CN112251366A - 一株富锌热带假丝酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株富锌热带假丝酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株富锌热带假丝酵母菌株及其应用，有效解决菌株富集锌的能力强、生长速率快、产率高，用来制备富锌酵母饲料添加剂，改善母猪的繁殖性能，提高母猪初乳中锌含量，减少仔猪发病及促生长的问题。本发明利用微生物遗传育种技术和微生物发酵技术，根据酵母菌株对锌的耐受特性，利用紫外诱变技术选育出一株热带假丝酵母菌株UDY‑12，该菌株在进行高生物量发酵时具有将无机锌转化为酵母锌的能力，菌株富集锌的能力强、生长速率快、产率高，可制备富锌酵母饲料添加剂产品，原料来源广、操作简便、发酵周期短，富锌酵母中有机锌含量高，安全、高效、无毒，给母猪补充酵母锌，改善母猪的繁殖性能，提高母猪初乳中锌含量，减少仔猪发病及促生长。

Description

一株富锌热带假丝酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是一株富锌热带假丝酵母菌株及其应用。
背景技术
锌是动物生长发育所必需的微量元素，在维持动物健康和正常生理机能等方面具有重要作用。研究表明，锌可参与动物体内多种酶和功能蛋白质的分泌和组成，锌还参与动物免疫器官发育，影响动物特异性和非特异性免疫功能的发挥，在维持机体正常免疫机能和防止病原微生物侵入等方面具有重要意义。锌还与动物许多的基础生理生化活动密切相关，不仅参与DNA、RNA、蛋白质、糖类、脂类、矿物质和维生素的代谢，而且与胰岛素、前列腺素、促性腺激素等的作用和功能高度相关。因此，锌元素在促进动物健康生长和高效养殖等方面起到非常重要的作用。
在动物养殖生产实践中，多以无机锌盐或氧化锌的形式在饲料中添加满足动物机体对锌的需求。实际应用中，为了满足动物健康和追求更高的养殖效益，通常运用超量添加无机锌的方法来加强对动物锌的营养供给，在养猪行业尤为突出。但是，高剂量锌的使用通常会给养猪业造成如下问题：(1)日粮中高剂量的锌进入动物消化道后，绝大部分不能被吸收，而直接从粪便排出。断奶仔猪日粮中添加的锌有时高达2500～3000mg/kg，其中大约90～95%的锌从粪便排出；(2)长期或者超剂量饲喂高锌，可使动物组织中锌含量增高，不仅导致动物机体慢性中毒，降低畜禽产品的品质和安全性，更严重的是动物组织中的残留和大量粪便排泄的锌会对人类及整个生态链和食物链的健康带来重要影响；(3)日粮中高剂量的锌会影响动物机体对铜、钙、铁、硒等其他微量元素的正常吸收，同时还可能对维生素的稳定性产生影响，降低动物对维生素的需求。因此，如何降低锌在动物养殖过程中使用量，提高其生物学利用率，一直是一个急待解决的重大技术问题。
目前我国允许在养殖环节使用的锌制剂有：氧化锌、氯化锌、硫酸锌、碳酸锌、乙酸锌、碱式氯化锌、葡萄糖酸锌、丙酸锌、甘氨酸锌、蛋白锌、蛋氨酸锌螯合物、赖氨酸锌螯合物、氨基酸络合物等，酵母锌还未被开发利用。酵母菌对锌离子有一定的耐受性和富集能力，可以将无机锌转化为酵母有机锌。但在培养过程中锌的浓度过高会对酵母菌产生毒性，抑制酵母菌的生长。因此，选育高效富锌酵母菌株至关重要。
锌在动物体内主要以有机结合态进行吸收、转运、储存和利用。无机锌只有转化为有机态才能被机体利用，因此无机锌的生物学效价，取决其转化成有生物活性有机锌的能力。有机锌则不需要在肠道内进行转化就可以在消化道内稳定存在，不与纤维素、植酸等形成阻碍吸收的复合物，能更有效的被动物消化吸收。据报道，酵母锌的吸收利用率高达70%以上，酵母锌的生物利用率是葡萄糖酸锌3.7倍，使用安全剂量是硫酸锌的300～400 倍。
本发明提供了一株高效的富锌热带假丝酵母，在发酵培养过程中加入无机锌元素，通过酵母在生长过程中对锌元素的吸收和转化，使锌与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合，消除无机锌对动物的毒副作用和肠胃刺激，使锌能够更高效、更安全地被动物消化吸收和利用，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株富锌热带假丝酵母菌株及其应用，可有效解决菌株富集锌的能力强、生长速率快、产率高，用来制备富锌酵母饲料添加剂，改善母猪的繁殖性能，提高母猪初乳中锌含量，减少仔猪发病及促生长的问题。
本发明解决的技术方案是，一株富锌热带假丝酵母菌株UDY-12，分类命名为热带假丝酵母（Candida tropicalis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日：2019年12月16日，保藏号：CGMCCNo.19133；该菌株在制备富锌酵母饲料添加剂中的应用，方法是，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2 +的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为硫酸锌、氧化锌中的任一种；
所述的Zn2+平板培养基为，在麦芽汁培养基中添加硫酸锌储备液使锌元素含量达到500μg/mL，琼脂20.0g，用麦芽汁培养基定容至1L，115℃灭菌15 min制成；
所述的Zn2+YEPD培养基为，将40.0g葡萄糖、10.0g蛋白胨和10.0g酵母粉溶于去离子水中，添加硫酸锌储备液使锌元素含量达到500μg/mL，用去离子水定容至1L，121℃灭菌15min制成；
所述的麦芽汁培养基为，在6°波美度麦芽汁中加入琼脂20.0g，再用6°波美度麦芽汁定容至1 L，115℃灭菌15 min制成；
所述的硫酸锌储备液为，称取硫酸锌4.4237g，加蒸馏水100mL，121℃灭菌15 min，其中锌元素的浓度为10000μg/mL；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为30-80g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到300-800μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积5-8%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为12.9-15.2g/L，菌株中锌的质量含量为≥7.98mg/g；
所述的质量糖浓度为30-80g/L的麦芽汁培养基是，1kg粉碎麦芽加水5L于不锈钢锅中50℃浸泡90min，升温至60℃糖化60min，再升温至70℃继续进行糖化，直到无淀粉反应，过滤后煮沸浓缩,再过滤稀释至适当糖度，115℃灭菌20min制成；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
本发明充分利用微生物遗传育种技术和微生物发酵技术，根据酵母菌株对锌的耐受特性，利用紫外诱变技术选育出一株热带假丝酵母菌株UDY-12，该菌株对无机锌有高强度的耐性，在进行高生物量发酵时具有将无机锌转化为酵母锌的能力，菌株富集锌的能力强、生长速率快、产率高，可以用来制备富锌酵母饲料添加剂产品。本发明还针对该菌株制定了特定的高锌含量的富锌酵母的生产工艺。该工艺生产富锌酵母具有原料来源广、操作简便、发酵周期短等特点，富锌酵母中有机锌含量高，用于饲料和养殖环节添加，安全、高效、无毒，通过给母猪补充酵母锌，可以改善母猪的繁殖性能，提高母猪初乳中锌含量，对减少仔猪发病及促生长作用均有显著的作用，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一株富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中的应用方法是，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2 +的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为硫酸锌；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为30g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到300μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积5%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为≥13.8g/L，菌株中锌的质量含量为≥8.35mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
实施例2
本发明一株富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中的应用方法是，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2 +的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为氧化锌；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为50g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到500μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积6%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为≥15.2g/L，菌株中锌的质量含量为≥9.83mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
实施例3
本发明一株富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中的应用方法是，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2 +的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为硫酸锌；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为70g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到800μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积7%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为≥12.9g/L，菌株中锌的质量含量为≥7.98mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
实施例4
本发明一株富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中的应用方法是，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2 +的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为氧化锌；
（2）制备发酵培养物：在500L的发酵罐中加入糖质量浓度为60g/L麦芽汁培养基，加入硫酸锌储备液7.5L，使培养基中锌元素含量达到500μg/mL，添加磷酸氢二钾300g，用麦芽汁培养基定容至150L，121℃灭菌15 min，待发酵罐内温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积8%的发酵培养种子液，发酵罐搅拌速度180r/min，通气量为1﹕0.6v/v.min，罐压0.04Mpa，30℃条件下培养60h，热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，其中热带假丝酵母菌株生物量≥15.2g/L，菌株中锌的含量≥9.83mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，以麦芽糊精为干燥助剂，在进风温度160℃、出风温度80℃、热风流量2.5m3/min条件下喷雾干燥，干燥物料呈球状颗粒，流动性和溶解性均好，载体选用玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不溶或可溶两类产品，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
本发明方法制备的富锌酵母饲料添加剂经试验和应用，效果非常好，有关资料如下：
一、紫外线诱变选育热带假丝酵母菌株UDY-12
1.1 原始菌株
热带假丝酵母(Candida tropicalis)由河南省工业酶工程技术研究中心提供。
培养基
平板培养基为麦芽汁琼脂培养基，配制为：在6o波美度麦芽汁中加入琼脂20.0 g，再用6o波美度麦芽汁定容至1 L，115℃灭菌15 min，在平皿中制成。
含Zn2+平板培养基配制为：在6o波美度麦芽汁培养基中添加硫酸锌储备液使锌元素含量达到（v/v）500μg/mL，琼脂20.0g，用麦芽汁培养基定容至1L,115℃灭菌15 min，在平皿中制成。
含Zn2+YEPD培养基配制为：将40.0g葡萄糖、10.0g蛋白胨和10.0g酵母粉溶于去离子水中，添加硫酸锌储备液使锌元素含量达到（v/v）500μg/mL，用去离子水定容至1L,121℃灭菌15 min。
所述的硫酸锌储备液的配制为：称取硫酸锌4.4237g，加蒸馏水100mL，121℃灭菌15 min，其中锌元素的浓度为10000μg/mL 。
测定方法
热带假丝酵母生物量的测定方法为：发酵液经过5000r/min 离心10min，弃上清液，收集菌体，菌体再经无菌生理盐水冲洗，5000r/min 离心10min，弃上清液，反复3次，收集菌体，60℃干燥至恒重。
热带假丝酵母菌株中锌含量的测定方法：准确称取1g 发酵酵母干体于50mL烧杯中, 加入 8mL浓HNO3和2mL高氯酸，加热至冒白烟但无油滴出现，冷却后将溶液转移入50mL容量瓶中, 用双蒸馏水定容, 摇匀，用原子吸收分光光度计测定酵母细胞中锌的含量。
热带假丝酵母菌株UDY-12的鉴定采用微生物的菌体形态、培养形态、生理生化特征和分子生物学特征等进行鉴定。
紫外线诱变处理
取经过平板培养基活化培养的热带假丝酵母用无菌生理盐水冲洗，菌液经3000r/min离心8min，去上清液，菌体用无菌生理盐水冲洗再离心弃上清液。将菌体加入到20mL 无菌生理盐水中振荡10min，用无菌生理盐水稀释菌体至含活菌106cfu/mL，取菌体稀释液 1mL凃于无菌平皿中，将平皿放置于距15W紫外灯30cm处分别照射60s、120s、180s、240s、300s，照射后的菌体适当稀释后，涂布于含Zn2+500μg/mL平板培养基上，在28℃条件下培养48h，从中挑选5株菌落较大、生长良好的菌株接入含Zn2+500μg/mL的YEPD培养基上28℃培养48h，测定发酵培养物中菌株的生物量和菌株中锌的含量，其中两项指标测定值最高者即为紫外线诱变技术选育的目标菌株，编号为UDY-12。
菌株UDY-12的遗传稳定性
将菌株UDY-12在含Zn2+YEPD发酵培养基中连续发酵培养 5代，并将每一代分别接种5环至含Zn2+500μg/mL的YEPD培养基于50mL/250mL三角瓶中，30℃条件下培养36h，摇床转速为180r/min，测定发酵菌株UDY-12的生物量和菌株中锌的含量，同时以第一代菌株UDY-12作对照，结果如表 1。
表1菌株UDY-12 连续传代的生物量及菌株中锌的含量
项目 F1 F2 F3 F4 F5
生物量（g/L） 12.2 12.1 11.9 11.9 11.7
菌株中锌含量（mg/g） 7.21 7.10 7.05 7.03 7.00
由表 1可以看出，菌株UDY-12经过连续5代在含Zn2+500μg/mL的YEPD培养基的发酵培养，与第1代相比，菌株各代发酵的生物量和菌株中锌的含量基本保持稳定，说明该菌株是一株可以用于富锌酵母产品生产的菌株。
菌株UDY-12的鉴定
1.6.1 菌株形态特征
显微镜下观察，菌株UDY-12呈卵圆柱形或椭圆形，大小为3.3μm×4.8μm，以多边出芽方式进行无性繁殖，液体培养可见明显的假菌丝。
菌株培养特征
菌株UDY-12在麦芽汁琼脂平板培养基上30℃培养60h后，菌落无光泽或稍有光泽，软而平滑，有皱纹，呈圆形、奶油色。长时间培养的菌落质地较硬。在加盖片的玉米淀粉琼脂培养基上生长的菌落，可见大量假菌丝，包括分枝的假菌丝，上面附有芽分生孢子。
菌株生理生化特性
表2的碳源同化试验结果表明，菌株UDY-12对糖的利用范围比较广，除能利用葡萄糖外，还能利用木糖、干油以及发酵利用麦麸、玉米粉等植物原料中的碳源生产单细胞蛋白饲料。
表2菌株UDY-12碳源同化试验结果
碳源 结果 碳源 结果 碳源 结果
葡萄糖 + 可溶淀粉 + 纤维二糖 -
果糖 + 干油 + 绵子糖 -
蔗糖 + D-木糖 + D- 阿拉伯糖 -
麦芽糖 + 乙醇 + L- 鼠李糖 -
D-半乳糖 + D-山梨醇 + 乳糖 -
D-海藻糖 + D-甘露糖 + 菊糖 -
柠檬酸 + DL-乳酸 + 赤鲜糖 -
注：“+”表示能同化，“-”表示不能同化。
菌株分子生物学特征
采用PCR技术扩增菌株UDY-12的26SrDNA序列，然后进行BLAST比对，结果显示，该菌株的26SrDNA序列与热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)同源性高达99%。
二、富锌酵母饲料添加剂对仔猪生长性能、血清中抗体水平、腹泻发病率及粪样中锌含量的影响试验
应用本发明制备的富锌酵母饲料添加剂作为锌源添加于仔猪饲料中，确定其对仔猪生长性能、血清中抗体水平、腹泻发病率以及粪样中锌含量的影响。以断奶仔猪为试验对象，选择平均体重约7.5kg的杜长大三元杂交仔猪80头，根据科学饲养试验原则，将试验仔猪随机分成4个组，每组20头仔猪，设2个重复，每个重复10头猪。Ⅰ组基础日粮不含锌，Ⅱ组基础日粮添加以锌元素计100mg/kg的硫酸锌，Ⅲ组基础日粮添加以锌元素计100mg/kg的氧化锌，Ⅳ组基础日粮添加以锌元素计100mg/kg 富锌酵母饲料添加剂。试验仔猪饲喂玉米-豆粕型基础日粮，基础日粮的标准参照NRC(1998)仔猪营养需要配制。试验前对猪舍进行消毒，试验仔猪以每个重复为单位群饲，试验期间自由采食，自由饮水，其它按照常规饲养管理规程进行。试验在河南罗山县某猪场进行，试验期30天，试验结果如下：
6.1富锌酵母对仔猪生长性能的影响
试验开始的当天早上8﹕00和试验结束的当天早上8﹕00分别空腹称取试验仔猪的重量，计算仔猪平均日增重，结果如表3。
表3富锌酵母对仔猪生长性能的影响
项目 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组
始重（kg） 7.52 7.52 7.51 7.51
末重（kg） 19.83 20.58 20.43 22.58
平均日增重（g） 410 435 431 502
表3表明，试验仔猪日粮添加硫酸锌平均日增重提高6.09%，添加氧化锌平均日增重提高5.12%，添加富锌酵母饲料添加剂平均日增重提高22.44%，因此，试验仔猪日粮添加富锌酵母饲料添加剂对提高仔猪平均日增重效果显著。
三、富锌酵母饲料添加剂对仔猪血清中抗体水平的影响试验
试验仔猪于试验的第10d、20d和试验结束当天，每个重复随机选取1头仔猪，禁饲12h，禁饲期间自由饮水。耳静脉采血5mL于采血管中，室温放置20min后2000 r/min离心15min分离血清，采用免疫透射比浊法测定免疫球蛋白A(lgA)、免疫球蛋白G(lgG)和免疫球蛋白M(lgM)，测定结果取其平均值，结果如表4。
表4富锌酵母对仔猪血清中抗体水平的影响
项目 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组
IgA（g/L） 0.96 1.36 1.37 1.47
IgG（g/L） 2.40 3.43 3.42 3.51
IgM（g/L） 21.50 22.95 23.05 23.20
表4表明，试验仔猪日粮添加硫酸锌、氧化锌和富锌酵母饲料添加剂可使仔猪血清中免疫球蛋白A(lgA)分别提高41.67%、42.71%、53.13%，免疫球蛋白G(lgG) 分别提高42.92%、42.50%、46.25%，免疫球蛋白M(lgM) 分别提高6.74%、7.21%、7.91%。因此，试验仔猪日粮添加富锌酵母饲料添加剂可显著提高仔猪血清中免疫球蛋白A(lgA)、免疫球蛋白G(lgG)和免疫球蛋白M(lgM)的水平。
四、富锌酵母饲料添加剂对仔猪腹泻发病率的影响试验
试验期间以组为单位分别统计仔猪腹泻发病头数，计算仔猪腹泻发病率，结果如表5。
表5富锌酵母对仔猪腹泻发病率的影响
项目 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组
仔猪腹泻发病率（%） 34.65 18.91 19.17 8.65
表5表明，试验仔猪日粮中添加硫酸锌、氧化锌和富锌酵母，分别减少仔猪腹泻发病率15.74%、15.48%、26.00%。
五、富锌酵母饲料添加剂对仔猪粪样中锌含量的影响试验
试验第10d、20d和试验结束当天，每个重复随机选取1头仔猪进行粪样收集，干燥至恒重，测定粪样中锌元素的含量，测定结果取其平均值，结果如表6。
表6富锌酵母对仔猪粪样中锌含量的影响
项目 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组
仔猪粪样中锌含量（mg/kg） 0 26.47 25.69 8.96
由表6可知，试验仔猪日粮中添加硫酸锌和氧化锌，粪样中锌含量分别为26.47 mg/kg和25.69 mg/kg，而添加富锌酵母的仔猪粪样中锌的含量仅为8.96 mg/kg，表明仔猪日粮中添加富锌酵母，其粪样中锌的排放量比添加硫酸锌和氧化锌的分别降低66.15%和65.12%，证明仔猪对富锌酵母中锌的吸收利用更充分，因此可以显著减少粪便中锌的排放量。
由上述可以看出，本发明目的之一是：提供一种热带假丝酵母（Candidatropicalis），另一目的是：提供一种富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中的应用及其应用方法。本发明提供的菌株含锌量稳定，有效用于富锌酵母产品生产，对糖的利用范围广，既能利用葡萄糖，还能利用木糖、干油以及发酵利用麦麸、玉米粉等植物原料中的碳源生产单细胞蛋白饲料，与热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)同源性高达99%，有效用于制备富锌酵母饲料添加剂，富锌酵母饲料添加剂的制备方法简单、产品质量稳定、便于推广应用的一种富锌酵母饲料添加剂制备方法。制备的富锌酵母饲料添加剂可以作为畜禽动物补充锌的饲料添加剂。富锌酵母在饲料中的添加量低，进入动物胃肠道吸收速度快，吸收率提高近3倍，除满足动物对锌的营养需要外，还可促进动物生长，提高免疫力。同时富锌酵母可以避免无机锌对饲料中维生素等营养物质的破坏，显著提高饲料的利用率。产品的使用，可有效减少动物粪便中锌的排出量，减轻养殖业对环境的污染，经济和社会效益显著。

Claims (7)

1.一株富锌热带假丝酵母菌株UDY-12，分类命名为热带假丝酵母（Candida tropicalis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日：2019年12月16日，保藏号：CGMCC No.19133。
2.权利要求1所述的富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中的应用。
3.权利要求2所述的富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中应用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2+的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为硫酸锌、氧化锌中的任一种；
所述的Zn2+平板培养基为，在麦芽汁培养基中添加硫酸锌储备液使锌元素含量达到500μg/mL，琼脂20.0g，用麦芽汁培养基定容至1L，115℃灭菌15 min制成；
所述的Zn2+YEPD培养基为，将40.0g葡萄糖、10.0g蛋白胨和10.0g酵母粉溶于去离子水中，添加硫酸锌储备液使锌元素含量达到500μg/mL，用去离子水定容至1L，121℃灭菌15min制成；
所述的麦芽汁培养基为，在6°波美度麦芽汁中加入琼脂20.0g，再用6°波美度麦芽汁定容至1 L，115℃灭菌15 min制成；
所述的硫酸锌储备液为，称取硫酸锌4.4237g，加蒸馏水100mL，121℃灭菌15 min，其中锌元素的浓度为10000μg/mL；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为30-80g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到300-800μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积5-8%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为12.9-15.2g/L，菌株中锌的质量含量为≥7.98mg/g；
所述的质量糖浓度为30-80g/L的麦芽汁培养基是,1kg粉碎麦芽加水5L于不锈钢锅中50℃浸泡90min，升温至60℃糖化60min，再升温至70℃继续进行糖化，直到无淀粉反应，过滤后煮沸浓缩,再过滤稀释至适当糖度，115℃灭菌20min制成；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
4.根据权利要求3所述的富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中应用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2+的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为硫酸锌；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为30g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到300μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积5%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为≥13.8g/L，菌株中锌的质量含量为≥8.35mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
5.根据权利要求3所述的富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中应用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2+的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为氧化锌；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为50g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到500μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积6%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为≥15.2g/L，菌株中锌的质量含量为≥9.83mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
6.根据权利要求3所述的富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中应用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2+的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为硫酸锌；
（2）制备发酵培养物：在质量糖浓度为70g/L的麦芽汁培养基中加入硫酸锌储备液，使锌元素含量达到800μg/mL，添加磷酸二氢钾2g，用麦芽汁培养基定容至1000mL，分装于三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌15min，待灭菌培养基温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积7%的发酵培养种子液，在转速为180r/min的摇床上30℃培养60h，得热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，热带假丝酵母菌株生物质量为≥12.9g/L，菌株中锌的质量含量为≥7.98mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，在温度70℃、蒸汽出口温度为140℃的条件下进行流化床干燥，加入载体玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不可溶或可溶两类富锌酵母饲料添加剂，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
7.根据权利要求3所述的富锌热带假丝酵母菌株UDY-12在制备富锌酵母饲料添加剂中应用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备种子液：将热带假丝酵母菌株UDY-12接入装有Zn2+平板培养基的三角瓶中，Zn2+的质量含量为500μg/mL，在28℃下培养36h，再接入装有Zn2+YEPD培养基的三角瓶中，置于摇床上，摇床转速180r/min，在28℃下培养60h，得发酵培养种子液；
所述的Zn2+为氧化锌；
（2）制备发酵培养物：在500L的发酵罐中加入糖质量浓度为60g/L麦芽汁培养基，加入硫酸锌储备液7.5L，使培养基中锌元素含量达到500μg/mL，添加磷酸氢二钾300g，用麦芽汁培养基定容至150L，121℃灭菌15 min，待发酵罐内温度降到40℃以下时，接入灭菌培养基体积8%的发酵培养种子液，发酵罐搅拌速度180r/min，通气量为1﹕0.6v/v.min，罐压0.04Mpa，30℃条件下培养60h，热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物，其中热带假丝酵母菌株生物量≥15.2g/L，菌株中锌的含量≥9.83mg/g；
（3）制备富锌酵母饲料添加剂：将热带假丝酵母菌株UDY-12富锌酵母的发酵培养物采用板框压滤机过滤和浓缩，使可溶性固形物质量含量≥20%，以麦芽糊精为干燥助剂，在进风温度160℃、出风温度80℃、热风流量2.5m3/min条件下喷雾干燥，干燥物料呈球状颗粒，流动性和溶解性均好，载体选用玉米淀粉或葡萄糖粉，制成不溶或可溶两类产品，使锌含量2-10mg/g，即为成品。
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