KR20180126365A - 생체시료로부터 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법 - Google Patents

생체시료로부터 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엑소좀 및 지질단백질이 혼합된 생체시료로부터 엑소좀과 지질단백질을 분리하는 방법에 관한 것으로 본 발명의 방법을 통해 분리된 엑소좀이 포함된 분획에는 지질단백질의 양이 크게 감소되어 획득된 엑소좀의 순도가 높아짐을 확인한 바, 본원발명의 방법은 엑소좀 및 지질단백질이 혼합된 시료로부터 엑소좀과 지질단백질을 효과적으로 분리하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생체시료로부터 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법{Method for Isolation of Exosomes and Lipoproteins from Biological Sample}
본 발명은 지질단백질 및 엑소좀이 혼합된 생체시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법에 관한 것이다.
세포외 소포(extracellular vesicle)는 세포에서 방출 또는 분비되는 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 미세소포(microvesicle) 및 세포자멸사 소체(apoptotic body)를 포함한 개념으로 그중 엑소좀은 20-150 nm 의 크기를 가지며 세포 내 다소포체(Multi vesicular bodies; MVB)로부터 생성되는 생체 나노 입자이다.
이들 세포외 소포는 혈액, 뇌척수액, 소변, 양수, 모유, 침, 정액 같은 여러 종류의 다양한 생체액(biofluid)에서 비교적 쉽게 분리할 수 있으며, 유래된 세포에 따라, 덱소좀(dexosome; 수지상세포에서 유래), 온코좀(oncosome; 암세포에서 유래), 프로타좀(prostasome; 전립선세포에서 유래), 카디오좀(cardiosome; 심근세포에서 유래) 등으로 불린다. 세포의 소포는 그 유래되는 세포나 세포 내 소기관에 따라 다양한 뉴클레오타이드 또는 표지단백질을 포함하게 된다. 예를 들어 암세포에서 유래된 세포외 소포인 온코좀은 암세포의 성장을 유도하는 유전자의 mRNA를, 항원제시세포(antigen-presenting cell)에서 유래된 세포외 소포는 주조직적합 복합체를 포함한다. 이처럼 세포외 소포는 세포특이적인 단백질이나 뉴클레오티드 같은 생체물질이 고농도로 농축되어 포함된 상태이므로 일반 생체액에선 전체 단백질체의 0.01% 정도로 존재하여 통상적인 분석방법으로는 검출이 어려운 단백질이나 뉴클레오티드도 세포외 소포에선 비교적 쉽게 검출이 가능한 장점이 있다. 아울러 비록 세포외 소포에 존재하는 단백질이나 뉴클레오티드의 종류가 전체의 극히 일부이긴 하나 세포외 소포의 물질은 자신이 유래한 세포의 고유의 특성을 나타낼 수 있으므로 엑소좀 분석은 특정 질환의 진단 목적으로 매우 유용하며, 이에 대한 연구가 최근 활발히 이루어지고 있다.
엑소좀을 이용한 진단이나 치료방법 연구에서는 순도 높은 엑소좀을 얻는 것이 중요하다. 엑소좀의 분리와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2016-0115988호를 포함하여 다양한 방법이 연구되어 오고 있다. 이의 예로는 초원심분리(ultracentrifuge), 밀도 원심분리(density centrifuge), 컬럼(column)의 이용, PEG 침전(PEG precipitation), 크로마토그래피(chromatography), 면역-자기분리(immuno-magnetic separation, IMS) 및 음향정제(acoustic separation, acoustic purification) 등이 있다. 컬럼 크로마토그래피의 경우, 단시간에 비교적 높은 순도의 엑소좀을 수득할 수 있다는 점에서 최근에 많이 주목받고 있다. 그러나, 현재 컬럼 크로마토크래피를 이용하여 엑소좀을 분리한 경우 엑소좀과 함께 지질단백질(lipoprotein)이 용출된다는 것이 보고되어 이 지질단백질을 제거하여 엑소좀의 순도를 더욱 높이는것이 중요한 과제가 되고 있다. 과거 컬럼 크로마토크래피 연구는 엑소좀 용출구간에만 집중되었고 지질단백질 용출에 대한 심도있는 분석은 거의 이루어지지 않았다. 그러나, 세포 배양액 또는 혈액 내에는 엑소좀과 비슷한 크기, 밀도를 가진 지질단백질이 항상 함께 존재하고 있기 때문에 엑소좀 연구에 있어서 지질단백질 분리는 필수적이다.
상기의 배경하에서 본 발명자들은 생체시료에서 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법을 개발하고자 하였으며, 세포 배양액 및 혈액에서 컬럼을 이용해 용출되는 각 구간의 입자를 분석함으로써 엑소좀과 지질단백질을 분리할 수 있는 조건을 최적화하고 이를 이용해 순수한 엑소좀을 얻을 수 있는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0115988호
본 발명의 목적은 지질단백질 및 엑소좀이 혼합된 생체시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 효율적으로 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5 내지 50 nm의 공극 크기를 갖는 고체 기질을 지나도록 시료를 유동시켜 크기 배제 크로마토그래피 (Size-exclusion chromatography; SEC)를 수행하는 단계를 포함하는, 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 생체시료에서 엑소좀을 분리하는 방법은 엑소좀 대비 지질 단백질의 양을 크게 감소시켜 획득된 엑소좀의 순도를 높일 수 있어 시료내 엑소좀과 지질 단백질을 분리하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 종래 컬럼을 이용한 엑소좀의 분리 방법을 도식화한 것이다.
도 2은 종래 컬럼을 이용한 엑소좀의 분리 결과이다:
A: 분획 #8 에서 관찰된 엑소좀; 및
B: 분획 #7 내지 9에서 관찰된 엑소좀의 크기 분포.
도 3는 동적 광 산란법(dynamic light scattering; DLS)을 통해 확인된 세포 배양액, 마우스 혈청 및 인간 혈청의 각 분획(분획 #8 부터 #15)에서의 입자 Z-평균 크기를 나타낸 것이다.
도 4은 웨스턴 블롯을 통한 세포 배양액, 마우스 혈청 및 인간 혈청의 각 분획(분획 #9 부터 #15)의 엑소좀과 지질단백질의 검출 결과를 나타낸 것다:
ApoB: 지질단백질 ; 및
CD63: 엑소좀 마커 단백질.
도 5는 세포 배양액과 인간 혈청의 각 분획(분획 #8 부터 #15)에서 컬럼 비드(2B 컬럼(column) 또는 6B 컬럼)에 따른 엑소좀과 지질단백질의 검출 결과를 나타낸 것이다:
ApoB: 지질단백질 ; 및
CD63: 엑소좀 마커 단백질.
도 6는 인간 혈청을 6B 컬럼(CL-6B)으로 분획한 분획 #12 부터 #14의 엑소좀을 현미경적으로 관찰한 결과이다:
A: 항-CD63 항체가 코팅된 자성 비드를 이용해 포획된 엑소좀;
B: 포획된 엑소좀의 크기; 및
C: 금 라벨된 엑소좀.
도 7은 분리 방법에 따른 엑소좀과 지질단백질의 비율을 나타낸다:
ApoB: 지질단백질 ;
CD63: 엑소좀 마커 단백질;
2B(8-10): 2B 컬럼 분획번호 #8-#10;
2B(12-14): 2B 컬럼 분획번호 #12-#14;
6B(8-10): 6B 컬럼 분획번호 #8-#10;
6B(12-14): 6B 컬럼 분획번호 #12-#14;
ExoQuick: ExoQuick　처리 후 원심분리로 얻어진 침전물; 및
serum: 별도의 처리가 되지 않은 혈청.
도 8은 분획 후 침전 과정을 거친 인간 혈청에서 기타 단백질의 제거 및 엑소좀 분리 효율을 나타낸다:
ApoB: 지질단백질 ;
CD63: 엑소좀 마커 단백질;
2B(12-14)-exo: 2B 컬럼 분획 #12-#14와 Exoquick 용액을 1:1(v/v)로 혼합하여 얻어진 침전물;
6B(12-14)-exo: 6B 컬럼 분획 #12-#14와 Exoquick 용액을 1:1(v/v)로 혼합하여 얻어진 침전물;
serum-exo: 분획하지 않은 혈청과 Exoquick 용액을 1:1(v/v)로 혼합하여 얻어진 침전물;
ExoQuick: 분획하지 않은 혈청과 Exoquick 용액을 5:1(v/v)로 혼합하여 얻어진 침전물; 및
serum: 별도의 처리가 되지 않은 혈청.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 5 내지 50 nm의 공극 크기를 갖는 고체 기질을 지나도록 시료를 유동시켜 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 지질단백질 및 엑소좀의 혼합시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 고체 기질은 비다공성 경질(rigid) 비드(bead) 또는 입자로 충전된 컬럼;
경질 망상 포말(reticulated foam)로 충전된 컬럼;
내부 유동 채널이 있는 소결된 비드 또는 비드형이 아닌(non-bead) 소결된 고체 매체의 경질 모놀리식 층(monolithic bed)으로 충전된 컬럼;
직조(woven) 또는 비직조(non woven) 경질 섬유(fabric)로 충전된 컬럼;
경질 실(yarn) 또는 임의로 중공인(hallow) 모노필라멘트 섬유로 충전된 컬럼;
나권형(螺卷形) 카트리지(spiral wound cartridge); 또는,
비드, 경질 망상 포말, 소결된 비드, 섬유, 실 및 모노필라멘트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 3종의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 기질은 아가로즈, 세파로즈, 셀룰로즈, 제어된 공극 유리, 실리카 겔, 덱스트란을 포함하는 친수성 물질 또는 폴리아크릴아미드 폴리스티렌을 포함하는 유기 인공 중합체로 구성된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 본원발명에서는 세파로즈로 구성된 비드를 포함하는 Sepharose CL-6B를 이용하였다.
상기 컬럼은 비드 직경이 20 내지 180 ㎛일 수 있고, 구체적으로는 40 내지 165 ㎛일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 시료는 혈액, 뇌척수액, 소변, 양수, 모유, 침, 정액 및 세포 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 본원발명의 분리 방법에서는 크로마토그래피를 수행한 후에 침전(precipitation)시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 침전은 해당 기술 분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
본원발명의 분리 방법에 의해 분리된 엑소좀은 상기 크로마토그래피 후 전체 용출액 중 40 내지 50% 구간에서 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본원발명의 분리방법에 의해 상기 40 내지 50% 구간의 용출액에는 지질단백질 대비 엑소좀의 비율이 크다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 종래 방법에서는 혈청의 엑소좀과 지질단백질 용출 구간이 중복되었으나(도 4), CL-6B 컬럼을 이용할 경우 혈청에서 엑소좀과 지질단백질 용출 구간의 분리가 명확하게 나타나는 것이 표지자를 이용한 관찰(도 5) 및 현미경 관찰에서 확인되었으며(도 6), 상기 방법은 종래의 2B 컬럼을 이용한 방법 및 ExoQuick을 이용하는 방법에 비해 지질단백질 대비 엑소좀의 분리 효율이 가장 높은 것으로 나타났고(도 7), 또한 CL-6B 컬럼을 진행한 후, Exoquick을 이용하여 침전을 시킬 경우 지질단백질의 침전이 감소되어 엑소좀의 순도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 8).
따라서 본 발명에 의한 생체시료에서 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법은 엑소좀 대비 지질 단백질의 양을 크게 감소시켜 획득된 엑소좀의 순도를 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.
단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 기존 컬럼 조건에서 엑소좀 분리 가능 확인
크로마토그래피를 하기 위해 제작된 컬럼은 다양한 부피를 가질 수 있으나, 본 발명에서는 대표적인 직경 10mm, 높이 50mm 부피에 충진 비드가 채워진 것을 이용하였다. 종래 컬럼 크로마토크래피에 의한 엑소좀 분리 정도를 확인하기 위해 세포 배양액을 비드의 직경이 60 내지 200㎛이고, 포어 크기가 75 nm인 sepharose CL-2B column(Sigma-Aldrich Co.)을 이용해 도 1과 같이 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography; SEC) 를 수행하였다.
구체적으로, 샘플을 로딩(loading)하기에 앞서, 300ml의 PBS로 충진 비드를 세척(washing)하였다. 세척 후, 충진된 컬럼 비드 외에 이동상 버퍼가 다 소진되면 바로 준비된 샘플을 로딩(loading)하였다. 컬럼에 로딩 되는 샘플의 부피는 충진된 비드 전체부피의 5%를 넘지 않도록 하였으며, 본 실험에서는 0.3 내지 0.5ml의 샘플을 로딩(loading)했다. 이동상의 압력은 2-4 Pa 로 흘려주었다. 샘플이 로딩된 시점부터 흘러나오는 용출액 0.5ml씩을 받은 용액을 1 분획으로 하였다. 샘플은 280 nm 흡광도 기준으로 25-30 구간 내에 모두 용출되었고, 분리된 샘플 분획은 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM)으로 확인하였다.
그 결과, TEM 분석에서 도 2과 같이 분획 번호 #7부터 #9 구간에서 엑소좀(검은 화살표로 표시)이 분리된 것이 관찰되었으며(도 2A), 관찰된 엑소좀의 크기 분포는 평균 48.5 ± 13.1 nm 인 것으로 나타났다(도 2B).
실시예 2. 세포 배양액과 혈청에서 엑소좀과 지질단백질 용출의 경향성 비교
세포 배양액 외에 혈청에서 엑소좀의 분리를 확인하고자 세포 배양액, 마우스 혈청 및 인간 혈청을 실시예 1과 같이 분획하고, 각 분획에 대하여 동적 광 산란(dynamic light scattering; DLS)을 이용해 Z-평균 크기(Z-Average size)를 측정하였다. 상기 혈청으로는 혈액을 10000 rcf, 4℃에서 30 min 동안 원심분리 후, 얻어진 상층액을 이용하였으며, 각 구간에서 분획물을 시료로 하여 엑소좀 마커 단백질 및 지질단백질에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체로 엑소좀 마커 단백질인 CD63에 대한 항체(Santa Cruz 사 제조 sc-15363) 및 지질단백질 항체인 ApoB-100 항체(Santa Cruz 사 제조 sc-25542)를 사용하였다. 구체적으로 5% (w/v) 탈지유(skim milk)를 TBST에 녹인 용액에 CD63에 대한 항체를 1:500 (0.1% (v/v))으로 희석하여 사용하였고, ApoB-100에 대한 항체를 1:1000 (0.1% (v/v))으로 희석하여 사용하였다.
그 결과, 분획번호 #9 및 10에서 DLS 결과상으로 입자의 평균 크기에 차이가 현저히 나타났으며, 혈청에서의 입자 크기는 세포 배양액의 35~53% 수준으로 더 작은 것으로 확인되었다(도 3). 혈액에 존재하는 엑소좀은 세포 배양액에서의 엑소좀보다 크기가 작은 것으로 확인되었다.
세포 배양액을 분획할 경우 분획번호 #9 및 10 구간에서 엑소좀과 지질단백질 입자가 용출되는 것을 확인했지만, 혈청을 분획할 경우 엑소좀이 지질단백질보다 뒤에 용출되는 것으로 나타났다(도 4). DLS 크기와 비교한 결과 지질 단백질은 z-평균 30-150 nm 에서, 엑소좀은 20-65 nm 에서 주로 검출되었다.
실시예 3. 컬럼 비드에 따른 엑소좀과 지질단백질 분리의 최적화 확인
비드 크기가 40-165 ㎛로 20 nm 내외의 포어 크기를 갖는 sepharose CL-6B column(Sigma-Aldrich Co.)으로 교체해 실시예 1과 같이 세포 배양액 및 인간 혈청을 분획하고 실시예 2와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 각 분획에 대하여 동적 광 산란(dynamic light scattering; DLS)을 이용해 Z-평균 크기(Z-Average size)를 측정하였다.
그 결과, 도 5A에서와 같이 혈청은 2B 컬럼으로 분획시 엑소좀과 지질단백질이 함께 용출되는 구간이 발생하나, 6B 컬럼으로 분획시 지질단백질이 용출되는 속도가 빨라지면서 혈청에서 엑소좀과 지질단백질 용출 구간의 분리가 명확해져 분획번호 #9부터 #11까지는 지질단백질이 먼저 분리되고, 분획번호 #12부터 #14까지는 엑소좀이 분리되었다. 혈액에 존재하는 엑소좀은 크기가 작기 때문에, 20 nm 포어 크기를 갖는 sepharose CL-6B 컬럼으로 분획하면 지질단백질과 엑소좀의 용출 구간이 벌어짐을 확인하였다. 그러나, 세포 배양액에서는 6B 컬럼으로 분획시에도 지질단백질과 엑소좀이 함께 용출되는 구간이 발생하는 것으로 나타났다.
실시예 4. 컬럼으로 분획된 구간에서 엑소좀의 존재 여부 확인
상기 실시예 3에서 6B 컬럼으로 인간 혈청을 분획한 분획번호 #12부터 #14의 분획물에 실제로 엑소좀이 존재하는지 확인하기 위하여 #9 분획물을 대조군으로 하여 anti-CD63 자성 비드(magnetic bead) 포획 및 CD63-면역-금 라벨링(CD63-immuno-gold labeling) 처리를 하고, TEM으로 확인하였다.
구체적으로, #12 부터 #14의 분획물을 2% PFA로 고정하고 TEM 그리드(grid) 위에 로딩한 후, 50 mM의 PBS로 세척하였다. 3% BSA로 블로킹하고 CD63에 대한 항체(Santa Cruz 사, sc-15363)와 반응시킨 다음, PBS 및 PBS/0.5% BSA로 세척하고, Protein A-gold (10 nm)와 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 다시 PBS로 세척하고 1% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 고정시킨 후, 3차 증류수로 세척하고 2% 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid, pH 7-8) 용액으로 상 대비를 진행하였다. 200 kV 전자투과현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 자성 비드에 엑소좀(검은 화살표로 표시)이 포획된 것이 확인되었으며(도 6A), 실시예 2에서와 같이 DLS의 #9 분획물이 72.9±28.1 nm이나, #12 분획물부터 #14 분획물은 32.7±7.02 로 나타났고(도 6B), 이는 실시예 2에서 엑소좀 분획물이 #12 분획물부터 #14 분획물에서 발견되며(도 4), 이 구간에 상응하는 분획물 크기가 20-65 nm인 결과(도 3)에도 상응되는 것이다. 또한 CD63-면역-금 라벨링을 통해 엑소좀이 분획된 것을 확인했다(도 6C).
실시예 5. 분리 방법에 따른 엑소좀과 지질단백질 분리 효율의 확인
분리 방법에 따라 엑소좀과 지질단백질의 상대적 양이 어떻게 차이가 나는지 실시예 2와 같이 웨스턴 블롯을 수행한 후, Bio-Rad 사 ChemiDoc Image Software를 이용하여 블롯팅된 시료 부분을 밀도 계측을 통해 정량화하였다.
실시예 2에 개시된 인간 혈청 시료를 분획하였다. 컬럼 크로마토그래피 방법은 실시예 1에 개시된 방법으로 CL-2B와 CL-6B를 이용하였으며, 상업화된 제품인 ExoQuick(System Biosciences, Inc.)을 이용하여 비교하였다. Exoquick을 이용한 분리방법은 다음과 같다. 혈청 시료를 10,000 rcf로 30분 동안 원심분리하여 미세소포(microvesicle) 및 세포 파괴물(cell debris)을 제거한 후, 수득한 상층액과 Exoquick 용액(Cat #.4478360)을 5:1로 혼합하고 재부유하여 30분 동안 4℃에서 보관하였다. 그 다음, 10,000 rcf에서 10분 동안 다시 원심분리하고, 형성된 펠렛을 PBS에 재부유하여 시료로 사용하였다.
그 결과, 도 7A에서와 같이 ExoQuick을 이용한 밀도원심분리 방법에서는 지질단백질이 엑소좀과 상당량 함께 분리됨을 확인하였다. 2B 컬럼을 이용한 분획에서 #8-#10 분획물에서는 지질단백질의 양이 대부분으로 나타났으며, #12-#14 분획물에서는 지질단백질과 엑소좀이 함께 나타났다. 6B 컬럼을 이용한 분획에서 #8 분획물부터 #10 분획물까지는 지질단백질이 더 많이 나타났으며, #12-#14 분획물에서는 지질단백질은 검출되지 않고, 엑소좀은 검출되었다. 이에 단순히 검출량만이 아닌 분획내 지질단백질과 엑소좀의 비율을 비교할 경우 도 7B에서와 같이 지질단백질 대비 엑소좀 분리 효율이 가장 높은 방법은 CL-6B 컬럼을 이용하여 분획 후 #12-#14 분획물을 수득하는 것으로 나타났으며, 엑소좀 대비 지질단백질 분리 효율이 가장 높은 방법은 Column CL-2B를 이용하여 분획 후 #8-#10 분획물을 수득하는 것으로 나타났다.
실시예 6. 혈청을 분획한 후 침전시킨 경우의 엑소좀과 지질단백질 분리 효율의 확인
상기 실시예 5을 통해 확인된 엑소좀의 분리 효율이 높은 분획물(분획 #12-#14)에 ExoQuick을 이용하여 추가로 침전시킨 경우의 엑소좀 분리 효율을 비교하였다.
구체적으로 인간 혈청 시료를 CL-2B와 CL-6B 컬럼으로 분획을 실시 후 상기 실시예 5를 참조해 엑소좀이 검출된 각각의 #12-#14 분획물과 Exoquick 용액(Cat #. 4478360)을 1:1 (v/v)로 혼합하여 침전시켰으며, 비교를 위해 분획을 하지 않은 혈청과 Exoquick 용액을 1:1 (v/v)로 혼합하여 침전시킨 것(도 8의 Serum-exo)과 분획을 하지 않은 혈청과 Exoquick 용액을 5:1 (v/v)로 혼합하여 침전시킨 것(도 8의 Exoquick)을 준비하였다. SDS-PAGE를 통해 각 시료의 분리를 확인하고, 웨스턴 블롯으로 엑소좀과 지질단백질의 양을 비교하였다.
그 결과, 혈청내 알부민(albumin: ~65k Da)과 같은 가용성 단백질(soluble protein)은 종래의 분획 기법을 통해서도 대부분 제거되는 것으로 나타났다(도 8A). 엑소좀은 CL-2B 컬럼을 이용하고 침전시킨 2B(12-14)-exo, CL-6B 컬럼을 이용하고 침전시킨 6B(12-14)-exo, 분획하지 않고 침전시킨 serum-exo 및 Exoquick 모두에서 검출되었으며(도 8B), 지질단백질 대비 엑소좀의 양에 있어서는 CL-6B 컬럼을 이용하고 침전시킨 경우에 엑소좀과 지질단백질 분리효율이 가장 높은 것으로 나타났다(도 8C).

Claims (7)

  1. 5 내지 50 nm의 공극 크기를 갖는 고체 기질을 지나도록 시료를 유동시켜 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 고체 기질이
    비다공성 경질(rigid) 비드(bead) 또는 입자로 충전된 컬럼;
    경질 망상 포말(reticulated foam)로 충전된 컬럼;
    내부 유동 채널이 있는 소결된 비드 또는 비드형이 아닌(non-bead) 소결된 고체 매체의 경질 모놀리식 층(monolithic bed)으로 충전된 컬럼;
    직조(woven) 또는 비직조(non woven) 경질 섬유(fabric)로 충전된 컬럼;
    경질 실(yarn) 또는 임의로 중공인(hallow) 모노필라멘트 섬유로 충전된 컬럼;
    나권형 카트리지(spiral wound cartridge); 또는,
    비드, 경질 망상 포말, 소결된 비드, 섬유, 실 및 모노필라멘트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 3종의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 기질은 아가로즈, 세파로즈, 셀룰로즈, 제어된 공극 유리, 실리카 겔, 덱스트란을 포함하는 친수성 물질 또는 폴리아크릴아미드 폴리스티렌을 포함하는 유기 인공 중합체로 구성된 것인, 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 비드는 직경 20 내지 180 ㎛인, 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 뇌척수액, 소변, 양수, 모유, 침, 정액 및 세포 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 크로마토그래피를 수행한 후에 침전(precipitation)시키는 단계를 추가적으로 포함하는, 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 분리된 엑소좀은 상기 크로마토그래피 후 전체 용출액 중 40 내지 50% 구간에서 포함되는 것인, 시료로부터 지질단백질과 엑소좀을 분리하는 방법.
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