KR102250401B1

KR102250401B1 - 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액

Info

Publication number: KR102250401B1
Application number: KR1020200000481A
Authority: KR
Inventors: 김준호; 유가은; 이정선; 장송선
Original assignee: 주식회사 바이오솔루션
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2021-05-11
Also published as: WO2021137398A1

Abstract

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)을 포함하는 조건화 배양액(conditioned medium)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 화장료 조성물 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액{Conditioned medium containing high concentration of extracellular vesicles bound to lactoferrin}

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 조건화 배양액을 포함하는 화장료 조성물 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

피부는 표피(Epidermis), 진피(Dermis), 피하지방층(Subcutis)의 세 층으로 구성되어 있으며, 피부 노화 및 재생과 깊은 관련이 있는 층은 진피층이다. 진피층에 존재하는 섬유아세포(Dermal fibroblast)는 진피층의 구조를 유지시키거나 탄성을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix)의 주요 인자인 콜라겐(Collagen)이나 파이프로넥틴(Fibronectin), 엘라스틴(Elastin) 등을 합성하거나 이를 돕는 팀프(TIMP, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase)와 같은 단백질을 생성한다. 하지만 섬유아세포의 손상은 세포외 기질을 감소시키거나 교차결합(Cross link)을 분해하는 메탈로프로테아제(MMP, Matrix Metalloproteinase)를 생성한다. 진피층 내의 세포외 기질의 합성과 분해의 밸런스로 인해 피부의 강도와 탄력성이 유지되며, 내인적인 노화나 외부의 자극으로 인한 노화가 일어나는 것은 분해가 합성을 넘어서 진피층이 유지되지 못하면 일어나는 현상이다.

세포외 소포(Extracellular vesicles)는 최근 각광받고 있다. 세포외 소포는 세포에서 유래하여 세포 밖으로 배출되는 30 ㎚ 내지 1 ㎛ 크기의 인지질 이중층(Phospholipid bilayer) 구조를 가진 베지클이다. 세포외 소포는 엑소좀(Exosome)과 마이크로베지클(Microvesicle)로 구성되어 있으며 이 두 가지는 만들어 지는 경로가 다르다. 엑소좀은 다소포성의 엔도솜(Multivescular endosome) 안에 다양한 크기로 생성된 후 세포 밖으로 방출되고, 마이크로베지클은 세포의 원형질 막(Plasma membrane)이 세포 바깥으로 직접 소포체를 형성하여 방출된다. 근래에 들어 세포외 소포체의 피부 재생이나 발모에 대한 효능이 꾸준히 제시되어 왔다 (J Extracell Vesicles. 2019 Jan 20;8(1):1565885, Sci Rep. 2017 Nov 14;7(1):15560).

기존의 세포 배양액은 세포외 소포의 비율이 낮기 때문에 세포외 소포의 양산이나 비용적인 측면에서 문제가 있어왔다. 본 발명자들은 이전의 연구를 통하여 배양배지에 락토페린/칼슘 조성물을 첨가하여 세포를 배양하면 세포 내 칼슘 농도가 증가하고 이로 인해 배출되는 세포외 소포의 생성량이 현저하게 증가함을 확인하였다. 그러나 상기 방법에 의해 수득한 조건화 배양액의 효능 또는 효과에 대해서는 현재까지 구체적으로 확인된 바 없다.

본 발명자들은 락토페린이 세포외 소포의 생성 신호를 증가시킨다는 이전의 발견에 더하여, 락토페린이 세포외 소포의 표면에 존재하는 GAPDH라는 락토페린의 수용체와 결합하여 세포외 소포와 함께 배출될 수 있을 것으로 가정하였다 [Biochem Cell Biol. 2012 Jun;90(3):329-38. doi: 10.1139/o11-058. Epub 2012 Jan 31.]. 또한 그로 인해 양전하의 락토페린이 세포외 소포의 전하 변화를 유도할 수 있는지에 대한 추가의 연구를 수행하였다.

본 발명자들은 락토페린이 배양액 내 세포외 소포의 개수를 증가시킬 뿐만 아니라 세포외 소포의 음전하를 감소시킴으로써 세포외 소포의 피부세포와의 결합능을 향상시켜 세포외 소포의 피부재생 효과를 강화할 것이라 예상하였다.

이에, 본 발명은 세포외 소포의 함유율을 높이고 세포외 소포의 피부재생 효능을 강화하는 조건화 배양액을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.

본 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 연구하였으며, 그 결과 락토페린이 세포외 소포에 결합하여 세포외 소포의 강한 막 음전하를 감소시킴으로써 세포외 소포의 피부세포와의 결합능을 향상시켜 세포외 소포의 피부재생 효능을 강화하는 것을 발견하였다.

나아가, 본 발명자들은 락토페린을 첨가한 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액이 피부재생 및 피부장벽을 강화할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액은 배양액 내 세포외 소포의 개수가 월등히 많음으로 인해 피부재생 효능을 높이는 양적인 효과와 락토페린의 양전하가 세포외 소포의 음전하를 감소시켜 세포외 소포의 피부세포와의 결합능을 증대시켜 피부재생 효능을 높이는 질적인 효과가 상승적으로 작용하여 피부 재생 효능을 극대화하는 장점이 있다.

또한 본 발명의 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액은 피부장벽 및 보습 역할을 담당하는 인자를 증가시켜 망가진 피부장벽을 회복시키는 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명의 조건화 배양액은 피부재생 강화용 및 피부장벽 강화용 화장품 및 의약품의 원료 물질로 활용될 수 있다.

도 1은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포의 개수를 나노입자 추적 분석기로 측정한 결과이다.
도 2는 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포의 크기를 나노입자 추적 분석기로 측정한 결과이다.
도 3은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포의 모양을 투과 전자 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 4는 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포에 결합되어 있는 락토페린을 투과 전자 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 5는 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포에 결합되어 있는 락토페린의 양을 ELISA로 정량한 그래프이다.
도 6은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포의 막 전하를 제타포텐셜&입도분석기로 측정한 결과이다.
도 7은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포의 섬유아세포와의 결합능을 FACS로 비교한 결과이다.
도 8은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 배양한 배양액을 섬유아세포에 처리하였을 때 모양과 증식율을 MTT 어세이로 확인한 결과이다.
도 9는 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 배양한 배양액에 의한 섬유아세포 내 세포외 기질의 발현 변화를 나타낸 RT-PCR 결과이다.
도 10은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 배양한 배양액으로부터 세포외 소포를 제거한 후 섬유아세포의 증식의 변화를 MTT 어세이로 확인한 결과이다.
도 11은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포를 개수 별로 비교하여 섬유아세포의 증식율을 확인한 MTT 어세이 결과이다.
도 12는 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 생성된 세포외 소포의 피부 조직 투과성을 촬영한 형광현미경 관찰 결과 및 조직 모양을 관찰한 H&E 결과이다.
도 13은 혈청대체제 단독과 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 배양한 배양액에 의해 피부 조직이 분비한 세포외 기질 및 메탈로프로테아제(MMP)의 변화를 확인한 ELISA 결과이다.
도 14는 무첨가 배지와 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 배양한 배양액에 의해 케라티노사이트가 분비한 필라그린의 변화를 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
도 15는 무첨가 배지와 혈청대체제/락토페린/칼슘의 조합으로 배양한 배양액에 의한 피부 표피 조직의 필라그린 복구 정도를 IHC로 관찰한 결과이다.

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 세포외 소포와 락토페린의 결합은 세포외 소포와 세포와의 결합을 증대시킬 수 있다. 후술하는 실시예에서 확인되는 바와 같이, 락토페린을 첨가한 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 배양액 내 세포외 소포는 락토페린의 수용체를 가지고 있어 락토페린과 세포외 소포의 결합의 가능성을 가진다. 이 결합은 세포외 소포의 음전하를 감소시켜 세포외 소포와 세포와의 결합을 극대화하는 현상을 유도한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배양배지 (Culture medium)"는 세포를 배양하기 전 배지를 지칭하며, "배양액 또는 조건화 배양액(Conditioned medium)"은 세포를 배양 후 수득한 배지를 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "세포외 소포(Extracellular vesicles)"는 세포막의 구조와 동일한 성분인 인지질 이중층으로 이루어진 세포외로 방출된 나노 크기(30 ~ 2,000 ㎚)의 소포체를 모두 포함한다. 따라서 세포에서 배출되는 "엑소좀(Exosome)"과 "마이크로베지클(Microvesicle)"을 포괄한다. 나아가, 용어 "세포외 소포"는 엑토좀(Ectosome), 마이크로파티클(Microparticle), 탈레로좀(Tolerosomes), 프로스타토좀(Prostatosomes), 카디오좀(Cardiosomes) 및 벡소좀(Vexosomes)을 포괄하는 의미로 사용되기도 한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액 중 세포외 소포의 개수는 1.0 × 10⁸/㎖ 내지 1.0 × 10¹¹/㎖의 범위일 수 있으며, 구체적으로는 1.0 × 10⁹/㎖ 내지 1.0 × 10¹¹/㎖의 범위일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액은 배양 전 배양배지에 락토페린이 0.1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있고, 배양 후 조건화 배양액 중 락토페린은 0.01 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 존재할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액에서 락토페린은 Holo-lactoferrin, Apo-lactoferrin 및 Pis-lactoferrin으로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 락토페린은 합성에 의한 것이거나 추출에 의해 수득된 것일 수 있으며, 사람 또는 사람 외의 동물 유래를 모두 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액은 배양 전 배양배지에 칼슘이 추가로 첨가될 수 있다. 일 구체예에서, 배양 전 배양배지에 상기 칼슘은 0.2 μM 내지 10 mM의 농도로 첨가될 수 있고, 배양 후 조건화 배양액 중 칼슘은 0.02 μM 내지 10 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 칼슘은 칼슘 이온(Ca² ⁺)의 형태로 첨가될 수 있으며, 상기 칼슘 이온의 공급원은 칼슘 이온 공급이 가능한 모든 염을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액은 배양 전 배양배지에 무첨가배지(basal media), 혈청대체제(serum replacement) 및 혈청(serum)으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질이 추가로 첨가될 수 있다. 상기 "혈청대체제"는 무혈청 배지를 제작하기 위한 혈청을 대체하는 단일 물질 및 조성 물질을 지칭한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액의 제조에 사용되는 세포는 인간 또는 동물 유래의 모든 종류의 세포일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세포는 피부재생능이 있는 세포이고, 구체적으로 상기 피부재생능이 있는 세포는 줄기세포일 수 있으나 반드시 줄기세포에 한정되는 것은 아니다. 후술하는 실시예에서는 상기 세포로서 "사람의 지방유래 중간엽 줄기세포(Human adipose-derived mesenchymal stem cell)"가 사용되었으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 중간엽 줄기세포, 예를 들어, 지방(Adipose), 제대(Umbilical cord), 제대혈(Umbilical cord blood), 골수(Bone marrow), 태반 유래, 배아 줄기세포, iPS 유래 줄기세포, 또는 피부 줄기세포일 수 있다. 일 구체예에서, 세포외 소포와의 결합을 확인한 세포인 섬유아세포(Dermal fibroblast)는 음전하를 띄는 사람 또는 사람 외의 동물 유래 세포 모두를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 조건화 배양액 및 미용학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 화장료 조성물은 피부재생 강화용 또는 피부장벽 강화용 용도를 가질 수 있다.

본 발명의 조건화 배양액이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 조건화 배양액 뿐만 아니라 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 화장수, 영양로션, 영양크림, 수분크림, 마사지크림, 아이크림, 에센스, 페이스트, 마스크팩, 패치, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌저, 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 왁스 또는 스프레이의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 조건화 배양액 및 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 피부재생 강화용 또는 피부장벽 강화용 용도를 가질 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 첨가제, 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약제학적 조성물은 피부외용제로 제형화될 수 있으며, 보다 상세하게는 연고, 크림, 젤, 스프레이, 피부 패치, 드레싱, 마스크, 비점착성 거즈 등의 형태로 제조될 수 있다. 또한 상기 약제학적 조성물은 주사제로 제형화될 수 있으며, 보다 상세하게는 피하 주사, 피내 주사 등의 형태로 제조될 수 있다. 또한 상기 약제학적 조성물은 포유동물 투여용, 더 바람직하게는 인간 투여용으로 제조될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며, 부형제, 항산화제, 완충액, 정균제, 분산제, 흡착제, 계면활성제, 결합제, 방부제, 붕해제, 감미제, 향미제, 활택제, 방출조절제, 습윤제, 안정화제, 현탁화제 및 윤활제에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 피부외용제로 제형화된 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 피하 주사 또는 피내 주사로 제형화된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 세포외 소포의 분리 방법, 즉 크기 기반 컬럼(Size Exclusion Columns) 방법은 다른 세포외 소포를 분리하는 방법, 예를 들어 초원심분리(Ultracentrifuge), 농도 구배(Density gradient), 초여과(Ultrafiltration), 면역친화 정제(Immunoaffinity purification)일 수 있으며, 상기 명시된 방법만으로 한정하지 않는다(Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Mar 2;10:131-141).

본 명세서에서 사용되는 용어 "피부 재생(Skin regeneration)"이라 함은 피부 진피층의 피부 재생 효과를 의미하고, 진피층 내 섬유아세포(Dermal fibroblast)의 증식율 증가와 세포외 기질 합성 증가를 포괄적으로 의미한다. 하지만 인체 조직 모델에서의 결과를 바탕으로 진피층만의 효능이 아닌 표피층의 효능일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "NF-CM(Nutrient Full media-Conditioned medium)"은 혈청대체제를 포함한 배양배지에서 배양 후 수득한 배양액을 의미하며, "NFL-CM(Nutrient Full media with Lactoferrin-Conditioned medium)"은 혈청대체제와 락토페린/칼슘 조성물을 포함한 배양배지에서 배양 후 수득한 배양액을 의미한다. 같은 맥락에서, NF-CM에서 분리한 세포외 소포는 "NF-EVs (NF-Extracellular vesicles)"로 표현하고, NFL-CM에서 분리한 세포외 소포는 "NFL-EVs (NFL-Extracellular vesicles)"라 표현한다.

후술하는 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명자들은 배양배지에 넣어준 락토페린이 배양액 내 증가한 세포외 소포와 결합하고, 이 결합으로 세포외 소포의 음전하가 감소하여 세포와의 결합 능력이 증가한다는 것을 확인하였다.

또한 본 발명자들은 상기 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포를 함유하는 조건화 배양액이 피부 섬유아세포의 재생 효능을 강화시키는 것을 피부 섬유아세포의 증식율 증가 및 세포외 기질 발현의 증가로 확인하였다.

또한 본 발명자들은 상기 조건화 배양액의 피부재생 증대 효능이 배양액 내 세포 외 소포의 양적 질적 변화 때문임을 증명하였다.

또한 본 발명자들은 피부 조직 모델을 사용하여 상기 조건화 배양액 내의 세포외 소포가 증대된 피부 조직 투과능을 나타내고 피부 조직이 분비하는 세포외 기질의 양을 증가시키는 것을 확인하였다.

또한 본 발명자들은 상기 조건화 배양액의 피부장벽 유지 및 피부장벽 회복 증대 효능을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 지방 유래 줄기세포 배양액 유래 세포외 소포 확인

실험을 진행하기 위하여 먼저 배양액을 수득하였으며 방법은 하기와 같다.

넓이가 175 ㎠인 세포배양접시(T175 flask)에 사람의 지방유래 중간엽 줄기세포(Human adipose-derived mesenchymal stem cell)를 72시간 동안 배양하였다. 72시간 뒤, 인산 완충 용액으로 세척하고 무첨가배지(Alpha-Minimum Essential Medium, alpha-MEM)를 넣어 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 혈청대체제가 포함된 배지에 칼슘(CaCl₂, sigma, USA)과 락토페린(Lactoferrin, aspira scientific, USA)을 혼합하여 세포에 처리하였다. 이와 함께 혈청대체제만 들어있는 군도 함께 진행하였다. 48시간 뒤 배양액을 수거하여 0.22-um 필터로 거른 후, 최종 배양액을 수득하였다. 락토페린/칼슘 조성물/혈청대체제로 세포 배양 후 수득한 배양액을 NFL-CM(Nutrient Full media with Lactoferrin-Conditioned medium)로 표현하였고 혈청대체제 만으로 세포 배양 후 수득한 배양액을 NF-CM(Nutrient Full media-Conditioned medium)이라 표현하였다.

배양액 내의 세포외 소포를 분리하기 위하여 크기 기반 컬럼(Size Exclusion Columns, IZONscience, New Zealand)을 이용하였다. 크기 기반 컬럼은 35 - 400 ㎚ 이상의 크기의 입자를 분리해내고, 배양액의 엑소좀과 연관되지 않은 작은 단백질들은 제거한다. NF-CM에서 분리한 세포외 소포는 NF-EVs, NFL-CM에서 분리한 세포외 소포는 NFL-EVs라 표현하였다. NF-EVs와 NFL-EVs내의 세포외 소포의 개수와 크기를 나노입자추적분석기(Nanoparticle tracking analysis, NTA, Nanosight NS300, Malvern, UK)로 측정하여 개수는 세포 수 대비하여 도 1에 나타내었고, 크기의 그래프는 도 2에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 락토페린/칼슘 조성물을 배양배지에 함께 첨가하면 배양액 내 세포외 소포가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 세포당 세포외 소포의 개수는 NF-CM을 100%로 하여 나타냈고, NF-CM 대비 NFL-CM은 약 4배 이상의 세포외 소포를 함유하고 있다는 것을 확인하였다 (Unparied t-test, ***; p < 0.0001). 한편, 세포외 소포의 크기에는 큰 변화가 없음을 확인하였다(도 2).

분리한 세포외 소포의 모양 관찰을 위하여 음성 염색을 진행하였다. 분리한 세포외 소포를 엑소좀 염색 키트(Exosome-TEM-easy kit, 101bio, USA) 내의 세척 용액으로 세척한다. 후에 키트 내의 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 10분간 음성 염색을 한 후 상온에서 건조하고 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope, TEM, Talos L120c, FEI, Czech)으로 120kV로 관찰하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, NF-EVs와 NFL-EVs 모두 지질 이중층의 모양으로 둘러 쌓인 모습을 관찰할 수 있었고, 통상적으로 확인할 수 있는 세포외 소포의 모양인 컵모양을 가지고 있는 것을 관찰하였다.

결론적으로, 락토페린/칼슘 조성물은 배양액 내의 세포외 소포의 개수를 증가시키지만 세포외 소포의 크기나 모양에 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2: 락토페린/칼슘 조성물에 의해 생성된 세포외 소포에 락토페린의 결합에 의한 피부세포와의 결합능 증가 확인

배양배지에 넣어준 락토페린이 배양액 내에 증가한 세포외 소포와 결합하여 피부세포와의 결합능을 증가시킬 것이라 생각하여 실험을 진행하였다.

실시예 1과 같이 배양액에서 분리한 세포외 소포를 락토페린-골드 항체(Lactoferrin-gold antibody)와 반응하여 투과 전자 현미경으로 관찰하였다.

구체적으로, 세포외 소포를 고정 (4% 파라포름알데하이드), 블로킹 (0.4% 소혈청알부민), 락토페린 항체 반응, 마지막으로 우라닐 아세테이트로 음성 염색을 진행하였다. 상온에서 건조한 후 투과 전자 현미경으로 120kV로 관찰하여 도 4에 나타냈다. 락토페린/칼슘 조성물/혈청대체제로 세포 배양 후 수득한 배양액에서 분리한 세포외 소포를 NFL-EVs로 표현하였고, 혈청대체제로 세포 배양 후 수득한 배양액에서 분리한 세포외 소포를 NF-EVs이라 표현하였다.

NF-EVs의 경우 락토페린-골드 입자가 세포외 소포와 결합하지 못함이 관찰되는 반면, NFL-EVs는 락토페린-골드 입자가 세포외 소포에 붙어 있는 것이 관찰되었다.

세포외 소포와 결합하고 있는 락토페린의 양을 효소 결합 면역 침강 분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 확인하였으며 방법을 아래와 같다.

실시예 1과 같이 크기 기반 컬럼으로 배양액 내의 세포외 소포와 결합하지 않은 락토페린 및 여러 단백질들을 제거하였고, 분리한 세포외 소포의 개수를 나노입자추적분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA)의 방법으로 측정하였다. 측정한 수를 바탕으로 2×10⁹개의 NF-EVs와 NFL-EVs에 결합되어 있는 락토페린의 양을 락토페린 엘라이자 키트(Lactoferrin ELISA kit, NOVUS, USA)를 이용하여 측정하였다.

구체적으로 락토페린 엘라이자 키트의 정량물질과 세포외 소포를 코팅된 96웰 플레이트(96well plate)에 넣은 후 2시간 동안 37℃에서 반응하였다. 그 후 첫번째 항체(Detection antibody)부착, 두번째 항체(HRP antibody)부착하였고 각각의 과정 사이마다 인산 완충 용액으로 3번 이상 세척하였다. 최종적으로 기질(Substrate)과 스톱 버퍼(Stop buffer)를 넣어 엘라이자 리더기(ELISA reader, Molecular devices, USA)로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였고 정량값을 도 5에 나타냈다.

2×10⁹개의 NFL-EVs와 결합한 락토페린의 양은 135 ng/㎖인 반면, 2×10⁹개의 NF-EVs와 결합한 락토페린의 양은 4.5 ng/㎖로 확인되었다. NFL-EVs와 결합하고 있는 락토페린은 NF-EVs와 결합하고 있는 락토페린의 30배임을 알 수 있었고 기존의 예상한 바와 같이 NFL-CM에 함유되어 있는 세포외 소포는 락토페린과 결합하고 있어 세포외 소포의 기능 강화를 유도할 것으로 예상한다 (unpaired T-test, ***;p < 0.0001).

크기 기반 컬럼으로 분리한 세포외 소포의 표면 전하를 측정하기 위하여 제타포텐셜&입도분석기(Zeta potential & particle size analysis)을 이용하였고 그 결과를 도 6에 나타냈다.

도 6에서 나타난 바와 같이, NF-EVs보다 락토페린을 포함한 배양배지에서 배양한 NFL-EVs의 음전하가 유의미하게 약해졌다. NF-EVs는 -60 ~ 64 ㎷의 전하를 확인하였지만 NFL-EVs의 경우 -20 ~ 30 ㎷의 전하를 확인하여 락토페린을 함께 배양하면 세포외 소포가 양성을 띄는 락토페린과 결합하여 음전하가 떨어질 것을 예상한 결과와 일치하는 것을 알 수 있었다 (unpaired T-test, **;p < 0.001).

세포외 소포의 음전하의 감소는 NFL-EVs가 세포막과 결합 증가를 보여줄 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. NFL-EVs와 NF-EVs의 피부 섬유아세포(Human dermal fibroblasts)와의 결합 능의 차이를 형광 활성화 세포 분리(Fluorescence activated cell sorting, FACS, ACEA, USA)로 확인하였다.

구체적으로, 친유성 염색약(Lipophilic dye, DiO, Invitrogen, USA)으로 세포외 소포를 염색한 후 실시예 1과 같이 크기 기반 컬럼으로 분리하였다. 염색한 세포외 소포를 군당 5×10⁶개씩 섬유아세포에 3시간 동안 처리하고, 인산 완충 용액으로 세척하고 1×트립신-이디티에이(0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA, welgene, Korea) 용액으로 세포를 배양 접시에서 분리하였다. 4% 파라포름알데하이드로 10분간 세포를 고정한 후 인산 완충 용액으로 세포를 세척 및 희석하였고 세포외 소포와 결합하여 녹색을 띄는 섬유아세포를 형광 활성화 세포 분리로 확인하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, NFL-EVs의 섬유아세포와 결합력은 NF-EVs보다 증가함을 확인하였다. NF-EVs와 결합한 세포는 전체 세포의 46.72%인 반면, NFL-EVs와 결합한 섬유아세포는 전체 세포의 82.02%였다. 따라서 NFL-EVs가 약 1.8배 더 많은 섬유아세포와 결합함을 알 수 있었다.

결론적으로 배양배지에 넣어준 락토페린은 배양액 내 증가한 세포외 소포와 결합하고, 이 결합으로 세포외 소포의 음전하가 감소하여 세포와의 결합 능력이 증가한다는 것을 확인하였다.

실시예 3: 락토페린/칼슘 조성물 배양액에 의한 피부세포 재생능 증가 확인

피부의 진피층에 존재하는 섬유아세포는 진피층의 세포외 기질의 단백질, 즉 콜라겐과 파이프로넥틴, 엘라스틴 등의 주요 원천이다. 세포외 기질은 피부 구조와 탄력을 유지하는데 주요한 역할을 하며, 따라서 섬유아세포의 증식과 세포외 기질 단백질의 증가는 피부 노화를 막는데 중요한 역할을 한다(Mol Cell Biochem. 2019 Oct 10).

실시예 1에서 제작한 배양액이 섬유아세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT 어세이법을 진행하였다. 락토페린/칼슘 조성물이 들어있는 혈청대체제 배양액을 NFL-CM(Nutrient Full media with Lactoferrin-Conditioned medium)로 표현하였고 혈청대체제만 들어있는 배양액을 NF-CM(Nutrient Full media-Conditioned medium)이라 표현하였다.

보다 구체적으로, 48개의 구멍이 있는 평판 배양접시(48-well plate)에 2 × 10⁴ cells/㎖의 섬유아세포 현탁액 250 ㎕를 넣고 24시간 동안 배양하였다. 배지(Fibroblast Growth Media, FGM, Lonza, USA)를 제거한 후, NF-CM과 NFL-CM 250 ㎕를 처리하였고, 음성 대조군으로 무첨가배지(SF)를 사용하였다. 접종 후, 37℃에서 48시간 동안 배양 후 각 배지를 제거하고 인산 완충 용액으로 3회 반복하여 세척하였다. MTT 용액(0.5 ㎎/㎖)을 2시간동안 반응시키고 혼합한 뒤, 이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol) 용액에서 30분 교반하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 SF을 100%로 두었을 때 상대값을 그래프로 나타냈다. 또한 세포 상태는 현미경(Inverted microscope, Olympus corporation, Japan)으로 관찰하여 함께 도 8에 나타냈다.

배양배지에 락토페린을 넣고 배양 후 얻은 배양액은 더 많은 섬유아세포의 증식을 유도한다는 것을 확인하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, NF-CM을 처리하였을 때 137%의 증식율을 보여준 반면, NFL-CM을 처리하였을 경우 174%의 세포 증식율을 확인할 수 있었다. 상기 결과의 차이는 유의미함을 확인하였다(Unparied T-test, ***;p < 0.0001).

NFL-CM에 의해 섬유아세포가 분비하는 기질의 주요 인자인 콜라겐과 엘라스틴, 파이브로넥틴의 변화를 역전사중합효소연쇄반응(Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 통해 관찰하였다.

6개의 구멍이 있는 평판 배양접시(6-well plate)에 3 × 10⁴ cells/㎖의 섬유아세포 현탁액 2 ㎖을 넣고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 뒤 NF-CM, NFL-CM, 그리고 양성대조군으로 아스코르빅 에시드(L-Ascorbic acid, Sigma, USA)를 최종 농도가 100 uM가 되도록 희석하여 1 ㎖씩 처리하였다. 48시간 후 섬유아세포를 인산 완충 용액으로 세척하고 1×트립신-이디티에이 용액으로 세포를 디쉬에서 분리하였다. 그 후 알엔에이 추출 키트(TAKARA MiniBEST universal RNA extraction kit, TAKARA, Japan)를 이용하여 세포 내 알엔에이(RNA)를 분리하였다. 이후 동량의 알엔에이로 cDNA(Complementary DNA)를 cDNA 합성 키트(PrimeScript 1^st strand cDNA synthesis kit, TAKARA, Japan)로 합성하였다. 이어서 합성한 cDNA를 역전사중합효소연쇄반응으로 프로콜라겐 1타입(Pro-collagen type1), 엘라스틴(Elastin), 파이브로넥틴(Fibronectin)을 정량적으로 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, NF-CM을 처리한 섬유아세포 대비 NFL-CM을 처리한 섬유아세포에서 기질의 증가가 유의미함을 확인하였다. NF-CM에서 음성대조군 대비 프로콜라겐 1타입, 엘라스틴, 파이브로넥틴이 각각 136%, 187%, 149%의 유전자 레벨이 증가하였고, NFL-CM에서 각각 174%, 244%, 187%의 유전자 레벨이 증가하였다. NFL-CM의 세가지 유전자의 결과값은 NF-CM에서 증가한 결과값과 유의미한 차이를 가지고 증가함을 확인하였다 (Unpaired T-test, ****; p < 0.0001).

실시예 4: NFL - CM 배양액에 의한 피부세포 증식율 증가가 배양액 내 세포외 소포의 양적 질적 변화 때문임을 확인

실시예 3에서 락토페린/칼슘 조성물을 통해 생성된 배양액에 의한 섬유아세포의 증식율의 증가가 배양액 내에 존재하는 세포외 소포에 의한 것임을 증명하는 실험을 준비하였다.

NFL-CM의 섬유아세포 증식율 증가 효과가 배양액 내 증가한 세포외 소포에 의한 것인지 확인하기 위하여 배양액 내 세포외 소포를 제거한 후 제거 전과 비교하는 실험을 진행하였다. 배양액 내 세포외 소포를 제거하는 방법은 하기와 같다.

배양액 농축에 일반적으로 사용하는 300,000 MWCO (Molecular Weight Cut-Off)의 필트레이션 스핀 컬럼(Filtration spin column)(Vivaspin20, Sartorius, UK)을 이용하였으며 컬럼에 배양액을 넣은 후 원심분리를 통해 배양액을 필터로 거른다. 걸러진 후 나온 배양액은 세포외 소포가 제거된 배양액으로 사용하였으며 도 10에서 NFL-CM에서 세포외 소포를 제거한 배양액을 "EVs-depleted NFL-CM"으로, NF-CM에서 세포외 소포를 제거한 배양액을 "EVs-depleted NF-CM"으로 각각 표현하였다.

먼저 상기의 방법대로 세포외 소포를 제거 후 동량으로 NF-CM, EVs-depleted NF-CM, NFL-CM, EVs-depleted NFL-CM으로 이틀 동안 섬유아세포에 처리 후 증식 차이를 확인하기 위하여 MTT 어세이를 진행하였다. 방법은 실시예 3의 도 8과 같다.

도 10에 나타난 바와 같이, NF-CM과 EVs-depleted NF-CM는 유의미한 세포증식율의 차이를 보이지 않은 반면, NFL-CM에서 세포외 소포를 제거한 EVs-depleted NFL-CM의 경우 섬유아세포의 증식율이 유의미하게 감소하였다 (Unpaired T-test, N.S; p > 0.05, ***; p < 0.0001). 결과적으로 NFL-CM가 NF-CM에 비해 섬유아세포 증식의 큰 차이를 보인 이유는 NFL-CM의 NFL-EVs가 주요하게 작용하였음을 증명하였다.

NFL-EVs에 의한 섬유아세포의 증식율 증가가 세포외 소포의 개수 변화뿐 만 아니라 세포외 소포의 표면 전하의 변화에 의함임을 확인하기 위한 실험을 준비하였다. 동일한 개수(2×10⁸)의 NF-EVs와 NFL-EVs를 피부 섬유아세포에 처리하였다. 또한 4×10⁸개의 NFL-EVs를 처리 후 개수 및 표면전하의 변화에 의한 섬유아세포 증식차이를 MTT 어세이를 통해 분석하였다. 실험은 실시예 1에서와 같이 크기 기반 컬럼으로 NF-CM과 NFL-CM에서 각각 세포외 소포를 분리한 후, 나노 입자추적분석기를 이용하여 각각의 세포외 소포 개수를 측정하였다. 그 후 실시예 3과 같이 섬유아세포의 증식차이를 비교하였고 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 2×10⁸개의 NF-EVs를 처리한 경우 104.5%의 증가를 보인 반면 같은 수의 NFL-EVs를 처리하였을 경우 109%의 세포 증가를 확인할 수 있었다 (Unpaired T-test, *: p < 0.01). 또한 4×10⁸의 NFL-EVs는 112%의 세포 증가를 확인할 수 있었다. 이는 2×10⁸의NFL-EVs와 유의미한 차이를 보였다 (Unpaired T-test, **: p < 0.001).

상기 결과를 토대로, NFL-EVs가 보여주는 섬유아세포의 뛰어난 증식율은 NFL-EVs의 증가한 개수에 의한 것뿐만 아니라 실시예 2에서 확인한 결과와 같이 함께 결합하고 있는 락토페린과의 시너지 효과라는 것을 간접적으로 나타낸다.

실시예 5: 피부 조직 모델에서 락토페린/칼슘 조성물 배양액 내 세포외 소포의 투과성 증가로 인한 재생능 증가 확인

섬유아세포는 진피층의 콜라겐이나 엘라스틴, 파이브로넥틴과 같은 세포외 기질을 합성하는 반면, 세포가 손상을 입으면 세포외 기질의 주요 인자인 콜라겐을 분해하는 메탈로프로테이즈를 분비하여 세포외 기질의 구조를 무너뜨리며, 메탈로프로테이즈는 섬유아세포가 만들어내는 억제제인 팀프에 의해 조절받는다. 이와 관련하여 섬유아세포가 만들어 내는 다양한 요소의 밸런스를 통해 피부 구조와 탄력이 유지되고 밸런스가 무너지게 되면 피부 노화가 유도되게 된다(Exp Cell Res. 2001 Dec 10;271(2):249-62).

세포외 소포는 피부의 투과성이 높다고 잘 알려져 있으며(BBRC, 2017, Nov 18;493(2):1102-1108), 나아가 실시예 2에서 확인된 바와 같이 본 발명의 조건화 배양액 내 세포외 소포는 그 개수가 많고 음전하의 감소로 피부 세포와의 결합능이 높기 때문에 상기 조건화 배양액은 피부 투과 능력과 재생 효과가 높을 것으로 예상하여 실험을 준비하였다.

친유성 염색약으로 세포외 소포를 염색한 후 실시예 1과 같이 크기 기반 컬럼으로 분리하였다. 3차원 피부 모델(KeraSkin™-FT, Biosolution, Korea)을 어세이 미디아(assay-media)가 들어 있는 6웰 플레이트에 옮긴 후 상기의 염색한 세포외 소포를 각각 100 ㎕씩 처리했다. 6시간 후, 조직을 고정 (4% formaldehyde), 세척, 탈수(Dehydration), 투명(Clearing), 침투(Infiltration), 포매(Embedding) 과정을 거쳐 파라핀 블록(Paraffin block)을 만들었다. 상기의 파라핀 블록을 미세절편기(Automated microtome, Leica, Germany)로 박절하였다.

상기 샘플은 후에 두가지 방식으로 진행되었다. 형광 실험을 위하여 상기 조직을 다피(DAPI, 4',6-diamidino-2-phenylindole)가 들어있는 마운팅 용액(Mounting medium, Vector laboratories, USA)을 이용하여 핵 염색 및 조직 보호를 하였으며 형광현미경(DM4000B, fluorescence microscopy, Leica, Germany)으로 조직 관찰 및 촬영을 진행하였다. 혹은 헤마톡실린&에오신(H&E, Hematoxylin and eosin) 염색 후 조직 관찰 현미경(BX41, Olympus, Japan)을 통해 400배 배율로 관찰을 하고 동일 배율로 촬영하였다.

도 12에 나타난 바와 같이, NFL-EVs는 뛰어난 조직 투과성을 보였다. 표피(epidermis)에 많은 NFL-EVs를 보여주기도 하였지만, 내부에 NFL-EVs가 투과되어 진피(dermis) 부분에서 누적되는 현상을 확인하였다.

진피에 누적되는 특성을 가진 NFL-EVs가 재생을 유도하는지 확인하기 위해, NFL-EVs를 포함한 NFL-CM을 상기와 같은 방법으로 인체조직 모델에 처리하는 실험을 진행하고 48시간 후에 어세이 미디아를 수득하였다. 어세이 미디아 내에 존재하는 기질인 프로콜라겐 1 타입, 그리고 기질을 분해하는 메탈로프로테이즈와 이를 조절하는 팀프의 변화를 프로콜라겐 1 타입 엘라이자 키트(PIP ELISA kit, TAKARA, Japan)와 팀프-1 엘라이자 키트(TIMP-1 ELISA kit, R&D system, USA), 메탈로프로테이즈-1 엘라이자 키드(Human total MMP-1 kit duoset, R&D system, USA)를 사용하여 측정하였으며 키트의 방법에 따라 진행한 후 SF군을 100%로 하여 그 상대값을 도 13에 나타냈다.

도 13에 나타난 바와 같이, NFL-CM을 처리한 군의 경우 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 142% 프로콜라겐 1타입, 391% 팀프-1의 증가와 77%의 메탈로프로테이즈-1 감소를 확인하였다. 반면 양성 대조군 아스코르빅 에시드(1 mM)의 경우 87% 프로콜라겐 1타입, 137% 팀프-1의 증가를 나타내어 NFL-CM에 비해 낮은 값을 보였고(Unpaired T-test, ***: p < 0.0001), 또한 아스코르빅 에시드는 메탈로프로테이즈-1 감소에 효과적으로 알려져 있었지만 90% 메탈로프로테이즈-1 감소를 나타낼 뿐이어서 NFL-CM에 비해 비교적 약한 효과를 보여주었다.

결론적으로 락토페린/칼슘 조성물과 함께 세포를 배양하면 더 많은 세포외 소포가 생성되고 락토페린이 세포외 소포의 음전하를 감소시킴으로써 더 많은 세포외 소포가 피부 조직에 도달하여 피부세포가 분비하는 세포외 기질의 양을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 실시예 3의 결과와 일치하며, 결과적으로 NFL-CM이 피부재생 효과를 증대시킴을 보여준다.

실시예 6: 피부세포 및 인체 조직 모델에서 락토페린/칼슘 조성물 배양액에 의한 필라그린 변화 확인

필라그린(Filaggrin)은 외부로부터 인체를 보호하는 피부 가장 외막에서 케라틴을 서로 연결하여 피부 장벽의 물리적인 지지력에 영향을 준다. 또한 필라그린의 최종 산물은 천연 보습 인자(Natural moisturizing factor)로 피부 보습을 유지하는 기능을 가지기에 필라그린은 피부 장벽과 보습에 주요한 요소로 작용한다.

실시예 1에서 제작한 배양액이 케라티노사이트 내 필라그린에 미치는 영향을 확인하기 위하여 필라그린 형광 염색(immunofluorescence)을 진행하였다. 락토페린/칼슘 조성물/혈청대체제로 세포 배양 후 수득한 배양액을 NFL-CM(Nutrient Full media with Lactoferrin-Conditioned medium)로 표현하였다.

구체적으로, 24개의 구멍이 있는 평판 배양접시(24-well plate)에 12Φ의 커버슬립(cover slip)을 구멍에 넣은 후 2 × 10⁴ cells/㎖의 케라티노사이트(HaCaT) 현탁액 500 ㎕를 넣고 48시간 동안 배양하였다. 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, Welgene, Korea)를 제거한 후, 배양배지 250 ㎕와 NFL-CM 250 ㎕를 처리하였고, 음성 대조군으로 무첨가배지를 사용하였다. 접종 후, 37℃에서 5일 동안 배양 후 각 배지를 제거하고 필라그린 염색을 하였다. 고정액(2% formaldehyde, sigma, USA), 투과(0.2 % Triton-X 100, MP biomedical, Germany), Blocking(5% 소 태아 혈청), 항체반응(Filaggrin antibody, Thermofisher, USA), 두번째 항체 반응(Fluorescein horse anti-mouse IgG antibodies, vector laboratories, USA) 하였고, 마지막으로 마운팅 용액(Mounting medium, Vector laboratories, USA)을 이용하여 핵 염색 및 세포 보호를 하였다. 결과는 형광현미경(DM4000B, fluorescence microscopy, Leica, Germany)으로 확인하였다

도 14에 나타난 바와 같이, 음성대조군에 비해 NFL-CM을 처리한 군에서 더 많은 필라그린이 염색되었음을 확인하였고 NFL-CM이 케라티노사이트가 필라그린을 생성하는데 효과 있음을 알 수 있었다.

실시예 1에서 제작한 배양액이 피부 조직 내 필라그린에 미치는 영향을 확인하기 위하여 필라그린 면역 염색(Immunohistochemistry)을 진행하였다. 구체적으로 사람의 3차원 피부 표피 모델(KeraSkin™, Biosolution, Korea)에 10% 도데실 황산 나트륨(SDS, Sodium Dodecyl Sulfate)을 처리하여 세포 장벽을 망가뜨린 후, NFL-CM을 처리하였다. 4일 뒤 조직을 고정액(4% formaldehyde, sigma, USA)에 4시간 고정하고 고정액을 제거하기 위하여 흐르는 물에 4시간 동안 수세(Washing)하였다. 다음으로 실시예 5에서와 같이 탈수(Dehydration), 투명(Clearing), 침투(Infiltration), 포매(Embedding), 박절, 건조, 탈파라핀(Deparaffinization), 함수(Hydration), 투과(0.2% Triton-X 100)를 진행한 후, 인산 완충 용액으로 3번 세척하였다. 조직 내 내인성 과산화수소 활성에 의한 항체의 비특이적 염색을 없애기 위하여 0.3% 과산화수속에 5분 동안 반응시킨 후, 0.01M의 시트르산 나트륨(sodium citrate)으로 항원을 노출시켰다. 이후 블로킹 (blocking), 필라그린 항체 반응(Filaggrin antibody, Thermofisher, USA), 비오틴 부착 2차 항체[biotinylated universal(Anti-Mouse IgG/Rabbit IgG) antibody]와 반응시켰다. 각 과정에는 세척과정이 포함되었다. 키트 내 ABC 시약과 30분 반응 후, DAB 기질(VECTOR laboratory, SK4100, USA)과 반응하였고 마운팅 용액으로 조직을 보호하였다. 조직 관찰은 현미경(BX41, Olympus, Japan)을 통해 400배 배율로 관찰을 하고 동일 배율로 촬영하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타난 바와 같이, 필라그린은 갈색으로 염색되었다. 도데실 황산 나트륨을 단독 처리하였을 경우, 피부 표피 조직이 망가졌음을 확인하였고, 필라그린의 양 또한 적음을 알 수 있었다. 그에 반해 도데실 황산 나트륨을 처리한 후 NFL-CM과 함께 배양하였을 경우 망가진 표피 조직이 기존의 피부 조직만큼 회복되었고, 필라그린의 양 또한 증가되는 것을 관찰하였다.

결론적으로 NFL-CM은 피부 장벽과 보습에 주요한 인자인 필라그린을 증가시켜 망가진 피부 장벽을 회복시키는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

Claims

락토페린(lactoferrin)을 포함하는 배양배지에서 세포를 배양함으로써 수득되는 락토페린과 결합하고 있는 고농도의 세포외 소포(extracellular vesicles)를 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium).
제1항에 있어서, 세포외 소포의 개수가 1.0 × 10⁸/㎖ 내지 1.0 × 10¹¹/㎖의 범위인 조건화 배양액.
제1항에 있어서, 배양 전 배양배지에 락토페린이 0.1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 조건화 배양액.
제1항에 있어서, 배양 후 조건화 배양액 중 락토페린이 0.01 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 조건화 배양액.
제1항에 있어서, 락토페린이 Holo-lactoferrin, Apo-lactoferrin 및 Pis-lactoferrin으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조건화 배양액.
제1항에 있어서, 배양 전 배양배지에 칼슘이 추가로 첨가되는 조건화 배양액.
제6항에 있어서, 칼슘이 0.2 μM 내지 10 mM의 농도로 첨가되는 조건화 배양액.
제1항에 있어서, 배양 후 조건화 배양액 중 칼슘이 0.02 μM 내지 10 mM의 농도로 존재하는 조건화 배양액.
제1항에 있어서, 배양 전 배양배지에 무첨가배지(basal media), 혈청대체제(serum replacement) 및 혈청(serum)으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질이 추가로 첨가되는 조건화 배양액.
제1항에 있어서, 세포가 피부재생능이 있는 세포인 조건화 배양액.
제10항에 있어서, 피부재생능이 있는 세포가 줄기세포인 조건화 배양액.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조건화 배양액 및 미용학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는 화장료 조성물.
제12항에 있어서, 피부재생 강화용 또는 피부장벽 강화용인 화장료 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조건화 배양액 및 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는, 피부재생 강화용 또는 피부장벽 강화용 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 피부외용제로 제형화된 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 피내 주사 또는 피하 주사로 제형화된 약제학적 조성물.
삭제