CN116334217A - Adam32基因在诊断和治疗肺腺癌中的应用 - Google Patents

Adam32基因在诊断和治疗肺腺癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ADAM32基因在诊断和治疗肺腺癌中的应用，尤其涉及一种标志物检测试剂在制备诊断肺腺癌的产品中的应用，所述标志物为ADAM32基因。本发明首次确定了ADAM32基因和肺腺癌的关系，抑制ADAM32表达具有延缓肺腺癌进程、延长病人寿命的作用。本发明为肺腺癌的治疗提供了一条有效的新途径。

Description

ADAM32基因在诊断和治疗肺腺癌中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及ADAM32基因在诊断和治疗肺腺癌中的应用。
背景技术
肺部肿瘤源于支气管粘膜上皮，可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌又分为鳞状细胞癌，腺癌和大细胞癌。小细胞肺癌约占支气管源性肺癌的15％-20％，小细胞肺癌确诊时，肿瘤处于局限期的患者约占30％，其余处于广泛期，当肿瘤扩散到锁骨上区以外时即为广泛期。与小细胞癌相比，非小细胞癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。肺腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部X线检查时被发现。表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移。淋巴转移则发生较晚。针对已知靶标的传统药物已经无法满足治疗的需求，急需探索新的治疗靶点。
解整合素-金属蛋白酶32(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 32，简称ADAM32；UniProt ID:(Human)Q8TC27；Entrez Gene ID:(Human)203102)基因是一个蛋白质编码基因。ADAM32属于ADAM蛋白质家族，是一个跨膜蛋白，其胞外去含有金属蛋白酶和整合素的结合区域，是一种催化样蛋白质。ADAM32在睾丸中高表达，可能在精子的发育和受精过程中起作用。
发明内容
针对目前临床上对靶向新靶标的防治肺腺癌药物的需求，本发明的目的是提供ADAM32在筛选治疗肺腺癌药物中的用途，可有效解决现有技术中筛选适合用于防治肺腺癌药物困难的问题。
本发明在一方面提供一种标志物检测试剂在制备诊断肺腺癌的产品中的应用，所述标志物为ADAM32基因。本发明首次确定了ADAM32基因和肺腺癌的关系，抑制ADAM32表达具有延缓肺腺癌进程、延长病人寿命的作用。本发明为肺腺癌的治疗提供了一条有效的新途径。
在一些实施方式中，所述标志物检测试剂是用于测定ADAM32基因表达量的试剂。
在一些实施方式中，所述测定ADAM32基因表达量的试剂包括检测ADAM32基因的信使RNA(mRNA)或其片段的试剂、检测ADAM32基因的互补DNA(cDNA)或其片段的试剂、检测ADAM32基因编码的蛋白质或其变体的试剂。
在一些实施方式中，所述产品选自芯片、试剂盒或试纸。
本发明在另一方面提供一种抑制标志物表达的试剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用，所述标志物为ADAM32基因。本发明首次确定了ADAM32基因和肺腺癌的关系，抑制ADAM32表达具有延缓肺腺癌进程、延长病人寿命的作用。本发明为肺腺癌的治疗提供了一条有效的新途径。
在一些实施方式中，所述抑制标志物表达的试剂包括特异于ADAM32基因的siRNA、特异于ADAM32基因的反义寡核苷酸、特异于ADAM32基因的核酶、ADAM32基因的抑制性抗体。
在一些实施方式中，所述ADAM32基因的抑制性抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体。在一些实施方式中，所述ADAM32基因的抑制性抗体为所述ADAM32基因的抑制性抗体为多克隆抗体，所述的多克隆抗体抗原为CHO-衍生的重组人ADAM32 Ser17-Thr476。在一些实施方式中，所述抗体为赛默飞公司的ADAM32抗体(货号：PA5-47731)。
本发明再一方面提供一种药物筛选系统，所述药物筛选系统包括：(1)检测模块，所述检测模块用于检测药物对于ADAM32基因表达的抑制作用；以及(2)分析模块，所述分析模块用于根据所述检测模块输出数据，输出所述药物用于治疗肺腺癌的治疗效果。
本发明再一方面提供一种肺腺癌诊断系统，所述诊断系统包括：(1)检测装置，其中所述检测装置用于检测ADAM32基因表达量；以及(2)分析装置，其中所述分析装置用于根据所述检测装置输出的ADAM32基因表达量的数据，输出肺腺癌的诊断结果。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明首次确定了ADAM32与肺腺癌的关系，即抑制ADAM32具有预防、缓解或治疗肺腺癌的作用。基于ADAM32与肺腺癌的密切关联，其可以作为治疗肺腺癌药物的新靶标，从而筛选得到适合用于治疗肺腺癌的新型治疗手段或药物，可有效解决现有技术中筛选药物困难的问题。ADAM32的抑制剂可用于制备治疗肺腺癌的药物。
附图说明
图1是本发明ADAM32基因在TCGA-HNSC数据集中的生存分析结果；
图2是本发明ADAM32基因的干扰小片段在NCI-H1299细胞中干扰效果验证(荧光定量PCR)；
图3是本发明ADAM32基因干扰后影响NCI-H1299细胞增殖的实验结果；
图4是本发明ADAM32基因干扰后影响NCI-H1395细胞增殖的实验结果；
图5是本发明ADAM32基因干扰后影响NCI-H1299细胞划痕的实验结果；
图6是本发明ADAM32基因干扰后影响NCI-H1395细胞划痕的实验结果；
图7是本发明ADAM32基因干扰后影响NCI-H1395细胞凋亡的实验结果；
图8是本发明ADAM32基因干扰后影响NCI-H1395细胞周期的实验结果；
图9是本发明ADAM32基因干扰后影响NCI-H1395细胞浸袭的实验结果；
图10是本发明ADAM32基因在NCI-H1395细胞使用不同浓度抗体孵育抑制增值的实验结果即IC50测定实验；
图11是本发明ADAM32基因在NCI-H1395细胞使用10μg/mL的抗体孵育后影响细胞迁移的实验结果；
图12是本发明ADAM32基因在NCI-H1395细胞使用10μg/mL的抗体孵育后影响细胞浸袭的实验结果；
图13是初步机制解析-流式检测ROS实验结果；
图14是初步机制解析-流式检测线粒体膜电位实验结果。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
Ohnolog基因
随着进化生物医学的发展，积累的进化知识已被成功地用于多种疾病发病机制解析和致病基因鉴别。由于基因的进化与多种疾病(特别是癌症)发生、进展密切相关，多项研究结果表明成功的药物靶标往往具有共同的进化学特征。全基因组倍增(Whole GenomeDuplication)通常被认为是脊椎动物的重要进化事件。人类祖先基因组在早期脊椎动物时期经历了两次全基因组倍增。为了纪念Ohno在相关研究中的突出贡献，这些与两次全基因组倍增事件相关的基因被称为“Ohnologs”。Ohnolog基因在生物体的发育和转录调控中发挥着重要作用。先前的研究表明，由于Ohnolog基因的高剂量敏感性(随着基因拷贝数的变化会引起表型变化)，其与人类表型或者疾病(包括癌症)的发生发展密切相关。因为一个合格的药物靶标基因要求要与疾病表型紧密相关，并且对药物刺激敏感。因此，Ohnolog基因的剂量敏感特性使其成为有希望的药物靶标。此外，众所周知，癌细胞可以通过“快速”进化来逃脱细胞分裂和程序性死亡控制，从而导致癌症迅速扩散。又有大量研究发现癌症相关基因具有独特的进化起源阶段。因此，追踪癌症基因起源，抑制或减缓其进化过程是有效降低癌细胞适应性从而对抗癌症进展的一种思路。研究表明癌症驱动基因显著富集到细胞生物(cellular organism)、真核生物(eukaryota)、后鞭毛生物(opisthokonta)、真后生动物(eumetazoa)4个阶段起源的基因。本发明团队研究发现ADAM32不仅属于Ohnolog基因，并且起源于与癌症相关的真后生动物起源阶段。但是，目前未有关于ADAM32与肺腺癌关联以及ADAM32在筛选用于防治肺腺癌药物中的用途的报道。
实施例1.ADAM32基因在TCGA-HNSC数据集中的生存分析结果
具体包括以下过程：
(1)对ADAM32基因进化特征分析：结果显示ADAM32属于Ohnolog基因；ADAM32起源于真后生动物起源进化阶段。ADAM32符合癌症基因进化特征。
(2)通过查询癌症驱动基因DriverDBv3数据库，ADAM32属于癌症驱动基因。
(3)通过查询癌症组织特异性表达基因TissGDB数据库，ADAM32属于癌症组织特异性表达基因，并且在癌症组织中特异性高表达。
(4)通过查询UniProt数据库，ADAM32编码蛋白的亚细胞定位于细胞膜。
(5)从TCGA数据库(The Cancer Genome Atlas,https://www.cancer.gov/tcga)中下载肺腺癌病人(TCGA-HNSC)的多组学数据，所述数据包括病人基因表达数据、临床数据，所述临床数据包括生存状态、生存时长，所述基因表达数据为RNA-seq测序得到的基因表达量FPKM。
(6)对步骤(5)的TCGA-HNSC数据进行预处理，得到有人类基因在肺腺癌病人中的基因表达矩阵，并对ADAM32基因的FPKM表达量与病人预后生存时间建立Cox比例风险回归模型。结果显示ADAM32基因的FPKM表达水平与肺腺癌病人生存时间显著相关(P-value＝4.77E-03)，风险比(hazard ratio)＝6.6679(图1)。该结果说明ADAM32高表达属于威胁肺腺癌病人生存时间的危险因素，即抑制ADAM32可以缓解肺腺癌复发，延长病人寿命。
实施例2.
针对ADAM32基因，设计并合成3条siRNA和1条NC，序列如表1所示。转染一个人的细胞系，转染24h后，加上空白细胞，共计5组，无重复，采用PCR筛选出一条最佳序列ADAM32-Homo-738(图2)。选取NCI-H1299细胞和NCI-H1395细胞，使用NCI-H1299细胞培养基和NCI-H1395细胞培养基进行细胞复苏，当细胞的密度达到80％时，对细胞进行传代，接下来对取处于对数生长期，生长状态良好的细胞进行细胞转染实验，设置平行对照。NCI-H1299细胞组：(1)NCI-H1299细胞正常对照，(2)NCI-H1299细胞+NC siRNA(NC组)，(3)NCI-H1299细胞+ADAM32-Homo-738(ADAM32 siRNA)；NCI-H1395细胞组：(1)NCI-H1395细胞正常对照，(2)NCI-H1395细胞+NC siRNA(NC组)，(3)NCI-H1395细胞+ADAM32-Homo-738(ADAM32 siRNA)。转染24h后进行细胞CCK8检测实验和细胞划痕实验。其中NCI-H1299(人非小细胞肺癌细胞)购自Procell普洛塞生物公司，NCI-H1299细胞来源于一个淋巴结转移，患者接受了初期放疗。NCI-H1299细胞均一性的部分缺失p53蛋白，并缺少p53蛋白表达。NCI-H1299细胞可以合成0.1pmol/毫克蛋白的NMB蛋白，而不合成促胃液释放肽(GRP)。NCI-H1395细胞(人肺腺癌癌细胞)购自Procell普洛塞生物公司，NCI-H1395细胞是于1986年4月建株的，组织提供者吸烟、每年15包；NCI-BL1395[BL1395]细胞是一株来源于同一患者的类淋巴母细胞。
表1
Figure BDA0003665779710000061
CCK8检测实验：细胞培养结束后，每孔加入10μL CCK8，37℃培养1-2h；酶标仪测定各孔吸光值OD450，实验结果整理后如图4，图5。
细胞划痕实验：按上述两个细胞系平行对照进行两组实验，marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔，每孔穿过3条线；用0.25％胰酶消化细胞，以每孔2×106个细胞接种于六孔板中，37℃、5％CO2饱和湿度条件培养24h；细胞密度达到90％左右，约铺满6孔板底部，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，不同孔之间使用同一只枪头划痕；用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，同时拍取0h照片，放入37度5％CO2培养箱，培养，24小时后拍照；提供照片：100倍照片，3张/组，划痕抑制实验结果整理后如图5和6所示。
实验结果表明干扰/抑制ADAM32基因后的NCI-H1299细胞和NCI-H1395细胞，其细胞增殖能力(如图3和4所示)和迁移能力(如图5和6所示)相比未干扰ADAM32基因的对照细胞均有所降低。
将NCI-H1395细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有5ml培养基的离心管中，离心收集细胞，室温1000rmp离心5min，弃上清；用含10％胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。细胞传代及扩大培养，细胞的密度达到80％时，对细胞进行传代，弃去培养基，用PBS洗一遍；加1-2ml 0.25％胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，消化1-2min，可看到细胞相互分离变圆，即消化完成；快速弃去胰酶，加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3的比例传代，37℃、5％CO2饱和湿度条件下扩大培养。细胞处理，取处于对数生长期，生长状态良好的NCI-H1395细胞，用1640培养基制成单细胞悬液，按每孔2×105个细胞量，将细胞均匀的接种到6孔板中，37℃、5％CO2饱和湿度条件培养过夜；转染前2小时，换成无血清1640培养基；按照如下实验分组分别转染：
1)NCI-H1395细胞对照组；
2)ADAM32 siRNA干扰对照组；
3)ADAM32 siRNA干扰组；
转染步骤：对于每个转染样品，均按下面的方法准备：用100μL无血清opti-MEM分别稀释10μL小片段(浓度为20μM)，并用枪头轻轻混匀，室温下静置5分钟；使用前轻轻混匀LipofectamineTM 2000，然后取5μL的LipofectamineTM 2000稀释在100μL opti-MEM中，室温下静置5分钟；室温下静置5分钟后，混合LipofectamineTM 2000和小片段的稀释液(总体积为200μL)，轻轻混匀并在室温下静置20分钟；每个培养孔对应加混合液200μL，前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀；细胞于37℃5％CO2培养箱中培养，6h后吸出转染液换入正常培养基；37℃5％CO2培养箱继续培养24h后进行后续检测。
细胞凋亡检测：用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集已处理好细胞，1500rpm，5min离心，去上清，加PBS重悬；用PBS将细胞润洗2次，1500rpm，5min；使用AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒进行检测：50μl的Binding Buffer中加入5μl 7-AAD染液，混匀；收集细胞中加入上述7-AAD染液，混匀；室温避光反应5～15min；反应后再加入450μl的Binding Buffer混匀；加入5μl Annexin V-APC混匀；室温避光反应5～15min。流式细胞仪上机检测，实验结果如图7所示。
细胞周期检测：用不含EDTA的0.25％胰酶消化已处理好细胞，终止消化后收集细胞，1000rpm，5min，去上清，PBS重悬润洗2次；1000rpm，5min，去上清，100μl PBS重悬细胞，缓慢加入700ul预冷的80％乙醇，使乙醇终浓度为70％；4℃固定4h以上；1000rpm，5min，预冷PBS润洗2次；加入100μl RNase(50ug/ml)，37℃水浴30min；加入400μl PI(50μg/ml)，4℃避光染色30min；流式细胞仪检测，实验结果如表2和图8所示。
表2
Figure BDA0003665779710000081
选取NCI-H1395细胞，使用NCI-H1395细胞进行细胞复苏，当细胞的密度达到80％时，对细胞进行传代，接下来对取处于对数生长期，生长状态良好的NCI-H1395细胞，用1640培养基制成单细胞悬液，按每孔2×105个细胞量，将细胞均匀的接种到6孔板中，37℃、5％CO2饱和湿度条件培养过夜；转染前2小时，换成无血清1640培养基；按照如下实验分组分别转染：
1)正常细胞对照组；
2)ADAM32 siRNA干扰对照组；
3)ADAM32 siRNA干扰组；
4)ADAM32抗体浓度组10ug/mL(处理24h)；
转染步骤：对于每个转染样品，均按下面的方法准备：用100μL无血清opti-MEM分别稀释10μL小片段(浓度为20μM)，并用枪头轻轻混匀，室温下静置5分钟；使用前轻轻混匀LipofectamineTM 2000，然后取5μL的LipofectamineTM 2000稀释在100μL opti-MEM中，室温下静置5分钟；室温下静置5分钟后，混合LipofectamineTM 2000和小片段的稀释液(总体积为200μL)，轻轻混匀并在室温下静置20分钟；每个培养孔对应加混合液200μL，前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀；细胞于37℃5％CO2培养箱中培养，6h后吸出转染液换入正常培养基；37℃5％CO2培养箱继续培养24h后进行后续检测。
取处理好的NCI-H1395细胞，加入3ml PBS清洗细胞，0.25％胰酶分别消化收集，1000rpm，5min离心，去上清，PBS润洗两次，清洗掉残余血清。无血清1640培养基重悬细胞，细胞计数板计数，无血清1640培养基稀释细胞浓度至3×105/ml，备用。将Matrigel在4℃提前一天融化，transwell小室、24孔培养板和枪头在-20℃过夜预冷；用的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml，冰上操作；在24孔板中加入4℃预冷800μl 10％FBS 1640培养基(含双抗)，并放入transwell小室，在transwell小室上室底部中央垂直加入100μl终浓度为1mg/ml的Matrigel，37℃温育4－5h使其干成胶状，待Matrigel干成胶状后在transwell上室分别接入200μl各组细胞悬液，37℃，5％CO2培养箱培养24h；取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用70％冰乙醇溶液固定细胞1h；用0.5％结晶紫染液染色，室温中放置20min，PBS清洗一下，用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净；显微观察拍照。干扰对浸袭的影响实验结果如图9所示。
选取NCI-H1395细胞，使用NCI-H1395细胞进行细胞复苏，当细胞的密度达到80％时，对细胞进行传代，接下来对取处于对数生长期，生长状态良好的细胞进行细胞铺板，取处于对数生长期，生长状态良好的NCI-H1395细胞，以5×103个/孔，接入96孔板，同时设空白组，37℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100μl无菌PBS)；按照如下分组对细胞进行处理：NCI-H1395正常组；NCI-H1395细胞+ADAM32抗体1.5625μg/mL；NCI-H1395细胞+ADAM32抗体3.125μg/mL；NCI-H1395细胞+ADAM32抗体6.25μg/mL；NCI-H1395细胞+ADAM32抗体12.5μg/mL；NCI-H1395细胞+ADAM32抗体25μg/mL；NCI-H1395细胞+ADAM32抗体50μg/mL。作用时间：24h。细胞CCK8检测，细胞培养所需时间后，每孔加入10μl cck8，37℃培养1-4h；酶标仪测定各孔吸光值OD 450。
细胞划痕实验：marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔，每孔穿过3条线；用0.25％胰酶消化细胞，以每孔2×106个细胞接种于六孔板中，37℃、5％CO2饱和湿度条件培养24h；细胞密度达到90％左右，约铺满6孔板底部，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，不同孔之间使用同一只枪头划痕；用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，同时拍取0h照片；并对细胞做如下处理：1)NCI-H1395细胞正常对照；2)NCI-H1395细胞+ADAM32抗体(10μg/mL)；放入37度5％CO2培养箱，培养，24小时后拍照；提供照片：100倍照片，3张/组。其中抗体ADAM32 Antibody(PA5-47731)购买自赛默飞公司，属于抗原免疫的多克隆抗体，其中抗原是CHO-衍生的重组人ADAM32 Ser17-Thr476。
细胞浸袭实验步骤同上，抗体孵育对浸袭的影响，如图12所示。
实验结果显示经ADAM32抗体孵育后的肺癌细胞增值率降低，IC50实验结果如图10所示；选取10ug/mL的抗体浓度孵育，ADAM32抗体孵育后的NCI-H1395细胞增值率降低率约20％(图10)；ADAM32抗体孵育后的NCI-H1395细胞迁移率降低率约20％(图11)；ADAM32抗体孵育后的NCI-H1395细胞浸袭能力降低约20％(图12)。通过特异性ADAM32抗体能够抑制肺腺癌的增值、迁移、浸袭，达到治疗肺腺癌的效果。
接下来我们对靶标机理进行了初步的解析，通过干扰ADAM32基因前后的RNAseq转录组测序，KEGG通路富集分析得到干扰ADAM32基因后细胞内氧化磷酸化途径异常，线粒体内氧化磷酸化酶，呼吸电子传递，化学渗透偶联合成ATP等通路基因上调，初步分析是否是线粒体凋亡途径介导的癌细胞死亡，线粒体凋亡途径指由活性氧介导引起线粒体膜通透性转换孔道开放，线粒体膜系统发生结构变化和破裂、片断化，其严重的后果可引起细胞死亡。为了初步证明我们猜想，我们用流式检测ROS,流式检测线粒体膜电位初步解释凋亡机理,进行了细胞ROS检测实验和细胞JC-1实验。
将NCI-H1395细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有5ml培养基的离心管中，离心收集细胞，室温1000rmp离心5min，弃上清；用含10％胎牛血清的完全培养基悬浮细胞,接种到培养皿中，轻轻吹打混匀,37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。
细胞传代及扩大培养：
细胞的密度达到80％时，对细胞进行传代：弃去培养基，用PBS洗一遍；加1-2ml0.25％胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，消化1-2min，可看到细胞相互分离变圆，即消化完成；快速弃去胰酶，加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3的比例传代，37℃、5％CO2饱和湿度条件下扩大培养。
细胞处理：
取处于对数生长期，生长状态良好的NCI-H1395细胞，用1640培养基制成单细胞悬液，按每孔2×105个细胞量，将细胞均匀的接种到6孔板中，37℃、5％CO2饱和湿度条件培养过夜；转染前2小时，换成无血清1640培养基；按照如下实验分组分别转染：
1)正常细胞对照组；
2)ADAM32 siRNA干扰对照组；
3)ADAM32 siRNA干扰组；
4)ADAM32抗体浓度组10ug/mL(处理24h)；
转染步骤：
对于每个转染样品，均按下面的方法准备：用100μL无血清opti-MEM分别稀释10μL小片段(浓度为20μM)，并用枪头轻轻混匀，室温下静置5分钟；
使用前轻轻混匀LipofectamineTM 2000，然后取5μL的LipofectamineTM 2000稀释在100μL opti-MEM中，室温下静置5分钟；室温下静置5分钟后，混合LipofectamineTM2000和小片段的稀释液(总体积为200μL)，轻轻混匀并在室温下静置20分钟；每个培养孔对应加混合液200μL，前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀；细胞于37℃5％CO2培养箱中培养，6h后吸出转染液换入正常培养基；37℃5％CO2培养箱继续培养24h后进行后续检测。
细胞ROS检测：
用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集，1500rpm，5min离心，去上清，加PBS重悬；用PBS将细胞润洗2次，1500rpm，5min；使用DCFH-DA细胞ROS检测试剂盒进行检测：去PBS加入稀释好的DCFH 1mL；37℃培养箱孵育20min，每隔3min混匀一次；用无血清培养基洗涤细胞三次；500ul PBS重悬；流式细胞仪上机检测。
细胞JC-1检测：
用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1200rpm，5min离心，弃上清，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红；加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，细胞培养箱中37℃孵育20分钟；在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴；37℃孵育结束后，1200rpm 4℃离心3分钟，弃上清；用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次：加入1mlJC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，1200rpm 4℃离心3分钟，弃上清。再加入1ml JC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，1200rpm 4℃离心3分钟，弃上清；500ul JC-1染色缓冲液(1X)重悬后，流式细胞仪上机。
实验结果显示药物/基因干扰ADAM32影响肺腺癌细胞内线粒体功能，导致了线粒体内ROS增加(图13)，膜电位异常(图14)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> ADAM32基因在诊断和治疗肺腺癌中的应用
<130> 2021-12-14
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> ADAM32-Homo-383正义链
<400> 1
gcucuggacu aagaggaaut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> ADAM32-Homo-383反义链
<400> 2
auuccucuua guccagagct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> ADAM32-Homo-738正义链
<400> 3
gcugucauca uuggaguuat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> ADAM32-Homo-738反义链
<400> 4
uaacuccaau gaugacagct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> ADAM32-Homo-1395正义链
<400> 5
gccgaaagca cauccugaat t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> ADAM32-Homo-1395反义链
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uucaggaugu gcuuucggct t 21
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<212> DNA
<213> NC序列正义链
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uucuccgaac gugucacgut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> NC序列反义链
<400> 8
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (10)

1.一种标志物检测试剂在制备诊断肺腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述标志物为ADAM32基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物检测试剂是用于测定ADAM32基因表达量的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述测定ADAM32基因表达量的试剂包括检测ADAM32基因的信使RNA或其片段的试剂、检测ADAM32基因的互补DNA或其片段的试剂、检测ADAM32基因编码的蛋白质或其变体的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品选自芯片、试剂盒或试纸。
5.一种抑制标志物表达的试剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述标志物为ADAM32基因。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制标志物表达的试剂包括特异于ADAM32基因的siRNA、特异于ADAM32基因的反义寡核苷酸、特异于ADAM32基因的核酶、ADAM32基因的抑制性抗体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述ADAM32基因的抑制性抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述ADAM32基因的抑制性抗体为多克隆抗体，所述的多克隆抗体抗原为CHO-衍生的重组人ADAM32 Ser17-Thr476。
9.一种药物筛选系统，其特征在于，所述药物筛选系统包括：
(1)检测模块，所述检测模块用于检测药物对于ADAM32基因表达的抑制作用。
(2)分析模块，所述分析模块用于根据所述检测模块输出数据，输出所述药物用于治疗肺腺癌的效果。
10.一种肺腺癌诊断系统，其特征在于，所述诊断系统包括：
(1)检测装置，其中所述检测装置用于检测ADAM32基因表达量。
(2)分析装置，其中所述分析装置用于根据所述检测装置输出的ADAM32基因表达量的数据，输出肺腺癌的诊断结果。
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