KR102324068B1

KR102324068B1 - 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102324068B1
Application number: KR1020200151082A
Authority: KR
Inventors: 강희철; 윤여초; 안범희; 김형기; 홍재화; 허윤회
Original assignee: (주)지에프씨생명과학; 한국콜마주식회사
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2021-11-10

Abstract

본 발명은 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리할 경우, 자연적으로 세포 밖으로 방출된 엑소좀에 비하여 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(피부 아세포에서의 세포 상처 치유 효과 및 세포 증식력 촉진 효과를 통한 세포 재생능)가 있어 화장품 및 의약품에 유용하게 적용이 가능하다.

Description

자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법{Composition comprising an exosome derived from Human adipose-derived stem cells induced from autophagy}

본 발명은 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

자가 포식(Autophagy)이란 세포가 영양소 결핍 상황이 됐을 때 자신의 단백질을 분해하거나 불필요한 세포 성분을 스스로 제거해 에너지를 얻는 활동을 의미한다. 즉, 자가 포식은 조절과정에서 손상된 세포 및 불필요하거나 기능을 하지 않는 세포 구성 성분을 선택적으로 분해하여 단백질들의 항상성을 유지하고 적절한 세포 기관의 기능을 보존하는 데에 있어 중요한 경로이다. 자가 포식 작용은 일종의 세포 스트레스 반응에 의하여 유도되게 되는데, 이는 아미노산, 성장인자, 산소, 에너지의 결핍과 과도한 ROS, DNA 손상 및 영양분 제한과 같은 극단적인 기아를 통해 자가 포식을 유도하여 세포 에너지 수준을 낮추어 유지함으로써 세포 생존에 도움을 준다. 또한, 자가 포식은 여러 메커니즘에 의해 세포 적합성 유지에 참여하는 필수적인 세포 보호 경로이며, 이러한 경로를 통해 지속적인 세포 내 생성 물질의 생성을 저하시키고, 세포 구성 요소의 재생을 위한 빌딩 블록을 제공하는 단백질을 생성하는 메커니즘으로 바뀌어 작용하게 되며, 이는 자가 포식에 의해 자기 구성 요소를 분해하여 새로운 영양분과 에너지를 제공하기 위해 거대 분자의 재활용을 가능하게 한다. 최근의 연구 결과들은 노화를 억제하고 평균 수명을 연장시키는데 있어 자가 포식 작용이 중요하게 작용하고 있음을 보여준다. 뿐만 아니라, 자가 포식 작용은 암 예방에 있어 종양 억제 강화 및 세포 사멸을 유도함으로서 전략적으로 사용될 수 있다.

한편, 엑소좀은 거의 모든 세포들이 세포 간 정보 교환을 위해 세포 외부 환경으로 분비하는 나노 크기의 작은 소포체이다. 이러한 세포 밖 소포체인 엑소좀은 세포 내 기원을 가지며 세포 배양액, 혈액, 소변, 타액, 눈물, 정액, 모유, 복수(ascites) 등의 다양한 체액에서도 발견된다. 또한, 엑소좀은 후기 엔도좀 (Endosome) 또는 다소포체(Multi-vesicular body)의 제한막이 안쪽으로 함입되어 관내 소포(Intra lumen vesicle)로 형성된다. 세포 스트레스 또는 활성화 신호는 이러한 엑소좀의 분비를 조절하며, 분비된 엑소좀은 mRNA의 형태로 단백질, 지질, 핵산의 특정 레퍼토리, 대사 물질 및 microRNA를 포함한 코딩되지 않은 작은 RNA를 운반하며 특이적인 분비 경로를 통해 생성된다. 엑소좀은 그 내용물을 이웃 세포 또는 표적 세포와 상호작용을 하며, 멀리 떨어진 세포라도 그 수용체에 의해 엑소좀 내용물을 전달할 수 있다. 결과적으로 엑소좀은 생리적 기능을 수행하며, 이러한 과정에서 세포 간 소통 역할을 통해 유기체 발달, 면역반응, 신경 물질 전달, 조직 복구에 기여하는 것으로 보고되고 있다.

이러한 특장점에도 불구하고 엑소좀에 대한 연구와 응용된 제품들이 아직까지는 미비한 상태이다. 그 이유 중 한가지로 엑소좀을 수득할 수 있는 방법이 아직까지 제한적이고 그 방법도 전체 엑소좀 중에 극히 소량만으로 추출할 수 있는 효율성이 떨어지는 것으로 연구와 제품 상용화에 있어 그 방법을 개선하는 것이 필수적인 상황이다.

엑소좀을 수득하기 위한 방법과 관련된 기술로는, 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-2125567호「식물 엑소좀의 대량 생산 방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-1980482호「엑소좀을 분리하기 위한 다중 컬럼 및 엑소좀 분리 방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-2059535호「생체시료로부터 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-2002527호「폴리페놀을 이용한 엑소좀의 분리」 등이 개시되어 있다.

이와 같이, 다양한 증거들로 인하여 자가 포식 경로와 엑소좀의 발생 및 분비는 밀접한 관계를 맺고 있다. 엑소좀이 생성되는 동안 단백질의 선택적 통합을 야기하는 메커니즘과 관내 소포 형성 및 다소포체의 성숙은 자가 포식의 한 유형으로 설명할 수 있다.

또한, 이러한 작용은 세포 항상성 유지와 밀접하게 관련이 있기 때문에 엑소좀의 발생 및 분비와 자가 포식 사이에 공유되는 분자적 조절 메커니즘을 통하여 효과적 및 효율적으로 엑소좀을 생성하는 방법을 발명할 수 있으며, 이의 용도를 개발하는 것이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명에서는 세포 배양 시 자가 포식을 유도하여 세포질 내 세포 성분들을 엑소좀의 형태로 봉입하여 대량의 자가 포식 작용으로부터 유도된 엑소좀을 제조할 경우, 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(피부 아세포에서의 세포 상처 치유 효과 및 세포 증식력 촉진 효과를 통한 세포 재생능)를 갖는 엑소좀을 수득할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-2125567호 대한민국 등록특허공보 제10-1980482호 대한민국 등록특허공보 제10-2059535호 대한민국 등록특허공보 제10-2002527호

본 발명의 목적은 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 화장품 또는 의약품을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a)자가 포식(Autophagy) 유도 방법을 통해 자가 포식 유도물을 제조하는 단계; (b)상기 자가 포식 유도물을 인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs) 배양액에 처리하여 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 제조하는 단계; 및 (c)자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 자가 포식(Autophagy) 유도 방법은 영양소 중단, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리를 통한 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 영양소 중단은 기본 세포 배양 배지 중 아미노산을 제외한 당류 및 비타민 무기질 류만 포함하는 성분을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 삼투압 조절은 당을 이용하여 삼투압을 증가시키는 것으로, 당 성분인 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스 Sucrose)를 1:3:1로 혼합하여 삼투압 조절을 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리는 막걸리의 발효 산물 중 하나인 바이오제닉아민기(Biogenic amine)를 고온/고압 멸균을 통해 멸균하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 자가 포식(Autophagy) 유도 방법은 영양소 중단, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리를 통한 자가 포식(Autophagy) 유도 방법은 영양소 중단인 무 혈청 배양액에 삼투압 조절 성분 혼합물 및 바이오제닉아민기 성분을 각각 1:1 비율로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 처리는 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에 자가 포식 유도물을 10 내지 20%의 농도로 처리하여 24 내지 48시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는, (a)인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 배양액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질 등을 분리 및 제거하는 단계; (b)배양액의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 상등액 만을 취하여 죽은 세포 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계; (e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및 (f) 1차 및 2차 펠렛층을 PBS에 재부유시켜 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 제조방법으로부터 수득된 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 자가 포식 미 유도(자연적으로 분비되는 엑소좀) 대비 세포 상처 치유 효과 및 세포 증식력 촉진 효과를 통한 세포 재생능을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 고수율의 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 의약품을 제공한다.

본 발명으로부터 제공되는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리할 경우, 자연적으로 세포 밖으로 방출된 엑소좀(자가 포식 미 유도)에 비하여 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(피부 아세포에서의 세포 상처 치유 효과 및 세포 증식력 촉진 효과를 통한 세포 재생능)가 있어 화장품 및 의약품에 유용하게 적용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 인체 지방 유래 줄기세포에서 자가 포식 유도 방법 및 엑소좀을 분리하는 방법의 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포의 세포 형태 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포에서 분리한 엑소좀 조성물의 나노 입자 추적 분석기(NTA)를 통한 크기별 농도 변화 및 평균 입자 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포에서 분리한 엑소좀 조성물의 나노 입자 추적 분석기(NTA)를 통한 시간별 수율 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포의 세포 생존능의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포의 바이오 마커(LC3-II, PKL-1 및 p62)의 변화를 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포의 바이오 마커(LC3-II, PKL-1 및 p62)의 변화를 Image J program을 이용하여 그래프로 분석하여 나타낸 것이다.
도 8은 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포에서 분리한 엑소좀 조성물의 피부 세포 상처 치유 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 자가 포식 유도별 인체 지방 유래 줄기세포에서 분리한 엑소좀 조성물의 피부 세포 증식 향상 효과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 발명자들은 자가 포식을 유도하여 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀의 수율을 증대시킬 뿐만 아니라, 인체에 유익한 인체 지방 유래 줄기세포 엑소좀 조성물을 제공하고자 하였다. 이러한 연구 과정 속에서 자가 포식을 유도하기 위해 일반적으로 이용되고 있는 영양소 중단 뿐만 아니라, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(Biogenic amine)를 처리한 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에서 분리한 엑소좀의 분리 및 추출 수율이 향상되었으며, 상기 자가 포식 유도 3종 방법을 모두 혼합하여 자가 포식을 유도한 인체 유래 줄기세포 배양액에서 분리한 엑소좀의 분리 및 추출 수율은 단일 방법에 비해 그 수율이 더욱 크게 향상되었다. 뿐만 아니라, 상기 방법으로 수득된 엑소좀은 인체 피부 세포에서의 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과와 같은 피부 세포 재생을 촉진하는 사실을 발견하여 피부 건강에 보다 유용한 효과를 부여한다는 사실을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 (a)자가 포식(Autophagy) 유도 방법을 통해 자가 포식 유도물을 제조하는 단계; (b)상기 자가 포식 유도물을 인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs) 배양액에 처리하여 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 제조하는 단계; 및 (c)자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 자가 포식(Autophagy)을 유도하기 위한 세포로서, 인체 지방 유래 줄기세포를 사용하였으나, 인체 지방 유래 줄기세포를 비롯한 동물 혹은 식물 조직 세포 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 사용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자가 포식(Autophagy) 유도 방법은 영양소 중단, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리를 통한 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 영양소 중단, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리를 통한 자가 포식(Autophagy) 유도 방법을 모두 혼합하여 자가 포식 유도물을 제조하는 것이 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 세포에서의 상처 치유 효과 및 세포 증식 능력을 현저하게 증가시킬 수 있다는 측면에서 더욱 바람직하다.

상기 영양소 중단은 기본 세포 배양 배지 중 아미노산을 제외한 당류 및 비타민 무기질 류만 포함하는 성분을 제공하는 것일 수 있다.

상기 삼투압 조절은 당을 이용하여 삼투압을 증가시키는 것으로, 당 성분인 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스(Sucrose)를 1:3:1의 비율로 혼합하여 삼투압 조절을 유도하는 것일 수 있다.

이때, 당 성분인 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스 Sucrose)의 혼합 비율이 상기 비율을 벗어날 경우에는 세포 사멸을 유도하기 때문에 바람직하지 않다.

상기 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리는 막걸리의 발효 산물 중 하나인 바이오제닉아민기(Biogenic amine)를 고온/고압 멸균을 통해 멸균하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자가 포식(Autophagy) 유도 방법은 영양소 중단, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리를 통한 자가 포식(Autophagy) 유도 방법은 영양소 중단인 무 혈청 배양액에 삼투압 조절 성분 혼합물 및 바이오제닉아민기 성분을 각각 1:1 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 자가 포식 유도 방법 중, 영양소 공급 중단은 무 혈청 배양액으로의 배양액 교체로 이루어지기 때문에 특정 비율로 나타 낼 수 없으며, 다른 유도 방법인 당을 이용한 삼투압 조절 성분과 바이오제닉아민기 성분 간의 혼합비로 나타낼 수 있기 때문에, 무혈청 배지 존재 하에 삼투압 조절 성분 혼합물 및 바이오제닉아민기 성분을 각각 1:1의 비율로 혼합하는 것일 수 있다.

이때, 상기 혼합 범위를 벗어날 경우에는 세포 사멸을 유도하기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 처리는 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에 자가 포식 유도물을 10 내지 20%의 농도로 처리하여 24 내지 48시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

이때, 자가 포식 유도물을 10% 농도 미만으로 처리할 경우에는 자가 포식 유도가 미비하며, 20%를 초과하여 처리할 경우에는 세포 사멸을 유도하기 때문에 바람직하지 않다.

또한, 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에 자가 포식 유도물을 처리하여 배양시 24 내지 48시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 48시간 동안 수행하는 것이 엑소좀의 수율을 가장 높게 나타낼 수 있다는 측면에서 더욱 바람직하다. 만일, 배양 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 자가 포식을 넘어 독소 생성을 유발하여 세포 사멸 유도 및 오염의 위험성을 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는, (a)인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 배양액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질 등을 분리 및 제거하는 단계; (b)배양액의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 상등액 만을 취하여 죽은 세포 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계; (e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및 (f) 1차 및 2차 펠렛층을 PBS에 재부유시켜 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것이 고 수율 및 고 순도의 엑소좀을 수득할 수 있을 뿐만 아니라 오염을 방지할 수 있다는 측면에서 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 제조방법으로부터 수득된 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

상기 엑소좀은 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에서 분리된 것으로서, 50~200nm의 직경을 가질 수 있다.

기존의 엑소좀의 분리는 자연적으로 세포 밖으로 방출되는 소포체를 분리하여, 분리/추출 수율 및 유효성의 한계가 존재하였다.

상기 인체 지방 유래 줄기세포에서 영양소 중단, 삼투압 조절, 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리를 통한 자가 포식 유도는 세포 간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀의 자연 방출 수율에 비해, 현저하게 증가된 엑소좀 수득률을 야기하며, 특히 영양소 중단, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(Biogenic amine) 처리를 통한 자가 포식(Autophagy) 유도 방법을 모두 혼합한 자가 포식 유도 방법을 통해 수득된 엑소좀은 수율을 크게 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 인체 피부 아세포에서의 세포 상처 치유 효과 및 세포 증식력 향상 효과를 부여하여 높은 유효성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장품 또는 의약품에 관한 것이다.

상기 방법으로 수득된 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔,시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<제조예 1> 자가 포식(Autophagy) 유도 방법을 통한 자가 포식 유도물 제조

인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs)는 성인의 지방조직으로부터 수득할 수 있는 줄기세포로서, 신체의 다양한 세포로의 분화할 수 있는 다능성 세포(Multipotent cell)이다. 또 다른 줄기세포인 배아줄기세포는 모든 조직으로의 분화할 수 있는 장점이 있지만 윤리적 문제로 인한 사용이 제한적이다. 그러나, 인체 지방 유래 줄기세포는 이미 성장한 성체로부터 분리하기 때문에 윤리적 논쟁을 피할 수 있으며, 다른 성체 줄기세포에 비하여 쉽게 획득 및 다량의 세포를 확보할 수 있다는 장점이 있다.

본 실시예에서는 인체 지방 조직을 수득하여 이로부터 직접 분리한 줄기세포에서의 엑소좀을 분리 및 추출 수율을 증대하는 방안으로 자가 포식 유도 방법을 활용하였으며, 자가 포식 유도 방법을 통한 자가 포식 유도물의 제조방법은 아래의 표 1과 같다.

<자가 포식 유도물 제조>

1. 영양소 중단: 무 혈청 배지(Serum free medium)를 이용한 영양소 공급 차단으로, 기본 세포 배양 배지(DMEM/F12) 중 아미노산을 제외한 당류 및 비타민 무기질류만 포함하는 성분을 제공하여 자가 포식 유도물을 제조하였다.

2. 삼투압 조절: 삼투압 조절을 통해 당을 이용하여 삼투압을 증가시키는 것으로, 당 성분인 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스 Sucrose)를 1:3:1로 혼합하여 삼투압 조절을 유도하여 자가 포식 유도물을 제조하였다.

3. 바이오제닉아민기(BA): 막걸리의 발효 산물 중 하나인 바이오제닉아민기(Biogenic amine)를 고온/고압 멸균을 통해 멸균하여 자가 포식 유도물을 제조하였다.

4. 자가 포식 유도(3종) 혼합: 상기 영양소 중단, 삼투압 조절 및 바이오제닉아민기(BA)의 자가 포식 유도 방법은 영양소 중단인 무 혈청 배양액에 삼투압 조절 성분 혼합물 및 바이오제닉아민기 성분을 각각 1:1 비율로 혼합하여 자가 포식 유도물을 제조하였다.

시료명	자가 포식 유도물
실시예 1	영양소 중단(Serum starvation)
실시예 2	삼투압 조절(트레할로오스:만노스:수크로오스 1:3:1)
실시예 3	바이오제닉아민기(BA) 막걸리 발효 산물
실시예 4	자가 포식 유도 방법 3종 혼합 (무 혈청 배양액+삼투압 조절 성분 혼합물:바이오제닉아민기 성분 1:1) 영양소 중단(Serum starcation) + 삼투압 조절(트레할로오스:만노스:수크로오스 1:3:1) + 바이오제닉아민기(BA) 막걸리 발효 산물

<제조예 2> 자가 포식(Autophagy)으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells) 유래의 엑소좀(Exosome)의 제조

인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs) 유래의 엑소좀을 제조하기 위한 방법은 도 1과 같다. 먼저, 자가 포식(Autophagy)으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포를 passage 4까지 배양하고, 자가 포식으로 인한 엑소좀의 수율 변화를 확인하고자 상기 제조예 1에서 수득한 자가 포식 유도물을 시간별(6, 12, 24, 48, 72시간)로 10%의 농도로 처리(영양소 공급 차단의 경우, 무 혈청 배지로 변경)하여 추가로 배양하였다. 상기 자가 포식 유도물을 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에 48시간 동안 처리한 후 세포 형태 변화는 도 2와 같다. 아래의 표 2는 각각의 자가 포식 유도물을 최적의 농도로 처리하여 제조된 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 나타낸 것이다.

시료명	자가 포식 유도물	농도%
실시예 1	영양소 중단(Serum starvation)	-
실시예 2	삼투압 조절(트레할로오스:만노스:수크로오스 1:3:1)	10~20
실시예 3	바이오제닉아민기(BA) 막걸리 발효 산물	10
실시예 4	자가 포식 유도 방법 3종 혼합 영양소 중단(Serum starcation) + 삼투압 조절(트레할로오스:만노스:수크로오스 1:3:1) + 바이오제닉아민기(BA) 막걸리 발효 산물	10

이후, PBS buffer로 세포를 두 번 washing 하고 Triple express 시약을 사용하여 세포를 떼어내고 원심분리기를 이용하여 1,500g, 5분 조건에서 세포를 침전시켰다. 침전 후, 세포를 제외한 배양액의 상등액만을 수득하여 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000g로 30분, 4℃에서 원심분리 후, 상등액만을 취하여 잔여 세포 및 이물질 등을 분리 및 제거하였다. 이후, 얻은 각각의 상등액을 0.22㎛ 바틀 탑 필터(Bottle top filter)를 사용하여 추가 잔여물들을 제거하였다. 필터된 각각의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000g, 70분 동안 원심분리하여 1차 엑소좀 펠렛을 수득하고, 펠렛층을 제외한 상등액을 다시 120,000g에서 90분 간 초고속 원심분리를 수행하여 추가적으로 2차 엑소좀 펠렛을 회수하였다. 이후, 1~2차로 확보한 펠렛에 PBS를 첨가하고 피펫 및 볼텍스를 이용하여 재 부유시켜 각각의 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포에서의 엑소좀 조성물을 제조하였다.

<실험예 1> 자가 포식으로 유도된 인체 유래 줄기세포 유래의 엑소좀 조성물의 수율 증대 효과 분석

상기 제조예 2에서 수득한 자가 포식으로 유도된 인체 유래 줄기세포 유래의 엑소좀 조성물의 정량적 및 분자 생물학적 평가를 하기 위해 일반적으로 사용되고 있는 브래드 포드 방법을 통해 단백질 농도를 측정하였으며, 브래드 포드 실험 방법은 바이오래드 BioRad) 사 제품에서 제공하는 절차에 따라 실시하였다. 상기 실시예 2로부터 수득된 엑소좀 조성물 40μL와 브래드 포드 시약 160μL을 96-웰 플레이트에서 혼합한 후, 호일로 빛을 차단한 상태에서 5분 간 반응시켰다. 이후, Microplate reader 장비를 이용하여 595nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 통한 단백질의 농도는 시약과 함께 제공된 BSA(Bovine serum albumin) 으로 표준 곡선(Standard curve)를 통해 분석하였다.

또한, 상기 제조예 2로부터 수득된 엑소좀 조성물의 정량(입자 크기, 입자 수) 분석은 나노 입자 추적 분석기(Nano Tracking Analyzer; NTA, Zetaview TWIN, Particle Metrix)를 이용하여 측정하였으며, 본 기기의 분석 프로그램인 ZetaView software을 이용하여 분석을 수행하였다.

시료명	평균 입자 크기	NTA 분석(Particle/mL)	Protein(μg/mL)
실시예 1	100.2	4.89x10⁸	97.12
실시예 2	104.6	1.15x10⁹	153.34
실시예 3	167.0	1.18x10⁹	188.53
실시예 4	143.2	1.53x10⁹	214.68

그 결과, 표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, 일반적인 자가 포식 유도 방법(영양소 중단)인 실시예 1 대비 실시예 2 내지 4의 입자 수가 각각 약 2.35, 2.41, 3.13배 증가하였고, 단백질 농도가 약 1.58, 1.94, 2.21배 증가한 것을 확인하였다. 실시예 3 및 4의 경우 실시예 1 및 2와 비교하여 엑소좀의 평균 입자 크기가 다소 높지만, 일반적으로 인식되고 있는 엑소좀의 크기인 50~200nm의 범위 내에 존재하기 때문에 고순도의 엑소좀을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다.

또한, 상기 자가 포식 유도 방법을 통한 인체 지방 유래 줄기세포에서의 세포 형태 변화 및 시간별, 엑소좀 수율의 변화를 확인하기 위하여, 상기 제조예 2에서 자가 포식 유도물을 10%의 동일한 농도 조건 하에서 48시간 처리한 세포 형태 변화 분석과 시간별(6, 12, 24, 48, 72시간)로 분리된 엑소좀의 입자 수를 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 인체 지방 유래 줄기세포의 세포 형태 변화의 경우, 대조군(PBS) 대비 실시예 1인 영양소 중단(무 혈청 배지) 및 실시예 2인 삼투압 조절을 통한 인체 지방 유래 줄기세포의 세포 형태는 크게 변하지 않았다. 그러나, 실시예 3인 막걸리 발효 산물인 바이오제닉아민기 처리 및 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합의 경우에는 세포의 형태가 크게 변한 것을 확인하였다.

이러한 결과는 실시예 3인 막걸리 발효 산물인 바이오제닉아민기 처리 및 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합물이 세포에 더 큰 영향을 끼치는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 4의 나노 입자 추적 분석기(NTA)를 통한 시간별 수율 변화에서도 확인할 수 있듯이, 시간별 입자 수의 변화는 모든 시간대에서 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합물을 처리한 군에서의 엑소좀 수율이 증가하였으며, 자가 포식을 유도한 모든 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀의 수율은 처리 후, 48시간에 가장 높게 나타났으며 그 이후 감소하는 것을 확인하였다.

결론적으로, 인체 유래 줄기세포에 자가 포식 유도 방법을 적용하였을 경우 엑소좀의 분리/추출 수율을 증대시키며, 특히, 자가 포식 유도 3종 혼합물을 통한 자가 포식 유도는 고수율의 엑소좀을 얻을 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 자가 포식 유도 시 가장 적절한 배양 시간은 48시간으로 상기 범위를 벗어나게 되면 독소 생성을 유발하여 세포 사멸 유도 및 오염의 위험성을 초래하기 때문에 바람직하지 않다는 것을 확인하였다.

<실험예 2> 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포의 세포 생존능 분석

인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs)를 96-웰 플레이트에 5 x 10⁴ cells/well씩 분주하여 배양한 후, 상기 제조예 1로부터 수득된 자가 포식 유도물을 10%의 농도로 처리한 후, 48시간 동안 추가 배양하였다. 이후, EZ-Cytox(WST-1, Dogendo Molecular Technologies Inc.) 시약이 10% 농도로 첨가된 새로운 세포 배양 배지로 교체하고 2시간 동안 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 흡광도는 Microplate reader(BioTek Instruments, Inc.) 기기를 사용하여 450nm의 파장에서 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS) 대비 실시예 1 내지 4의 세포 생존능이 현저히 감소된 것을 확인하였다. 구체적으로 실시예 1인 영양소 중단(무 혈청 배지)의 경우 91.65%로 나타났으며, 실시예 2인 삼투압 조절, 실시예 3인 막걸리 발효 산물인 바이오제닉아민기 처리 및 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합물에서의 세포 생존능은 각각 74.48, 63.90 및 54.02%로 확인하였다.

결론적으로, 자가 포식 유도는 인체 지방 유래 줄기세포의 세포 생존능에 영향을 미치며, 특히 실시예 1~3 대비 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합물의 처리가 세포 생존능을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.

<실험예 3> 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포에서의 자가 포식 관련 마이오 마커 분석

인체 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs)를 6-웰 플레이트에 5 x 10⁵ cells/well씩 분주하여 배양한 후, 상기 제조예 1로부터 수득된 자가 포식 유도물을 10% 농도로 처리한 후, 48시간 동안 추가 배양하였다. 이후, Trizol(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 이용하여 세포의 RNA를 분리하고 나노 드롭(Nano Drop™ 2000/2000c Spectrophotometer; Thermo Fisher scientific) 장비를 이용하여 260nm/280nm의 파장을 통해 분리된 RNA의 순도를 분석하였다. 이후, ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)를 활용하여 cDNA를 제작하였다. 각 cDNA(30ng)는 2X DyeMIX-Tenuto kit(Enzynomics)를 활용하여 RT-PCR(Reverse transcription-PCR)을 진행하였다. 이때, 사용한 프라이머의 정보는 다음과 같다.

서열번호 1 : PLK-1 Forward 5'- AACACGCCTCATCCTCTACAAT-3'

서열번호 2 : PLK-1 Reverse 5'- AGGAGGGTGATCTTCTTCATCA-3'

서열번호 3 : LC3-II Forward 5'- GAGAAGCAGCTTCCTGTTCTGG-3'

서열번호 4 : LC3-II Reverse 5'- GTGTCCGTTCACCAACAGGAAG-3'

서열번호 5 : p62 Forward 5'- TGCCCAGACTACGACTTGTG-3'

서열번호 6 : p62 Reverse 5'- AGTGTCCGTGTTTCACCTTCC-3'

서열번호 7 : GAPDH Forward 5'- GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'

서열번호 8 : GAPDH Reverse 5'- ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'

PCR 증폭은 1% 아가로오스 겔(Agarose-gel)을 사용하여 전기영동으로 확인하였다. RNA 발현 Band의 밀도 차이는 Image J program을 이용하여 그래프로 분석하였다.

상기 실험예 2에서 확인된 바와 같이, 인체 지방 유래 줄기세포가 자가 포식 유도에 의해 세포 생존능이 감소되었던 바와 같이, 이러한 세포 생존능 감소가 자가 포식 유도에 영향을 미치는 지에 대하여 확인하기 위해 자가 포식 관련 바이오 마커들 중, LC3-II, PKL-1 및 p62의 RNA 발현 변화를 확인하였다. 자가 포식이 유도되었을 때의 LC3-II의 RNA 발현은 증가하며, 이와는 반대로 PKL-1 및 p62의 RNA 발현은 감소한다는 보고가 있다.

그 결과, 도 6~7에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS) 대비 자가 포식 바이오 마커 LC3-II의 RNA 발현은 실시예 1~4와 같이 자가 포식을 유도했을 경우에 증가하였으며, 특히, 대조군(PBS) 대비 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합물을 10% 처리한 경우 3.04배 증가하였다. 또한, 자가 포식 바이오 마커인 PKL-1 및 p62의 RNA 발현은 자가 포식을 유도했을 경우에 감소하는 것으로 나타났으며, 특히, 대조군(PBS) 대비 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합물을 10% 처리한 경우 각각 2.48 및 3.08배 감소하였다.

결론적으로, 상기 자가 포식 유도물은 인체 지방 유래 줄기세포의 자가 포식능을 활성화시키며, 특히, 실시예 1~3 대비 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합물의 처리는 세포의 상당한 자가 포식을 유도하는 것을 확인하였다.

<실험예 4> 자가 포식이 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀 조성물의 인체 피부 섬유 아세포 상처 치유 효과 분석

상기 제조예 2에서 수득한 자가 포식을 유도한 인체 유래 줄기 세포 유래의 엑소좀 조성물이 인체의 피부에 미치는 영향을 조사하기 위해, 인체 피부 섬유 아세포(HDF cells)를 24-웰 플레이트에 1 x 10⁵ cells/well씩 분주하여 배양한 후, 200μL 피펫팁을 이용하여 세포에 상처를 낸 후, 상기 제조예 2로부터 수득된 엑소좀 조성물을 10μg/mL의 농도로 세포 배양 배지에 처리한 후, 48시간 동안 추가 배양하여, 상처 치유에 미치는 영향을 관찰하였다. 대조군은 상기 배지와 동일한 배지에 PBS를 처리하여 24시간 동안 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후, 현미경을 이용하여 상처 부위의 세포 이동을 통한 회복 속도의 차이를 관찰하였으며, 정량적인 분석을 위해 Image J 프로그램을 사용하여 상처 부위의 비어있는 면적을 계산하여 그래프로 나타내었다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS) 대비 자가 포식 유도를 하지 않은 군(10% FBS 첨가)의 상처 치유 효과는 미미하게 증가되었다. 그러나, 자가 포식을 유도한 인체 지방 유래 줄기세포 엑소좀 조성물의 처리는 상처 치유 효과가 나타났다. 특히, 실시예 3인 막걸리 발효 산물인 바이오제닉아민기 및 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합으로 분리한 엑소좀 조성물의 경우, 상당한 상처 치유 효과를 확인하였다.

결론적으로, 자가 포식이 유도된 인체 지방 유래 줄기세포에서 분리된 엑소좀 조성물은 피부 세포의 상처 치유 능력을 증가 시키며, 특히, 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합으로 분리한 엑소좀 조성물의 경우, 상처 치유 능력을 극대화시키는 것을 확인하였다.

<실험예 5> 자가 포식이 유도된 인체 유래 줄기세포 유래의 엑소좀 조성물의 인체 피부 섬유 아세포의 세포 증식력 증대 효과 분석

상기 제조예 2에서 수득한 자가 포식이 유도된 인체 유래 줄기세포 유래의 엑소좀 조성물이 인체 피부 세포의 증식력에 미치는 영향을 평가하기 위하여 인체 피부 섬유 아세포(HDF cells)를 96-웰 플레이트에 5 x10⁴ cells/well씩 분주하여 배양하고, 상기 제조예 2로부터 수득된 엑소좀 조성물을 10μg/mL로 동일하게 처리한 후, 48시간 동안 추가 배양하였다. 이후, Cell counting kit-8(CCK-8, Dogendo Molecular Technologies Inc.) 시약을 10% 농도로 첨가된 새로운 세포 배양 배지로 교체하고 2시간 동안 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 흡광도는 Microplate reader(BioTek Instruments, Inc.) 기기를 사용하여 450nm의 파장에서 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS) 대비 자가 포식이 유도된 모든 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀 조성물을 인체 피부 섬유 아세포에 처리하였을 경우, 인체 피부 아세포(HDF cells)의 증식 속도가 증가됨을 확인하였다. 특히, 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합으로 분리한 엑소좀을 처리한 경우, 대조군(PBS) 대비 세포 증식력이 약 32% 정도의 향상된 효과를 확인하였다.

결론적으로, 자가 포식을 유도한 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀은 인체 피부 세포의 증식력을 증가시키며, 특히, 실시예 4인 자가 포식 유도 3종 혼합으로 분리한 엑소좀 조성물의 경우, 현저하게 피부 세포 증식을 촉진하는 것으로 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> GFC Life Science Co., Ltd. Kolmar Korea Co., Ltd. <120> Composition comprising an exosome derived from Human adipose-derived stem cells induced from autophagy <130> p20237 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK-1 Forward <400> 1 aacacgcctc atcctctaca at 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK-1 Reverse <400> 2 aggagggtga tcttcttcat ca 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC3-II Forward <400> 3 gagaagcagc ttcctgttct gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC3-II Reverse <400> 4 gtgtccgttc accaacagga ag 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p62 Forward <400> 5 tgcccagact acgacttgtg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p62 Reverse <400> 6 agtgtccgtg tttcaccttc c 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward <400> 7 gtctcctctg acttcaacag cg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse <400> 8 accaccctgt tgctgtagcc aa 22

Claims

(a)자가 포식(Autophagy) 유도 방법을 통해 자가 포식 유도물을 제조하는 단계;
(b)상기 자가 포식 유도물을 인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs) 배양액에 처리하여 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 제조하는 단계; 및
(c)자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법에 있어서,
자가 포식(Autophagy) 유도 방법은
1. 영양소 중단: 무 혈청 배지(Serum free medium)를 이용한 영양소 공급 차단으로, 기본 세포 배양 배지(DMEM/F12) 중 아미노산을 제외한 당류 및 비타민 무기질류만 포함하는 성분을 제공하여 자가 포식 유도물을 제조
2. 삼투압 조절: 삼투압 조절을 통해 당을 이용하여 삼투압을 증가시키는 것으로, 당 성분인 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스 Sucrose)를 1:3:1 중량비로 혼합하여 삼투압 조절을 유도하여 자가 포식 유도물을 제조
3. 막걸리 발효 산물 처리: 막걸리의 발효 산물을 고온/고압 멸균을 통해 멸균하여 자가 포식 유도물을 제조; 및
4. 자가 포식 유도(3종) 혼합: 상기 영양소 중단, 삼투압 조절 및 막걸리 발효 산물 처리의 자가 포식 유도 방법은 영양소 중단인 무 혈청 배양액에 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스 Sucrose)가 1:3:1 중량비로 함유된 삼투압 조절 성분 혼합물 및 막걸리 발효 산물을 각각 1:1 부피비 비율로 혼합하여 자가 포식 유도물을 제조
로 구성된 방법에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 처리는 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에 자가 포식 유도물을 10 내지 20부피%의 농도로 처리하여 24 내지 48시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는,
(a)인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 배양액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질 등을 분리 및 제거하는 단계;
(b)배양액의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 상등액 만을 취하여 죽은 세포 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계;
(c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계;
(d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계;
(e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및
(f) 1차 및 2차 펠렛층을 PBS에 재부유시켜 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 조성물의 제조방법으로부터 수득된 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 화장료 조성물.
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제9항의 조성물을 포함하는 화장품.
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(a)자가 포식(Autophagy) 유도 방법을 통해 자가 포식 유도물을 제조하는 단계;
(b)상기 자가 포식 유도물을 인체 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ASCs) 배양액에 처리하여 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 제조하는 단계; 및
(c)자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 약학 조성물의 제조방법에 있어서,
자가 포식(Autophagy) 유도 방법은
1. 영양소 중단: 무 혈청 배지(Serum free medium)를 이용한 영양소 공급 차단으로, 기본 세포 배양 배지(DMEM/F12) 중 아미노산을 제외한 당류 및 비타민 무기질류만 포함하는 성분을 제공하여 자가 포식 유도물을 제조
2. 삼투압 조절: 삼투압 조절을 통해 당을 이용하여 삼투압을 증가시키는 것으로, 당 성분인 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스 Sucrose)를 1:3:1 중량비로 혼합하여 삼투압 조절을 유도하여 자가 포식 유도물을 제조
3. 막걸리 발효 산물 처리: 막걸리의 발효 산물을 고온/고압 멸균을 통해 멸균하여 자가 포식 유도물을 제조; 및
4. 자가 포식 유도(3종) 혼합: 상기 영양소 중단, 삼투압 조절 및 막걸리 발효 산물 처리의 자가 포식 유도 방법은 영양소 중단인 무 혈청 배양액에 트레할로오스(Trehalose), 만노스(Mannose) 및 수크로오스 Sucrose)가 1:3:1 중량비로 함유된 삼투압 조절 성분 혼합물 및 막걸리의 발효 산물을 각각 1:1 부피비 비율로 혼합하여 자가 포식 유도물을 제조
로 구성된 방법에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 약학 조성물의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 처리는 인체 지방 유래 줄기세포 배양액에 자가 포식 유도물을 10 내지 20부피%의 농도로 처리하여 24 내지 48시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 약학 조성물의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는,
(a)인체 지방 유래 줄기세포 배양액을 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 배양액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질 등을 분리 및 제거하는 단계;
(b)배양액의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 상등액 만을 취하여 죽은 세포 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계;
(c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계;
(d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계;
(e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및
(f) 1차 및 2차 펠렛층을 PBS에 재부유시켜 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 약학 조성물의 제조방법.
제14항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 조성물의 제조방법으로부터 수득된 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 세포 상처 치유 효능 및 세포 재생능을 갖는 약학 조성물.
제17항의 조성물을 포함하는 의약품.