KR102002527B1

KR102002527B1 - 폴리페놀을 이용한 엑소좀의 분리

Info

Publication number: KR102002527B1
Application number: KR1020170112835A
Authority: KR
Inventors: 김필남; 장민정
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2017-09-04
Publication date: 2019-07-22
Also published as: KR20190026285A

Abstract

본 발명은 폴리페놀을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물 및 이를 이용하여 엑소좀을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물 및 방법으로 엑소좀을 추출하는 경우 종래의 추출방법과는 달리 크기가 큰 엑소좀을 포함하는 응집체를 간단한 방법으로 얻을 수 있다.

Description

폴리페놀을 이용한 엑소좀의 분리 {Isolation of exosomes using polyphenol}

본 발명은 폴리페놀을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 폴리페놀기를 포함하는 물질을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물 및 폴리페놀을 이용하여 엑소좀을 추출하는 방법에 관한 것이다.

엑소좀 (Exosome)은 작은 소낭구조를 이루며 표면단백질, 내부단백질, mRNA, miRNA등의 정보를 담고 있어, 바이오마커로서 이점이 있는 것으로 알려져 있으며, 엑소좀은 모든 세포 유형에서 분비되어 혈액, 타액, 소변 및 모유에서 형태를 유지하는 것으로 알려져 있어, 최근 엑소좀은 질병진단을 위한 새로운 바이오마커로서 대두되고 있다.

엑소좀 (Exosome)은 작은 크기 (~100 nm)로 존재하고 있기 때문에 분리하기가 어렵고, 기존의 엑소좀 분리방법인 초고속원심분리기 (100,000~120,000 g)를 이용한 방법, 항원항체반응을 이용한 방법 등은 고비용이 소요되고, 다양한 단계를 거쳐 수행되어야 하므로 추출 과정에서 긴 시간이 소요되며, 고도의 숙련도 및 전문성을 요구하는 문제가 있었고, 상용화된 kit를 이용하여 엑소좀을 분리하는 방법은 PEG를 이용하여 엑소좀을 분리하는 기술로서, 고비용이 소요되는 문제가 있었다.

엑소좀 분리기술을 활용하여 분리한 엑소좀을 이용하여 단백질, mRNA, miRNA등의 바이오마커를 활용한 질병진단용 마이크로 플랫폼, 진단센서 등에 적용하여 연구를 진행할 수 있고, 체액에 존재하는 소량의 엑소좀을 검출하여 질병진단 장비의 제작 및 비침습적 액체생검검사 (liquid biopsy)를 통한 엑소좀 진단법 개발에 적용이 가능할 것으로 예상된다.

따라서, 엑소좀을 보다 쉽고 간단하게 추출하는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 하나의 목적은 폴리페놀을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 세포 외부로 분비되는 상층액을 수집하는 제1단계; 및 상기 수집한 상층액에 폴리페놀을 첨가하여 반응시키는 제2단계를 포함하는 폴리페놀을 이용하여 엑소좀을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 세포 외부로 분비되는 상층액을 수집하는 제1단계; 상기 수집한 상층액에 폴리페놀을 첨가하여 반응시키는 제2단계; 및 상기 제2단계에서 제조된 산물을 필터를 이용하여 거르는 제3단계를 포함하는, 폴리페놀을 이용하여 추출한 엑소좀을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

엑소좀은 세포에서 분비되는 50~150 nm 크기의 작은 소낭 (vesicle)으로, 단백질, mRNA, miRNA 등의 정보를 담고 있는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 작은 소낭 구조를 이루며 표면단백질, 내부단백질, mRNA, miRNA 등의 정보를 담고 있어, 바이오마커로서 이점이 있다. 또한 엑소좀은 모든 유형의 세포에서 분비되며, 혈액, 타액, 소변 및 모유에서 자연적으로 형성되는 것으로 알려져 있어, 질병진단을 위한 새로운 바이오마커로 대두되고 있다.

본 발명의 일 양태는 폴리페놀을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 세포 외부로 분비되는 상층액을 수집하는 제1단계; 및 상기 수집한 상층액에 폴리페놀을 첨가하여 반응시키는 제2단계를 포함하는 폴리페놀을 이용하여 엑소좀을 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 원리는 도 1의 모식도와 같이 나타낼 수 있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명은 엑소좀과 폴리페놀기가 반응하여 엑소좀의 응집체를 형성하는 기술에 관한 것이다(도 1의 a 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서는 엑소좀을 분리하기 위해서 폴리페놀의 일종인 EGCG를 이용하여, 상기 EGCG가 엑소좀과 반응하여 EGCG-엑소좀 또는 폴리페놀-엑소좀 복합체를 형성함을 확인하였다 (도 1의 b). 상기 폴리페놀 복합체는 수용액상에 녹지 않는 응집체 (aggregate)를 형성하게 되고, 상기 응집체는 크기가 커짐에 따라 상대적으로 낮은 원심력 (~ 3,000 rpm)에서도 바닥에 가라앉을 수 있으므로, 본 발명의 방법을 이용하면 저원심력(~ 3,000 rpm)으로도 엑소좀의 분리가 가능할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 세포 외부로 분비되는 상층액을 수집하는 제1단계;

상기 수집한 상층액에 폴리페놀을 첨가하여 반응시키는 제2단계; 및

상기 제2단계에서 제조된 산물을 필터를 이용하여 거르는 제3단계를 포함하는,

폴리페놀을 이용하여 추출한 엑소좀을 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 폴리페놀을 이용하여 추출한 엑소좀을 필터링하는 방법에 관한 원리는 도 7의 모식도에 나타나 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 폴리페놀의 일종인 EGCG를 이용하여 형성한 폴리페놀-엑소좀 복합체를 이용하여 원심분리없이 필터링하여 엑소좀을 추출할 수 있음을 확인하였다 (도 8).

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 폴리페놀을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 상기 폴리페놀은 EGCG (Epigallocatechin gallate), 갈릭산, 카테킨류 (catechin, catechin-3-gallate, gallocatechin, gallocatechin-3-gallate, Catechin gallate, Epicatechin, Gallocatechin gallate, Epigallocatechin), 또는 탄닌산 등 일 수 있으며, 바람직하게는 EGCG (에피갈로카테킨 갈레이트, Epigallocatechin gallate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 '폴리페놀'은 우리 몸에 있는 활성산소(유해산소)를 해가 없는 물질로 바꿔주는 항산화 물질 중 하나로 알려져 있고, 폴리페놀은 활성산소에 노출되어 손상되는 DNA의 보호나 세포구성 단백질 및 효소를 보호하는 항산화 능력이 커서 다양한 질병에 대한 위험도를 낮춘다고 보고되고 있으며. 폴리페놀은 항암작용과 함께 심장질환을 막아주는 역할을 하는 것으로도 알려져 있다.

본 발명의 일실시예에서 폴리페놀의 일종으로 사용한 EGCG는 녹차엽으로부터 추출되는 물질로서, 강력한 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 엑소좀을 추출하기 위한 조성물에서 폴리페놀의 농도는 전제 조성물의부피에 대해 0.1 내지 10 mg/mL일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서 사용한 EGCG를 이용하는 경우 EGCG의 농도는 전체 조성물의 부피에 대해 0.1 내지 10 mg/mL일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 2 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리페놀은 엑소좀과 복합체를 형성하는 것일 수 있고, 상기 엑소좀과 결합된 복합체는 주변 엑소좀과 결합하여 응집체 (Aggregate)를 형성할 수 있으며, 상기 응집체는 수용액상에 녹지 않는 성질이 있어서, 원심분리시 바닥에 가라앉을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 폴리페놀의 일종으로 사용한 EGCG는 엑소좀과 복합체를 형성하고, 상기 엑소좀과 결합된 복합체는 주변 엑소좀과 결합하여 응집체를 형성함을 현미경을 통해 관찰하였고 (도 1 c, d), 상기 응집체가 모여서 점점 크기가 커지면, 3,000 rpm 이하의 낮은 원심력에서도 쉽게 바닥에 가라앉을 수 있음을 확인하였다. 본 발명에서, EGCG와 같은 폴리페놀은 엑소좀과 결합하여 복합체를 형성하는 과정에서 엑소좀, 인지질 이중층 (Phospholipid bilayer) 뿐 아니라 다양한 단백질과 반응하여 복합체를 형성하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시에에서는 폴리페놀을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물을 이용하여 엑소좀이 추출되었는지 여부를 원심분리를 이용하여 바닥에 가라앉았는지 여부로 확인 (도 3 상단)하였고, 상기 추출한 엑소좀에서 엑소좀 추출의 효율을 확인하기 위해서 추출한 엑소좀 응집체에서 RNA를 추출하여 그 양을 확인하였다 (도 3 하단).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 세포 외부로 분비되는 상층액을 수집하는 제1단계; 및

상기 수집한 상층액에 폴리페놀을 첨가하여 반응시키는 제2단계를 포함하는,

폴리페놀을 이용하여 엑소좀을 추출하는 방법에 관한 것이며, 상기 제2단계 이후에 상기 제2단계에서 제조된 산물을 원심분리하여 침전물을 얻는 제3단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 폴리페놀은 EGCG (Epigallocatechin gallate), 갈릭산, 카테킨류 (catechin, catechin-3-gallate, gallocatechin, gallocatechin-3-gallate, Catechin gallate, Epicatechin, Gallocatechin gallate, Epigallocatechin), 또는 탄닌산 등 일 수 있으며, 바람직하게는 EGCG (에피갈로카테킨 갈레이트, Epigallocatechin gallate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제1단계에서 원심분리는 세포 또는 세포 배양물로부터 상층액을 수집할 수 있는 회전속도 (분당회전수, rpm)와 시간을 공지의 기술에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있으나, 본 발명에 따르면 종래의 100,000 내지 120,000 rpm을 사용하는 초고속원심분리방법을 사용하지 않고, 상대적으로 낮은 회전속도 및/또는 시간에서 원심분리를 수행하여도 엑소좀의 분리가 가능하다. 예를 들어, 원심분리는 2000 내지 16000 rpm으로 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 3000 rpm으로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 1단계의 원심분리는 2000 내지 16,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 세포 배양액의 세포찌꺼기 (cell debris)가 제거된 상층액 (supernatant)을 얻는 과정으로 수행할 수 있고, 상기 원심분리에 의해서 세포 배양시 발생한 세포 찌꺼기들을 제거하는 효과가 있다.

상기 제1단계에서 세포는 상기 세포는 인간을 포함한 포유 동물 혹은 식물에서 유래한 (분리된) 조직, 세포를 의미할 수 있으며, 상기 포유 동물은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유 동물을 의미하고, 바람직하게는 토끼, 개, 원숭이, 말, 고양이, 염소, 마우스, 래트, 돼지 또는 인간을 의미할 수 있으며, 상기 포유 동물의 세포는 체세포, 생식세포, 또는 암세포일 수 있으며, 상기 식물은 옥수수, 벼, 목화, 밀 등을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 제1단계에서 세포는 섬유아세포 (fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 성상교세포 (astrocyte) 혈액세포, 신경 줄기세포, 조혈모 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제1단계에서 세포 배양물은 혈청을 넣지 않은 배양액, 혈청을 넣은 배양액, 또는 엑소좀을 제거한 혈청을 넣은 배양액에서 세포를 배양하여 얻은 것일 수 있으며, 상기 세포 배양물에는 세포에 분비된 엑소좀이 존재할 수 있다.

상기 혈청을 넣지 않은 배양액을 사용하는 경우, 분석의 오차를 줄여 엑소좀 검출효율을 높일 수 있다.

상기 제2단계에서 수집한 상층액에 첨가하는 폴리페놀의 농도는 0.1 내지 10 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에서 상기 제2단계에서 EGCG를 사용할 수 있고, 이 경우 원심분리하여 세포찌꺼기가 제거된 전체 상층액의 부피에 대해 상기 EGCG를 0.1 내지 10 mg/mL를 사용할 수 있고, 바람직하게는 1 내지 2 mg/mL를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 방법을 이용하여 폴리페놀로 엑소좀을 추출하는 경우, 상용화된 키트를 이용하여 엑소좀을 추출하는 경우에 비해서 엑소좀 추출의 효율이 현저하게 높음을 확인하였다 (도 5).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 엑소좀을 추출하기 위한 방법을 사용하여 추출한 엑소좀에 관한 것이다. 상기 엑소좀은 수용액상에 녹지 않는 응집체를 형성하는 것일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 세포 외부로 분비되는 상층액을 수집하는 제1단계;

상기 제2단계의 반응에 의해서 폴리페놀은 엑소좀과 복합체를 형성할 수 있고, 상기 엑소좀과 결합된 복합체는 주변 엑소좀과 결합하여 응집체 (Aggregate)를 형성할 수 있으며, 상기 응집체는 수용액상에 녹지 않는 성질이 있어서 원심분리를 하지 않고 필터를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 폴리페놀의 일종인 EGCG를 이용하여 형성한 폴리페놀-엑소좀 복합체는 EGCG를 넣기 전에 비해서 현저하게 크기가 증가함을 확인하였고 (실시예 5-3), 상기 크기가 증가한 폴리페놀-엑소좀 복합체를 원심분리없이 필터링하여 엑소좀을 수득하는 경우, 원심분리하여 수득하는 경우에 비해서 소량의 샘플, 저농도에서도 효율적이게 엑소좀 응집체를 수득할 수 있음을 확인하였다 (실시예 5-4).

상기 제3단계에서 사용하는 필터의 구멍 (pore) 크기는 180 내지 600 nm일 수 있고, 바람직하게는 200 내지 500 nm일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 폴리페놀을 유효성분으로 포함하는 엑소좀을 추출하기 위한 조성물 및 폴리페놀을 이용하여 엑소좀을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물 및 방법으로 추출한 엑소좀은 질병진단을 위한 새로운 바이오마커로서 활용이 가능하다.

도 1의 a는 본 발명의 실시예에 따라서 EGCG에 의한 엑소좀 응집체의 형성을 나타내는 그림이고, 도 1의 b는 본 발명의 실시예에 따라 EGCG의 처리 유무에 따른 엑소좀의 추출 차이를 확인한 그림이고, 도 1의 c, 및 d는 본 발명의 실시예에 따라 전자현미경 (각각 SEM 및 TEM)을 사용하여 EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체의 구조를 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 2은 본 발명의 실시예에 따라서 EGCG에 의한 엑소좀 응집체를 형성하는 방법을 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 EGCG 용액의 농도에 따른 엑소좀 응집체 형성의 효율을 확인한 것으로, 도 5의 상단은 추출한 엑소좀 응집체의 이미지이고, 도 5의 하단은 추출한 엑소좀 응집체에서 전체 RNA를 추출하고, 그 농도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 4은 본 발명의 실시예에 따라 폴리페놀기를 포함한 다른 물질들을 이용하여 엑소좀을 추출한 결과를 나타낸다.
도 5은 본 발명의 실시예에 따라 EGCG에 의해서 추출한 엑소좀 응집체와 상용화된 키트를 사용하여 추출한 엑소좀의 추출효율을 시각적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 EGCG에 의해서 추출한 엑소좀 응집체와 상용화된 키트를 사용하여 추출한 엑소좀의 추출효율을 수치적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 필터를 이용한 엑소좀 응집체 추출방법을 모식화한 그림이다.
도 8의 상단은 본 발명의 실시예에 따라 필터를 이용하여 추출하기 전 엑소좀 응집체의 크기 분석한 결과, 하단은 본 발명의 실시예에 따라 필터를 이용하여 추출한 후 필터에 존재하는 엑소좀 응집체를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 발명의 실시예에 따라 필터를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체의 추출효율을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. EGCG를 이용한 엑소좀의 추출 방법

위암세포인 AGS (ATCC)를 세포 배양 디쉬에서 세포의 일반적인 배양방법을 사용하여 2일간 배양했다. 세포 배양 배지는 10% (v/v) Fetal bovine serum (FBS, Welgene, 한국) 및 1% (v/v) Penicillin/streptomycin (P/S, Welgene, 한국)의 RPMI1640 배지 (Welgene, 한국)를 사용하였다. 상기 배양한 AGS가 세포 배양 디쉬 바닥 면적의 약 80~90%정도 채워질 때까지, 상기 배지에서 FBS를 제외한 배지로 교체하여 2일간 배양했다. 상기 배양 후에, cell debris (세포 찌꺼기)등을 제거하기 위해서 상기 FBS를 제외한 배지를 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 세포찌꺼기가 제거된 상층액 (supernatant) (이하 Conditioned media, 조건 배지)을 얻었다.상기 상층액에 녹차추출물인 1 mg/mL in DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Welgene) 에피갈로카테킨 갈레이트 ((-)-Epigallocatechin gallate, EGCG) (SIGMA, E4143) (이하 EGCG 용액) 또는 DPBS (Welgene) (대조구)를 주입하였다. 이때 상기 상층액과 상기 EGCG 용액의 부피비는 3:1이며, 상기 EGCG 용액을 주입한 후에 4℃에서 밤새 (약 12시간) 반응했다. 상기 반응 후, EGCG 용액을 처리한 상층액을 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하고 가라앉은 침전물 (pellet)을 얻을 수 있는데, 상기 침전물이 엑소좀 응집체 (Exosome aggregate)이다.

도 2는 상기 실험과정의 모식도이고, 상기 실험결과는 도 1 b에 나타냈다.

도 1b에 나타난 것과 같이, DPBS를 주입한 대조구에 비해서, EGCG를 주입한 경우 엑소좀이 현저하게 추출됨을 확인할 수 있었다.

실험예 1. EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체 구조 확인

EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체의 미세 구조 및 인지질 이중층의 구조를 확인하기 위해서, 전자현미경을 사용하여 EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체의 구조를 확인하였다.

EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체의 미세구조를 확인하기 위해서 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라서 실시예 1과 같은 방법으로 추출한 엑소좀 응집체 를 SEM (scanning electron microscope, 주사전사현미경, FEI, Sirion)를 사용하여 EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체를 관찰하고, EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체의 인지질 이중층의 구조를 확인하기 위해서 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라서 실시예 1과 같은 방법으로 추출한 엑소좀 응집체를 TEM (transmission　electron　microscope, 투과형전자현미경, JEOL, JEM-2100F HR)를 사용하여 EGCG를 이용하여 추출한 엑소좀 응집체를 관찰하였다.

구체적으로, SEM 이미징을 위해 실시예 1과 같은 방법으로 추출한 엑소좀 응집체를 2.5% (w/v) glutaldehyde (Sigma)용액을 이용하여 2시간 고정화하고, 25, 50, 75, 90, 95, 또는 100% (v/v) 에탄올을 이용하여 각 15분씩 탈수반응 후 완전 건조시킨다. 건조된 엑소좀 응집체 샘플은 30 mA 로 120초간 백금 (Pt) 스퍼터 코팅 (sputter coating) 후 제조사가 제공하는 프로토콜을 이용하여 SEM으로 관찰하였다.

또한, TEM 이미징을 위해, 실시예 1과 같은 방법으로 추출한 엑소좀 응집체를 DPBS에 다시 re-suspension하고 3000 rpm에 원심분리하여 wash한다 (2번 반복). 2번 워시한 엑소좀 응집체는 DPBS에 suspension하여 copper grid (carbon mesh)에 약 10 uL 올리고 5분 방치한다. 5분 후 남아있는 용액은 깨끗한 필터페이퍼를 이용해 제거하고, 1% (w/v) phosphotungstic acid (sigma, cat # HT152) 용액을 이용해 copper grid (carbon mesh)에 약 10 uL 올리고 negative staining을 3~5분 진행한다. 남은 용액을 필터페이퍼를 이용해 제거하고 완전 건조한 후 제조사가 제공하는 프로토콜을 이용하여 TEM으로 관찰하였다.

그 결과를 도 1 c, d에 나타냈다.

SEM으로 관찰한 결과 도 1 c에 나타난 것과 같이, EGCG를 이용하여 엑소좀 응집체가 추출되었음을 확인할 수 있었고, TEM으로 관찰한 결과 도 1 d에 나타난 것과 같이, EGCG를 통해 형성된 엑소좀 응집체의 모습 (약 ~400~500nm)을 시각적으로 확인할 수 있었다.

실시예 1 내지 7 및 비교예 1.

EGCG 용액의 농도에 따라 엑소좀 응집체 형성의 효율을 확인하기 위해서 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 5 mg/mL의 다양한 농도의 EGCG 용액을 이용하여 실시예 1과 같은 방법으로 엑소좀을 추출하였다.

실시예 2 : EGCG 5 mg/mL (Conditioned media 6 mL : 5 mg/mL EGCG 2 mL)

실시예 3 : EGCG 2 mg/mL (Conditioned media 6 mL : 2 mg/mL EGCG 2 mL)

실시예 1 : EGCG 1 mg/mL (Conditioned media 6 mL : 1 mg/mL EGCG 2 mL)

실시예 4 : EGCG 0.5 mg/mL (Conditioned media 6 mL : 0.5 mg/mL EGCG 2 mL)

실시예 5 : EGCG 0.25 mg/mL (Conditioned media 6 mL : 0.25 mg/mL EGCG 2 mL)

실시예 6 : EGCG 0.125 mg/mL (Conditioned media 6 mL : 0.125 mg/mL EGCG 2 mL)

실시예 7 : EGCG 0 mg/mL (Conditioned media 6 mL : 0 mg/mL EGCG 2 mL)

비교예 1 : EGCG 2 mg/mL (Control media 6 mL : 2 mg/mL EGCG 2 mL)

다만, 상기 Conditioned media는 실시예 1과 같은 방법으로 세포를 FBS를 제외한 배지와 배양한 후 원심분리하여 얻은 세포배양 상층액 (supernatant)을 의미하며, Control (대조군)은 실시예 1과 같은 방법을 수행하되 세포 없이 FBS를 제외한 배지를 주입한 후, 상기 배지를 원심분리하여 얻은 상층액 (supernatant)을 의미한다.

상기 Conditionaed media 및 Control media 에 실시예 1과 같은 방법으로 EGCG 용액을 주입하여 엑소좀을 추출하였다.

실험예 2. EGCG 용액의 농도에 따른 엑소좀 응집체 형성의 효율 확인

실시예 1 내지 7 및 비교예 1 의 방법으로 추출한 엑소좀 응집체 형성의 효율을 확인한 결과를 확인하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 추출한 엑소좀 응집체에서 페놀/클로로폼 방법을 이용하여 RNA를 추출하였다.

구체적으로, 실시예 1과 같은 방법을 이용하여 추출한 엑소좀 응집체를 Trizol (Prime)과 클로로폼 (Sigma)를 이용하여 엑소좀 내의 RNA를 분리하고, Isopropanol (Sigma) 과 glycogen (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 분광광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 농도를 측정하였다.

상기 추출한 RNA의 농도 측정결과를 도 3에 나타냈다.

도 3의 상단은 실시예 1 내지 7 및 비교예의 방법으로 추출한 엑소좀 응집체의 이미지이며, 도 3의 하단은 실시예 1 및 비교예 1 내지 7의 방법으로 추출한 엑소좀 응집체에서 전체 RNA를 추출하고, 그 농도를 비교한 결과이다.

상기 결과를 통해서 1 내지 2 mg/mL 농도의 EGCG 용액을 이용하여 엑소좀을 추출했을 때, 가장 많은 양의 RNA가 추출됨을 확인할 수 있었고, 상기 1 내지 2 mg/ml 농도의 EGCG 용액이 효율적으로 엑소좀을 분리하는데 적합하며, 3000 rpm의 비교적 낮은 원심력을 사용하더라도 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 폴리페놀기를 포함한 물질들을 이용한 엑소좀의 추출

EGCG가 폴리페놀기를 통해서 엑소좀을 형성할 수 있기 때문에, 다른 폴리페놀기를 포함하고 있는 물질들을 이용하여서 엑소좀을 분리하여 추출할 수 있는지 여부를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1과 같은 방법으로 세포찌꺼기가 제거된 상층액 (도 4의 Conditioned media, CM)을 얻거나, 실시예 1과 같은 방법을 수행하되 세포 없이 FBS를 제외한 배지를 주입한 후, 상기 배지를 원심분리하여 얻은 상층액 (Control (대조군))을 얻은 후, 상기 상층액에 대하여 실시예 1과 같은 방법으로 EGCG (1 mg/Ml, Sigmal), Catechin (5 mg/ml, 10% (w/v) ethanol에 녹임, Sigma), Gallic acid (2 mg/ml, water에 녹임, Sigma), Tannic acid (5 mg/ml, water에 녹임, Sigma), 또는 DPBS (Welgene)를 주입하여 엑소좀의 추출 여부를 확인하였다.

그 결과를 도 4에 나타냈다.

도 4에 나타난 것과 같이, EGCG, Catechin, Gallic acid, 및 Tannic acid를 실시예 1과 같은 방법으로 원심분리하여 얻은 상층액에 주입했을 경우 엑소좀이 추출되었음을 확인할 수 있고, DPBS를 실시예 1과 같은 방법으로 원심분리하여 얻은 상층액에 주입했을 경우 엑소좀이 추출되지 않았음을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해서 폴리페놀기를 포함한 물질들을 실시예 1과 같은 방법으로 원심분리하여 얻은 상층액에 주입했을 경우 엑소좀이 추출됨을 알 수 있었다.

실험예 4. EGCG를 이용한 엑소좀의 추출 및 상용화된 키트를 이용한 엑소좀의 추출 효율 비교

4-1. EGCG를 이용한 엑소좀의 추출 및 상용화된 키트를 이용한 엑소좀의 추출 효율의 시각적 비교

EGCG를 이용하여 엑소좀을 추출하는 경우 및 상용화된 키트를 이용하여 엑소좀을 추출하는 경우의 추출 효율을 비교하기 위해서, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, EGCG는 실시예 1과 같은 방법을 수행하여 엑소좀을 추출하였고, DPBS는 실시예 1과 같은 방법을 수행하여 엑소좀을 추출하되 EGCG 대신에 DPBS를 사용하였고, ExoQuick-TC (SBI, System bioscience Institute)를 이용하여 엑소좀을 추출하기 위해서 실시예 1과 같은 방법으로 원심분리하여 얻은 상층액에 2 mL ExoQuick-TC solution을 밤새배양하고, 이를 1500 rpm에서 20분간 원심분리하였고, Total exosome isolation kit (ThermoFisher)를 이용하여 엑소좀을 추출하기 위해서 실시예 1과 같은 방법으로 원심분리하여 얻은 상층액에 5 mL kit solution을 밤새 배양하고, 이를 3000 rpm에서 20분간 원심분리하였다.

그 결과를 도 5에 나타냈다.

도 5에 나타난 것과 같이, 원심분리하여 형성된 펠릿 (추출된 엑소좀)의 크기를 비교하였을 때, EGCG에 의해서 추출된 엑소좀의 양이 ExoQuick-TC에 의해서 추출된 엑소좀에 비해 현저하게 많았고, EGCG에 의해서 추출된 엑소좀의 양이 Total exosome isolation kit에 의해서 추출된 엑소좀에 비해 현저하게 많았다.

4-2. EGCG를 이용한 엑소좀의 추출 및 상용화된 키트를 이용한 엑소좀의 추출 효율의 수치적 비교

EGCG를 이용하여 엑소좀을 추출하는 경우 및 상용화된 키트를 이용하여 엑소좀을 추출하는 경우의 추출 효율을 수치적으로 비교하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 molecular beacon을 이용하여 엑소좀 miRNA 분석을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 4-1을 이용하여 추출한 엑소좀 응집체를 2% (v/v) Triton X-100 (Sigma, DPBS에 녹임)을 이용하여 용해하고, 상기 용해된 엑소좀 내의 miRNA는 molecular beacon (Macrogen)과의 반응을 통해 발현되는 형광신호를 통해 확인하였다.

상기 실험결과는 도 6에 나타냈다.

도 6에 나타난 것과 같이, EGCG에 의해서 추출된 엑소좀 miRNA의 양이 ExoQuick-TC (SBI) 에 의해서 추출된 엑소좀에 비해 약 2배 가량 많았고,

EGCG에 의해서 추출된 엑소좀 miRNA의 양이 Total exosome isolation kit (ThermoFisher)에 의해서 추출된 엑소좀에 비해 약 3배 가량 많았다.

상기 결과를 통해서, EGCG를 이용하여 엑소좀을 추출하는 경우, 상용화된 엑소좀을 추출하는 키트에 비해서 현저하게 엑소좀 추출 효율이 향상됨을 알 수 있었다.

실험예 5. 필터를 이용한 엑소좀 응집체 분리

5-1. 필터를 이용한 엑소좀 응집체 분리

폴리페놀기를 포함한 물질들을 이용하여 얻은 엑소좀의 응집체를 원심분리하지 않고 필터를 이용하여 분리가능한지 여부를 하기와 같은 방법으로 확인했다.

구체적으로, 필터 홀더에 450 nm 필터 (PALL, Supor®-450)를 넣고 o ring으로 완전히 패킹되도록 조립한 후, 실시예 1에서와 같은 방법으로 EGCG 용액을 주입한 후에 4℃에서 밤새 (약 12시간) 반응한 반응물을 원심분리하지 않고 상기 필터에 흘려주어 필터에 걸러진 엑소좀을 얻었다.

상기 실험 방법에 대한 모식도는 도 7에 나타나 있다.

5-2. 필터를 이용하여 분리한 엑소좀 응집체의 확인

실시예 5-1의 방법으로 필터를 이용하여 엑소좀 응집체가 분리됐는지 여부를 확인하기 위해서 전자현미경으로 관찰하였다.

구체적으로, 실시예 5-1의 방법으로 필터에 실시예 1에서와 같은 방법으로 EGCG 용액을 주입한 후에 4℃에서 밤새 (약 12시간) 반응한 반응물을 흘려준 필터를 실험예 1과 같은 방법으로 SEM을 사용하여 분석하였다. 대조군은 실시예 7과 같은 방법 (EGCG를 넣지 않음)을 수행한 결과물을 실시예 5-1의 방법으로 필터에 흘려준 것이다.

상기 결과는 도 8의 하단에 나타나 있다.

도 8의 하단에 나타나 것과 같이, EGCG를 처리하고 필터링한 필터 표면에는 엑소좀 응집체들이 존재함을 확인할 수 있었다.

5-3. 엑소좀 응집체의 크기 분석

실시예 5-1과 같은 방법으로 필터를 이용하여 엑소좀 응집체의 분리하기 위해서 사용 가능한 필터의 사이즈를 결정하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 엑소좀 응집체의 크기를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 1에서와 같은 방법으로 EGCG 용액을 주입한 후에 4℃에서 밤새 (약 12시간) 반응한 반응물에서 형성된 엑소좀 응집체의 입자 크기를 파티클사이즈 분석기 (Zetasizer, Malvern)을 이용하여 분석하였다. 대조군은 EGCG를 넣지 않고 실시예 1과 같은 방법을 수행한 결과물을 이용하여 파티클 사이즈를 분석한 것이다.

상기 분석 결과는 도 8의 상단에 나타나 있다.

도 8의 상단에 나타난 결과와 같이, EGCG를 처리한 그룹에서 그 크기가 138±25.52nm에서 656.3±102.8nm로 증가하였다.

상기 결과를 통해서, EGCG를 처리함으로써 엑소좀들의 응집체의 크기가 증가하고, 상기 증가한 응집체의 크기는 필터의 구멍 (pore)보다 크기가 커서 이를 필터에 적용한 경우 필터에 걸러질 수 있음을 확인할 수 있었다.

5-4. 필터를 이용한 엑소좀 응집체의 분리와 원심분리를 이용한 엑소좀 응집체의 분리의 비교

필터를 이용한 엑소좀 응집체의 분리와 원심분리를 이용한 엑소좀 응집체의 추출을 비교하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 5-1과 같이 실시예 1에서와 같은 방법으로 EGCG 용액을 주입한 후에 4℃에서 밤새 (약 12시간) 반응한 반응물을 양의 변화 (5 mL, 2 mL, 1 mL, 0.5 mL, 0.2 mL, 0.1 mL, 0.05 mL, 또는 0 mL)를 주어서 필터링한 후, 상기 필터를 실시예 4-2와 같은 방법으로 엑소좀 내의 miRNA를 측정하였고, 대조군은 실시예 1에서와 같은 방법으로 EGCG 용액을 주입한 후에 4℃에서 밤새 (약 12시간) 반응한 반응물을 원심분리하고 얻은 상등액 (5 mL, 2 mL, 1 mL, 0.5 mL, 0.2 mL, 0.1 mL, 0.05 mL, 또는 0 mL)을 실시예 4-2와 같은 방법으로 엑소좀 내의 miRNA를 측정한 것이다.

상기 실험 결과는 도 9에 나타나 있다.

도 9에 나타난 것과 같이, 실시예 5-1과 같은 방법의 필터 기반의 분리기술을 이용하여 소량의 샘플 (2 mL 이하)에서도 엑소좀 응집체를 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

폴리페놀을 유효성분으로 포함하는, 세포 또는 세포 배양물에서 엑소좀을 추출하기 위한 조성물로서,
상기 폴리페놀은 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG), 카테킨, 카테킨-3-갈레이트, 갈로카테킨, 갈로카테킨-3-갈레이트, 카테킨 갈레이트, 에피카테킨, 갈로카테킨 또는 에피갈로카테킨이고,
상기 폴리페놀은 엑소좀과 수용액상에 녹지 않는 응집체를 형성하고, 상기 응집체는 553.5 내지 759.1nm의 크기를 갖는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리페놀의 농도는 0.1 내지 10 mg/mL인, 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 응집체는 3,000rpm 이하 속도의 원심분리로 분리 가능한 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은, 세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 얻어진, 세포 외부로 분비되는 상층액으로부터 추출하는 것인, 조성물.
세포 또는 세포 배양물을 원심분리하여 세포 외부로 분비되는 상층액을 수집하는 제1단계; 및
상기 수집한 상층액에 폴리페놀을 첨가하여 엑소좀과 수용액상에 녹지 않는 응집체를 형성하는 제2단계를 포함하는, 폴리페놀을 이용하여 엑소좀을 추출하는 방법으로서,
상기 폴리페놀은 EGCG (Epigallocatechin gallate), 카테킨, 카테킨-3-갈레이트, 갈로카테킨, 갈로카테킨-3-갈레이트, 카테킨 갈레이트, 에피카테킨, 갈로카테킨 또는 에피갈로카테킨이고,
상기 제2단계에서 응집체는 553.5 내지 759.1nm의 크기를 갖는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 제1단계에서 원심분리는 2000 내지 16000 rpm으로 수행하는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 제1단계의 세포는 섬유아세포 (fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 성상교세포 (astrocyte) 혈액세포, 신경 줄기세포, 조혈모 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 제1단계에서 세포 배양물은 혈청을 넣지 않은 배양액에서 세포를 배양하여 얻은 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 제2단계에서 수집한 상층액에 첨가하는 폴리페놀의 농도는 0.1 내지 10 mg/mL인, 방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 응집체를 3,000rpm 이하 속도의 원심분리로 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 응집체를 필터로 여과하는 제3단계를 추가로 포함하는, 방법.
삭제
제13항에 있어서, 상기 제3단계에서 사용하는 필터의 구멍 (pore) 크기는 180 내지 600 nm인, 방법.