水化合物的利用效率，可作为饲料添加剂广泛应用于水产饲料中，促进水产动物生长。与对照组相比，饲喂本发明提供的地衣芽孢杆菌DN01的益生菌组鲫鱼的增重率和存活率分别提高了28.3%和114.3%。
此外，所述地衣芽孢杆菌DN01能很好地与金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、爱德华氏菌等病原菌发生共聚集并抑制其生长，尤其对嗜水气单胞菌和爱德华氏菌的抑制效果最强，有利于提高水产动物的免疫力和抗病力，在水产养殖领域应用前景广泛。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌DN01产淀粉酶曲线；
图2为鲫鱼糖代谢相关基因相对表达量分析图。
具体实施方式
本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
本发明实施例中所涉及地衣芽孢杆菌DN01菌粉，其制备方法为：将地衣芽孢杆菌DN01进行活化，扩大培养，经液态发酵、喷雾干燥制成活菌量约为1010 CFU /g的菌粉。
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。
实施例1 菌株的分离、筛选与鉴定
1、 样品
采集于青岛胶南市淡水养殖试验场鲫鱼肠道。
2、 培养基
1)LB培养基：蛋白胨10g，氯化钠 10g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，配制固体培养基加入20g的琼脂，121˚C灭菌20min。
2)淀粉筛选培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠 0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸铁0.01g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，配制固体培养基加入20g的琼脂，121˚C灭菌20min。
3)淀粉利用培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，氯化钠 10g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
4)淀粉-溴甲酚紫培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，氯化钠 10g，1.6%溴甲酚紫4m1，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
3、 分离与筛选
鲫鱼饥饿24小时后将肠道采出，近胃端剪取约1cm肠道，无菌水反复冲洗内腔，收集洗液涂布淀粉筛选培养基平板，30℃培养24h-48h。挑选均匀清晰的单菌落，接种淀粉-溴甲酚紫培养基，30℃培养24h，选取使溴甲酚紫由紫色变为黄色的目标菌，划线纯化细菌，依此命名DN01、DN02、DN03……DN12。所述12株菌即为能降解淀粉产酸的菌株。
4、相对淀粉酶活性测定
采用淀粉碘液显色法测量菌液中相对淀粉酶活性。取5m1 0.5%可溶性淀粉稀释液与0.5ml菌液，pH.6.0、40℃下进行反应5min，加入5m1 0.1mo1/L 硫酸中止反应。取0.5m1反应液和5ml 0.4mmol/L 碘化钾溶液进行显色，测定620nm吸光值。以无菌水为对照，计算相对淀粉酶活性，具体结果见表1。
表1 筛选菌株相对淀粉酶活性
菌株 相对淀粉酶活性
DN01 0.48±0.01
DN02 0.08±0.02
DN03 0.12±0.02
DN04 0.23±0.01
DN05 0.16±0.03
DN06 0.26±0.02
DN07 0.14±0.03
DN08 0.25±0.01
DN09 0.29±0.03
DN10 0.31±0.01
DN11 0.22±0.03
DN12 0.26±0.02
从表1的数据可以看出，本发明筛选到的12株能降解淀粉产酸的菌株中，DN01菌株菌液中的相对淀粉酶活性最高。
5、菌株鉴定
（1）菌落形态特征：将上述DN01菌株重新划线培养，其呈现为白色、不透明、菌落凸起、边缘整齐，镜检显示其细胞为短杆状。
（2）提取上述菌株DN01的基因组DNA，利用PCR技术扩增16SrRNA序列，通过测序BLAST比对分析，其与已公布的多株地衣芽孢杆菌的16S rRNA序列相似度高于99%，鉴定证实DN01菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），与生化鉴定结果一致。
（3）将DN01菌株命名为地衣芽孢杆菌DN01（Bacillus licheniformis DN01），已于2020年4月29日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2020090。
实施例2地衣芽孢杆菌DN01产淀粉酶能力测定
接种活化地衣芽孢杆菌DN01，取活化好的菌液5ml，接种于液体发酵培养基中，37℃培养，每隔8 h取样一次，参照GB/T 24401-2009方法测定发酵上清液中淀粉酶酶活，以U/ml表示。淀粉酶活定义为在pH7.0、37℃条件下，1h液化1g可溶性淀粉即为一个酶活力单位（U）。地衣芽孢杆菌DN01产淀粉酶曲线见图1。
从图1可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌DN01在液体培养条件下产淀粉酶能力很强。培养8h开始，该菌株发酵产淀粉酶活力急剧上升，40h时淀粉酶活力最高达2417.5 U/ml，32h-80h范围内，地衣芽孢杆菌DN01产淀粉酶能力持续较高，取得了意料不到的技术效果。
实施例3地衣芽孢杆菌DN01降解淀粉产短链脂肪酸情况
益生菌分解产生的短链脂肪酸能够影响机体肠道生理功能以及生长性，这些短链脂肪酸可为肠上皮细胞提供能量，起到维持肠道内水电解质平衡的作用，还对粘膜免疫细胞有维护作用，减少促炎因子的生成，有利于粘膜炎症的修复。
将地衣芽孢杆菌DN01接种于淀粉利用培养基，培养24h，菌液样品预冷后浓硫酸进行酸化，乙醚萃取，上清液进行样品检测。气相色谱上机测试，进样口温度为180 ℃，柱温为80℃，初试时间2min，后以5℃/min升至150℃，保持5min，检测器温度为180 ℃，上样量为1µl。检测结果见表2。
表 2 地衣芽孢杆菌DN01产短链脂肪酸情况
短链脂肪酸 含量g/L
乙酸 1.54
丙酸 0.23
丁酸 1.34
异丁酸 0.09
戊酸 0.06
异戊酸 0.12
从表2的结果可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌DN01 能够有效降解淀粉产生乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸等短链脂肪酸，其中乙酸含量最高为1.54g/L，丁酸含量也高达1.34 g/L。地衣芽孢杆菌DN01降解淀粉产生的这些短链脂肪酸能够高校参与机体能量代谢，调节机体能量平衡，促进机体健康。
实施例4地衣芽孢杆菌DN01对鲫鱼碳水化合物利用的影响
将地衣芽孢杆菌DN01进行活化，扩大培养，经液态发酵、喷雾干燥制成活菌量约为1010CFU/g的菌粉。
实验饲料为高淀粉配方，淀粉添加量为45%，设置对照组和益生菌组，每组分别设置三个平行，每个平行鲫鱼40 尾。其中，对照组饲喂基础饲料，益生菌组是在基础饲料中按2‰质量比添加上述地衣芽孢杆菌DN01菌粉，混合均匀投喂。养殖实验期间每天投饵三次，溶氧≥7 mg/l，温度28 ± l ˚C，pH 7.5 ± 0.2。
实验饲料添加三氧化二钇进行标记，实验过程中收集粪便，离子色谱法测定钇元素含量，计算表观消化率。养殖实验结束，随机取样，分别测定鱼体肝糖原、肌糖原、血糖及胰岛素含量，具体结果见表3。
解剖取肝脏及肠道，荧光定量PCR测定糖代谢相关基因表达情况。选取以下基因进行检测：糖酵解通路丙酮酸激酶(PK)和葡萄糖激酶(GK)；葡萄糖摄取相关的葡萄糖转运蛋白4 (Glut4)；胰岛素信号转导通路的糖原合酶激酶(GSK)，糖原合酶(GS)和胰岛素受体(IR)，具体结果如图2所示。
表3 鲫鱼表观消化率及糖代谢相关指标
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从表3的数据可以看出，与对照组相比，饲喂本发明提供的地衣芽孢杆菌DN01的实验组鲫鱼表观消化率提高了22.5%；同时，肝糖原和肌糖原的储存量降低了42.3%和40.5%，血糖和胰岛素含量也降低了43.7%和27.8%。
图2显示了地衣芽孢杆菌DN01对鲫鱼糖代谢相关基因表达的影响：
（1）在糖酵解通路上，GK能促进葡萄糖向葡萄糖-6-磷酸盐的转化。GK表达量低可能是鱼类对淀粉利用效率低的原因，而地衣芽孢杆菌DN01的添加显著提高了GK的基因表达；
（2）在葡萄糖摄取方面，Glut4负责转运葡萄糖进入细胞质。Glut4基因在地衣芽孢杆菌DN01添加组表达量增加；
（3）在胰岛素信号转导通路中，IR表达量升高，胰岛素结合更多的受体，从而降低了血糖含量。同时，GSK表达降低，GS表达升高。
综上所述，地衣芽孢杆菌DN01的添加使得鱼体糖代谢关键酶较为活跃，显著加强了鱼体对碳水化合物的利用效率，取得了意料不到的技术效果。
实施例5地衣芽孢杆菌DN01抑菌能力测定
5.1 菌体与病原菌共聚集能力
分别挑取地衣芽孢杆菌DN01及病原菌单菌落活化，转接培养后收集菌体，调整菌量为107CFU/ml，取500µl 地衣芽孢杆菌DN01与等体积病原菌混合，静置孵育，6h取混合样品及对照组的上层菌液测定OD600值，计算菌体共聚能力，结果见表4。
共聚能力=[(A益生菌+A病原菌)-A混合样]/ (A益生菌+A病原菌)×100%。
表4 地衣芽孢杆菌DN01与病原菌共聚集能力比较
病原菌 共聚能力（%）
金黄色葡萄球菌 66.31±2.13
嗜水气单胞菌 73.28±3.12
荧光假单胞菌 70.54±3.02
爱德华氏菌 83.75±4.65
从表4的结果可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌DN01能很好地与金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、爱德华氏菌等病原菌发生共聚集，其中与爱德华氏菌的结合能力最强。地衣芽孢杆菌DN01的这种高结合能力有助于其有效结合并杀死或抑制病原菌的生长。
5.2 抑菌效果-平板拮抗法
以常见水产病原菌为指示菌，采用平板拮抗法分别测定地衣芽孢杆菌DN01的抑菌效果。在涂有指示菌的平板上点种地衣芽孢杆菌DN01菌液，28˚C恒温培养，48h内观察点种区周围是否出现抑菌透明区或覆盖区，测量抑菌圈大小，结果见表5。抑制作用表示为抑菌圈直径与菌落直径的比值，1表示没有抑制作用，1-2表示抑制作用一般，>2表示抑制作用较强。
表5 地衣芽孢杆菌DN01对水产病原菌的抑菌效果
菌株 金黄色葡萄球菌 嗜水气单胞菌 荧光假单胞菌 爱德华氏菌
DN01 1 3.04±0.11 2.98±0.07 3.29±0.08
从表5的结果可以看出，本发明筛选到的地衣芽孢杆菌DN01对水产病原菌嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和爱德华氏菌均有较强的抑制作用，尤其对嗜水气单胞菌和爱德华氏菌的抑制效果最强。
实施例6地衣芽孢杆菌DN01对鲫鱼生长性能及免疫力的影响
实验饲料为高淀粉配方，淀粉添加量为45%，设置对照组和益生菌组，每组分别设置三个平行，每个平行鲫鱼40 尾。其中，对照组饲喂基础饲料，益生菌组是在基础饲料中按3‰质量比添加上述地衣芽孢杆菌DN01菌粉（1010CFU/g），混合均匀投喂。养殖实验期间每天投饵三次，溶氧 ≥ 7 mg/l，温度28 ± l ˚C，pH 7.5 ± 0.2。
养殖实验结束，随机取样称重记录，统计分析其生长性能。选取20尾鱼进行108CFU/ml的嗜水气单胞菌攻毒实验，按照0.02m1/g进行腹腔注射，观察并记录罗非鱼存活情况，具体结果见表6。
表6 鲫鱼生长性能及免疫力的影响
增重率% 存活率%
对照组 274.54 35
益生菌组 352.10 75
从表6的数据可以看出，与对照组相比，饲喂本发明提供的地衣芽孢杆菌DN01的益生菌组鲫鱼的增重率和存活率分别提高了28.3%和114.3%。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌DN01能够显著促进鲫鱼生长，并且大幅度提高其攻毒后的存活率。
综上，本发明筛选到的地衣芽孢杆菌DN01可以高效利用淀粉，并产生短链脂肪酸，能够调节鱼体糖代谢相关基因表达，改善鱼体碳水化合物利用效率，并且能够显著抑制病原菌，提高水产动物的免疫力和抗病力，促进水产动物生长，可单独作为饲料添加剂，还可以与枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、双歧杆菌中的任意一种或两种或多种组合制备微生物制剂，还可以进一步与多糖类免疫增强剂、维生素类等进行复配，应用于鱼类、虾蟹等水产动物的饲料中，应用前景广阔。
实施例7
一种复合预混合饲料，每公斤所述复合预混合饲料中各组分及其含量分别为：地衣芽孢杆菌DN01菌粉5g，低聚木糖20g，低聚果糖5g，维生素A 10g，维生素D 5g、维生素K12g、叶酸1.5g，硫酸亚铁5g，硫酸锌10g，硫酸锰12g，亚硒酸钠1g，稻壳粉913.5g。
实施例8
一种复合预混合饲料，每公斤所述复合预混合饲料中各组分及其含量分别为：地衣芽孢杆菌DN01菌粉5g，低聚木糖30g，低聚果糖6g，维生素A 8g，维生素D 3g、维生素K18g、叶酸2g，硫酸亚铁10g，硫酸锌6g，硫酸锰24g，亚硒酸钠1g，稻壳粉887g。
实施例9
一种复合预混合饲料，每公斤所述复合预混合饲料中各组分及其含量分别为：地衣芽孢杆菌DN01菌粉10g，低聚木糖15g，低聚果糖5g，维生素A 6g，维生素D 4g、维生素K20g、叶酸1.5g，硫酸亚铁6g，硫酸锌10g，硫酸锰16g，亚硒酸钠2g，稻壳粉904.5g。
此外，申请人发现，保持其他组分一致，仅提高地衣芽孢杆菌DN01的菌含量，复合预混合饲料的益生效果得到明显提升，从而说明地衣芽孢杆菌DN01在本发明提供的复合预混合饲料中起到了重要作用。同时，寡糖、维生素及微量元素的配伍起到了加强的益生作用。所述复合预混合饲料中多种功能性组分的复合形式能够从不同角度发挥益生作用，更有益于促进水产动物的健康。
综上，本发明提供的微生态复合预混合饲料能显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进养殖动物生长，并且能够增强水产动物抗病力，提高存活率，有助于提高养殖户的经济效益，应用前景广阔。

Claims (5)

1.一种复合预混合饲料，其特征在于，所述的复合预混合饲料包含益生菌、益生元、维生素、微量元素和载体；所述的益生菌为地衣芽孢杆菌DN01（Bacillus licheniformis DN01），保藏编号为CCTCC NO: M 2020090。
2.如权利要求1所述的复合预混合饲料，其特征在于，所述的益生元由低聚木糖和低聚果糖组成。
3.如权利要求1或2所述的复合预混合饲料，其特征在于，所述的维生素由维生素A、维生素D、维生素K和叶酸组成。
4.如权利要求1或2所述的复合预混合饲料，其特征在于，所述的微量元素由硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、亚硒酸钠组成。
5.权利要求1-4任一所述的复合预混合饲料在水产饲料制备中的应用。
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