KR102292608B1

KR102292608B1 - 기능이 강화된 세포외 소포를 고농도로 함유하고 있는 조건화 배양액의 탈모 완화 및 방지 용도

Info

Publication number: KR102292608B1
Application number: KR1020200029118A
Authority: KR
Inventors: 김준호; 유가은; 이정선; 장송선
Original assignee: 주식회사 바이오솔루션
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2021-08-23
Also published as: WO2021182725A1

Abstract

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)의 탈모 완화, 방지 또는 치료 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

기능이 강화된 세포외 소포를 고농도로 함유하고 있는 조건화 배양액의 탈모 완화 및 방지 용도{Use of conditioned media containing high concentration of extracellular vesicles with enhanced functions for alleviating and preventing hair loss}

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)의 탈모 완화, 방지 또는 치료 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 치료용의 화장품 및 의약품 조성물에 관한 것이다.

모발은 모근과 모간으로 나뉘며, 모근을 둘러싸고 있는 모낭에서 모발이 생장한다. 모낭에서 생물학적 특성을 조절하는 두 가지 중요한 요소는 모낭상피인 외측모근초 세포(Outer Root Sheet)와 중간엽 유래의 모유두(Dermal Papilla)이며, 모주기의 반복을 통하여 모발이 성장하고 탈락하게 된다. 모발은 크게 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)의 3단계를 거치며, 각질층에서 모발은 각각 표피와 모낭의 증식 및 분화를 통하여 만들어지고 탈락되는데 모낭 하부의 모유두에는 중간엽 유래의 전이증폭세포가 존재하여 성장기 모낭의 모유두를 유지하는 역할을 한다고 알려져 있다. 다양한 호르몬(hormone), 사이토카인(cytokines) 및 성장인자(growth factors)가 모발 형태 발생과 모발 성장 조절에 관여한다고 알려져 있다. 모낭의 수와 크기의 증가는 성장기에 관찰되었는데, 휴지기의 모낭은 진피층(dermis)에 위치하는 것과 달리 성장기에는 모낭이 깊은 피하조직(subcutis)에 위치하므로 모낭의 수와 크기의 증가는 성장기와 밀접하게 연관되어 있다.

세포외 소포(Extracellular vesicles)는 최근 각광받고 있다. 세포외 소포는 세포에서 유래하여 세포 밖으로 배출되는 30 ㎚ 내지 1 ㎛ 크기의 인지질 이중층(Phospholipid bilayer) 구조를 가진 베지클이다. 세포외 소포는 엑소좀(Exosome)과 마이크로베지클(Microvesicle)로 구성되어 있으며 이 두 가지는 만들어 지는 경로가 다르다. 엑소좀은 다소포성의 엔도솜(Multivescular endosome) 안에 다양한 크기로 생성된 후 세포 밖으로 방출되고, 마이크로베지클은 세포의 원형질 막(Plasma membrane)이 세포 바깥으로 직접 소포체를 형성하여 방출된다. 근래에 들어 세포외 소포체의 피부 재생이나 발모에 대한 효능이 꾸준히 제시되어 왔다 (J Extracell Vesicles. 2019 Jan 20;8(1):1565885, Sci Rep. 2017 Nov 14;7(1):15560).

기존의 세포 배양액은 세포외 소포의 비율이 낮기 때문에 세포외 소포의 양산이나 비용적인 측면에서 문제가 있어왔다. 본 발명자들은 이전의 연구를 통하여 배양배지에 락토페린/칼슘 조성물을 첨가하여 세포를 배양하면 세포 내 칼슘 농도가 증가하고 이로 인해 배출되는 세포외 소포의 생성량이 현저하게 증가함을 확인하였다. 이와 함께 락토페린은 증가한 세포외 소포와 결합하여 섬유아 세포와의 결합능을 향상시키고, 이에 따라 피부 재생 효과가 높아짐을 확인하였다. 또한 배양액을 케라티노사이트에 처리하면 장벽 및 보습인자로 알려진 필라그린이 증가함을 확인하였다. 그러나 수득한 고농도 세포외 소포를 함유한 조건화 배양액이 탈모 완화 및 양모 효능을 나타내는지에 대해서는 현재까지 구체적으로 확인된 바 없다.

본 발명자들은 락토페린을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액이 그 자체로서 탈모를 완화할 수 있는지에 대한 연구를 수행하였다.

그 결과, 본 발명자들은 상기 조건화 배양액으로부터 분리한 세포외 소포뿐만 아니라 상기 조건화 배양액이 그 자체로서 모유두 세포(dermal papilla cell)의 증식을 촉진하고, 약물에 의해 유도된 모발의 퇴행기를 억제하고 성장기를 유지하는 효과를 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은 상기 조건화 배양액의 탈모 완화, 방지 또는 치료 용도를 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)을 탈모의 완화, 방지 또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조건화 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체의 두피에 도포하는 것을 포함하는, 대상체의 탈모를 완화, 방지 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 락토페린을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액은 모유두 세포(dermal papilla cell)의 증식을 촉진하고, 약물에 의해 유도된 모발의 퇴행기를 억제하고 성장기를 유지하여, 궁극적으로 탈모를 완화, 방지 또는 치료할 수 있다.

따라서 본 발명의 조건화 배양액은 탈모 완화, 방지 또는 개선용 화장품의 원료 물질, 또는 탈모 완화, 방지 또는 치료용 의약품의 원료 물질로 활용될 수 있다.

도 1은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포를 마커인 CD9 ELISA로 측정한 결과이다.
도 2은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 배양한 배양액을 모유두 세포(dermal papilla cell)에 처리하였을 때 세포 증식율을 MTT 어세이로 확인한 결과이다.
도 3은 덱사메타손에 의해 모발의 퇴행기가 유도된 C3H 마우스에서 처리 물질 별 성장기 피부의 유지 정도를 확인한 사진이다.
도 4는 덱사메타손에 의해 모발의 퇴행기가 유도된 C3H 마우스에서 처리 물질 별 전체 피부 면적 대비 성장기를 유지한 피부의 면적을 보여주는 그래프이다.
도 5는 덱사메타손에 의해 모발의 퇴행기가 유도된 C3H 마우스에서 처리 물질 별 피부 조직 내 개별 모낭의 모양을 확인한 사진이다.
도 6은 덱사메타손에 의해 모발의 퇴행기가 유도된 C3H 마우스에서 처리 물질 별 피부 조직 내 진피(dermis)/피하(subcutis)/전체(whole)층의 두께를 조사한 그래프이다.
도 7은 덱사메타손에 의해 모발의 퇴행기가 유도된 C3H 마우스에서 처리 물질 별 피부 조직 내 함유된 개별 모낭의 단면 모양 및 깊이를 확인한 사진이다.
도 8은 덱사메타손에 의해 모발의 퇴행기가 유도된 C3H 마우스에서 처리 물질 별 피부 조직내 전체 모낭의 개수를 분석한 그래프이다.

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)을 탈모의 완화, 방지 또는 치료에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 탈모 완화, 방지 또는 개선용 화장료 조성물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 탈모 완화, 방지 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조건화 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체의 두피에 도포하는 것을 포함하는, 대상체의 탈모를 완화, 방지 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배양배지 (Culture medium)"는 세포를 배양하기 전 배지를 지칭하며, "배양액 또는 조건화 배양액(Conditioned medium)"은 세포를 배양 후 수득한 배지를 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "세포외 소포(Extracellular vesicles)"는 세포막의 구조와 동일한 성분인 인지질 이중층으로 이루어진 세포외로 방출된 나노 크기(30 ~ 2,000 ㎚)의 소포체를 모두 포함한다. 따라서 세포에서 배출되는 "엑소좀(Exosome)"과 "마이크로베지클(Microvesicle)"을 포괄한다. 나아가, 용어 "세포외 소포"는 엑토좀(Ectosome), 마이크로파티클(Microparticle), 탈레로좀(Tolerosomes), 프로스타토좀(Prostatosomes), 카디오좀(Cardiosomes) 및 벡소좀(Vexosomes)을 포괄하는 의미로 사용되기도 한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액 중 세포외 소포의 개수는 1.0×10⁸/㎖ 내지 1.0×10¹¹/㎖의 범위일 수 있으며, 구체적으로는 1.0×10⁹/㎖ 내지 1.0×10¹¹/㎖의 범위일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액은 배양 전 배양배지에 락토페린이 0.1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있고, 배양 후 조건화 배양액 중 락토페린은 0.01 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 존재할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액에서 락토페린은 Holo-lactoferrin, Apo-lactoferrin 및 Pis-lactoferrin으로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 락토페린은 합성에 의한 것이거나 추출에 의해 수득된 것일 수 있으며, 사람 또는 사람 외의 동물 유래를 모두 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액은 배양 전 배양배지에 칼슘이 추가로 첨가될 수 있다. 일 구체예에서, 배양 전 배양배지에 상기 칼슘은 0.2 μM 내지 10 mM의 농도로 첨가될 수 있고, 배양 후 조건화 배양액 중 칼슘은 0.02 μM 내지 10 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 칼슘은 칼슘 이온(Ca²⁺)의 형태로 첨가될 수 있으며, 상기 칼슘 이온의 공급원은 칼슘 이온 공급이 가능한 모든 염을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액은 배양 전 배양배지에 무첨가배지(basal media), 혈청대체제(serum replacement) 및 혈청(serum)으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질이 추가로 첨가될 수 있다. 상기 "혈청대체제"는 무혈청 배지를 제작하기 위한 혈청을 대체하는 단일 물질 및 조성 물질을 지칭한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액의 제조에 사용되는 세포는 인간 또는 동물 유래의 모든 종류의 세포일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세포는 재생능이 있는 세포이고, 구체적으로 상기 재생능이 있는 세포는 줄기세포일 수 있으나 반드시 줄기세포에 한정되는 것은 아니다. 후술하는 실시예에서는 상기 세포로서 "사람의 지방유래 중간엽 줄기세포(Human adipose-derived mesenchymal stem cell)"가 사용되었으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 중간엽 줄기세포, 예를 들어, 지방(Adipose), 제대(Umbilical cord), 제대혈(Umbilical cord blood), 골수(Bone marrow), 태반 유래, 배아 줄기세포, iPS 유래 줄기세포, 또는 피부 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 조건화 배양액은 모발의 퇴행기를 억제하고 성장기를 유지하는 효과를 나타낸다. 후술하는 실시예에서는 본 발명의 조건화 배양액이 발포 주기에서 중요한 역할을 하는 모유두 세포(dermal papilla cell)의 증식을 촉진하는 효과를 구체적으로 확인하였다. 그러나 본 발명의 조건화 배양액이 증식 효과를 나타내는 세포는 모유두 세포(Dermal papilla cell)에만 한정되지 않으며, 모주기에 영향을 주거나, 발모 및 탈모와 관련한 사람 또는 사람 외의 동물 유래 세포 모두를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액 또는 이를 포함하는 조성물은 동결건조를 통한 고체 상태로 제조될 수 있으며, 이때 배양액 뿐만 아니라 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예컨대 부형제, 안정화제, 안료 및 향료와 같은 보조제 등을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상기 조건화 배양액 및 미용학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 개선용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 조건화 배양액이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 조건화 배양액 뿐만 아니라 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어팩, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 헤어비누, 헤어패치, 포마드, 분말, 젤, 솔젤, 에멀젼, 오일, 헤어에센스, 헤어세럼, 헤어미스트, 왁스 또는 에어졸의 제형으로 제조될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상기 조건화 배양액 및 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는 탈모 완화, 방지 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 첨가제, 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약제학적 조성물은 피부 외용제로 제형화될 수 있으며, 보다 상세하게는 연고, 크림, 젤, 스프레이, 피부 패치, 드레싱, 마스크, 비점착성 거즈 등의 형태로 제조될 수 있다. 또한 상기 약제학적 조성물은 주사제로 제형화될 수 있으며, 보다 상세하게는 피하 주사, 피내 주사 등의 형태로 제조될 수 있다. 또한 상기 약제학적 조성물은 포유동물 투여용, 더 바람직하게는 인간 투여용으로 제조될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며, 부형제, 항산화제, 완충액, 정균제, 분산제, 흡착제, 계면활성제, 결합제, 방부제, 붕해제, 감미제, 향미제, 활택제, 방출조절제, 습윤제, 안정화제, 현탁화제 및 윤활제에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 피부 외용제로 제형화된 것일 수 있다. 예를 들어, 용액, 겔, 폼 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 피하 주사 또는 피내 주사로 제형화된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 세포외 소포의 분리 방법, 즉 크기 기반 컬럼(Size Exclusion Columns) 방법은 다른 세포외 소포를 분리하는 방법, 예를 들어 초원심분리(Ultracentrifuge), 농도 구배(Density gradient), 초여과(Ultrafiltration), 면역친화 정제(Immunoaffinity purification)일 수 있으며, 상기 명시된 방법만으로 한정하지 않는다(Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Mar 2;10:131-141).

본 명세서에서 사용되는 용어 "NF-CM(Nutrient Full media-Conditioned medium)"은 혈청대체제를 포함한 배양배지에서 배양 후 수득한 배양액을 의미하며, "NFL-CM (Nutrient Full media with Lactoferrin-Conditioned medium)"은 혈청대체제와 락토페린/칼슘 조성물을 포함한 배양배지에서 배양 후 수득한 배양액을 의미한다. 또한 NFL-CM으로부터 세포외 소포를 농축한 물질을 "NFL-EVs (NFL-Extracellular vesicles)" 또는 "NFL-Exosome"이라 표현한다.

후술하는 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명자들은 세포외 소포("NFL-Exosome") 뿐만 아니라 상기 조건화 배양액("NFL-CM") 자체도 모유두 세포(dermal papilla cell)의 증식을 촉진하고, 약물에 의해 유도된 모발 성장 주기의 퇴행기를 억제하고 성장기를 유지하는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 락토페린/칼슘 조성물을 포함하는 배양배지에 의한 세포외 소포의 생성량 증대

실험에 사용할 배양액을 하기의 방법으로 수득하였다.

넓이가 175 ㎠인 세포배양접시(T175 flask)에 사람의 지방유래 중간엽 줄기세포(Human adipose-derived mesenchymal stem cell)를 배양한 뒤, 인산 완충 용액(PBS, phosphate buffer saline)으로 세척하고 무첨가배지(Alpha-Minimum Essential Medium, alpha-MEM)를 넣어 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 혈청대체제가 포함된 배지에 칼슘(CaCl₂, sigma, USA)과 락토페린(Lactoferrin, aspira scientific, USA)을 혼합하여 세포에 처리하였다. 이와 함께 혈청대체제만 들어있는 군도 함께 진행하였다. 48시간 뒤 배양액을 수거하여 0.22-um 필터로 거른 후, 최종 배양액을 수득하였다. 락토페린/칼슘 조성물/혈청대체제로 세포 배양 후 수득한 배양액을 NFL-CM(Nutrient Full media with Lactoferrin-Conditioned medium)로 표현하였고 혈청대체제 만으로 세포 배양 후 수득한 배양액을 NF-CM(Nutrient Full media-Conditioned medium)이라 표현하였다.

배양액 내 세포외 소포의 양의 증가 유무를 확인하기 위하여 세포외 소포의 마커인 CD9의 양을 결합 면역 침강 분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 확인하였다. CD9 엘라이자 키트(CD9 ELISA kit, Mybiosource, USA)를 사용하여 CD9을 측정하였으며 방법은 아래와 같다. 코팅된 96웰 플레이트(96well plate)에 얻은 배양액과 정량물질(standard)를 각각 100 ㎕씩 넣은 후 90분 동안 37℃에서 반응하였다. 그 후, 정량물질과 배양액을 제거하고 첫번째 항체(detection antibody)와 두번째 항체(HRP antibody)를 각각 반응하였고 과정 중간에 세척을 진행하였다. 최종적으로 기질(substrate)과 스톱 버퍼(stop buffer)를 넣어 엘라이자 리더기(ELISA reader, Molecular devices, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 NF-CM군을 기준으로 계산한 비율을 도 1에 나타냈다.

도 1에 나타난 바와 같이, 이전 연구를 통해 배양액 내 세포외 소포의 양을 증가시키는 락토페린/칼슘의 조합군인 NFL-CM은 NF-CM군에 비해 약 2.8배 CD9이 증가함을 확인하였다(Tukey's test, p < 0.05). 이 결과로 보아 상기 방법으로 수득한 배양액은 기존 발명과 일치하는, 세포외 소포가 증가한 배양액임을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 락토페린/칼슘 조성물에서 배양 후 수득한 배양액에 의한 모유두 세포(Dermal papilla cell)의 증식 효과

모유두 세포(dermal papilla cell)는 양모 주기를 조절하는 중요한 세포로 모낭 줄기 세포(hair follicle stem cell)와 상호작용하고 지시하는 역할을 하여(Jamien Lima, Krystle Joy Nga, Carlos Clavel, Advances in Stem Cells and their Niches. 2019(3):115-138) 발모 주기에서 중요한 세포이다. 따라서 실시예 1의 방법으로 수득한 배양액의 모유두 세포 증식 효과를 MTT 어세이 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 48개의 구멍이 있는 배양 접시(48-well plate)에 2.8×10⁴cells/㎖의 모유두 세포 현탁액 250 ㎕를 넣고 24시간 동안 배양하였다. 배지(alpha-Minimum Essential Medium, alpha-MEM + 10% FBS)를 제거하고 인산 완충 용액으로 세척한 후, NF-CM과 NFL-CM을 각각 250 ㎕를 처리하였고, 음성 대조군으로 무첨가배지(SF, Serum free media)를 사용하였다. 접종 후, 37℃에서 48시간 동안 배양 후 각 배지를 제거하고 인산 완충 용액으로 3회 반복하여 세척하였다. MTT 용액(0.5 ㎎/㎖)을 2시간동안 반응시킨 뒤, MTT 용액을 제거하고 이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol) 용액에서 30분 교반하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 SF을 100%로 두었을 때 상대값을 그래프로 나타냈다(도 2).

도 2에 나타난 바와 같이, NF-CM 그룹에 대비하여 NFL-CM 그룹에서 모유두 세포의 증식율이 증가함을 확인하였다. 구체적으로, NF-CM을 처리하였을 경우 110%의 세포가 증가한 반면, NFL-CM을 처리하였을 경우 135%의 세포증식율이 증가하여 NFL-CM이 NF-CM에 비해 발모 주기를 조절 가능한 모유두 세포 증식에 효과가 있음을 관찰하였다.

전체 그룹내의 차이가 존재함을 one-way ANOVA를 수행하여 확인하였으며, 개별적인 평균들 간의 차이는 Tukey's test를 활용하여 분석되었다. 그룹 간의 통계적인 명확성은 *** p < 0.0001, N.S (Not significant)p >0.05 로 그래프에 표시하였다. 본 통계는 Prism software version. 5를 이용하여 분석되었다.

실시예 3: 덱사메타손에 의해 모발의 퇴행기가 유도된 마우스의 락토페린/칼슘 조성물 배양액에 의한 성장기 유지 효과

모발의 성장 주기 중 휴지기(telogen)에서 성장기(anagen)로 넘어가는 시기에 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하면 탈모 주요한 인자인 DKK-1(Dickkopf-1)을 증가시켜 퇴행기를 유도한다(Exp Dermatol. 2017 Oct;26(10):952-954). 본 실험에서는 덱사메타손으로 퇴행기가 유도된 마우스에 실시예 1에서 수득한 NFL-CM을 처리하여 성장기 유지 효능을 확인하였다. 또한 NFL-CM 내의 세포외 소포의 효능을 확인하기 위해 NFL-Exosome(NFL-CM으로부터 세포외 소포를 분리한 물질)도 함께 실험을 진행하였다.

NFL-CM의 경우 실시예 1과 같은 방법으로 수득하였다. 이후 NFL-exosome의 경우 "유체샘플로부터 세포외 소포를 고농축 하는 크기 기반 분리법"을 활용하였다(한국특허출원 공개번호 제10-2020-0000792호). 간단히 말해서, 본 방법 내에 50 nm 필터를 활용하여 NFL-CM으로부터 세포외 소포를 분리하였고, 이를 인산 완충 용액으로 용출하였다. NFL-CM, NFL-Exosome은 1.5 ㎎/㎖의 동일한 농도로 처리되었다.

암컷 C3H/HeN 마우스(Orient Bio, Korea)의 등을 제모하기 전 마우스의 주기를 판별한 후 각 군당 같은 마리의 주기가 비슷한 마우스가 들어가도록 군별 3마리의 마우스를 배치하고 실험을 진행하였다. 마우스를 케타민(ketamine, 유한양행, Korea)과 럼푼(rompun, 바이엘코리아, Korea) 혼합액으로 마취한 후 클리퍼(Clipper)를 이용하여 마우스 등의 털을 제거한 뒤, 남은 털을 제모 크림으로 완벽하게 제거하고 실험을 진행하였다. 제모 7일 후부터 7일 동안 24시간 간격으로 인산 완충 용액, NFL-CM, NFL-Exosome, 2% 미녹시딜(Minoxidil, 판시딜액, 동국제약, Korea) 각각을 덱스판테놀(dexpanthenol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 에탄올(ethanol)이 섞인 제형과 1:1로 섞은 후 마우스 등에 600 ㎕씩 도포하고 잘 흡수되도록 하였다. 제모 9일 후부터 5일 동안 퇴행기를 유도하는 덱사메타손 (0.2% dexamethasone 21-acetate, sigma, USA)을 500 ㎕씩 마우스 등에 도포하여 잘 흡수되도록 하였다. 제모 17일 후 마우스의 양모 정도를 확인하고 제모를 통해 검은 피부의 유지 정도(성장기 유지)를 사진으로 촬영하여 도 3에 나타냈다.

그 결과, 비 효능 물질인 인산 완충 용액을 처리 후 덱사메타손을 처리한 마우스의 경우 성장기의 특성인 검은색 등의 면적이 덱사메타손을 비 처리한 군에 비해 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. 이는 덱사메타손이 퇴행기를 유도함을 알 수 있고 인산 완충 용액은 퇴행기 방어 능력이 없는 것으로 확인되었다. 반면, NFL-CM을 처리한 군은 검은색 등의 면적이 넓게 유지하여 퇴행기 억제 효과가 있음이 확인되었다. 또한 NFL-Exosome의 경우, 그룹 전체에서 제모 면적 대비 가장 넓은 부분의 검은색 등을 유지한다는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 NFL-CM이 퇴행기 억제효과를 가지는 것을 확인하였고, NFL-CM이 NFL-Exosome에 버금가는 탈모 완화 효과를 가짐을 확인 할 수 있었다.

정량적인 분석을 위해, 도 3의 결과를 바탕으로 Image J를 이용하여 마우스 등의 면적을 측정하였고, 전체 제모 부위 면적 대비 성장기의 검은색 등의 비율을 그래프로 나타내어 도 4에 표현하였다.

그 결과, 덱사메타손이 비처리되어 모발의 성장기가 유지되는 양성대조군은 제모 면적 대비 약 62%의 검은색 등을 보였다. 반면, 덱사메타손과 인산 완충 용액을 함께 처리한 그룹은 약 7%가 검은색 등으로 유지되어 덱사메타손이 성장기의 면적을 줄이고 퇴행기 및 휴지기의 면적을 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 덱사메타손과 NFL-CM을 함께 처리하면 30%의 검은색 등을, 덱사메타손과 NFL-Exosome과 함께 처리하면 48%의 검은색 등을 유지하는 것을 확인하여 NFL-CM이 탈모완화에 효능을 가짐을 정량적으로 다시 한번 확인하였다. 특히, 30% 검은색 등의 면적을 보인 NFL-CM은 대표적인 탈모완화 일반의약품인 2% 미녹시딜의 27%의 면적과 비교하여 유사한 수치를 보였기에 상기 30%의 수치는 탈모완화 효과로 명확히 말할 수 있다. 또한 미녹시딜은 음성 대조군인 덱사메타손과 인산 완충 용액을 처리한 그룹과 비교해 유의미성을 확인하기 어려웠다. 반대로 NFL-CM과 NFL-exosome은 음성대조군과 비교해 명확한 차이를 보여주어 덱사메타손의 탈모 상황에서 더 효과적인 물질임을 확인할 수 있었다.

각각은 unpaired T-test로 유의미성을 확인하였고 확인하였고 * p< 0.01, ** p < 0.001, *** p < 0.0001, N.S (Not significant)p > 0.05로 나타내었다.

실시예 4: 덱사메타손에 의해 모발 성장 주기의 퇴행기가 유도된 마우스의 락토페린/칼슘 조성물 배양액에 의한 피부 두께와 모낭 성장기 형태 유지

실시예 1에서 수득한 배양액(NFL-CM)과 실시예 3의 방법으로 분리한 세포외 소포(NFL-Exosome)가 모발 성장 주기의 퇴행기가 유도된 마우스의 피부의 두께와 모낭 형태에 미치는 영향을 확인하여, NFL-CM의 효능을 NFL-Exosome의 효능과 비교 분석하였다.

구체적으로 실시예 3의 과정 후 마우스의 피부 조직을 털의 방향으로 채취하고 고정액(4% formaldehyde, sigma, USA)에 24시간 고정하였다. 그 후 수세(washing), 탈수(dehydration), 투명(clearing), 침투(infiltration), 포매(embedding) 과정을 거쳐 파라핀 블록(paraffin block)을 만들었다. 블록을 8 ㎛로 박절한 뒤 조직을 슬라이드(microscope slides, marienfeld, Germany)에 부착하였고, 37도 슬라이드 워머(slide warmer)에서 12시간 건조했다. 탈파라핀(deparaffinization), 함수(hydration) 뒤, 조직을 헤마톡실린(hematoxylin, sigma, USA)과 에오신(eosin, sigma, USA)으로 염색하였고 마운팅 용액(Mounting solution, Richard allan scientific, USA)을 이용하여 커버 글라스(cover glass)로 조직을 보호하였다. 현미경(BX41, Olympus, Japan)을 통해 400배 배율로 관찰을 하고 동일 배율로 촬영하여 결과를 도 5에 나타냈다.

덱사메타손이 비 처리되어 모발의 성장기가 유지되는 양성대조군은 모낭이 깊고 크기가 큰 성장기의 형태를 가지며 조직 두께가 두꺼운 반면, 덱사메타손과 인산 완충 용액을 함께 처리한 음성대조군의 경우 모낭의 형태가 망가지고 위치가 진피에 존재하며 조직 두께가 얇아지는 것을 확인하여 덱사메타손에 의해 퇴행기가 유도되어 휴지기의 특성을 보임을 확인하였다. 반면, NFL-CM과 덱사메타손을 함께 처리하면 조직의 두께가 두껍고 생장기 모낭의 형태를 유지하며 모낭이 피하에 위치하였기에 탈모 완화 효과가 있음을 명확히 보여주었다. 또한 NFL-Exosome 그룹은 덱사메타손과 함께 처리한 군 중 가장 두꺼운 조직을 보이며, 성장기 형태인 양성대조군과 가장 유사한 모양 및 위치의 모낭을 가지고 있음을 확인하였다.

도 5의 결과를 바탕으로 각각 그룹의 조직 사진 내의 진피층(dermis), 피하층(subcutis), 전체(whole) 조직 두께를 조직 당 10군데를 Image J로 측정한 후 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 양성대조군(positive control)의 경우 피하층의 두께가 529 ㎛이고 전체 조직은 810 ㎛로 두껍게 피부가 유지되었다. 그에 반면, 덱사메타손과 인산 완충 용액을 처리한 그룹은 진피의 두께에는 큰 변화가 없었으나, 피하층의 두께가 평균 529 ㎛에서 65 ㎛로 얇아지고 전체 조직 두께가 평균 810 ㎛에서 256 ㎛로 줄어드는 것을 관찰하였다. 덱사메타손과 함께 NFL-CM을 처리한 경우 피하층이 187 ㎛로, 전체 조직이 393 ㎛로 두께가 증가하였고, NFL-Exosome을 함께 처리하였을 경우 피하층이 325 ㎛, 전체 조직이 570 ㎛로 두께가 증가하는 것을 관찰하였다. 결론적으로 NFL-CM은 인산 완충 용액에 비해 피하층의 퇴행기를 약 287% 억제시켰으며, NFL-Exosome은 500%의 퇴행기 억제 효과를 보인다고 사료되었다. 또한 2%의 미녹시딜은 146 ㎛의 피하층과 392 ㎛의 전체 조직 두께를 가져 피하층 약 224%의 퇴행기 억제 효과를 가짐을 확인하였다.

실시예 5: 덱사메타손에 의해 모발 성장 주기의 퇴행기가 유도된 마우스의 락토페린/칼슘 조성물 배양액에 의한 모낭 개수 유지

실시예 1에서 수득한 배양액(NFL-CM)과 실시예 3의 방법으로 분리한 세포외 소포(NFL-Exosome)가 퇴행기가 유도된 마우스의 조직 내 모낭의 개수에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로 실시예 3의 과정 후 마우스의 피부 조직을 털과 수직 방향으로 채취하고 실시예 4의 방법으로 헤마톡실린과 에오신 염색을 진행한 조직 슬라이드를 제작하였다. 현미경을 통해 400배 배율로 관찰을 하고 동일 배율로 촬영하여 결과를 도 7에 나타냈다.

양성대조군은 크고 많은 수의 모낭을 가지는 반면 덱사메타손과 인산 완충 용액을 함께 처리한 그룹의 경우 모낭의 개수가 급격하게 줄어들고 크기도 작아지는 것을 관찰하였다. 반면 NFL-CM를 처리한 그룹과 NFL-Exosome을 처리한 그룹에서는 더 많고 굵은 모낭이 존재함을 확인하였다.

도 7의 결과를 바탕으로 Image J를 이용하여 군 별 1 mm당 피부 내 모낭의 개수를 측정하였다. 그룹당 8개의 조직 내에서 모낭의 개수를 측정한 후 그래프로 나타냈다.

그 결과, 도 8에서 보듯이, 아무것도 처리하지 않은 양성대조군 그룹 내의 모낭 개수는 평균 약 92개인 반면, 덱사메타손과 인산 완충 용액을 처리한 그룹의 조직 내 모낭의 개수는 평균 약 24개를 확인하였다. NFL-CM을 처리한 군은 47개, NFL-Exosome을 처리한 군은 약 77개의 모낭을 유지하여, 인산 완충 용액 그룹에 비해 약 1.9배와 3.2배의 모낭 개수를 유지하는 것으로 사료되었다. 또한 미녹시딜 그룹에서는 54개의 모낭 개수를 유지하여 NFL-CM과 NCL-Exosome 사이의 개수임이 관찰되었다. 그룹간의 통계적인 명확성은 *** p < 0.0001, ** p < 0.001, * p < 0.01, N.S p > 0.05로 그래프에 표시하였다. 본 통계는 Prism software version. 5를 이용하여 분석되었다.

Claims

락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)을 포함하며, 여기서 상기 세포는 지방유래 중간엽 줄기세포인, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 조건화 배양액 내 세포외 소포의 개수가 1.0×10⁸/㎖ 내지 1.0×10¹¹/㎖의 범위인, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 배양 전 배양배지에 락토페린이 0.1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 포함되는, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 조건화 배양액 내 락토페린이 0.01 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 존재하는, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 락토페린이 Holo-lactoferrin, Apo-lactoferrin 및 Pis-lactoferrin으로 구성된 그룹 중에서 선택되는, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 배양 전 배양배지에 칼슘이 추가로 첨가되는, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 칼슘이 0.2 μM 내지 10 mM의 농도로 첨가되는, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 조건화 배양액 내 칼슘이 0.02 μM 내지 10 mM의 농도로 존재하는, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 배양 전 배양배지에 무첨가배지(basal media), 혈청대체제(serum replacement) 및 혈청(serum)으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질이 추가로 첨가되는, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 조성물.
락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)을 포함하고, 미용학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 추가로 포함하며, 여기서 상기 세포는 지방유래 중간엽 줄기세포인, 탈모 완화, 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)을 포함하고, 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 추가로 포함하며, 여기서 상기 세포는 지방유래 중간엽 줄기세포인, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 피부 외용제로 제형화된, 탈모 완화, 방지 또는 치료용 약제학적 조성물.
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