CN108611343B - 一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，步骤包括：使用从人体输血后废弃医疗用品中回收并提取的中性粒细胞嗜天青颗粒,经研磨，溶解，离心后获得含有蛋白酶3的层析过柱起始蛋白溶液，结合阳离子交换层析柱，染色配体层析柱，分子筛层析柱以及亲和层析柱等纯化方法从人体血液中性粒细胞嗜天青颗粒中分离、纯化天然蛋白酶3。采用上述方法制备得到的天然蛋白酶3在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高，其高质量更适用于科学研究以及医学检测。

Description

一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋 白酶3的方法

技术领域

本发明涉及医学检测产品技术领域，具体涉及一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法。

背景技术

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是在坏死性小血管炎中发现的。这些抗体大部分属于IgG类型，在乙醇固定的中性粒细胞和单核细胞的间接免疫荧光反应中有很明显的阳性反应，它们其中一个主要靶点是蛋白酶3(PR3)抗原(即是所谓的胞浆型cANCA)。抗蛋白酶3(PR3)特异性抗体是中性粒细胞特异性自身抗体相关脉管炎疾病，特别是韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)的一种敏感的和特异性的标记物，可辅助临床医生诊断各种系统性炎症疾病。该抗体在活动性韦格纳肉芽肿病(GPA)以及全身性血管炎患者中的特异性大于90％。抗蛋白酶3(PR3)抗体阳性也可见于少数多动脉炎(MPA)，Chung-Strauss综合征(CSS)，结节性多动脉炎(PAN)少数巨细胞动脉炎，过敏性紫癜，白细胞破碎性皮肤血管炎和白塞氏病等。目前中性粒白细胞间接免疫荧光检测(IIF)和标准化的抗蛋白酶3(PR3)抗体ELISA检测相结合的检测方法被广泛适用于以上疾病的检测。抗蛋白酶3(PR3)抗体在临床上另一重要应用价值在于该抗体效价与病情活动一致，在GPA等原发性血管炎患者常被作为判断疗效、估计复发的指标，从而指导临床治疗。对抗蛋白酶3(PR3)抗体进行高灵敏度，高准确性的检测，需要诊断试剂中的核心原料蛋白酶3(PR3)抗原具备高纯度，高活性，高特异性等特质，来避免检测结果中可能出现的假阳性，假阴性。这对蛋白酶3(PR3)抗原的制备提出了很高的要求。

目前市场中，用于检测产品开发的抗原原料主要分为重组表达和天然提取两个来源。相对于利用宿主细胞表达出的重组抗原，从人体血液细胞中提取并纯化的天然抗原具备诸多优势，包括：高度的氨基酸序列同源性，天然的蛋白质三级以及四级构象，正确的人血细胞翻译后修饰过程(如磷酸化，糖基化等)，以及完整的蛋白功能表达所需的抗原受体和抗原表位等。同时，天然抗原不存在重组抗原通常都有的聚集和溶解度的问题，可以更加良好充分的和其特异性抗体相结合，从而降低检测的差异性。然而由于天然蛋白的资源有限,来源各异,导致大规模，批量提取天然抗原具有一定难度,且成本昂贵。

过去的文献中介绍天然蛋白酶3(PR3)纯化的方法主要是常规的色谱层析法，通常以嗜中性粒细胞的全细胞裂解液作为初始粗蛋白液。但是全细胞裂解液含有大量的细胞杂蛋白，需要复杂的后续色谱层析分离、纯化步骤。

成功纯化蛋白酶3的较早报道出现在上世纪80年代。1988年，J Clin Invest.82(6):1963-73，Proteinase 3.A distinct human polymorphonuclear leukocyteproteinase that produces emphysema in hamsters，by Kao RC,Wehner NG et.al.简单粗略的介绍了蛋白酶3的纯化方法.

1992年，ANCA-Associated Vasculitides:Immunological and ClinicalAspects，1(1)：56-58,Proteinase 3:Substrate Specificity and PossiblePathogenetic effect of Wegener’s Granulomatosis Autoantibodies(c-ANCA)byDysregulation of the enzyme，by Wolfgang L.Gross沿用了过去使用染料配体亲和层析法，初步分离白细胞颗粒并提取纯化蛋白酶3的方法。此方法产生蛋白纯度较低。

1993年，Manual of Biological Markers of Disease，Section B AutoantigensChapter7.1Proteinase 3(c-ANCA)，by W.J.van Venrooij，Ravinder N.Maini提到蛋白酶3可以用染色配体亲和层析和离子交换层析，或者高压液相色谱从人体血液中性粒细胞中提取纯化。

1996年，Journal of Immunological Methods.197(1-2):121-130,Acomprehensive method to purify three major ANCA antigens:proteinase 3,myeloperoxidase and bactericidal/permeability-increasing protein from humanneutrophil granule acid extract，by MingHuiZhao and C.MartinLockwood，描述了一种用橙-A染料配体色谱和阳离子交换层析法连续纯化蛋白酶3(PR3)的方法，从相同的原料中提取正常人中性粒细胞的酸性提取物。分离后，未发现其他已知的微量ANCA抗原(MPO,BPI),但其他未知抗原的污染未知。

1997年，J Immunol Methods.206(1-2):35-42,A simple high yield procedurefor purification of human proteinase 3,the main molecular target of cANCA,byStummann L,Wiik A报道了一种简单高效纯化蛋白酶3(PR3)的方法。根据文章描述，用TritonX-100洗脱液将蛋白酶3从氮气空弹和Percoll梯度离心后产生的嗜中性粒细胞颗粒中洗脱。再使用阴离子交换色谱法除去了许多杂质蛋白质，这些蛋白质被固定在柱上。用凝胶过滤法分离含有大部分蛋白酶3的未结合蛋白。但是此方法效率低，所得蛋白酶3纯度不高，不适用于免疫检测。

2002年，The Molecular Pathology of Autoimmune Diseases，2nd Edition。Chapter 28,system Vasculitis by Argyrios N Theofilopoulos，Constantin A.Bona.提到了使用离子交换层析法从人体血液中纯化蛋白酶3.

2006年，中华检验医学杂志第八期，蛋白酶3抗原的提取纯化及鉴定，作者：朱爱萍；胡学芳等，再次提到了使用常规方法从血液分离血小板后废弃的富含中性粒细胞白膜中提取天然PR3的方法。此研究使用Ficoll-Hypaque梯度剂分离人血白细胞，之后通过超声细胞粉碎机进行破膜处理。细胞粗提液经过DEAE离子交换层析柱和分子筛层析柱达到分离纯化蛋白酶3的目的。此方法可在32g的中性粒细胞中提取蛋白酶3粗抗原36.84mg。此方法局限性在于提取抗原中依旧存在其他抗原杂质，抗原特异性不高，不适合用于免疫医学检测(其造成假阳性结果的机率较高)。

2007年，Autoantibodies(Second Edition)，ANTINEUTROPHIL CYTOPLASMICAUTOANTIBODIES WITH SPECIFICITY FOR PROTEINASE 3by ANTONELLA RADICE,et.al.提出现今为了诊断目的，天然形式的PR3仍然是首选。天然PR3抗原的来源是人体血液中性粒细胞。PR3的纯化主要有两种方法。第一种是基于染料配体(Orange A)与PR3的亲和结合，然后通过阳离子交换层析纯化抗原。第二种是用TritonX-100提取人中性粒细胞组分，然后用阴离子交换层析和凝胶过滤。

上述已有的关于天然蛋白酶3抗原的纯化方法报道没有提及与本发明专利一致的纯化技术。

当前，天然蛋白酶3(PR3)的制备流程基本沿用的是二十一世纪第一个十年前的常规方案，主要包括从人体血液中性粒细胞裂解液获得的全细胞粗提液，经过多重色谱层析柱的分离、纯化，提取相对富集与高纯度的目标抗原。由于全细胞粗提液含有大量的杂蛋白，所需的色谱层析柱分离步骤繁琐，并有大量的损失，因此产量和纯度都受到严重影响。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，本方法应用天然蛋白酶3(PR3)的生化特性，通过细胞裂解，细胞内含物的分离，盐梯度层析洗脱等方法大幅降低杂蛋白在白细胞粗提液中的含量，再通过更加完善合理的色谱层析步骤，从而更加高效地获得天然蛋白酶3(PR3)，使其在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高。

本发明提供了一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，步骤包括：

S1、研磨、溶解：将嗜天青颗粒细胞组织研磨均匀，高速离心去除不溶解杂质获得过柱起始蛋白溶液；

S2、阳离子交换层析：将起始蛋白溶液负载于阳离子交换柱层析柱中，使用梯度盐度层析洗脱方式进行洗脱，得到初级纯化蛋白样品；

S3、染色配体层析：将初级纯化蛋白样品再通过染色配体层析柱进一步洗脱去除杂质，得到二级纯化蛋白溶液；

S4、分子筛层析：将二级纯化蛋白溶液通过分子筛层析柱进一步洗脱分离蛋白酶3抗原，分馏收集洗脱液得到三级纯化蛋白溶液；

S5、亲和层析：经过亲和层析柱将三级纯化蛋白溶液中的杂蛋白进一步洗脱剔除，得到最终成品。

本发明根据蛋白酶3的生物化学特性(其与细胞其它杂蛋白具有不同的表体电荷和分子量，在不同盐浓度下的与层析柱结合的差别，以及与抗体结合的特异性)，通过不同盐浓度配成梯度层析洗脱液分离细胞组织中各类蛋白，获得高度富集的蛋白酶3的初级产品。再通过一组完整严谨的层析系统，包括阳离子交换，染色配体层析，分子筛色谱层析和亲和层析最后获得高纯度蛋白酶3。

优选的，步骤S2中，所述阳离子交换柱层析柱中采用的层析缓冲液为20-50mM醋酸钠(Na-Acetate),PH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol(芦布若尔)；依次采用洗脱缓冲液1和洗脱缓冲液2进行梯度盐度层析洗脱，所述洗脱缓冲液1为20-50mM醋酸钠,PH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol,0-0.3M NaCl；洗脱缓冲液2为20-50mM醋酸钠,PH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol,0.4-0.6M NaCl。

优选的，步骤S3中，所述染色配体层析柱中采用的层析缓冲液为20-50mM醋酸钠,PH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol，所述洗脱采用的洗脱缓冲液为20-50mM醋酸钠,PH5.4-5.6,0-2M NaCl,0.02-0.05％Lubrol。

优选的，步骤S4中，所述洗脱采用的洗脱缓冲液为15-25mM Hepes-NaOH(4-羟乙基哌嗪乙磺酸-NaOH),pH 7.5-8.5，0.02-0.05％Lubrol,0.1-0.5M NaCl。

优选的，步骤S5中，所述洗脱采用的洗脱缓冲液为15-25mM Hepes-NaOH,pH 7.5-8.5，0.02-0.05％Lubrol,0.1-0.5M NaCl。

优选的，步骤S1中，所述嗜天青颗粒细胞组织采用以下方法得到：采用PBS缓冲液洗脱原材料中的白细胞，洗脱液离心，弃上清保留下层细胞层，向细胞层中加入细胞裂解液后离心，取下层沉淀，即得嗜天青颗粒细胞组织。所述嗜天青颗粒细胞组织中富含蛋白酶3。所述原材料可采用人体输血后废弃医疗用品。

优选的，步骤S3中，采用电动玻璃均浆器研磨并溶解嗜天青颗粒细胞组织；所述高速离心为转速14000～16000rpm下离心25～35分钟。

本发明的有益效果是：本发明针对现有人血蛋白酶3纯化方法中存在的问题，通过对天然蛋白酶3(PR3)生化特性的研究，设计出一套从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离、纯化天然蛋白酶3(Proteinase 3,PR3)的改进方法。本发明的优点一在于通过增加细胞组织的分离以及目标组织的提取和再研磨的方式，改进了初级白细胞组织液提取过程，进而大幅度增加色谱层析前蛋白酶3的富集度和相对纯度。本发明的优点二在于通过联合之后一整套更加完善合理的色谱层析方法，减少了色谱层析后的蛋白酶3的产量损耗，从而能更加高效地获得天然蛋白酶3，使整个纯化工艺更加适用于批量生产。

经由本工艺提取纯化的天然蛋白酶3抗原已经通过一系列高规格的质量检测证明，其在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高，其高质量更适用于科学研究以及医学检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的工艺流程示意图；

图2为实施例1中阳离子层析所得初级蛋白酶3的蛋白电泳胶；

图3为实施例1中阳离子层析所得初级蛋白酶3的蛋白转印结果图；

图4为实施例1中PR3阳离子交换层析图谱；

图5为实施例1中染色配体层析所得蛋白酶3的蛋白电泳胶；

图6为实施例1中染色配体层析所得蛋白酶3的蛋白转印结果图；

图7为实施例1中分子筛层析所得蛋白酶3的蛋白电泳胶；

图8为实施例1中分子筛层析所得蛋白酶3的蛋白转印结果图；

图9为实施例1中亲和层析所得蛋白酶3的蛋白电泳胶；

图10为实施例1最终得到的PR3抗原蛋白光吸收图；

图11为实施例2中PR3抗原纯化结果对比蛋白胶SDS-PAGE。

具体实施方式

现有的天然蛋白酶3(PR3)的制备、纯化工艺由于不够合理的初级白细胞组织液提取过程致使血液中性粒细胞粗提液中杂蛋白较多，再加上不够完善的色谱层析步骤导致全细胞粗提液中的杂蛋白不能够很好的被分离出去，导致天然蛋白酶3最终的产量，纯度以及特异性都受到严重的影响。本发明针对现有人血蛋白酶3纯化方法中存在的问题，为了得到产量化的高纯度、高活性、高特异性的天然蛋白酶3抗原，通过对天然蛋白酶3(PR3)生化特性的研究，设计出一套从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离、纯化天然蛋白酶3(Proteinase 3,PR3)的改进方法。此方法的目的一是通过增加细胞组织的分离以及目标组织的提取和再研磨的方式，来改进初级白细胞组织液提取过程，以利于大幅度增加色谱层析前蛋白酶3的富集度和相对纯度。此方法的目的二是通过联合之后一整套更加完善合理的色谱层析方法，来减少色谱层析后的蛋白酶3的产量损耗，从而更加高效地获得天然蛋白酶3，使整个纯化工艺更加适用于批量生产。在本发明的几个实施例中经过一系列高规格的质量检测表明，经由本工艺提取纯化的天然蛋白酶3抗原在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高，其高质量更适用于科学研究以及医学检测。

具体的，本发明利用密度梯度分离生物颗粒溶剂初步分离细胞组织获得目标细胞组织，结合阳离子交换层析柱，染色配体层析柱，分子筛层析柱以及亲和层析柱等纯化方法从人体血液中性粒细胞嗜天青颗粒中分离、纯化天然蛋白酶3，基本工艺流程如附图1所示。本发明提供了一种在裂解白细胞并提取全细胞粗提液后分离细胞组织并提取富集蛋白酶3的细胞组织，去除其他非目标抗原的方法。此方法可为之后的色谱层析纯化打下良好的基础。本发明解决的另一技术问题是结合并改进色谱层析分离、纯化天然蛋白酶3的技术，它具有大幅提高分离产量，样品纯度以及样品特异性的优点。

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

本实施例使用从人体输血后废弃医疗用品中回收并提取的中性粒细胞嗜天青颗粒30.5g,经研磨，溶解，离心后获得含有蛋白酶3的层析过柱起始蛋白溶液，后结合阳离子交换层析，染色配体层析，分子筛层析以及亲和层析等一系列色谱层析方法，最终获得35.0mg高纯度的PR3抗原。具体实施步骤如下：

1、采用PBS缓冲液洗脱人体输血后废弃医疗用品中的白细胞，洗脱液离心，弃上清保留下层细胞层，向细胞层中加入细胞裂解液后离心，保留下层沉淀，即得嗜天青颗粒细胞组织。所述嗜天青颗粒细胞组织中富含蛋白酶3。所述离心速度为4000rpm,30分钟。所述PBS缓冲液及细胞裂解液均为市场购买得到的常规试剂。

2、使用电动玻璃均浆器(宁波新芝公司生产)研磨并溶解中性粒细胞嗜天青颗粒，在研磨均匀后，将细胞研磨液分装于高速离心瓶内，经过离心后去除不溶解杂质从而获得过柱起始蛋白溶液。所述的离心转速为15000rpm，时间为30分钟。

3、将起始蛋白溶液负载于阳离子交换柱层析柱中，本实施例中采用的阳离子交换柱层析柱为汇琼离SP-6FF(汇研生物)。依次采用洗脱缓冲液1、洗脱缓冲液2进行盐梯度层析洗脱，使用盐梯度层析洗脱方式分两步将表面负载阳离子的抗原洗脱出来，通过洗脱得到的洗脱液1包含高分子量杂质，得到的洗脱液2为富含蛋白酶3的初级蛋白样品。所述步骤中，装填层析柱过程中使用的层析缓冲液为25mM Na-Acetate,pH5.5,0.02％Lubrol；洗脱过程中，使用的洗脱缓冲液1为25mM Na-Acetate,pH5.5,0.2M NaCl,0.02％Lubrol洗脱缓冲液2为25mM Na-Acetate,pH5.5,0.4M NaCl,0.02％Lubrol。对经过阳离子层析得到的初级蛋白酶3进行蛋白电泳及蛋白转印检测，检测结果如附图2、附图3所示。图2所示蛋白电泳胶显示初级蛋白酶3纯化效果(阳离子层析)。根据蛋白酶3(PR3)的分子量(29～33kD),可以清晰的在图上看到纯化的蛋白酶3，其上部和下部还有其他杂抗原。图3所示蛋白转印显示初级蛋白酶3纯化效果(阳离子层析)。根据蛋白酶3(PR3)的分子量(～29kD-33kD),可以清晰的在图上看到纯化的蛋白酶3。此蛋白转印同时转印了样品中另一主要抗原杂质MPO，有待在之后的层析步骤中纯化剔除。阳离子交换层析图谱如附图4所示，从图4可以清晰的看到当盐梯度浓度达到0.6M时吸光度有一个波峰(E2)，此波峰代表富集蛋白酶3的初级蛋白样品。

4、收集的初级纯化蛋白样品再通过含有染色配体层析柱进一步去除杂质，得到二级纯化蛋白溶液，本实施例采用的染色配体层析柱为Reactive Yellow3-Agarose(西格玛)。所用的层析缓冲液为25mM Na-Acetate,pH5.5,0.02％Lubrol洗脱缓冲液为25mM Na-Acetate,pH5.5,2M NaCl,0.02％Lubrol。对经过染色配体层析得到的初级蛋白酶3进行蛋白电泳及蛋白转印检测，检测结果如附图5、附图6所示。图5所示蛋白电泳胶显示蛋白酶3纯化效果(染色配体层析)。根据蛋白酶3(PR3)的分子量(～29kD-33kD),可以清晰的在图上看到纯化的蛋白酶3.其上部和下部还有少量其他抗原。主要抗原杂质MPO和BPI，LF已经被基本剔除。图6所示蛋白转印显示蛋白酶3纯化效果(染色配体层析)。此蛋白转印转印使用PR3和MPO抗体检测。从纤维膜的转印印记上可以看到此纯化的抗原蛋白样品中已经基本不含MPO抗原杂质。

5、之后通过分子筛层析柱进一步分离蛋白酶3抗原，分馏收集洗脱液5毫升/管得到三级纯化蛋白溶液，本实施例采用的分子筛层析柱为Chromdex 200pg(博格隆)。所述洗脱缓冲液为20mM Hepes-NaOH,pH 8.0，0.02％Lubrol；0.4M NaCl。对经过分子筛层析得到的初级蛋白酶3进行蛋白电泳及蛋白转印检测，检测结果如附图7、附图8所示。图7所示蛋白电泳胶显示蛋白酶3纯化效果(分子筛层析)，根据蛋白酶3(PR3)的分子量(～29kD-33kD),可以清晰的在图上看到纯化的蛋白酶3.其上部和下部还有极少量其他抗原，主要包括MPO和BPI，LF，这些杂质将在亲和层析中被剔除。图8所示蛋白转印显示蛋白酶3纯化效果(分子筛层析)。此蛋白转印转印使用PR3和MPO抗体检测。从纤维膜的转印印记上可以看到此纯化的抗原蛋白样品中已经不含MPO抗原杂质但含有大量纯化PR3。

6、最后经过亲和层析柱将三级纯化蛋白溶液中的杂蛋白进一步剔除(包括MPO,BPI等)，得到最终成品，本实施例采用的亲和层析柱为汇琼亲CNBr-4B(汇研生物)。亲和层次柱所用缓冲液以及产品最终的缓冲液成份为20mM Hepes-NaOH,pH 8.0，0.02％Lubrol；0.4M NaCl。对经过分子筛层析得到的初级蛋白酶3进行蛋白电泳检测，检测结果如附图9所示。从图9中可以看到BPI，MPO等杂质已经被剔除，得到高富集的、高纯度的天然蛋白酶3抗原。

7、本实施例以30.5g的中性粒细胞嗜天青颗粒为原料,经研磨，溶解，离心获得含有蛋白酶3的层析过柱起始蛋白溶液，后经一系列色谱层析方法，最终获得165.0ml成品。

8、获得的纯化蛋白，测定A280值为0.235，按1.108对应于1mg蛋白/ml计算蛋白得率，共获得35.0mg高纯度的天然蛋白酶3抗原。PR3抗原蛋白光吸收图如附图10所示。

实施例2

本实施列对实施列1提取和纯化的天然蛋白酶3抗原进行了纯度的验证，同时使用印度Yashraj Biotechnology公司纯化的蛋白酶3抗原进行了平行对比。验证方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯蓝染色，之后采用BioRad的ChemiDoc MP成像仪扫描后对电泳胶结果进行光密度分析(Densitometry Analysis)。检测结果如附图11所示。从附图11所示蛋白胶可明显看到，由实施例1提取纯化的蛋白酶3抗原较印度YashrajBiotechnology公司的产品具有更高的纯度和热稳定性等特征。

实施例3

本实施列对实施列1提取和纯化的天然蛋白酶3抗原进行了特异性的验证，同时使用印度Yashraj Biotechnology公司纯化的蛋白酶3抗原进行了平行对比。验证方法采用了酶联免疫法(ELISA)，检测了13例样本(7例正常血清样本+6例阳性血清样本)。检测结果如表1所示。

表1实施例1产品与印度Yashraj Biotechnology公司产品特异性对比试验结果

从上表可以看出，经由本发明方法提取纯化的天然蛋白酶3对比印度YashrajBiotechnology公司提取纯化的蛋白酶3，正常血清效价更低，抗PR3抗体阳性血清效价更高，显示其纯度更高，活性更高，特异性更高。

本发明经过前期研发实验，所提取纯化的天然蛋白酶3已经通过了公司内部一系列高规格的质量检测，证明其在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高。下游客户的试验检测结果也呈现良好的反馈。均证明了本发明提供方法制备得到的天然蛋白酶3可以使用并且可以批量生产。

实施例4

本实施例使用人体输血后废弃医疗用品，经初级提取得到蛋白酶3富集组织细胞沉淀，后经一系列色谱层析方法，最终获得高纯度的PR3抗原。具体实施步骤与实施例一基本一致，区别在于：

阳离子层析步骤中，采用的层析缓冲液为30mM醋酸钠,pH5.6,质量百分比0.04％Lubrol；采用的洗脱缓冲液1为30mM醋酸钠,pH5.6,质量百分比0.04％Lubrol,0.3M NaCl；洗脱缓冲液2为30mM醋酸钠,pH5.6,质量百分比0.04％Lubrol,0.6M NaCl。

染色配体层析步骤中，采用的层析缓冲液为30mM醋酸钠,pH5.6,0.04％Lubrol，洗脱缓冲液为30mM醋酸钠,pH5.6,1M NaCl,0.04％Lubrol。

分子筛层析步骤中，采用的洗脱缓冲液为23mM Hepes-NaOH,pH 8.3，0.04％Lubrol,0.2M NaCl。

亲和层析步骤中，采用的洗脱缓冲液为23mM Hepes-NaOH,pH 8.3，0.04％Lubrol,0.2M NaCl。

本实施例所得蛋白酶3富集组织细胞沉淀在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上与实施例1基本一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，其特征在于：步骤包括：S1、研磨、溶解：将嗜天青颗粒细胞组织研磨均匀，高速离心去除不溶解杂质获得过柱起始蛋白溶液；S2、阳离子交换层析：将起始蛋白溶液负载于阳离子交换柱层析柱中，使用梯度盐度层析洗脱方式进行洗脱，得到初级纯化蛋白样品；S3、染色配体层析：将初级纯化蛋白样品再通过染色配体层析柱进一步洗脱去除杂质，得到二级纯化蛋白溶液；S4、分子筛层析：将二级纯化蛋白溶液通过分子筛层析柱进一步洗脱分离蛋白酶3抗原，分馏收集洗脱液得到三级纯化蛋白溶液；S5、亲和层析：经过亲和层析柱将三级纯化蛋白溶液中的杂蛋白进一步洗脱剔除，得到最终成品；

步骤S2中，所述阳离子交换柱层析柱中采用的层析缓冲液为20-50mM醋酸钠,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol；依次采用洗脱缓冲液1和洗脱缓冲液2进行梯度盐度层析洗脱，所述洗脱缓冲液1为20-50mM醋酸钠,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol,0-0.3M NaCl，所述洗脱缓冲液2为20-50mM醋酸钠,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol,0.4-0.6M NaCl；

步骤S3中，所述染色配体层析柱中采用的层析缓冲液为20-50mM醋酸钠,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol，所述洗脱采用的洗脱缓冲液为20-50mM醋酸钠,pH5.4-5.6,0-2MNaCl,0.02-0.05％Lubrol；

步骤S4中，所述洗脱采用的洗脱缓冲液为15-25mM Hepes-NaOH,pH 7.5-8.5，0.02-0.05％Lubrol,0.1-0.5M NaCl；

步骤S5中，所述洗脱采用的洗脱缓冲液为15-25mM Hepes-NaOH,pH 7.5-8.5，0.02-0.05％Lubrol,0.1-0.5M NaCl。

2.如权利要求1所述的从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，其特征在于：步骤S1中，所述嗜天青颗粒细胞组织采用以下方法得到：采用PBS缓冲液洗脱原材料中的白细胞，洗脱液离心，弃上清保留下层细胞层，向细胞层中加入细胞裂解液后离心，取下层沉淀，即得嗜天青颗粒细胞组织。

3.如权利要求1所述的从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，其特征在于：步骤S1中，采用电动玻璃均浆器研磨并溶解嗜天青颗粒细胞组织；所述高速离心为转速14000～16000rpm下离心25～35分钟。

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