WO2020073630A1 - 长链非编码在头颈癌检测及逆转肿瘤耐药性中的应用 - Google Patents

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徐寒梅
武和明
李梦玮
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中国药科大学
南京医科大学附属口腔医院
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Definitions

  • Head and neck cancer is the seventh type of malignant tumor among tumor diseases, accounting for about 7% of human body malignant tumor diseases, of which more than 90% of head and neck cancer is head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). More than 500,000 patients are diagnosed with head and neck squamous cell carcinoma every year, and the number of new cases in China accounts for 1/5 of them, and the number of deaths each year is about 56,000.
  • squamous cell carcinoma of the head and neck is divided into oral cancer, nasopharyngeal cancer, oropharyngeal cancer and laryngeal cancer.
  • head and neck squamous cell carcinoma can also be divided into HPV negative and positive tumors. Poor lifestyle habits such as smoking and alcoholism are generally considered to be the cause of head and neck squamous cell carcinoma.
  • R / M remote metastasis or recurrent symptoms
  • the transmembrane glycoprotein epidermal growth factor receptor can activate the downstream pathways (such as PI3K and ERK-1 / 2, etc.) to regulate tumor cell proliferation, invasion and drug resistance.
  • An important target molecule in head and neck squamous cell carcinoma 90% of patients with head and neck squamous cell carcinoma overexpress EGFR.
  • Cetuximab (Cetuximab, Erbitux) became the first FDA-approved targeted therapy for head and neck squamous cell carcinoma on November 7, 2011. According to reports, only 10% -20% of head and neck squamous cell carcinoma patients Complete remission was achieved during long-term treatment with cetuximab. However, at present, the mechanism of drug resistance is still unclear.
  • the present invention studies the mechanism of action of lncRNA related to cetuximab resistance in head and neck squamous cell carcinoma, hoping to provide a reference for clinical treatment.
  • the detection primer sequences used for real-time quantitative PCR are shown in SEQ ID NO. 2 and SEQ ID NO. 3.
  • the invention also discloses a method for establishing a stable cetuximab drug-resistant cell line: a concentration gradient screening method is used to establish an SCC4 / CTX drug-resistant cell strain.
  • the present invention also attempts to specifically interfere with the role of RP11-499F3.2 in other indications of cetuximab, including colon cancer, esophageal cancer, and non-small cell lung cancer drug resistance cell model, which is cetuximab
  • the clinical drug delivery plan expands the treatment direction;
  • the experiment designed by the present invention is scientifically reasonable, feasible and effective, and the research on long-chain non-coding RNA RP11-499F3.2 is in-depth system; based on the above findings, the expression level of lncRP11-499F3.2 can be used as a new biomarker It assists the diagnosis of head and neck cancer and predicts the degree of malignancy, especially reversing the response of head and neck cancer patients to cetuximab resistance, improves the therapeutic effect, and has good prospects for translational medicine.
  • Figure 6 The relationship between the expression level of RP11-499F3.2 in 30 HNSCC clinical serum samples and the overall survival rate of HNSCC patients;
  • Figure 20 A dynamic tumor growth diagram of cetuximab drug-sensitive PDX transplanted tumor model
  • specimens of head and neck cancer and adjacent tissues were collected during the operation, washed with normal saline, and stored in liquid nitrogen or -80 °C refrigerator for use.
  • SCC4 cells Resuscitate and cultivate SCC4 cells.
  • SCC4 cells grow to 70% density, discard the culture medium in the culture bottle and replace with DMEM complete medium with a final drug concentration of 80 nM at 37 ° C and 5% CO2 incubator. Incubate for 48 hours in medium, and then use a drug-free medium for stable passage for 3 or more times;
  • SCC4 and SCC4 / CTX cells were cultured in large quantities, digested with 0.25% trypsin solution, and the cell suspension was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes after termination of digestion. The cells were resuspended in serum-free DMEM medium and counted, and the cell concentration was adjusted to 5 ⁇ 10. 7 / ml;
  • Fig. 23 The results are shown in Fig. 23.
  • the administration cycle of the cetuximab tolerant oral squamous cell carcinoma PDX model (OSCC-CR) in the saline group, cetuximab group, LNA group, cetuximab group + LNA group ended After that, the tumor volume was (1959.08 ⁇ 79.09) mm 3 , (832.08 ⁇ 92.08) mm 3 , (419.03 ⁇ 73.38) mm 3 and (97.05 ⁇ 35.04) mm 3 (see Figure 24).

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Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA RP11-499F3.2的头颈癌临床检测中的应用以及该长链非编码RNA在逆转肿瘤对西妥昔单抗耐药中的应用。本发明公开的lncRNA RP11-499F3.2有助于揭示头颈癌新的发病机制，为头颈癌的预后监测提供新的肿瘤标志物，同时可以促进包括头颈癌、结肠癌、食管癌等几种肿瘤对西妥昔单抗的耐药性。

Description

[根据细则37.2由ISA制定的发明名称]　长链非编码在头颈癌检测及逆转肿瘤耐药性中的应用 技术领域
本发明属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域，更具体地说，涉及一种长链非编码RNA RP11-499F3.2在头颈癌的临床检测及逆转肿瘤对西妥昔单抗耐药中的应用。
背景技术
头颈癌是肿瘤疾病中排名第七的恶性肿瘤类型，约占人体全身恶性肿瘤疾病的7％，其中多于90％的头颈癌属于头颈鳞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)。每年超过50万患者被确诊为头颈鳞癌，中国新发病例数约占其中的1/5，每年死亡病例数约5.6万例。一般意义上头颈鳞癌分为口腔癌、鼻咽癌、口咽癌及喉癌等。同时，由于约四分之一的头颈鳞癌患者与体内感染乳头瘤病毒(HPV)相关(尤其是口咽癌患者)，头颈鳞癌也可分为HPV阴性及阳性肿瘤。吸烟与嗜酒等不良生活习惯被普遍认为是头颈鳞癌发生的诱因。同时由于患者诊断意识较差，患者体内远端转移或复发症状(Recurrent or metastatic，R/M)较为普遍等原因，头颈鳞癌疾病的临床早期诊断及综合治疗仍受到极大限制，头颈鳞癌患者的平均生存期仅为5年。
长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是目前研究肿瘤疾病机制的重点，其定义是非编码RNA分子中核苷酸(nt)长度大于200个，且缺少完整开放阅读框(Open reading frame，ORF)的RNA分子。lncRNA具有较高的组织与细胞特异性，大量的lncRNA被报道在肿瘤疾病中具有差异表达谱，被认为是潜在的原癌基因及肿瘤抑制基因，并有望作为临床诊断分期及治疗的理想靶标。目前，lncRNA参与肿瘤疾病发生发展已被普遍认同，但其具体分子机制仍需大量研究作为实验依据。因此，本发明通过分析头颈鳞癌的lncRNA差异表达谱，研究相关lncRNA的功能机制，希望为发现头颈鳞癌的生物标志物提供依据。
手术切除、化疗及放疗等传统方式是头颈鳞癌患者常用的临床治疗方法，但由于头颈部器官位置特殊，该类治疗较易造成患者器官功能性损伤，影响生存质量。同时对于被诊断为晚期或出现远端转移、局部复发症状的头颈鳞癌患者，传统治疗的治疗效果往往不尽人意。随着恶性肿瘤疾病的分子病理学研究逐渐开展，诸多肿瘤类型的治疗效果已被证明与信号通路调控及靶基因突变有关，头颈鳞癌靶向治疗也开启了临床治疗新思路。
跨膜糖蛋白表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)可通过激活下游通路(如PI3K及ERK-1/2等)进而调控肿瘤细胞增殖、侵袭及耐药性产生等生命活动，是头颈鳞癌中重要的靶标分子，90％的头颈鳞癌患者过表达EGFR。西妥昔单抗(Cetuximab，商品名Erbitux)于2011年11月7日成为首个FDA批准用于头颈鳞癌的靶向治疗药物，据报道，仅有10％-20％的头颈鳞癌患者在西妥昔单抗长期治疗中取得完全缓解。但目前，其耐药性产生机制仍不明确，本发明通过对头颈鳞癌西妥昔单抗耐药相关lncRNA的作用机制进行研究，希望为临床治疗提供参考。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是发现一种与头颈癌相关的长链非编码RNA RP11-499F3.2。该lnc RP11-499F3.2与头颈鳞癌临床诊断及预后密切相关，能促进头颈鳞癌细胞体外增殖及转移，可作为头颈鳞癌潜在的生物标志物。针对其设计的锁核甘酸能提高西妥昔单抗耐药的敏感性。
为了实现上述目的，技术方案如下：
本发明公开了一种长链非编码RNA RP11-499F3.2，是由发明人综合分析癌症基因图谱(TCGA)数据库中头颈癌和正常癌旁组织的lncRNA表达谱芯片数据发现的一个显著高表达在头颈癌组织中的lncRNA。其位于人类染色体15:81,660,482-81,871,125反义链，DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
用于头颈癌的临床检测方法为实时定量PCR，所述的方法包括：
从患有头颈癌的对象获得测试样品；
确定所述测试样品中包括长链非编码RNA RP11-499F3.2的表达水平；和
分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的预后。
更进一步地，所述的测试样品是液氮保存的肿瘤组织和血清。
更进一步地，用于检测生物标志物表达水平的试剂是实时定量PCR检测试剂盒。
用于实时定量PCR的检测引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
用于评估lnc RP11-499F3.2对头颈癌细胞功能的影响，具体的实验步骤如下：
采用lnc RP11-499F3.2过表达和沉默慢病毒分别感染SCC4细胞，筛选出稳转细胞，然后分别做细胞增殖、迁移侵袭和划痕实验检测。
本发明还公开了一种建立稳定西妥昔单抗耐药细胞系的方法：采用浓度梯度筛选法建立SCC4/CTX耐药细胞株。
为了探究lnc RP11-499F3.2在西妥昔单抗耐药中的作用，我们通过设计锁核甘酸特异性调控RP11-499F3.2的表达。具体地，这一特异锁核甘酸序列见SEQ ID NO.4。
更进一步地，以非特异性序列NC的序列作为阴性对照，序列见SEQ ID NO.5，分别转染SCC4/CTX细胞株，通过检测耐药细胞体外增殖及转移能力变化，考察lnc RP11-499F3.2对西妥昔单抗耐药细胞的敏感性变化。
同时，我们考察特异性锁核甘酸对头颈鳞癌体内西妥昔单抗耐药的影响。具体地说，通过体内多次传代建立头颈鳞癌西妥昔单抗耐药PDX模型，瘤内注射给予一定剂量的lnc RP11-499F3.2的锁核甘酸，监测肿瘤体积变化。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明发现lnc RP11-499F3.2在头颈鳞癌中显著高表达，且与预后密切相关，可作为头颈鳞癌潜在的生物标志物；
(2)本发明发现lnc RP11-499F3.2在头颈癌细胞中的表达水平显著高于正常上皮细胞，lnc RP11-499F3.2缺失表达后能够明显抑制头颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成，提示其对肿瘤生长和转移的重要性，为头颈癌靶向治疗提供参考；
(3)本发明通过体外建立西妥昔耐药细胞株，体内建立西妥昔耐药PDX模型，发现下调lnc RP11-499F3.2表达有助于恢复头颈癌细胞对西妥昔单抗的敏感性，进一步证明lnc RP11-499F3.2是头颈鳞癌西妥昔单抗耐药表型产生的关键lncRNA；
(4)本发明还尝试特异性干扰RP11-499F3.2在西妥昔单抗其它适应症，包括结肠癌、食管癌、非小细胞肺癌耐药细胞模型中的作用，为西妥昔单抗的临床给药方案拓展治疗方向；
(5)本发明设计的实验科学合理、可行有效，对长链非编码RNA RP11-499F3.2的研究深入系统；基于以上发现，lnc RP11-499F3.2表达水平可作为一个新的生物标志物辅助头颈癌的诊断和恶性程度的预测，特别是逆转头颈癌患者对西妥昔单抗耐药的反应性，提高治疗效果，具有良好的转化医学前景。
附图说明
附图1头颈癌组织和癌旁组织中差异表达的LncRNA芯片聚类图，数据来自TCGA数据库；
附图2 lnc RP11-499F3.2表达水平与HNSCC患者总生存率的关系，数据来自TCGA数据库；
附图3 lnc RP11-499F3.2在46对头颈癌组织和癌旁组织中的表达量比较，数据来自TCGA 数据库；
附图4 lnc RP11-499F3.2在50对HNSCC临床样本中的qPCR检测结果(2 -ΔΔct值比较，*P<0.05，**P＜0.01)；
附图5 lnc RP11-499F3.2在50例HNSCC临床组织样本中表达水平与HNSCC患者总生存率的关系图；
附图6 lnc RP11-499F3.2在30例HNSCC临床血清样本中表达水平与HNSCC患者总生存率的关系图；
附图7 lnc RP11-499F3.2在HNSCC细胞和口腔上皮细胞中的表达量比较结果图；
附图8 lnc RP11-499F3.2过表达和沉默慢病毒载体质粒图谱；
附图9 lnc RP11-499F3.2过表达和沉默慢病毒载体转染SCC4细胞和qPCR检测结果图；
附图10过表达和沉默lnc RP11-499F3.2对SCC4细胞增殖能力的影响结果图；
附图11过表达和沉默lnc RP11-499F3.2对SCC4细胞迁移能力的影响结果图；
附图12过表达和沉默lnc RP11-499F3.2对SCC4细胞侵袭能力的影响结果图；
附图13 MTT法检测亲代SCC4对cetuximab响应的IC50值；
附图14 cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞增殖能力的影响结果图；
附图15 cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞周期分布影响的结果图；
附图16 cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞凋亡影响的结果图；
附图17 cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞克隆形成影响的结果图；
附图18 cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞体内肿瘤生长影响的结果图；
附图19 SCC4及SCC4/CTX细胞株中lnc RP11-499F3.2表达水平的检测；
附图20建立cetuximab药物敏感PDX移植瘤模型的肿瘤动态生长图；
附图21头颈鳞癌cetuximab耐药PDX移植瘤模型肿瘤动态生长图；
附图22 cetuximab敏感和耐受的HNSCC-PDX模型肿瘤组织中lnc RP11-499F3.2表达水平检测；
附图23 cetuximab耐药的HNSCC PDX模型给予lnc RP11-499F3.2靶向抑制剂后的肿瘤动态生长图；
附图24 cetuximab耐药的HNSCC PDX模型给予lnc RP11-499F3.2靶向抑制剂后的肿瘤解剖图；
附图25 cetuximab耐药的HNSCC PDX模型给予lnc RP11-499F3.2靶向抑制剂后的主要脏器的HE染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
人头颈癌组织与配对正常组织的lncRNA测序结果分析
肿瘤基因组图谱(TCGA)计划由美国National Cancer Institute(NCI)和National Human Genome Research Institute(NHGRI)于2006年联合启动的项目，利用大规模测序为主的基因组分析技术，针对36种癌症进行大规模实验，TCGA基因组分析中心(GCC)比对肿瘤和正常组织，寻找与各癌症或者亚型相关的基因突变、扩增或者缺失。为理解癌症的分子机制，提高人们对癌症发病分子基础的科学认识提供帮助。
进入TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)头颈鳞癌选项页面，选定clinical及RNAseq选项，点击进入页面。在RNAseq选项中选取rsem.genes.normalized_results.txt文件，并选取METADATA及clinical目录中所有文件，获取地址后下载；获取头颈鳞癌组织基因表达数据后，按照METADATA文件信息将RNA标准化数据重命名，以方便与基因表达数据文件及临床病理信息比对；比对后统计共有500例头颈鳞癌癌组织及46例头颈鳞癌癌旁组织，对应RNA表达数据和临床病理信息完整。
选用R语言软件(3.1版本)分析头颈鳞癌组织基因表达数据，筛选差异表达lncRNA，R语言软件是通过芯片表达丰度及噪音高低进行修正的基因芯片表达差异算法；以头颈鳞癌组织基因表达数据为标准化数据录入Excel软件，取出表达的空缺值多于80％样本量的lncRNA数据；使用R语言软件分析差异表达lncRNA，差异表达lncRNA的筛选条件设置为FDR<0.05，Fold change>2，即筛选在头颈鳞癌癌组织及正常组织中表达水平差异P值<0.05且差异值(绝对值)>2倍的lncRNA，使用Cluster 3.0软件包绘制聚类分析图，对头颈鳞癌组织高通量基因表达数据进行可视化分析。
结果见图1，从13964个候选lncRNA中，本文依据筛选条件共得到563个差异表达lncRNA(fold change>2，P<0.05)，其中在头颈鳞癌组织中表达显著上调的有254个，下调的有309个。
实施例2
lnc RP11-499F3.2的筛选及其表达水平与HNSCC患者总生存率的关系
将所有临床样本无差异随机平分为两组(训练集组及测试集组)，每组为250例临床样 本；将训练集临床样本以已筛选lncRNA相对表达水平分为high risk及low risk组，以患者生存时间为自变量，使用lasso方法选取变量，绘制Kaplan-Meier生存曲线；利用测试集对训练集组筛选的lncRNA进行验证，筛选方法及条件相同。
表1.Kaplan-Meier生存曲线法筛选与HNSCC生存期显著相关的lncRNA
Figure PCTCN2019082004-appb-000001
为进一步验证并筛选头颈鳞癌诊断相关lncRNA，本发明对已筛选的8种lncRNA进行ROC曲线绘制，评估上述lncRNA对头颈鳞癌患者生存期的诊断预测能力，筛选头颈鳞癌理想的诊断分子标志物。
表2 ROC曲线法筛选头颈鳞癌患者生存期相关lncRNA
Figure PCTCN2019082004-appb-000002
结合表1、表2剔除ROC曲线中AUC<0.6的lncRNA后，共筛选出符合条件的lncRNA共4个：RP11-499F3.2、LINC00460、LINC00958及ST3GAL4-AS1，并显示其特异性及灵敏度较高。其中，在头颈鳞癌组织特异性高表达的lnc RP11-499F3.2的AUC面积最高，其训练集及测试集的AUC分别为0.714及0.748，且敏感度及特异性均高于80％，可以作为头颈鳞癌理想的诊断分子标志物。
结果见图1，在训练集及测试集中lnc RP11-499F3.2的表达水平与HNSCC预后均显著性相关。
实施例3
lnc RP11-499F3.2在HNSCC肿瘤组织和配对正常组织中的表达水平分析
根据实施例1的方法获取43对HNSCC样本癌组织和癌旁组织的clinical信息以及对应的lnc RP11-499F3.2表达数据。结果见图2，与配对的正常癌旁组织相比，lnc RP11-499F3.2在HNSCC的表达水平显著升高，考虑可作为头颈癌临床早期诊断的指标。
实施例4
lnc RP11-499F3.2在头颈癌病人及正常癌旁组织中的表达情况。
(1)标本的采集
在患者知情同意的情况下，于术中采集头颈癌及癌旁组织标本，生理盐水清洗后，保存于液氮或-80℃冰箱中备用。
(2)引物设计
根据lnc RP11-499F3.2的信息在ensemble数据库中查找该基因的所有exon序列信息，并根据获取的序列信息采用Primer Premier5.0设计引物，序列如下：
上游引物(SEQ ID NO.2)
下游引物(SEQ ID NO.3)
(3)实时定量PCR检测lnc RP11-499F3.2在头颈癌病人及正常癌旁组织中的表达。
按life公司的Trizol说明书提取收集样本的总RNA，再用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA的纯度和浓度，琼脂糖质检确保提取RNA的完整性。采用TaKaRa试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)对提取的总RNA反转录合成cDNA。采用TaKaRa试剂盒
Figure PCTCN2019082004-appb-000003
Premix Ex Taq TMII(Tli RNaseH Plus)进行qPCR反应。反应体系如下表：
表3 PCR反应体系
Figure PCTCN2019082004-appb-000004
将上述组份混合均匀后按以下程序：95℃30s预变性，40个循环；95℃5s，60℃30s。
根据熔解曲线判断反应的特异性，由公式2-ΔΔCt计算lnc RP11-499F3.2的相对表达量。结果见图4，在75％左右的头颈癌样本中，lnc RP11-499F3.2的表达水平显著高于正常癌旁组织。
实施例5
lnc RP11-499F3.2表达水平与50例HNSCC患者总生存率的关系
根据lncRNA相对表达水平将50例HNSCC患者分为high risk及low risk组，以患者生存时间为自变量，使用lasso方法选取变量，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
结果见图5，lnc RP11-499F3.2的表达与头颈癌病人的存活率存在相关性，lnc RP11-499F3.2低表达的患者总生存率显著高于TMEM170B高表达的患者，进一步证实lnc RP11-499F3.2作为头颈癌预后的一个新指标。
实施例6
lnc RP11-499F3.2在头颈癌患者及健康人血清中的表达水平
(1)标本的采集
在患者知情同意的情况下，于术前收集头颈癌患者和健康志愿者血清样本，保存于-80℃冰箱中备用。
(2)实时定量PCR检测在头颈癌患者及健康志愿者血清中lnc RP11-499F3.2的表达
引物设计及具体检测方法同实施例5。
结果见图6，与健康志愿者相比，lnc RP11-499F3.2在HNSCC的表达水平显著升高，考虑可作为头颈癌临床早期诊断的血清学指标。
实施例7
检测HNSCC细胞和正常上皮细胞中的lnc RP11-499F3.2表达
提取头颈癌SCC4，SCC9，SCC13，CAL27和正常上皮细胞HIOEC的总RNA，qPCR检测lnc RP11-499F3.2，具体检测方法同实施例5。结果见图7，头颈鳞癌细胞系lnc RP11-499F3.2表达均明显高于HIOEC细胞。
实施例8
lnc RP11-499F3.2过表达和沉默载体的制备和病毒转染效率检测
合成针对lnc RP11-499F3.2的全长cDNA导入过表达慢病毒载体(图8)，按照shRNA的设计规则，设计三条针对lnc RP11-499F3.2外显子的小分子干扰RNA(序列分别为SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)导入沉默慢病毒载体(图8)，将上述质粒同包装质粒DR8.9和包膜质粒VSVG.2共转入293T细胞中以产生病毒，转染48h后，收集细胞的病毒上清，感染SCC4细胞。感染24h后，加入嘌呤霉素筛选获得稳转lnc RP11-499F3.2过表达和沉默细胞株。收集稳转细胞的总RNA，通过qPCR(具体方法同实施例5)检测lnc RP11-499F3.2表达变化。
结果见图9，根据观察转染细胞lnc RP11-499F3.2过表达慢病毒质粒的转染细胞在荧光下可观察到明显的GFP蛋白表达，其lnc RP11-499F3.2表达较对照组CTRL产生显著上调(P<0.01)。同时根据GFP表达及qRT-PCR实验，结果显示sh-c干扰慢病毒质粒转染效率最高。
实施例9
过表达和沉默lnc RP11-499F3.2对SCC4细胞增殖能力的影响
采用MTT法检测过表达和沉默lnc RP11-499F3.2后对SCC4细胞增殖的活性的影响。头颈癌细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10 4个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO2培养箱中培养。分别在培养0h、24h、48h和72h后向96孔板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在检测波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)。
试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05 为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。
结果见图10，过表达lnc RP11-499F3.2的组别则产生极显著的细胞增殖能力上调，而沉默lnc RP11-499F3.2使头颈鳞癌细胞增殖能力下降。这显示lnc RP11-499F3.2具有体外促进头颈鳞癌细胞增殖的能力。
实施例10
过表达和沉默lnc RP11-499F3.2对SCC4细胞迁移能力的影响
将头颈癌细胞SCC4接种到transwell小室中，每孔100μL，在transwell下室加入0.6mL含10％FBS的完全培养基刺激细胞迁移，于5％CO2，37℃培养24h。弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migration inhibition rate，MIR)：
Figure PCTCN2019082004-appb-000005
其中Ntest为测试组的细胞迁移数，Ncontrol为空白对照组的细胞迁移数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。
结果见图11，SCC4细胞在过表达lnc RP11-499F3.2后成功迁移的数量显著增多，与此相对，敲低lnc RP11-499F3.2的SCC4细胞在培养48h后显著减少了迁移细胞数量。这说明lnc RP11-499F3.2在头颈鳞癌细胞系SCC4中可以促进细胞迁移。
实施例11
过表达和沉默lnc RP11-499F3.2对SCC4细胞侵袭能力的影响
将10mg/mL Matrigel用培养基以1:3稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。将培养到对数生长期的头颈癌细胞用胰蛋白酶消化，收集，用PBS洗涤两次后用空白培养基重悬。将细胞浓度调整到1×10 5个/mL。将细胞接种到transwell小室中，每孔100μL，在transwell下室加入0.6mL含10％FBS的完全培养基刺激细胞侵袭，于5％CO2，37℃培养24h。弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未发生侵袭的细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算侵袭抑制率(Invasion inhibition rate,IIR)：
Figure PCTCN2019082004-appb-000006
其中Ntest为测试组的细胞侵袭数，Ncontrol为空白对照组的细胞侵袭数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。
结果见图12，SCC4细胞在过表达lnc RP11-499F3.2后成功侵袭的数量显著增多，与此相对，敲低lnc RP11-499F3.2的SCC4细胞在培养48h后显著减少了侵袭细胞数量。这说明lnc RP11-499F3.2在头颈鳞癌细胞系SCC4中可以促进细胞侵袭。
实施例12
MTT法检测亲本敏感SCC4对cetuximab响应的IC 50值
设置西妥昔单抗10nM、20nM、40nM、80nM、160nM、320nM药物浓度，以多西他赛(10μg/ml)为阳性药，MTT检测不同药物浓度下SCC4细胞的zengzhi情况，具体方法见实施例9。
结果见图13，西妥昔单抗对SCC4细胞的增殖抑制效果随药物浓度提升显著增高，该细胞株对西妥昔单抗药物敏感，SCC4细胞在西妥昔单抗药物作用下的IC50值为80nM，作为筛选西妥昔单抗耐药细胞株的起始浓度。
实施例13
cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞增殖能力的影响
(1)复苏并培养SCC4细胞，当SCC4细胞生长至70％密度，弃去培养瓶中培养基，更换为药物终浓度为80nM的DMEM完全培养基，在37℃，含5％CO2的培养箱中培养48h，再采用无药物培养基稳定传代3次或以上；
(2)待细胞恢复稳定生长，细胞密度达到70％密度，开始倍增培养基中西妥昔单抗药物浓度，重复上述步骤，每个药物剂量保持细胞培养15-20天；
(3)定期冻存各药物浓度诱导的SCC4细胞，测定诱导细胞的IC50值，最终获得耐受1280nM西妥昔单抗的SCC4细胞，将耐药细胞命名为SCC4/CTX。
(4)利用MTT法检测不同浓度西妥昔单抗对SCC4和SCC4/CTX两种细胞的增殖能力的影响，具体方法见实施例9。
结果见图14，相较于亲本SCC4药物敏感细胞，本发明建立的耐药细胞SCC4/CTX在西 妥昔单抗耐受剂量内的细胞增殖水平仍显著增长。
实施例14
cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞周期分布的影响
(1)当SCC4及SCC4/CTX生长至对数生长期，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化，转至EP管后1000rpm离心5min，重悬并铺设至六孔细胞培养板培养，当细胞密度生长至60％，弃去培养基，分别加入含0nM、40nM、320nM西妥昔单抗药物浓度的DMEM无血清培养基，六孔板置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养48h；
(2)加入0.25％胰蛋白酶溶液消化，转至离心管后900rpm离心5min，再用PBS重悬洗涤细胞，使用细胞计数仪计算细胞量，细胞悬液浓度调整为1×10 6个/ml；
(3)取1ml细胞悬液，加入500μl的70％预冷乙醇溶液，4℃下固定2h至过夜，1000rpm离心3min后弃去上清，PBS洗涤细胞两次，洗去残余固定液；
(4)按照RNase：PI工作液为1:9的体积比例配制染色工作液，每个样本加入500μl染色工作液，4℃下避光孵育30min；
(5)采用流式细胞仪上机检测细胞周期，选取并记录激发波长488nm处各细胞样品的红色荧光信号；
(6)数据分析采用FlowJo v5.7.3软件，使用Dean-Jett-Fox拟合模型，以细胞数量作为纵坐标，PI红色荧光信号强度为横坐标，统计样品细胞在各细胞周期的分布。
结果见图15，SCC4细胞在G1期的细胞分布比例随药物浓度提升而显著增加(P<0.05)；S期细胞分布比例随药物浓度提升而显著下降(P<0.05)，西妥昔单抗使细胞生长阻滞于G1期，抑制SCC4细胞增殖活力。而在西妥昔单抗不同药物浓度作用下，SCC4/CTX细胞的G1、S、G2/M期细胞分布均无显著差异。
实施例15
cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞凋亡的影响
(1)当SCC4及SCC4/CTX生长至对数生长期，0.25％胰蛋白酶溶液消化，转至EP管后1000rpm离心5min，重悬并铺设至六孔细胞培养板培养，当细胞密度生长至60％，弃去培养基，分别加入含0nM、40nM、320nM西妥昔单抗药物浓度的DMEM无血清培养基，六孔板置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养48h；
(2)加入0.25％胰蛋白酶溶液消化，转至离心管后900rpm离心5min，用预冷的PBS缓 冲液重悬并漂洗细胞两次，除去细胞悬液中残留的胰酶，使用细胞计数仪计算细胞量，加入Annexin V结合液400μl，重悬细胞调整细胞浓度至1×10 6个/ml；
(3)向细胞悬液加入Annexin V-FITC染色液5μl，轻轻混匀，4℃下避光孵育15min，再加入10μl的PI染色液，轻轻混匀，4℃下避光孵育5min；
(4)立刻使用流式细胞仪上机检测细胞凋亡，选取并记录激发波长488nm、发射波长530nm处细胞样品的荧光信号，同时检测未经药物处理细胞的Annexin V-FITC单阳性管及PI的单阳性管，确定荧光补偿数值以及十字象限门的位置；
(5)数据分析采用FlowJo v5.7.3软件，以PI红色荧光信号强度作为纵坐标，Annexin V-FITC绿色荧光信号强度为横坐标。实验结果中，右上Q2象限属于晚期凋亡细胞，右下Q3象限属于早期凋亡细胞，左下Q4象限属于正常细胞，统计细胞凋亡率时采用Q2象限及Q3象限。
结果见图16，SCC4细胞在40nM及320nM西妥昔单抗药物作用下，细胞凋亡率均显著增加；而SCC4/CTX仅在320nM药物浓度压力下产生细胞凋亡率显著增加，且相同药物浓度下，SCC4/CTX细胞凋亡率较SCC4细胞显著性降低。由此可认为，在西妥昔单抗药物压力下，SCC4/CTX较SCC4具有更强的凋亡抵抗功能。
实施例16
cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞克隆形成的影响
(1)称取0.56g低熔点琼脂糖粉末，加入10ml双蒸水，配制为5.6％的琼脂糖胶母液，121℃下高压灭菌30min，放至50℃水浴锅中恒温；
(2)0.8％下层琼脂糖胶配制：取5.6％的琼脂糖胶母液1.5ml，温度维持在40℃左右，防止凝固，加入9ml DMEM完全培养基，吹打均匀，分装0.5ml/孔至12孔细胞培养板，共铺设18个孔，4℃下冷却凝固5min；
(3)分别配制45.7nM以及365.7nM的含西妥昔单抗DMEM完全培养基，消化并收集处于对数生长期的SCC4及SCC4/CTX细胞，两种细胞均等量分为三份，采用DMEM完全培养基、45.7nM加药DMEM培养基及365.7nM加药DMEM培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度至1×10 4个/ml；
(4)0.7％上层琼脂糖胶配制：吸取5.6％的琼脂糖胶母液1.2ml，均分至6个5ml离心管中，分别加入上述SCC4及SCC4/CTX的已配制细胞悬液各1.4ml，缓慢吹打均匀，分装0.5ml/孔至已铺设下层胶的十二孔细胞培养板中，同种细胞的相同药物浓度设三个复孔，每种细 胞悬液共铺设9个孔，每孔铺设细胞量为5×103个，4℃下冷却凝固5min；
(5)琼脂糖胶凝固后，按克隆形成实验组别分别向孔中加入相应的DMEM完全培养基、40nM加药DMEM培养基及320nM加药DMEM培养基，每孔各0.5ml；
(6)12孔板放置于37℃，含5％CO2的培养箱培养15-20天，每三天更换上层相应培养基，当培养板中存在肉眼可见的细胞克隆，停止细胞培养；
(7)吸取上层培养基并弃去，每孔中加入1ml 0.01％结晶紫染色液，避光染色1h，PBS缓冲液脱色至克隆清晰可见，将细胞培养板置于倒置显微镜，观察并统计SCC4及SCC4/CTX的细胞克隆量。
结果见图17，随着药物浓度增加，SCC4细胞细胞克隆形成数目显著下降，而SCC4/CTX在不同浓度药物压力下，细胞克隆形成量均未产生明显下降，且无显著性差异，这表明西妥昔单抗抑制SCC4/CTX细胞克隆形成的能力较弱。
实施例17
cetuximab对SCC4及SCC4/CTX细胞体内移植瘤模型的肿瘤生长影响
(1)大量培养SCC4及SCC4/CTX细胞，采用0.25％胰酶溶液消化，终止消化后细胞悬液1000rpm离心5min，用无血清的DMEM培养基重悬细胞后计数，调整细胞浓度至5×10 7个/ml；
(2)每只裸鼠(订购4-6周龄、体重在14-16g的雌性BALB/c裸鼠共24只，在SPF级动物饲养室适应性饲养1周)左侧腋下接种200μl对应组别的细胞悬液，注射细胞量为1×10 7个；
(3)接种后密切观察裸鼠接种部位的肿瘤生长情况，接种后第7天，接种部位出现白色结节，触摸后可于皮下活动，随肿瘤组织生长，接种部位逐渐形成坚硬瘤块，约14天肿瘤组织平均体积达到100mm3，将BALB/c裸鼠随机分至四组，每组6只，开始给药时动物体重为16-18g；
(4)每隔两日测量并记录移植瘤体积，肿瘤体积(Tumor volume，TV)计算公式如下：
肿瘤体积＝0.5×a×b^ 2
其中，a为移植瘤长度，b为移植瘤宽度。
结果见图18，SCC4移植瘤模型中，西妥昔单抗组(20mg·kg -1)的肿瘤体积明显减少，具有极显著性差异(P<0.001)；SCC4/CTX移植瘤模型中，西妥昔单抗组(20mg·kg -1)在西妥昔单抗药物持续压力下未产生明显的肿瘤生长减缓，肿瘤生长曲线与阴性组相近。这表明SCC4/CTX细胞移植瘤模型对西妥昔单抗产生耐药表型，SCC4/CTX细胞在体内具有西妥 昔单抗耐药性。
实施例18
SCC4及SCC4/CTX细胞体内肿瘤给药结束后lnc RP11-499F3.2表达水平的检测
SCC4及SCC4/CTX细胞体内移植瘤模型给药结束后，剖瘤组织进行qRT-PCR监测，实验结果见图19，在西妥昔单抗药物压力(20mg·kg -1)下，SCC4细胞移植瘤组织的lnc RP11-499F3.2表达水平表现为显著下降(P<0.05)，而SCC4/CTX细胞系的表达并未产生明显变化，其表达水平lnc RP11-499F3.2较SCC4细胞依然有极显著性差异(P<0.01)。lnc RP11-499F3.2表达与西妥昔单抗耐药表型正相关，其可能为逆转头颈鳞癌西妥昔单抗耐药的靶点分子。
实施例19
建立cetuximab药物敏感PDX移植瘤模型的肿瘤动态生长情况
(1)头颈鳞癌新鲜组织样本由术后直接获得，样本离体后迅速放入无菌器皿，运送至无菌操作台；
(2)新鲜肿瘤组织使用含抗菌素的生理盐水迅速清洗，立即转移至含抗菌素DMEM培养基的10cm细胞培养皿，剪去坏死肿瘤组织、瘤内纤维组织及脂肪组织，再次清洗；
(3)将剩余活性肿瘤组织剪切成2×2×2mm3大小的肿瘤组织块。取2-3只BALB/c裸鼠，75％乙醇消毒前肢背腹部皮肤，异氟烷麻醉小鼠，在小鼠前肢腋下部位剪出2mm皮肤破口，肿瘤组织块填装入18号套管穿刺针，穿刺至小鼠前肢肩背部皮下，形成皮下10mm长移行窦道，推动套管穿刺针针芯使肿瘤组织块接种于肩背部位皮下，每只小鼠接种两处，每例样本接种2-3只小鼠(视肿瘤样本量确定)，样品离体至肿瘤组织移植过程不超过4h，头颈鳞癌PDX移植瘤模型命名为G1代；
(4)待各实验组内PDX移植瘤模型平均肿瘤体积生长至150mm 3，且相同代数PDX模型小鼠数量满足分组要求(不少于8只)，开始体内西妥昔单抗给药，验证PDX亲代模型小鼠对西妥昔单抗药物的敏感性；
(5)各实验组PDX模型小鼠随机分至两组，每组4只小鼠，组别设置分别为G1阴性对照(生理盐水)、G2西妥昔单抗(20mg·kg-1)，给药周期为21天。
结果见图20，裸鼠肿瘤体积在药物处理后缩小多于50％的PDX组别定义为药物敏感组，药物处理后肿瘤体积增加超过35％的定义为药物耐受组，其余组别定义为药物稳定组。共获 得2例药物敏感组PDX模型，本发明选取中度敏感的PDX模型(C2组，口腔鳞癌患者)作为建立西妥昔单抗耐药头颈鳞癌PDX移植瘤模型的亲代模型，进行体内给药实验。
实施例20
头颈鳞癌cetuximab耐药PDX移植瘤模型肿瘤动态生长情况
将筛选的头颈鳞癌药物敏感PDX移植瘤进行传代后，待肿瘤体积生长至150mm 3，进行西妥昔单抗体内给药，诱导药物敏感PDX移植瘤模型耐药表型的产生。经过三轮西妥昔单抗体内给药及肿瘤组织传代，C2组PDX模型出现显著耐药表型，肿瘤体积在西妥昔单抗药物压力下仍产生明显增长。结果见图21，西妥昔单抗敏感口腔鳞癌PDX模型(OSCC)在西妥昔单抗给药后，肿瘤体积与阴性对照组(生理盐水组)相比产生显著下降，而西妥昔单抗多次体内给药诱导产生的口腔鳞癌PDX模型(OSCC-CR)，其阴性对照组肿瘤生长体积较药物敏感模型(OSCC)显著较高(P<0.01)，其在西妥昔单抗药物压力下出现明显的肿瘤生长，肿瘤体积增加超过35％，表现显著的药物耐受表型，符合药物耐受组定义，即成功建立头颈鳞癌西妥昔单抗耐药PDX移植瘤模型。
实施例21
cetuximab敏感和耐受的HNSCC-PDX模型肿瘤组织中lnc RP11-499F3.2表达水平检测
cetuximab敏感和耐受的HNSCC-PDX模型体内给药结束后，剖瘤组织进行qRT-PCR监测，实验结果见图22，西妥昔单抗药物耐受OSCC-CR PDX模型的lnc RP11-499F3.2表达水平较药物敏感模型有极显著性差异(P<0.01)。同时，在西妥昔单抗药物压力下，药物敏感模型的肿瘤组织的lnc RP11-499F3.2相对表达表现为显著下降(P<0.05)，而OSCC-CR模型肿瘤组织的表达并未产生明显变化，其lnc RP11-499F3.2表达水平较药物敏感模型依然更高，且具有极显著性差异(P<0.01)。上述结果与lnc RP11-499F3.2在SCC4/CTX中表达情况一致(实施例18)，再次通过临床肿瘤组织证明lnc RP11-499F3.2表达水平与西妥昔单抗耐药性呈正相关，同时验证本发明中西妥昔单抗耐受头颈鳞癌PDX模型建立成功。
实施例22
cetuximab耐药的HNSCC PDX模型给予lnc RP11-499F3.2靶向抑制剂后的肿瘤动态生长监测
为体内验证lnc RP11-499F3.2在形成头颈鳞癌西妥昔单抗耐药PDX移植瘤模型中的作 用，本发明设计靶向lnc RP11-499F3.2的LNA进行瘤内注射。
(1)订购4-6周龄、体重在14-16g的雌性BALB/c裸鼠共20只，在SPF级动物饲养室中适应性饲养1周，复苏并接种OSCC-CR西妥昔单抗耐药口腔鳞癌模型组织块，密切观察裸鼠接种部位的移植瘤生长情况；
(2)当肿瘤组织平均体积达到150mm3，将BALB/c裸鼠随机分至四组，每组5只，组别设置分别为G1阴性对照组(0.2ml/20g)、G2西妥昔单抗组(20mg·kg-1)，G3LNA组(5mg·kg-1)、G4西妥昔单抗+LNA组(西妥昔单抗：20mg·kg-1；LNA：5mg·kg-1)；
(3)给药周期为21天，给药周期结束后观察PDX模型小鼠一周，测量并记录PDX模型肿瘤体积变化；
(4)实验结束后脱臼处死小鼠，剥离瘤块，计算肿瘤体积并拍照，各PDX模型组别肿瘤组织块留样进行液氮速冻及冻存。
结果见图23，西妥昔单抗耐受口腔鳞癌PDX模型(OSCC-CR)的生理盐水组、西妥昔单抗组、LNA组、西妥昔单抗组+LNA组给药周期结束后，肿瘤体积分别为(1959.08±79.09)mm 3、(832.08±92.08)mm 3、(419.03±73.38)mm 3及(97.05±35.04)mm 3(见图24)。OSCC-CR模型在西妥昔单抗压力下肿瘤体积增加超过35％，表现显著的药物耐受表型，证明OSCC-CR模型具有西妥昔单抗耐药性；单独施加LNA使肿瘤生长体积较对照组出现显著下降(P<0.001)，证明LNA靶向下调lnc RP11-499F3.2可抑制西妥昔单抗耐药模型肿瘤生长；西妥昔单抗组+LNA组给药周期结束后，肿瘤体积出现负增长，即OSCC-CR模型在西妥昔单抗药物压力下，同时靶向下调肿瘤内lnc RP11-499F3.2表达可使原本耐药症状表型逆转为显著的药物治疗效果，这表明LNA靶向下调lnc RP11-499F3.2可以使西妥昔单抗耐药的头颈鳞癌复敏。
实施例23
cetuximab耐药的HNSCC PDX模型给予lnc RP11-499F3.2靶向抑制剂后的主要脏器的HE染色结果
cetuximab耐药的HNSCC PDX模型给予lnc RP11-499F3.2靶向抑制剂结束后，取模型鼠心脏、肝、脾、肺、肾脏组织，10％的福尔马林固定，石蜡包埋后切片，HE染色观察组织病理情况。收集头颈鳞癌OSCC-CR PDX模型lnc RP11-499F3.2靶向抑制剂各实验组的组织，进行HE染色，观察各组织病理情况。
结果见图25，各组别心脏、肝、脾、肾脏脏器未出现明显病理症状，G3西妥昔单抗给 药组出现肺部浸润，这表明该组别有肿瘤转移现象，即头颈鳞癌西妥昔单抗耐药的PDX移植瘤模型建立过程中出现一定程度的肺部转移。
实施例24
靶向干扰lnc RP11-499F3.2对结肠癌亲本和耐药细胞HT29(CTX-R)，食管鳞癌细胞TE13(CTX-R)和非小细胞肺癌A549(CTX-R)增殖能力的影响
采用cetuximab浓度梯度的方法建立HT-29，TE13和A549耐药细胞株，具体方法见实施例13，利用MTT法检测lnc RP11-499F3.2锁核甘酸分别对HT29，TE13和A549敏感和耐药细胞的增殖能力的影响，具体方法见实施例9。
结果见表4，相较于对照组，本发明设计的lnc RP11-499F3.2锁核甘酸单独作用能HT-29，TE13和A549耐受细胞的增殖能力显著降低，联合cetuximab后增殖能力有极显著降低，说明靶向特异性降低lnc RP11-499F3.2的表达，能够使西妥昔单抗耐药结肠癌，食管鳞癌和非小细胞肺癌复敏。
表4靶向干扰lnc RP11-499F3.2对耐药细胞的影响
Figure PCTCN2019082004-appb-000007
试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

Claims (10)

  1. 一种长链非编码RP11-499F3.2在头颈癌临床检测中的应用。
  2. 一种长链非编码RP11-499F3.2在逆转肿瘤对西妥昔单抗耐药中的应用。
  3. 根据权利要求1所述的一种长链非编码RP11-499F3.2，其特征在于所述长链非编码RNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
  4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述头颈癌包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤以及口腔颌面部肿瘤。
  5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的用于头颈癌的临床检测试剂为实时定量PCR检测试剂。
  6. 根据权利要求2所述的逆转肿瘤对西妥昔单抗耐药中的应用，其特征在于，通过合成特异性锁核甘酸(Locked Nucleic Acid,LNA)抑制lnc RP11-499F3.2的表达。
  7. 根据权利要求2所述的逆转肿瘤对西妥昔单抗耐药中的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括头颈癌、结肠癌、食管癌和非小细胞肺癌。
  8. 根据权利要求5所述的应用一种用于头颈癌的临床检测的实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的长链非编码RNA设计并合成出特异性用于实时定量PCR的检测引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
  9. 根据权利要求6所述的应用，其特征是，其锁核甘酸序列为序列表中SEQ ID NO.4，所述的锁核甘酸合成方式是化学合成，可以作为基因治疗药物。
  10. 根据权利要求9所述的lnc RP11-499F3.2的锁核甘酸的体内给药方式为瘤内原位、尾静脉、皮下或肌肉注射。
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