KR102541493B1

KR102541493B1 - 모유두전구세포로부터 분리된 엑소좀 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102541493B1
Application number: KR1020220053576A
Authority: KR
Inventors: 김성하; 최혜인
Original assignee: 주식회사 셀파크글로벌
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2023-06-13
Also published as: KR102541490B1; KR20210151454A; KR20220080049A; KR20220080050A; KR102403851B1

Abstract

본 발명은 모유두전구세포에서 분리된 엑소좀에 관한 것으로, 탈모의 예방, 개선, 치료 효과가 우수할 뿐만 아니라 피부 개선, 상처 치유 효과 또한 뛰어난 모유두전구세포로부터 분리된 엑소좀 및 이의 다양한 용도를 제공할 수 있다.

Description

모유두전구세포로부터 분리된 엑소좀 및 이의 용도{Exosome isolated from dermal papilla precursor cells and uses thereof}

본 발명은 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 모유두전구세포에서 분리된 엑소좀 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.

탈모란 모발 주기에서 성장기, 퇴행기, 휴지기를 거쳐 모발이 두피로부터 빠지는 현상으로서, 일반적으로 대략 3-5년 동안 모발의 성장과 탈모가 주기적으로 발생하게 된다. 하지만 여러 요인들에 의해 성장/탈모의 균형이 깨지면서 하루에 탈모된 모발수가 100 여개 이상이 될 경우, "탈모증"이란 질환으로 판단하게 된다. 이러한 탈모증의 요인으로는 유전이거나 남성 호르몬의 변성과 같은 내적인 요인과 일상생활에서의 스트레스 및 두피에 쌓여가는 해로운 물질 (과산화지질 등)에 의한 외부적인 요인들로 알려져 있고, 대부분은 남성 호르몬의 변성 (테스토스테론에서 디하이드로테스토스테론으로 변성)이다.

일반적인 탈모증 치료방법에는 대표적인 탈모 치료약으로 알려진 프로페시아, 아보다트와 같은 약물 치료법과 타인의 모발을 이식받는 모발 이식법이 있다. 약물 치료에 많이 사용되는 프로페시아나 아보다트 등은 원래 전립선비대증의 치료약물로 알려져 있었으나, 발모 효과 또한 입증되어 시판된 약물로서 효능은 뛰어나지만 남성에게는 발기부전증, 여성에게는 불임 등의 부작용이 보고되고 있다. 이에 비해 모발 이식법은 본인 혹은 타인의 모발을 이식하는 방법이므로 가장 뛰어난 효과를 보이지만 근본적인 원인을 치료하는 것이 아니므로 일시적이고 또한 이식할 때 통증이 유발되는 문제점이 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서는 생체 유래의 물질 또는 성분을 유효성분으로 사용할 수 있고, 상기 생체 유래의 물질의 예로는 엑소좀이 있다. 엑소좀 (Exosome)은 지질-이중층으로 구성된 소포 (vesicle)로, 세포가 세포 외로 분비하는 물질의 구성체이다. 엑소좀은 세포-세포 간의 커뮤니케이션 및 세포성 면역을 중재하는 기능적인 역할을 수행하기 위해, 세포 내의 생체분자인 단백질, 생체활성 지질 및 RNA (miRNA)를 수송(운반)하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 엑소좀은 알츠하이머 등 신경질환의 바이오마커로도 연구되고 있으며, 뇌척수액과 혈액을 분리하는 혈액뇌관문 (blood-brain barrier, BBB)을 투과할 정도로 선택적 투과성이 높아 특정 약물의 나노전달체 (nanocarrier)와 같은 약물 전달 시스템의 개발에도 활용되고 있다.

탈모 치료제와 관련된 선행기술로는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 (등록특허공보 제10-2112736호), 아이론을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 (공개특허공보 제10-2019-0046697호) 등이 있으나 이들은 화학적 약물 치료제와 관련된 것이어서 본 발명과 기술적 특징이 상이하다.

한편, 화학 성분 기반의 치료제의 경우 부작용도 함께 수반되는 경우가 많기 때문에 특정 질환에 대한 치료 효과는 우수하면서도 부작용은 거의 없는 약물에 대한 개발 필요성이 높아지고 있다. 이에 본 발명자들은 엑소좀의 효능에 대해 연구한 결과, 모유두전구세포로부터 엑소좀을 분리하여 이의 다양한 용도에 대한 발명을 완성하고자 하였다.

등록특허공보 제10-2112736호 공개특허공보 제10-2019-0046697호

Gnedeva et al., PLoS One 10, e0116892, 2015

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 부작용이 거의 없으면서도 탈모의 예방, 개선 또는 치료 효과, 피부 개선 효과 및 상처의 치료 효과가 우수한 모유두전구세포 유래의 엑소좀 및 이를 유효성분으로 포함하는 탈모의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물, 피부 개선용 조성물, 상처 또는 흉터 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 필러용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 엑소좀을 포함하는 조성물을 이용하여 탈모의 예방, 개선 또는 치료 방법, 피부 개선 방법, 상처 또는 흉터를 치료하는 방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 모유두전구세포 또는 모유두전구세포 배양물로부터 분리된 엑소좀을 제공한다.

본 발명의 엑소좀은 모유두전구세포 (DPPC, dermal papilla precursor cells) 유래이며, 상기 모유두전구세포는 인간 유래 모유두전구세포, 마우스 유래 모유두전구세포 또는 이들의 배양물로부터 유래된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기의 모유두전구세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능줄기세포, 조혈모세포, 신경줄기세포, 중간엽줄기세포 등을 포함하는 인간 유래 줄기세포 또는 마우스 유래 줄기세포로부터 분화되거나 또는 제작된 모유두전구세포 또는 이들의 배양물로부터 분리되는 것일 수 있다.

상기 배양물은 상기 인간 또는 마우스 유래의 줄기세포 또는 이들로부터 분화되거나 또는 제작된 모유두전구세포를 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 또는 상기 배양액의 건조, 여과 및/또는 농축물을 의미할 수 있고,

상기 배양액은 1 내지 7일 동안 배양할 수 있고, 바람직하게는 12시간 내지 120시간, 더욱 바람직하게는 24시간 내지 96시간, 더욱 바람직하게는 48시간 내지 96시간, 또는 60시간 내지 84시간, 더욱 바람직하게는 72시간 동안 배양한 후, 배양액을 수거하고 원심 분리하여 수득한 상등액인 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상등액에서 크기-배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography), 밀도구배 원심분리 (density gradient centrifugation), 분별 원심분리 (differential centrifugation), 한외여과 (ultrafilteration), 침전법 (exosome precipitation), 총 엑소좀 추출 키트 (total exosome isolation kit), 면역흡착포획 (immune-absorbent capture), 친화성 방법 (affinity method), 예를 들어, 친화성 포획 (affinity capture), 친화성 정제 (affinity purification), 면역분석법 (immunoassay), 미세유체 분리 (microfluidic separation) 또는 이들의 조합을 수행하여 엑소좀을 추출할 수 있고, 상기 방법 이외에 당업계에서 엑소좀을 분리하기 위해 통상적으로 사용하는 방법에 의해서도 분리할 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 배양액을 200-400 x g에서 5 내지 20분간 원심분리 하여 남아있는 세포와 세포 잔여물을 제거한 뒤, 상층액을 취하여 9,000-12,000 x g로 60-80분간 고속원심 분리한 후, 다시 상층액을 취하여 90,000-120,000 x g로 80-100분간 원심분리하고 상층액을 제거함으로써 하층에 남아 있는 엑소좀을 얻을 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 배양액을 수거하여 300 x g에서 10분간 원심분리 하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하고, 상층액을 취하여 0.22 μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기 (high speed centrifuge)를 이용하여 10,000 x g, 4℃에서 70분간 원심분리 한다. 원심분리 된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000 x g, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 하층에 남아있는 엑소좀을 분리할 수 있다. 엑소좀은 상기 방법 이외에 당 업계에서 엑소좀을 분리하기 위해 통상적으로 사용하는 방법에 의해서도 추출할 수 있다.

본 발명의 모유두전구세포로부터 분리된 엑소좀의 크기는 30 내지 200nm일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 180 nm, 더욱 바람직하게는 50 내지 150nm의 크기일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 엑소좀은 세포 당 1x10¹⁶/cell 내지 1x10¹⁷/cell, 바람직하게는 2x10¹⁶/cell 내지 5x10¹⁶/cell 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 엑소좀은 CD63, CD9, CD81 중 선택되는 어느 하나 이상의 마커가 발현될 수 있다.

상기 마커의 발현율은 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 상기 마커 중 CD63의 발현율은 80% 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 90% 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 엑소좀은 모유두전구세포의 배양 방법에 따라 분리되는 엑소좀의 양이 달라질 수 있다. 일반적인 세포 배양 방법인 2차원 배양에 비해 3차원 배양방법으로 배양하거나 저산소 배양, 다른 세포와의 혼합 배양에 따라 분리되는 엑소좀의 수가 달라질 수 있다.

구체적으로 3차원 배양방법은 세포가 배양접시에 부착되지 않고 액체배지에 부유상태로 배양되는 방법을 의미하는 것으로, 바람직하게는 모유두전구세포를 10 ㎍/㎖ FGF2, 100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 10 % FBS (Fetal bovine serum) DMEM/F12 + glutamax (1:1)에서 배양한 세포를 사용하였다. 모유두전구세포는 계대 배양 (passage) 2~3 세포를 트립신으로 회수한 다음 Ultra-low cluster, 96 well 배양접시에 well당 10⁴개의 세포를 10 % DMEM/F12 + glutamax (1:1) 배지에서 24 시간 동안 세포배양기에서 배양한다. 배양 후에는 DMEM/F12 + glutamax (1:1) 무혈청 배지로 바꿔준 후 48 시간 배양조건 하에 배양되는 것일 수 있다.

저산소 배양의 경우 대기 중 산소의 양이 0.1 내지 10% 인 조건일 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 2 % 산소조건 하에 배양되는 것일 수 있다.

다른 세포와의 혼합 배양은 동일한 배양접시 또는 세포배양 insert (Transwell 등) 조건 하에서 배양되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 모유두전구세포를 Ultra-low cluster, 96 well 플레이트에 well당 10⁴개 넣고 10 % DMEM/F12 + glutamax (1:1) 배지에서 24 시간 동안 세포배양기에서 배양할 수 있다.

상기 배양 후, 배양배지를 제거하고 well당 10⁴개의 각질형성세포를 넣고 세포배양기에서 배양한다. 24 시간 후, 보충제(Supplement)가 없는 Epilife 배지를 이용하여 세척하고 배지를 넣어 배양할 수 있고, 배양 시간은 24시간 내지 72시간, 바람직하게는 48시간 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

혼합 배양되는 세포는 피부 및 모발에 관련된 세포로 모유두전구세포, 모유두세포, 각질형성세포, 외측모근초세포, 멜라닌형성세포, 섬유아세포 등 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 약학 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 중에서 선택되는 조성물일 수 있다.

본 발명에서의 약학 조성물은 정제, 캅셀제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등을 포함하는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 제제시에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여, 국소투여 등의 방식으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 섭취 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg(체중)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 화장료 조성물은 화장수, 로션, 에센스, 크림 등의 제형으로 제조될수 있으며, 이외에도 마사지 크림, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 샤워겔, 샤워크림, 자외선차단제, 핸드로션, 헤어로션, 비누, 샴푸, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 오일, 클렌징 크림, 두피 세정제 등의 형태로도 제조될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물의 제조시에는 화장료 제조시 통상적으로 사용되는 포함되는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 추가적으로 포함할 수 있고, 또한, 당 업계에서 통상적으로 제조되는 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에서의 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 당 업계에서 식품 조성물을 제조하는데 통상적으로 사용하는 첨가제, 향료, 증점제, 안정화제, pH 조절제 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물의 제조방법은 당 업계에서 식품을 제조하는 데에 통상적으로 사용되는 방법으로 제조될 수 있으며, 특정 방법으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 탈모의 예방, 개선, 치료용 약학적 조성물 또는 탈모의 예방, 개선용 화장료 조성물, 탈모의 예방, 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 탈모는 안드로겐성 탈모, 휴지기 탈모, 약제성 탈모, 기계적 탈모, 외상성 탈모, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모, 선천성 탈모, 원형 탈모, 머리 백선, 전두 탈모, 감모증, 유전성 단순 감모증 및 전신 탈모를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 탈모의 예방, 개선용 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등을 포함하는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 또는 흉터의 개선, 치료용 조성물을 제공한다.

상기 상처는 피부에 난 상처를 의미하며, 구체적으로는 당뇨발, 욕창, 화상, 열상(쓸린 상처), 자가 치유능력이 현저히 떨어져 있는 만성상처 등과 같이 손상된 피부를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 상처 또는 흉터 치료용 약학적 조성물은 손상된 피부 또는 흉터 부위의 세포 재생 능력을 촉진하여 정상 피부와 같이 회복시켜 손상된 피부 또는 흉터를 치료할 수 있음을 의미한다.

상기 상처 또는 흉터의 개선, 치료용 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.

상기 피부 개선은 피부 미백, 주름 개선, 탄력 증진, 피부 재생, 피부 보습, 노화 방지, 피부 자극 완화, 여드름 예방 또는 개선, 아토피 예방 또는 개선 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 필러용 조성물을 제공한다.

상기 필러용 조성물은 발모 촉진, 탈모의 예방, 개선 또는 치료용, 피부 개선용, 상처의 치료용 등으로 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 필러 조성물의 투여 방법은 특별한 방식으로 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 다양한 투여 방법으로 투여될 수 있으나, 바람직하게는 주사 투여 방식으로 투여될 수 있다.

이에 제한되는 것이 아니며 당 업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다.

상기 필러용 조성물은 두피를 포함하는 피부 영역에 주사될 수 있으며, 바람직하게는 진피에 투여될 수 있다. 투여시에는 피부의 표면에서 약 1㎜ 이하의 깊이에서 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 약 0.8㎜ 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.6㎜ 이하 또는 약 0.4㎜ 이하 깊이에서 주사될 수 있다. 상기 필러용 조성물은 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것 이외에, 필러를 제조하는데 당 업계에서 통상적으로 사용되는 첨가제, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 필러용 조성물의 제조 방법은 필러용 조성물을 제조하는데 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하고, 특정 제조 방법으로 국한되는 것은 아니다.

상기 필러용 조성물의 제조 형태 또한 필러용 조성물을 제조하는데 통상적으로 제조될 수 있는 형태로 제조될 수 있으며, 특정 제형으로 국한되는 것은 아니다.

상기 엑소좀이 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 필러 조성물의 유효성분으로 포함될 경우 제한되는 것은 아니나 1.0x10⁶입자 수 (particles) 내지 1.0x10¹²입자 수 (particles)로 포함될 수 있다. 상기 엑소좀의 함량이 1.0x10⁶입자 수 미만인 경우 그 효과가 미미할 수 있고, 1.0x10¹²입자수를 초과하는 경우 인체에 독성을 유발시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 엑소좀을 이용하여 탈모의 예방, 개선, 또는 치료 방법, 피부 개선 방법, 상처 또는 흉터의 치료 방법 등을 제공할 수 있다.

본 발명은 모유두전구세포에서 분리된 엑소좀에 관한 것으로, 탈모의 예방, 개선 치료 효과가 우수할 뿐만 아니라 피부 개선, 상처 치유 효과 또한 뛰어난 모유두전구세포로부터 분리된 엑소좀 및 이의 다양한 용도를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 엑소좀의 세포에서의 추출 값을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 엑소좀의 마커 발현 분포도를 유래 세포별로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 엑소좀의 세포증식 평가결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 따른 엑소좀이 모낭에 미치는 영향(모낭 길이성장)에 대해 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 엑소좀이 모발 성장 주기에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본발명에 따른 엑소좀의 모낭에서의 세포증식 평가결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 엑소좀의 모유두세포에서의 성장인자 발현 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 8a, 도 8b및 도 8c는 본 발명에 따른 엑소좀의 모발성장과 관련된 유전자 발현의 평가결과를 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 본발명에 따른 엑소좀이 노화된 모유두세포에서의 노화 회복 평가결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 엑소좀의 세포이동능 평가결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1 및 2>

본 발명의 엑소좀을 분리하기 위해 다음의 문헌 [Gnedeva et al., PLoS One 10, e0116892, 2015]을 참고하여 모유두전구세포를 준비하였다. 상기 방법에 따라 제조된 모유두전구세포를 이용하여 실시예 1은 저산소 조건인 1 % 산소조건에서 배양, 실시예 2는 일반 배양조건인 5% 이산화탄소, 37℃ 세포배양기에서 배양하였다.

모유두전구세포를 Ultra-low cluster, 96 well 배양접시에 1 well당 10⁴개의 세포를 10 % DMEM/F12 + glutamax (1:1) 배지에서 24시간 동안 배양한다. 배양 후 DMEM/F12 + glutamax (1:1) 무혈청 배지로 교체하고 48시간 동안 배양한 후, 배지를 수거하여 300 x g에서 10분간 원심분리 하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하고, 상층액을 취하여 0.22 μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기(high speed centrifuge)를 이용하여 10,000 x g, 4℃에서 70분간 원심분리 하였다. 원심분리 된 상층액을 다시 취하여 초고속원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000 x g, 4℃에서 90분 간 원심분리 하여 상층액을 제거함으로써 하층에 남아있는 엑소좀을 분리하여 엑소좀을 수득하였다.

<비교예 1 및 2>

실시예 1 및 2와 엑소좀 분리방법은 동일하되, 모유두전구세포 대신 비교예 1인 섬유아세포 또는 비교예 2인 모유두세포를 이용하여 엑소좀을 분리하여 수득하였다.

<실험예 1> 본 발명에 따른 엑소좀의 특성 평가 (엑소좀 크기)

본 발명의 엑소좀 특성을 평가하기 위해 실시예 1, 2를 이용하여 모유두전구세포에서 분리된 엑소좀의 크기를 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 엑소좀은 50~150nm사이에 분포하였고, 평균 크기는 63.6nm로 나타났다.

<실험예 2> 본 발명에 따른 엑소좀의 특성 평가 (세포당 추출되는 엑소좀 수)

본 발명의 엑소좀 특성을 평가하기 위해 실시예 및 비교예 2를 이용하여 세포 당 분비되는 엑소좀의 수를 비교 평가하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 모유두전구세포에서 분비된 엑소좀은 5x10¹⁶/cell, 비교예 2의 모유두세포에서 분비된 엑소좀은 2x10¹⁶/cell로 나타나 모유두전구세포에서 분비되는 엑소좀의 수가 2.5배 이상 높은 것을 알 수 있었다(도 1).

<실험예 3> 본 발명에 따른 엑소좀의 특성 평가 (발현 마커 확인)

본 발명의 엑소좀 특성을 평가하기 위해 실시예 및 비교예 1, 2를 이용하여 엑소좀에서 발현되는 마커의 분포도를 평가하였다. 평가 결과, 각 세포에서 엑소좀 발현 마커인 CD63, CD9, CD81가 공통적으로 발현되었으나, 마커별로 발현 비율이 다르게 나타났다. 본 발명의 실시예인 모유두전구세포의 엑소좀은 CD63 발현율이 90~95% 정도로 나타났다. 비교예 1의 섬유아세포의 엑소좀은 CD63 발현율은 80%, CD81이 약 19%, CD9가 약 1% 정도로 나타났다. 비교예 2의 모유두세포의 엑소좀은 CD63이 98% 이상으로 나타났고, CD9, CD81의 발현율은 매우 낮은 것으로 나타났다(도 2).

<실험예 4> 세포증식평가

본 발명에 따른 엑소좀의 모발 성장 및 피부 개선 효과를 평가하기 위해 모낭 형성 및 모발 성장에 중요하다고 알려진 모유두세포 (Dermal papilla cell; DPC), 외측모근초세포 (outer root-sheath cell; ORSC), 피부 세포인 각질형성세포(Keratinocyte cell; KC)에 대해 세포 증식을 평가하였다.

대조군은 아무런 처리를 하지 않은 것, 양성대조군은 탈모치료에 사용되는 미녹시딜 (Minoxidil), 비교예는 섬유아세포 유래의 엑소좀을 처리한 것이며, 평가결과는 도 3에 도시하였다. 실험방법은 96 well배양접시 (well plate)에 well 당 5 x 10³ 개의 모유두세포를 10 % DMEM 배지에서 24 시간 배양한다. 24시간 후 무혈청 DMEM 배지로 교체하고 실시예 1의 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 양성대조군인 미녹시딜 (1 uM)을 처리하였다. 48시간 배양 후 무혈청배지 75㎕와 MTT 용액을 25㎕를 넣어주고 3시간 배양한 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포증식 여부를 확인하였다. 세포증식률은 흡광도를 측정한 결과를 음성대조군에 대비하여 세포 증식의 증가 비율을 그래프로 나타낸 것이다.

모낭의 외측모근초세포와 각질형성세포는 96 well 배양접시 (well plate)에 well 당 1 x 10⁴ 개의 세포를 Epilife 배지에 24 시간 배양한다. 24시간 배양후 보충재(supplement)가 없는 배지로 교체하고 실시예 1의 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 양성대조군인 미녹시딜 (1 μM)을 처리한 후 위와 동일한 조건으로 진행하였다.

평가 결과, 본 발명에 따른 실시예 1은 모유두세포, 외측모근초세포, 각질형성세포에서 모두 증식이 활발하였으며, 특히 실시예 1은 탈모치료제로 사용되는 미녹시딜 대비 세포 증식률이 우수함을 알 수 있다(도 3).

<실험예 5> 사람 모낭 기관 배양 시험을 통한 모낭 성장영향평가

사람의 모낭 성장에 미치는 본 발명의 엑소좀의 영향을 평가하기 위하여, 사람 모낭 기관 배양 시험 (ex vivo hair follicle organ culture)을 수행하였다. 보다 구체적으로, 두피 조직을 모낭 단위로 분리하고, 분리된 모낭의 피지선 아래 부분을 잘라내어 남은 상태의 모낭을 사용하였다. 준비된 모낭에 실시예 1, 2 및 양성대조군인 미녹시딜을 처리하고 3 일째와 6 일째 자라나는 모발의 길이를 측정한 다음, 이를 음성대조군과 비교하여 사람 모낭의 길이 성장 및 성장 주기를 평가하였다.

5-1. 모낭길이성장평가 1

세포 및 배양조건을 달리하여 분리한 모유두전구세포 유래의 엑소좀이 모낭의 길이성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 사람 모낭 조직을 2 mM L-glutamine, 100 U/ml streptomycin, 10 ng/ml hydrocortisone, 10 μg/ml insulin 이 함유되어 있는 Williams E 배양 배지에서 배양하고, 실시예 1의 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 실시예 2의 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 양성대조군인 미녹시딜 (1 μM) 및 비교예 2의 엑소좀 (1.0x10⁹particles)을 처리하여 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양 3일째와 6일째에 성장한 모낭의 길이를 현미경의 눈금자를 이용하여 측정하였다. 평가결과는 도 4a에 나타내었다.

평가 결과, 아무런 처리를 하지 않은 대조군과 비교예 1은 6일 동안 모발이 1mm 성장하였고, 양성대조군은 약 1.5mm 성장하였다. 반면에 저산소 배양한 실시예 1은 6일 동안 약 2.2mm, 일반 배양한 실시예 2는 1.8mm 성장하였는바, 저산소 배양 후 분리한 엑소좀이 양성대조군 대비 20% 이상 모발 성장 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

5-2. 모낭길이성장평가 2

세포 및 배양방법을 달리하여 분리한 모유두전구세포 유래의 엑소좀이 모낭의 길이성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 사람 모낭 조직을 2 mM L-glutamin, 100 U/ml streptomycin, 10 ng/ml hydrocortisone, 10 μg/ml insulin 이 함유되어 있는 Williams E 배양배지에서 배양하고, 3차원 배양한 실시예 2의 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 3차원 배양한 비교예 2의 엑소좀 (1.0x10⁹particles) 및 3차원 배양 및 각질형성세포와 혼합 배양한 실시예 2의 엑소좀 (1.0x10⁹particles)을 처리하여 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양 3일 째와 6일 째에 성장한 모낭의 길이를 현미경의 눈금자를 이용하여 측정하였다. 평가 결과는 도 4b에 나타내었다.

평가 결과, 일반 배양방법으로 배양되어 분리된 실시예 2에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles)은 6일 동안 모발이 0.6mm 성장하였고, 3차원 배양한 비교예 2에서 분리한 엑소좀(1.0x10⁹particles)은 약 1.1mm 성장하였다. 이와 달리 3차원 배양한 실시예 2에서 분리한 엑소좀(1.0x10⁹particles)은 1.2mm 성장하였고, 3차원 배양 및 각질형성세포와 혼합 배양된 실시예 2에서 분리한 엑소좀(1.0x10⁹particles)은 약 1.4mm성장하였는바, 일반 배양방법과 달리 3차 배양방법에 의해 배양한 뒤 분리된 엑소좀의 모낭 길이 성장률이 더 뛰어나며, 각질형성세포와 함께 처리할 경우 상승효과가 있음을 알 수 있다.

5-3. 모발성장주기 평가

본 발명이 모발의 성장주기에 미치는 영향을 평가하기 위하여 모낭 조직에서 성장기 모낭만을 분리하여 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 대조군, 양성대조군(1 μM) 및 비교예 1에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles)을 처리한 후 모낭의 성장주기를 평가하기 위하여 다음의 문헌 [Langan et al., Experimental dermatology, 2015]을 참고하여 실험하였다. 성장주기구분 기준은 사람의 모낭을 현미경으로 관찰한 후 모간(hair shaft)과 모유두세포 간의 거리를 비교하여 분류하였다. 성장기와 퇴행기 1~3 기로 구분하여 점수로 구분하였고, 결과는 도 5에 나타내었다.

평가결과, 대조군 처리 모낭은 성장기 없이 대부분 퇴행기로 전환되었고, 비교예 1에서 분리한 엑소좀을 처리한 모낭은 대조군보다 퇴행기는 짧지만 성장기가 전혀 나타나지 않았다. 미녹시딜을 처리한 모낭도 비교예 1에서 분리한 엑소좀을 처리한 모낭과 결과가 유사하게 나타났다. 이와 달리 본 발명의 실시예 2 (일반 배양 조건)에서 분리한 엑소좀을 처리한 모낭은 퇴행기가 20%로 매우 짧고 초기퇴행기는 40% 이상 유지되었다. 실시예 1 (저산소 조건)에서 분리한 엑소좀을 처리한 모낭은 퇴행기가 전혀 나타나지 않았고, 초기퇴행기가 60%, 성장기가 20%로 나타나 모발이 계속 성장하고 있음을 알 수 있다.

5-4. 모낭에서의 모낭기질세포증식평가

본 발명의 엑소좀이 모발의 직접적인 길이성장에 관여하는 모낭기질세포 (hair matrix) 증식에 미치는 영향을 평가하기 위해 모낭 조직에서 성장기 모낭만을 분리하여 본 실험에 사용하였다. 사람 모낭 조직은 2 mM L-glutamin, 100 U/ml streptomycin, 10 ng/ml hydrocortisone, 10 μg/ml insulin이 함유되어 있는 Williams E 배양배지 이용하여 대조군, 양성대조군 (1 μM) 및 3차원 배양한 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles)을 2 일간 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양 후 사람 모낭을 동결하여 절단한 후 Ki-67에 대한 면역 형광 염색을 진행하였다. 모낭 기질세포에 Ki-67 양성인 세포가 많을수록 모낭성장이 증가된 것으로 평가하였고 결과는 도 6에 나타내었다.

평가결과, 대조군과 양성대조군인 미녹시딜에 비해 본 발명의 실시예 1, 2에서 분리된 엑소좀을 처리한 모낭조직에서 Ki-67 양성인 세포 (붉은색)가 더 많이 발현하였고, 이를 통해 세포증식이 활발한 것을 알 수 있다.

<실험예 6> 모발성장관련 성장인자 발현 평가

본 발명의 엑소좀이 모발성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 모유두세포에서 모발성장에 중요한 유전자들의 발현을 확인하였다. 6 well배양접시 (well plate)에 well당 5.0x10⁴ 개의 모유두세포를 10 % DMEM 배양배지로 24시간 배양하였다. 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 2번 세척한 후, 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지에 배양한다. 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 대조군 및 양성대조군 (1 μM)을2 시간 처리한 후 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR을 이용하여 모발 성장에 관여하는 성장인자인 FGF7, FGF10, IGF1 및 PDGF 유전자의 발현 여부를 평가하였고, 결과는 도 7에 나타내었다.

평가결과, 본 발명의 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀은 양성대조군인 미녹시딜 대비 모든 성장인자의 발현율이 높았으며, 특히 실시예 1에서 분리한 엑소좀을 처리한 성장인자의 발현이 가장 높은 것을 알 수 있다.

<실험예 7>모낭 형성능 관련 유전자 발현 평가

본 발명의 엑소좀이 모낭형성능을 얼마나 유지시키는지 평가하기 위해 모유두세포의 모낭형성능에 관여하는 유전자인 프로테오글리칸 (Proteoglycan), Wnt 표적 유전자, 모유두세포 마커 유전자의 발현여부를 확인하였다.

6 well 배양접시 (well plate)에 well당 5.0x10⁴ 개의 모유두세포를 10 % DMEM 배양배지로 24시간 배양하였다. 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 2번 세척한 후, 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지에 배양한다. 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 대조군 및 양성대조군 (1 μM)을 4 시간 처리한 후 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR을 이용하여 각 유전자의 발현 여부를 평가하였고, 결과는 도 8a 내지 8c에 나타내었다.

7-1. 프로테오글리칸 관련 유전자 발현 평가

프로테오글리칸은 피부 및 모발에 존재하는 다형성 거대분자로, 성장인자 및 콜라겐과 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 모발성장주기에서 휴지기 모낭에서는 감소하며, 성장기 모낭에서는 증가되는 것으로 밝혀져 있다(Couchman, 2017, Journal of Dermatological Science). 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀, 대조군 및 양성대조군을 처리한 모유두세포를 Real-time PCR을 이용하여 프로테오글리칸의 발현에 관여하는 Versican, Biglycan, Syndecan1 유전자의 발현을 평가하였고, 결과는 도 8a에 나타내었다.

평가결과, 본 발명의 실시예 2에서 분리한 엑소좀은 양성대조군 수준 또는 그 이상의 유전자가 발현되었다. 본 발현의 실시예 1에서 분리한 엑소좀은 모든 유전자의 발현이 양성대조군 이상으로 높게 나타남을 알 수 있다.

7-2. Wnt 표적유전자발현평가

Wnt 신호전달 체계는 모낭형성 및 분화 과정의 핵심 물질이며, 관련 유전자들의 활성화가 모낭의 성장주기에서 휴지기에서 성장기로 진입하는데 중요한 것으로 잘 알려져 있다 (Lim & Nusse, 2013). 본 발명의 엑소좀이 Wnt 신호전달체계의 주요 표적유전자의 발현을 조절하는지 확인하기 위하여, 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀, 대조군 및 양성대조군을 처리한 모유두세포를 Real-time PCR을 이용하여 Wnt 표적 유전자의 발현에 관여하는 LEF1, Axin2, beta-catenin, Wnt5a의 유전자 발현울을 평가하였고, 평가는 음성대조군의 유전자 발현형에 비례하여 나타나는 값을 그래프로 나타내었다. 결과는 도 8b에 나타내었다.

평가 결과, 본 발명의 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀은 LEF1, Axin2, beta-catenin, Wnt5a의 발현율이 대조군 및 양성대조군에 비해 높게 나타났으며, 특히 양성대조군 대비 LEF1, Axin2는 발현율이 2배 이상 높았고, beta-catenin, Wnt5a는 30~40% 이상 높게 나타남을 알 수 있다.

7-3. 모유두세포대표 유전자 발현 평가

모유두전구세포의 마커로 잘 알려진BMP4, SOX2, Corin의 발현율이 증가할수록 모낭 형성능이 증가되는 것으로 알려져 있다. 실시예 1, 2에서 분리한 엑소좀, 대조군 및 양성대조군을 처리한 모유두세포를 Real-time PCR을 이용하여 모유두세포 대표 유전자인 BMP4, SOX2, Corin 유전자의 발현을 평가하였고, 결과는 도 8c에 나타내었다.

평가 결과, 본 발명의 실시예 1, 2에서 분리된 엑소좀 BMP4, SOX2, Corin유전자의 발현율이 대조군 및 양성대조군 대비 적게는 3배 이상, 많게는 10배 이상 높게 나타났음을 알 수 있다.

<실험예 8>노화된 모유두세포에서의 노화회복평가

모유두세포는 계대 배양이 거듭될수록 노화 (Cellular senescence)가 되어 모낭형성능을 상실한다. 본 발명의 엑소좀이 모낭형성능을 상실한 노화된 모유두세포의 모낭 형성능 및 세포노화 회복에 효과가 있는지를 확인하였다.

8-1. 모낭 형성능 회복 (rejuvenation) 평가

알칼리 인산분해효소 (Alkaline Phosphatase, AP)는 모낭형성능의 대표 마커로, 모유두세포가 노화되면 알칼리 인산분해효소의 활성이 감소한다. 6 well 배양접시 (well plate)에 3.0x10⁴ 개의 모유두세포를 10 % DMEM으로 24시간 배양하였다. 무혈청 DMEM 배지로 2번 세척한 후, 실시예 1, 2, 비교예 1에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles) 및 대조군을 처리하였다. 48 시간 뒤, TBS (Tris-buffered saline)로 두 번 세척한 후 차가운 아세톤을 이용하여 10분 동안 고정하고 TN (0.01M Tris-HCl and 0.1M NaCl, pH8.0)에 NBT/BCIP을 1:50의 비율로 혼합된 용액을 넣어 10분간 반응한다. TBS (Tris-buffered saline)로 다시 두 번 세척한 후 현미경으로 관찰하며, AP의 활성은 보라색이 염색되는 정도로 확인할 수 있다. 결과는 도 9a에 도시하였다.

평가 결과, 보라색으로 염색된 세포의 비율이 대조군 및 비교예 1에서 분리한 엑소좀에 비해 본 발명의 실시예 1, 2에서 분리된 엑소좀에서 높게 나타났다. 이를 통해 본 발명의 엑소좀이 AP의 활성을 증가시키고, 모낭형성능도 증가시킴을 알 수 있다.

8-2. 모유두세포에서의 노화 방지 평가

본 발명의 엑소좀이 노화된 모유두세포의 세포 노화 회복 (rejuvenation)에 효과가 있는지를 확인하기 위해서 세포 노화 마커인 SA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase) 염색을 수행하였다. 6 well 배양접시 (well plate)에 3.0x10⁴ 개의 모유두세포를 10% DMEM으로 24시간 배양하였다. 무혈청 DMEM 배지로 2번 세척한 후, 실시예 1에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 대조군 및 양성대조군인 미녹시딜 (1 uM)을 48시간 동안 처리하였다. Senescence β-galactosidase Staining Kit를 이용하여 프로토콜에 따라 염색하였다. 세포의 노화는 SA-β-gal 염색(파란색)이 많이 될수록 노화가 되었음을 확인할 수 있고, 결과는 도 9b에 도시하였다.

평가 결과, 본 발명의 실시예 1에서 분리한 엑소좀은 대조군, 양성대조군 대비 SA-β-gal 염색된 세포의 비율이 낮음을 확인하였다. 이를 통해 실시예 1에서 분리한 엑소좀이 세포의 노화 억제를 통해 노화 방지 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

<실험예 9> 세포이동능 평가

본 발명에 따른 엑소좀의 상처 치료 및 피부 개선 영향을 평가하기 위해 각질형성세포의 세포이동능을 확인하였다. 6 well 배양접시 (well plate)에 well당 1.0x10⁵ 개의 각질형성세포를 넣어준 후 24시간 동안 배양하였다. 멸균된 10 ㎕ 팁을 이용하여 배양접시 내 배양중인 세포를 긁어서 상처(wound)를 낸 후, PBS (phosphate buffer saline)로 세척하였다. Epilife 배지에 실시예 1에서 분리한 엑소좀 (1.0x10⁹particles), 대조군 및 양성대조군으로 표피증식인자인 EGF (epidermal growth factor)를 처리하고 12시간 후 현미경을 이용해 세포 이동 정도를 관찰하였다. 상처 낸 면적이 채워지는 정도를 현미경으로 관찰하여 세포이동능을 평가하였으며, 결과는 도 10에 도시하였다.

평가결과, 대조군에 비해 실시예 1에서 분리한 엑소좀에 의해 세포의 이동능이 증가하여 상처 면적 부위가 감소하였으며, 양성대조군인EGF와 세포이동능이 거의 유사하게 나타났음을 알 수 있다.

Claims

모유두전구세포 또는 모유두전구세포 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 모유두전구세포는 1 내지 2% 산소 조건 하에서 배양되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 모유두전구세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 조혈모세포, 신경줄기세포 또는 중간엽줄기세포 유래인 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 모유두전구세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 조혈모세포, 신경줄기세포 또는 중간엽줄기세포로부터 분화되거나 또는 제작되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 50 내지 150nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 CD63, CD9, CD81 중 어느 하나 이상의 마커가 발현되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 엑소좀의 CD63의 발현율이 80% 이상인 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 1x10¹⁶/cell 내지 1x10¹⁷/cell 포함되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 모유두전구세포는 3차원 배양 또는 각질형성세포, 외측모근초세포, 멜라닌형성세포, 섬유아세포 중 선택되는 어느 하나 이상의 세포와 혼합 배양되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 1.0x10⁶입자 수 내지 1.0x10¹²입자 수로 포함되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 흉터의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.