CN107213161B - 长链非编码rna rp11-224o19.2抑制剂的用途 - Google Patents

长链非编码rna rp11-224o19.2抑制剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了长链非编码RNA RP11‑224O19.2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物和一种肝癌筛查和/或肝癌预后诊断的试剂盒。本发明表明，RP11‑22O19.2抑制剂对肿瘤治疗效果显著。另外，检测RP11‑224O19.2的表达水平，可用于临床肝癌的辅助诊断及预后判断，应用前景良好。

Description

长链非编码RNA RP11-224O19.2抑制剂的用途
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNA RP11-224O19.2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
肝癌是一种具有转移率高、病死率高、预后差的高度恶性肿瘤，对人类健康和生命造成严重威胁。肝癌的病因至今尚不完全明确，一般认为诱因包括慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、酒精滥用、毒物污染食物的摄入等。目前，肝癌的主要治疗手段有肝移植、手术切除、放疗、化疗和靶向治疗，肝癌患者的短期存活率有一定增加，但总体死亡率和术后复发率仍然居高不下。
长链非编码RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)是一类内源性长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，起初它被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。越来越多的证据表明，LncRNA是一类具有重要生物学功能的RNA，能够在表观遗传、转录和转录后水平通过介导DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等生物学过程来发挥调控功能。
RP11-224O19.2是一种长链非编码RNA，位于第1号染色体chr1:218517538-218519020，hg19，基因序列长度为1483bp，转录本长度为557bp。
目前RP11-224O19.2的功能尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA RP11-224O19.2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途及治疗肿瘤的药物。
RP11-224O19.2抑制剂：为抑制RP11-224O19.2表达的物质，包括阻断和/或干扰RP11-224O19.2表达的化合物、核苷酸序列等。
本发明提供了一种长链非编码RNA RP11-224O19.2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
其中，所述治疗肿瘤的药物为抑制RP11-224O19.2表达的药物。
进一步地，所述抑制RP11-224O19.2表达的药物为siRNA药物。
其中，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
siRNA为双链分子，其中，SEQ ID NO：1所示的序列为正向序列。SEQ ID NO：2所示的序列为反向序列。
SEQ ID NO：1：GCAUGACUCUGCAGCCAUATT
SEQ ID NO：2：UAUGGCUGCAGAGUCAUGCTT
其中，所述治疗肿瘤的药物为治疗肝癌的药物。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，它是以RP11-224O19.2抑制剂为活性成分，加上学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
其中，所述RP11-224O19.2抑制剂为抑制RP11-224O19.2表达的药物。
其中，所述抑制RP11-224O19.2表达的药物为siRNA药物。
和/或，所述治疗肿瘤的药物为治疗肝癌的药物。
其中，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种siRNA分子，序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了检测RP11-224O19.2表达的试剂在制备肝癌筛查和/或肝癌预后诊断的试剂中的用途。
本发明还提供了一种肝癌筛查和/或肝癌预后诊断的试剂盒，它包含任选的用于检测RP11-224O19.2表达水平的试剂。
本研究发现，抑制RP11-22O19.2表达能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡，降低TGFB2表达水平，从而达到治疗肿瘤的效果，尤其对肝癌治疗效果显著，小分子RP11-224O19.2siRNA可以作为靶向肿瘤的药物，应用前景良好。
另外，通过检测RP11-224O19.2的表达水平，可以筛查待检人群患肝癌的风险，及对肝癌患者的预后情况做出预测，可用于临床肝癌的辅助诊断及预后判断。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1下调RP11-224O19.2的表达抑制HepG2细胞的增殖、克隆形成并诱导凋亡。a：转染siRNA后显著地下调RP11-224O19.2的表达，b：下调RP11-224O19.2抑制HepG2细胞的增殖，c：下调RP11-224O19.2抑制HepG2细胞的克隆形成，d：下调RP11-224O19.2诱导HepG2细胞的凋亡
图2下调RP11-22O19.2的表达抑制HepG2细胞的迁移和侵袭。细胞划痕实验(a)和Transwell细胞迁移实验(b)表明HepG2细胞的迁移能力在RP11-224O19.2下调后被抑制了，c：Transwell细胞侵袭实验表明下调RP11-224O19.2的表达抑制HepG2细胞的侵袭。
图3RP11-224O19.2调控机制的初步研究。a：GSE77314数据集的分析结果表明TGFB2在肝癌中上调，b：TCGA数据集验证了TGFB2的上调，c：TGFB2的表达量在RP11-224O19.2被干扰后显著地下调了
图4RP11-224O19.2在肝癌组织中表达上调并与肿瘤大小密切相关。GSE77509(a)和TCGA(b)数据集的分析结果表明RP11-224O19.2在肝癌组织中上调，GSE77509(c)和TCGA(d)数据集的分析结果表明RP11-224O19.2能作为生物标记物将肝癌组织和正常组织区分开，e：根据RP11-224O19.2的相对表达量将50个临床病例分为高表达和低表达组，f：高表达的RP11-224O19.2与更高阶的肿瘤大小分期相关。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1 靶向于RP11-224O19.2的siRNA设计及筛选
1、靶向于RP11-224O19.2的siRNA设计与合成
靶向于RP11-224O19.2的siRNA及其相应的对照siRNA(negative control siRNA)由我们自行设计，序列见表2，然后委托公司合成双链的siRNA序列。
2、实验分组及细胞转染
实验分组：根据不同的处理条件将细胞分为3组，实验组(RP11-224O19.2-siRNA组)为转染了干扰效率高的siRNA的HepG2细胞；阴性对照组(Negative control siRNA组)为转染了阴性对照siRNA的HepG2细胞；空白组(Control组)为不进行任何处理的HepG2细胞。
HepG2细胞常规培养操作如下：
1)细胞复苏：肝癌HepG2细胞由本实验室保存，从液氮罐中小心地取出冻存的HepG2细胞冻存管，迅速置于37℃的恒温水浴锅(金城国胜实验仪器厂)中，将冻存管缓慢摇晃使其迅速解冻。解冻完成后迅速将细胞转移到含有5mL 10％FBS(法国Biowest公司)DMEM培养基(美国Gibco公司)的10mL离心管中，用5mL移液枪(美国Thermo公司)轻轻吹打细胞悬液使其充分混匀。将10mL离心管放入高速冷冻离心机(德国HERMLE公司)中以1200r/min离心5min。离心后小心地将上清液吸弃，用5mL 10％FBS DMEM培养液重悬沉淀的细胞，转移至10cm的细胞培养板(美国Corning公司)中并补齐培养液至10mL，将培养板置于37℃含有5％CO2的恒温细胞培养箱(日本Panasonic公司)中培养，次日更换细胞培养液，继续培养。
2)细胞传代：当在倒置显微镜(日本Olympus公司)下观察到HepG2细胞的生长密度达到80％-90％时，细胞需要进行传代，将所有仪器设备准备完毕后，将细胞培养板置于超净工作台。首先将培养板中的旧培养基吸弃，用4mL无菌的PBS洗2次后加入1mL 0.25％的胰酶(美国Thermo公司)后迅速置于恒温培养箱中进行消化。消化1min后在倒置显微镜下观察细胞形态，当观察到细胞变圆并漂浮流动时，立即用5mL 10％FBS DMEM培养液终止消化，用5mL移液枪充分吹下细胞并将其转移到10mL离心管中，放入高速冷冻离心机中以1200r/min离心5min。离心后小心地吸弃上清液，用5mL 10％FBS DMEM培养液重悬沉淀的细胞，将细胞悬液一分为二后转移至10cm的细胞培养板中并补齐培养液至10mL，将培养板置于37℃含有5％CO2的恒温细胞培养箱中培养。
细胞转染：操作步骤如下：
1)将生长状态良好并处于对数生长期的肝癌HepG2细胞消化计数后，按3×105个/孔的接种密度将细胞接种于6孔板中，置于恒温细胞培养箱中培养；
2)第二天待细胞密度达到80％左右时，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，每孔加入1.5mL无双抗的10％FBS DMEM培养基；
3)转染试剂配置：对于每一个孔的转染试剂的配置，取两个洁净无菌的1.5mL EP管，先用250μL无双抗的DMEM培养基稀释5μL浓度为100μM的siRNA并轻轻混匀，然后再用250μL无双抗的DMEM培养基稀释5μL LipofectamineTM6000转染试剂(上海碧云天生物公司)并轻轻混匀，在室温环境下静置5min；
4)静置5min后，将siRNA稀释后加入到含有LipofectamineTM6000转染试剂的培养基中并轻轻混匀，在室温环境下静置20min；
转染时，保证siRNA的终浓度为50nM，Lipofectamine6000的用量取决于siRNA的用量，保证Lipofectamine6000的体积和siRNA的体积一样；
5)静置20min后，将混匀后的混合物均匀地加入到各孔中，轻轻摇晃混匀，放入恒温细胞培养箱中培养；
6)培养6h后，先将旧培养基吸弃，用PBS洗2次，每孔加入2mL含双抗的10％FBSDMEM培养基，置于恒温细胞培养箱中继续培养48h；
7)转染好的细胞用于后续的实验。
3、提取各组的总RNA并逆转为cDNA
总RNA提取：转染48h后收集细胞。用提前预冷的DEPC(江苏凯基生物公司)处理的PBS洗2次，之后6孔板中每孔都加入1mL Trizol试剂(美国Invitrogen公司)并反复吹打充分裂解细胞，随后将细胞裂解液转入无菌无酶的1.5mL EP管中。按照Trizol试剂的使用说明书进行总RNA的提取，提前将高速冷冻离心机预冷至4℃。首先向1.5mL EP管中加入200μL氯仿(成都科龙化工)，加入后立即上下颠倒并用力摇晃，混匀后将EP管放在冰山静置10min。接下来将EP管放入高速冷冻离心机中以4℃、12000r/min离心15min，离心后EP管中液体分为三层。用移液枪小心地吸取400μL的水相RNA到另一无酶的1.5mL EP管中，注意枪头不要伸的太下，防止DNA污染。以等体积的比例加入异丙醇(成都科龙化工)400μL，上下颠倒几次而充分混匀，冰上放置10min。将1.5mL EP管放入高速冷冻离心机中以4℃、12000r/min离心10min。弃上清液，加入提前预冷的1mL 75％的乙醇，冰上放置10min，充分洗涤沉淀。将1.5mL EP管放入高速冷冻离心机中以4℃、12000r/min离心5min，用枪头将上清液吸弃。敞开EP管，室温晾干后加入30μL的DEPC处理水，室温下充分溶解沉淀。
RNA纯度、浓度检测：取1μL RNA在酶标仪上进行RNA纯度和浓度的检测，本底为DEPC水，RNA纯度以OD260/OD280＝1.8-2.0为合格，将RNA纯度和浓度数据保存好。
RNA完整性检测：提前将制胶模具和梳子用二次蒸馏水洗好并组装好，待模具干燥后组装起来，加入提取制好的1％琼脂糖凝胶(已加核酸染料)，待凝胶凝固后放入电泳槽中(北京六一仪器厂)，加入0.5×TBE电泳液(北京天根生物公司)没过胶面。取1μL RNA和1μL10×loading buffer(北京天根生物公司)以及1μL DEPC水混匀，用移液枪将混匀后的RNA加入到样品槽中，用电压80V电泳20min。电泳完成后在GeneGenius凝胶成像分析系统(美国Syngene公司)中观察电泳条带并拍照。
RNA逆转录：RNA逆转录使用美国Invitrogen公司的M-MLV第一链合成试剂盒，根据试剂盒的使用说明选择建立20μl的反应体系(可逆转录1ng-5μg总RNA)，并按照试剂盒使用说明书进行实验操作。
将以下组分加入无核酸酶的微量PCR离心管中：
Figure BDA0001307931060000051
各组分加入后立即瞬离混匀，然后将微量PCR管放入PCR仪(美国AppliedBiosystems公司)以65℃孵育5min，完成后迅速置于冰上冷却2min以上。之后在每个微量PCR管中加入如下组分：
Figure BDA0001307931060000061
各组分加入后瞬离混匀，在37℃下孵育2min，随后加入1μL M-MLV逆转录酶，再瞬离混匀。将微量PCR管放入PCR仪中并设置好如下程序，先在25℃孵育10min，然后在37℃孵育50min，最后在70℃加热15min以终止反应。将逆转好的cDNA放于-80℃冰箱保存。
4、荧光定量PCR检测siRNA
荧光定量PCR引物设计：利用NCBI网站的引物设计软件“Primer Blast”对RP11-224O19.2以及内参GAPDH的引物进行设计，Tm值均设定在60℃左右。引物详细信息如表1。
表1 RP11-224O19.2和GAPDH的qRT-PCR引物
Figure BDA0001307931060000062
RP11-224O19.2的相对定量：将转染了不同siRNA的各组的cDNA模板稀释1倍作为实时荧光定量PCR的cDNA模板(三个重复孔)，选择三步扩增法进行实验，退火温度均为60℃，设置40个循环，每个样品三次平行重复，荧光定量PCR实验所用的试剂盒为FaststartEssential DNA Green Master(瑞士罗氏公司)。反应体系如下(反应体系为14μL)：
Figure BDA0001307931060000063
实时荧光定量PCR的程序设置如下：
Figure BDA0001307931060000064
Figure BDA0001307931060000071
5、siRNA筛选结果
在靶向于RP11-224O19.2的siRNA的筛选中，我们发现转染了其中一组siRNA的RP11-224O19.2的表达量(数值为0.319385312±0.133813761)较阴性对照组(表达数值为1.000000003±0.082696094)显著下降了(下调了70％，见图1a)，表明这条siRNA对RP11-224O19.2的干扰效率达到70％，干扰效果良好，因此我们将其命名为RP11-224O19.2-siRNA(见表2)。
表2筛选得到的siRNA和相应的对照siRNA的序列
Figure BDA0001307931060000072
因此，本发明设计的siRNA序列对RP11-224O19.2的干扰效率高，可用于高效抑制RP11-224O19.2表达。
实施例2 靶向于RP11-224O19.2的siRNA用于治疗肝癌
本实验采用转染siRNA的方式抑制RP11-224O9.2的表达，验证其对肝癌的作用。
一、抑制RP11-224O19.2对肝癌细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响
1、CCK8实验检测HepG2细胞增殖
实验步骤如下：
1)将转染好的实验组和阴性对照组的HepG2细胞以及未处理的空白组的HepG2细胞按照3000个/孔的铺板密度铺板于96孔板中，每个96孔板设置6孔实验组、6孔阴性对照组和6孔空白组，另设6孔只加培养基进行调零，一共接种5个96孔板，铺板完成后将96孔板放入培养箱中培养；
2)按照预定的实验计划，细胞分别培养24h、48h、72h、96h和120h后，取出96孔板，吸弃旧培养基，每孔避光加入含有10％CCK8的新鲜培养基100μL，放入培养箱中孵育1.5h；
3)孵育完成后，使用酶标仪在450nm处检测各孔的吸光度(OD450值)；
4)每组都先用调零孔的平均OD450值进行调零，然后计算每组的平均OD450值，细胞存活率＝实验组(阴性对照组)平均OD450值/空白组平均OD450值×100％。
实验结果见表3和图1b。
表3 RP11-224O19.2-siRNA对HepG2细胞增殖的影响
Figure BDA0001307931060000081
Figure BDA0001307931060000082
可见，与空白组和阴性对照组相比，转染了RP11-224O19.2-siRNA的HepG2细胞的增殖能力在转染铺板后的第3天开始被显著抑制，随着时间的延长，抑制作用更加显著，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明了HepG2细胞的增殖能力在转染了RP11-224O19.2-siRNA后被显著削弱。
因此抑制RP11-224O19.2可以显著抑制肝癌细胞的增殖，RP11-224O19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。
2、平板克隆形成实验检测HepG2细胞形成克隆的能力
实验步骤如下：
1)将转染好的实验组和阴性对照组的HepG2细胞以及未处理的空白组的HepG2细胞按照200个/孔的铺板密度分别铺板于不同的6孔板中，每个实验分组接种1个6孔板；
2)铺板完成后，每孔补加培养基至5mL，轻轻摇晃培养板使细胞均匀分散，放于培养箱培养2-3周；
3)每隔3天观察一次，当每个孔板出现肉眼可见的克隆时终止培养，吸弃旧培养基，用PBS洗2次；
4)用4％多聚甲醛固定30min，吸弃固定液；
5)每孔加入1mL的0.1％结晶紫进行染色，染色时间为20min；
6)染色完成后，吸弃染色液，用PBS冲洗，室温下干燥；
7)拍照，对肉眼可见的克隆数目进行统计。
实验结果见表4和图1c。
表4 RP11-224O19.2-siRNA对HepG2细胞克隆形成的影响
Figure BDA0001307931060000091
组别 克隆数
空白对照组Control 21±2.915475947
阴性对照组Negative control 18.6±3.209361307
RP11-224O19.2-siRNA组 11.6±1.341640786
可见，与空白组和阴性对照组相比，转染了RP11-224O19.2-siRNA的HepG2细胞所形成的克隆数量显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，这说明HepG2细胞在转染了RP11-224O19.2-siRNA后其增殖能力明显减弱。
因此抑制RP11-224O19.2可以显著抑制肝癌细胞的克隆形成能力，进而抑制肝癌细胞的增殖，RP11-224O19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。
3、细胞凋亡实验检测HepG2细胞凋亡
实验步骤如下：细胞凋亡使用流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)进行检测，所用的凋亡试剂盒为Annexin-V-Fluos Staining Kit(瑞士Roche公司)，本次检测由成都里来生物公司协助完成。将处于对数生长期的HepG2细胞以3×105个/孔的密度铺于6孔板中，待细胞长至80％左右时进行细胞转染，空白组不处理，阴性对照组转染negativecontrol siRNA，实验组转染RP11-224O19.2-siRNA，转染48h后分别收集各组细胞。将各组细胞以1200r/min离心5min，吸弃上清；各组细胞加入500μL PBS洗涤，以1200r/min离心5min，吸弃上清。将Annexin-V-Fluos、碘化丙啶(PI)、Binding Buffer缓冲液以1:1:48混匀，避光放置，作为工作液；取空白组、阴性对照组和实验组分别加入100μL工作液，避光孵育10min；再加入300μL Binding Buffer重悬，上机检测。
实验结果见表5和图1d。
表5 RP11-224O19.2-siRNA对HepG2细胞凋亡的影响
Figure BDA0001307931060000092
组别 克隆数
空白对照组Control 10.02333333±4.084242076
阴性对照组Negative control 12.86333333±2.181291666
RP11-224O19.2-siRNA组 23.87333333±0.657292426
可见，与空白组和阴性对照组相比，转染了RP11-224O19.2-siRNA的HepG2细胞凋亡率显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)，这说明RP11-224O19.2表达下调后可促进HepG2细胞凋亡。
因此抑制RP11-224O19.2可以显著促进肝癌细胞的凋亡，RP11-224O19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。
二、抑制RP11-224O19.2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响
1、细胞划痕实验检测HepG2细胞的体外迁移能力
实验步骤如下：将转染好的实验组和阴性对照组的HepG2细胞以及未处理的空白组的HepG2细胞以3×105个/孔的铺板密度铺于6孔板中，每个实验分组铺1个6孔板。待细胞长至90％左右时，用10μL的无菌枪头在每个孔中均匀地划3条直线，用PBS轻轻的洗去划落的细胞，加入2mL不含血清的培养基进行培养。分别在划痕后0h、24h和48h在倒置显微镜(日本Olympus公司)下观察并拍照，计算不同细胞分组的相对迁移距离，相对迁移距离＝0h划痕的宽度-24h(48h)划痕的宽度。
实验结果见表6和图2a。
表6细胞划痕实验考察对HepG2细胞体外迁移能力的影响
Figure BDA0001307931060000101
Figure BDA0001307931060000102
可见，与空白组和阴性对照组相比，RP11-224O19.2表达被抑制后能显著地抑制HepG2细胞的体外迁移能力，差异具有统计学意义(P<0.001)，这说明HepG2细胞在转染了RP11-224O19.2-siRNA后其迁移能力明显减弱。
因此抑制RP11-224O19.2可以显著地抑制HepG2细胞的体外迁移，RP11-224O19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。
2、Transwell细胞迁移实验检测HepG2细胞的体外迁移能力
实验步骤如下：将转染好的实验组和阴性对照组的HepG2细胞以及未处理的空白组的HepG2细胞用无血清的培养基重悬，并将其密度调整为5×104个/mL，取200μL细胞悬液加入到Transwell小室(美国Corning公司)的上室中，并在下室中加入500μL含20％FBS的培养基，在培养箱中培养24h后取出。先将小室中的旧培养基吸弃，用PBS洗几次，然后用干净棉签轻轻地擦去上室中未迁移的细胞。接下来在室温环境下用4％多聚甲醛固定30min，固定后用0.1％结晶紫染色20min，再用PBS洗几次。最后在倒置显微镜下观察并拍照，计算迁移到下室的细胞个数。
实验结果见表7和图2b。
表7 Transwell细胞迁移实验考察对HepG2细胞迁移的影响
Figure BDA0001307931060000111
组别 迁移细胞数
空白对照组Control 236±13.11487705
阴性对照组Negative control 232.6666667±11.01514109
RP11-224O19.2-siRNA组 126±6
可见，在RP11-224O19.2表达下调后，HepG2细胞的体外迁移能力与空白组和阴性对照组相比被明显地削弱了，差异具有统计学意义(P<0.01)，这说明HepG2细胞在RP11-224O19.2表达下调后其体外迁移能力明显减弱了。
因此抑制RP11-224O19.2可以显著地抑制HepG2细胞的体外迁移，RP11-224O19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。
3、Transwell细胞侵袭实验检测HepG2细胞的体外侵袭能力
实验步骤如下：提前将基质胶Matrigel(美国BD公司)放入4℃冰箱中过夜融化，将Matrigel按1:8的比例用DMEM稀释，每个Transwell小室中加入100μL稀释后的Matrigel进行包被，放入培养箱中孵育过夜。将转染好的实验组和阴性对照组的HepG2细胞以及未处理的空白组的HepG2细胞用无血清的培养基重悬，并将其密度调整为5×104个/mL，取200μL细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，并在下室中加入500μL含20％FBS的培养基，在培养箱中培养24h后取出。先将小室中的旧培养基吸弃，用PBS洗几次，然后用干净棉签轻轻地擦去上室中未迁移的细胞。接下来在室温环境下用4％多聚甲醛固定30min，固定后用0.1％结晶紫染色20min，再用PBS洗几次。最后在倒置显微镜下观察并拍照，计算侵袭到下室的细胞个数。
实验结果见表8和图2c。
表8 Transwell细胞侵袭实验考察对HepG2细胞体外侵袭能力的影响
Figure BDA0001307931060000112
组别 侵袭细胞数
空白对照组Control 256±14.4222051
阴性对照组Negative control 251±13
RP11-224O19.2-siRNA组 109.3333333±4.163331999
可见，实验结果表明与空白组和阴性对照组相比，HepG2细胞的体外侵袭能力在RP11-224O19.2表达下调后被显著地抑制了，差异具有统计学意义(P<0.01)，这说明HepG2细胞在RP11-224O19.2表达下调后其侵袭能力明显减弱。
因此抑制RP11-224O19.2可以显著地抑制HepG2细胞的体外侵袭，RP11-224O19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。
综上，靶向RP11-224O19.2的siRNA可以有效抑制RP11-224O19.2表达，进而抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡，RP11-224O19.2的抑制剂对肝癌的治疗效果显著。
三、抑制RP11-224O19.2对TGFB2的表达水平影响
1、TGFB2在肝癌中的表达
TGFB2的表达量分别提取自数据集GSE77314和TCGA数据库中肝癌的RNA-seq表达量文件。
通过对下载的RNA-seq表达量文件比较分析发现，TGFB2在肝癌组织中的表达量显著高于正常组织(图3a)。
此外，筛选自TCGA数据库中肝癌的RNA-seq表达量文件的分析结果进一步证实了TGFB2在肝癌组织中表达上调(图3b)。
2、荧光定量PCR方法检测RP11-224O19.2表达量下调后的TGFB2表达量
取按照实施例1方法提取的RNA制备的两种cDNA，即转染RP11-224O19.2-siRNA的HepG2细胞组和转染了Negative control siRNA的阴性HepG2细胞对照组。然后荧光定量PCR方法检测TGFB2表达水平。
引物设计：利用NCBI网站的引物设计软件“Primer Blast”对TGFB2以及内参GAPDH的引物进行设计，引物详细信息如表9。
表9 TGFB2和GAPDH的qRT-PCR引物
Figure BDA0001307931060000121
TGFB2的相对定量：将不同分组的cDNA模板稀释1倍作为实时荧光定量PCR的cDNA模板(三个重复孔)，选择三步扩增法进行实验，退火温度均为60℃，设置40个循环，每个样品三次平行重复，荧光定量PCR实验所用的试剂盒为Faststart Essential DNA GreenMaster(瑞士罗氏公司)。反应体系如下(反应体系为14μL)：
Figure BDA0001307931060000122
Figure BDA0001307931060000131
实时荧光定量PCR的程序设置如下：
Figure BDA0001307931060000132
3、RP11-224O19.2抑制后的TGFB2的表达水平
结果见图3c。
可见，阴性对照组的TGFB2表达量为1±0.052835971，，在RP11-224O19.2表达被抑制后，TGFB2的表达量下调了88％(数值为0.118222992±0.004975651)，差异具有统计学意义(P<0.05)。
TGFB2基因属于TGFβ超家族，文献报道下调TGFB2的表达能显著地抑制肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和转移等生物学功能。本实验结果表明，抑制RP11-224O19.2的表达可以显著下调TGFB2表达，从而抑制肿瘤的发生发展，达到治疗肿瘤的效果。
实施例3 RP11-224O19.2表达水平与肝癌的关系
分析RP11-224O19.2在肝癌中的表达：
数据分析方法如下：所有实验数据使用SPSS 19.0软件(IBM SPSS)进行分析，以student's t-test计算的组间P<0.05作为统计学差异阈值，作图用Origin 8.0和GraphPadPrism 5软件完成。按照RP11-224O19.2的表达量倍数变化(fold change)对50个肝癌临床病例进行分类，RP11-224O19.2的表达量倍数变化与临床病理参数的相关性分析由SPSS19.0软件完成，两个样本间分析采用非参数检验中的Mann-Whitney U test方法，三个样本间分析采用非参数检验中的Kruskal-Wallis test方法，P<0.05作为统计学差异阈值。
实验结果：通过对20对肝癌与正常组织样本的RNA-seq表达量进行分析，我们发现RP11-224O19.2在肝癌组织中的表达量明显高于正常组织(P＝0.0146)(图4a)。对另一项50对肝癌与正常组织样本的RNA-seq表达量进行分析，同样证实RP11-224O19.2在肝癌组织中表达上调(P＝0.00148,图4b)。
另外，通过不同组数据的分析表明，RP11-224O19.2的表达量表现出对肝癌组织较高的诊断准确性(P＝0.00065，见图4c；P＝0.00034，见图4d)。
可见，RP11-224O19.2的表达水平与肝癌呈正相关，RP11-224O19.2的高表达会显著提高患肝癌的可能性，因此，可以通过检测待检人群的RP11-224O19.2的表达水平，将肝癌的易感人群筛查出来，用于临床肝癌的辅助诊断。
已知肝癌细胞的迁移、侵袭和转移会导致门静脉血栓(PVTT)，并使肝癌患者有差的预后状况。数据分析表明，RP11-224O19.2在PVTT中的表达量高于肿瘤组织，说明RP11-224O19.2与肝癌的侵袭转移正相关(图4a)。
为了进一步探究RP11-224O19.2的表达量与肝癌患者的预后关系，我们将50个肝癌临床病例按照RP11-224O19.2的表达量倍数变化分为两类，31个高表达病例是指RP11-224O19.2的fold change≥2，19个低表达病例是指RP11-224O19.2的fold change<2，并且高表达组的RP11-224O19.2的表达量倍数变化值显著比低表达组高(P＝3.94E-09，Mann-Whitney U test)(图4e)。
我们将RP11-224O19.2表达量与肝癌的临床病理特征进行相关性分析，得到的结果如表10所示。此外，高表达的RP11-224O19.2与肝癌患者的晚期肿瘤分期密切相关(P＝0.029，Kruskal-Wallis test)(图4f)。
可见，RP11-224O19.2的表达量可以用于预测肝癌患者预后状况，RP11-224O19.2表达量越高，肝癌患者的预后情况越差。
表10 RP11-224O19.2表达量与临床病理特征的相关性
Figure BDA0001307931060000141
Figure BDA0001307931060000151
备注：有些临床数据缺失，P<0.05作为统计学差异阈值
因此，通过检测RP11-224O19.2的表达水平，可以筛查待检人群患肝癌的风险，及对肝癌患者的预后情况做出预测，可用于临床肝癌的辅助诊断及预后判断。
综上，抑制RP11-22O19.2表达能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡，降低TGFB2表达水平，从而达到治疗肿瘤的效果。另外，通过检测RP11-224O19.2的表达水平，可以筛查待检人群患肝癌的风险，及对肝癌患者的预后情况做出预测，可用于临床肝癌的辅助诊断及预后判断。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南交通大学
<120> 长链非编码RNA RP11-224O19.2抑制剂的用途
<130> GY138-17P1197
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> RP11-224O19.2-siRNA正义链
<400> 1
gcaugacucu gcagccauat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> RP11-224O19.2-siRNA反义链
<400> 2
uauggcugca gagucaugct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 阴性对照siRNA正义链
<400> 3
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 阴性对照siRNA反义链
<400> 4
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> RP11-224O19.2正向引物
<400> 5
cgaaccgttg agggagtgtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> RP11-224O19.2反向引物
<400> 6
aggccccata cacaactgaa 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> GAPDH正向引物
<400> 7
gttggtatcg tggaaggac 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> GAPDH反向引物
<400> 8
aaaggtggag gagtgggt 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> TGFB2正向引物
<400> 9
ccaaagggta caatgccaac 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> TGFB2反向引物
<400> 10
cagatgcttc tggatttatg gtatt 25

Claims (3)

1. 长链非编码 RNA RP11-224O19.2 抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的用途；
所述RNA RP11-224O19.2 抑制剂是siRNA；
所述siRNA的正义链如SEQ ID NO:1所示，反义链如SEQ ID NO:2所示。
2. 一种治疗肝癌的药物，其特征在于：它是以 RP11-224O19.2 抑制剂为活性成分，加上学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂；
所述 RP11-224O19.2抑制剂为 siRNA；
所述siRNA的正义链如SEQ ID NO:1所示，反义链如SEQ ID NO:2所示。
3. 一种 siRNA 分子，其特征在于：
所述siRNA的正义链如SEQ ID NO:1所示，反义链如SEQ ID NO:2所示。
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