KR101796711B1 - 테트라아세틸피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

테트라아세틸피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 a') 테트라아세틸피토스핑고신 및 b) 5종 이상의 아미노산 혼합물 또는 a") 테트라아세틸피토스핑고신을 포접하는 리포좀 및 b) 5종 이상의 아미노산 혼합물을 주성분으로 하여 제조한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 노화 방지 효과, 구체적으로는 피부 재생 및 상처 치유 개선 효과, 항산화효과, 아쿠아포린 생합성 촉진효과, MMP-1 발현 억제 효과, 히아루론산 생합성 촉진효과, 멜라닌 생성 억제효과, 피부각질형성세포 분화촉진 효과, 콜라겐 생합성 증진 효과, 피부장벽기능 개선효과, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, 보습효과, 미백효과, 피부 주름개선 효과, 피부 탄력 개선효과, 진피치밀도 개선효과 및 항염 효과가 우수하다.

Description

테트라아세틸피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING TETRAACETYL PHYTOSPHINGOSINE}
본 발명은 테트라아세틸피토스핑고신 및 5종 이상의 아미노산을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어난다. 그 원인에 따라 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이 등의 이유로 자유라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다.
좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성 물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부 노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히, 단백질의 산화는 피부의 결합 조직인 콜라겐(collagen), 히아루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증 반응과 피부의 탄력에 지장을 주고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역 기능 저하에 이르게 된다.
그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 자유라디칼이나 자외선 조사, 염증 반응에 의해 매개되어 발생하는 자유라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.
노화에는 이러한 자유라디칼뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다.
그러므로, 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현량 및 활성을 조절하고자 하였다.
이러한 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학 물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐만 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발 가치가 한층 늘어나고 있다.
한국등록특허 제10-0404072호는 테트라아세틸 파이토스핑고신 등의 스핑고리피드 장쇄염기를 포함하는 광범위 피부질환 치료용 조성물에 관하여 기재되어 있고, 한국공개특허 제2001-0027942호는 테트라아세틸피토스핑고신 등을 포함하는 입술용 화장품 조성물에 대하여 기재되어 있다. 또한, 한국등록특허 제10-1117562호는 나노 리포좀에 포접하여 안정화시킨 올리고 펩타이드 혼합물을 포함하는 피부노화 방지용 화장료에 대하여 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 테트라아세틸피토스핑고신 및 5종 이상의 아미노산을 함유하여 세포재생효과, 항산화효과, MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성 효과, 히아루론산 생합성 촉진효과, 아쿠아포린 생합성 촉진효과, 피부 각질형성세포 분화 촉진효과, 멜라닌 생성억제효과, 보습효과, 미백효과, 피부 장벽 기능 개선 효과, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, 피부 주름개선 효과, 피부 탄력 개선효과, 진피치밀도 개선효과, 피부 항노화 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는데 있다. 또한, 본 발명의 목적은 리포좀에 포접하여 안정화시킨 테트라아세틸피토스핑고신 및 5종 이상의 아미노산을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 테트라아세틸피토스핑고신; 및 5종 이상의 아미노산 혼합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 아미노산 혼합물은 글라이신, 세린, 글루타민, 아스파틱애씨드, 류신, 라이신, 알지닌, 타이로신, 프롤린, 이소류신, 히스티딘, 시스틴, 메치오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린 및 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택된 5종 이상이다.
바람직하게는, 상기 테트라아세틸피토스핑고신은 리포좀에 포접된 것이다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 탄력 개선 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 장벽 기능 개선 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 항산화 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 보습 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 미백 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 재생 및 상처 치유 개선 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 항염 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 아미노산 혼합물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30.0 중량% 함유된다.
바람직하게는, 상기 테트라아세틸피토스핑고신은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 20.0 중량%로 함유된다.
바람직하게는, 상기 리포좀은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 20.0 중량%로 함유되고, 상기 리포좀에 포접된 테트라아세틸피토스핑고신은 리포좀의 총 중량에 대하여 0.00003 내지 2 중량%로 함유된다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 세포재생 효과(실험예2), 항산화 효과(실험예 3), 아쿠아포린 생합성 촉진 효과(실험예 4), 피부 각질형성세포 분화촉진 효과 (실험예 5), 멜라닌 생성 억제효과 (실험예 6), 히아루론산 발현 촉진효과(실험예 7), MMP-1 생성 억제 효과 (실험예 8), 콜라겐 생합성 효과(실험예 9), 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과(실험예 10), 피부장벽기능 개선효과(실험예 11), 보습효과(실험예 12), 미백효과(실험예 13), 피부 탄력 개선효과(실험예 14), 피부 주름 개선 효과(실험예 15), 진피치밀도 개선효과(실험예 16), 피부 재생 및 상처 치유 개선 효과(실험예 17)를 갖는다.
또한, 본 발명에 따라 사용된 리포좀은 유효성분의 침투 효과(카페인 투과량)가 우수한 것을 알 수 있다(실험예 1).
도 1은 본 발명의 제조예 1 내지 47의 히아루론산 생합성 촉진 효과(실험예 7)를 나타낸다.
본 발명은 a') 테트라아세틸피토스핑고신 및 b) 5종 이상의 아미노산 혼합물 또는 a") 테트라아세틸피토스핑고신을 포접하는 리포좀 및 b) 5종 이상의 아미노산 혼합물을 주성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 사용되는 "테트라아세틸피토스핑고신"은 (2S,3S,4R)-1, 2, 3, 4-Tetraacetylphytosphingosine으로 표기되는 하기 화학식 1의 구조를 가지는 분자량이 485.67인 화합물이며, 피토스핑고신의 유도체로, 상업적으로 판매되고 있다.
[화학식 1]
Figure 112017035802763-pat00001
본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신은 화장료 총 중량에 대하여 0.00001 내지 20.0 중량% 포함될 수 있다. 테트라아세틸피토스핑고신을 0.00001 중량% 미만으로 포함하는 경우에는 피부 개선 효과가 나타나지 않으며, 20.0 중량%를 초과하여 포함하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 개선 효과 증대 정도가 미미하다.
본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 사용되는 아미노산은 단백질을 구성하는 아미노산 중 글라이신, 세린, 글루타민, 아스파틱애씨드, 류신, 라이신, 알지닌, 타이로신, 프롤린, 이소류신, 히스티딘, 시스틴, 메치오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린 및 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택된 5종 이상, 바람직하게는 10종 이상의 아미노산을 함유할 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 기재된 모든 아미노산을 함유할 수 있다. 아미노산을 5종 미만으로 함유하는 경우에는 사용되는 아미노산에 비하여 효과가 미미하다.
본 발명에 화장료 조성물에 유효성분으로 사용되는 아미노산은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30.0 중량% 포함될 수 있다. 또한, 각 아미노산의 함량은 동일하거나 상이하며, 바람직하게는 포함되는 임의의 1종의 아미노산이 다른 임의의 1종의 아미노산의 함량에 대하여 최대 30배, 바람직하게는 4배로 포함될 수 있다.
따라서, 이러한 다양한 기능을 가진 a') 테트라아세틸피토스핑고신 및 b) 아미노산 5종 이상을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 화장료 조성물은 피부 노화 방지 효과가 우수하다. 구체적으로 피부 노화 방지 효과는 우수한 항산화효과, 세포재생 효과, MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성 효과, 히아루론산 발현 촉진효과, 아쿠아포린 생합성 촉진효과, 피부 각질형성세포 분화 촉진효과, 멜라닌 생성억제효과, 보습효과, 미백효과, 피부 장벽 기능 개선 효과, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, 피부 주름개선 효과, 피부 탄력 개선효과 및 진피치밀도 개선효과 등의 효과를 포괄하는 개념이다.
또한, 본 발명은 a") 리포좀에 포접하여 안정화시킨 테트라아세틸피토스핑고신 및 b) 5종 이상의 아미노산 혼합물을 주성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 리포좀에 포접하여 안정화시키면 테트라아세틸피토스핑고신의 효능을 오랫동안 안정하게 유지시켜주며, 피부 침투가 용이하여 효과를 극대화할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 테트라아세틸피토스핑고신을 포접하고 있는 리포좀을 함유하는 경우에는 리포좀은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 20.00 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10.0 중량% 포함될 수 있다. 또한, 테트라아세틸피토스핑고신은 리포좀 총 중량을 기준으로 0.00003 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.0003 내지 0.4 중량%, 보다 바람직하게는 0.0003 내지 0.003 중량% 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물이 테트라아세틸피토스핑고신을 포접하고 있는 리포좀을 함유하는 경우도 아미노산은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30.0 중량% 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "리포좀"은 수용성 머리와 불용성의 꼬리를 가진 양친매성 분자로 구성된 입자의 상호 자발적인 결합 및 정렬된 콜로이드 입자로, 세포막과 유사한 이중막 구조를 의미한다. 이와 같은 리포좀의 특성으로 인하여 리포좀에 포접하여 안정화시킨 테트라아세틸피토스핑고신을 함유하는 화장료 조성물은 테트라아세틸피토스핑고신의 효능을 장시간 안정하게 유지할 수 있는 효과가 있으며, 손상된 피부장벽의 회복, 피부장벽의 강화, 피부자극의 완화의 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 리포좀은 유성성분, 인지질, 계면활성제, 폴리올 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다. 상기에서 유성(oil)성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있다. 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일; 에스테르계의 합성 오일; 디메치콘 및 사이클로메치콘계과 같은 실리콘 오일; 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일; 에톡시레이티드 알킬에테르계오일; 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일; 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질;세레브로사이드; 콜레스테롤; 시토스테롤; 콜레스테릴설페이트; 시토스테릴설페이트; C10-40 지방알콜 및 이의 혼합물을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 시토스테롤을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태로서, 등록특허 제10-1117562호에 기재된 리포좀을 사용할 수 있다.
유성성분의 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 0.1-10.0 중량%일 수 있고, 바람직하게는 1.0-5.0 중량%일 수 있다.
상기에서 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 난황 레시틴, 대두 레시틴 또는 스핑고마이엘린과 같은 천연 인지질 및/또는, 하이드로제네이티드포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티틸콜린 또는 수첨레시틴과 같은 합성 인지질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 천연 인지질인 레시틴과 합성 인지질인 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린을 함께 사용할 수 있다. 천연 인지질과 합성 인지질의 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 각각 0.1-10.0 중량%일 수 있고, 바람직하게는 1.0-5.0 중량%일 수 있다.
상기에서 계면활성제는 당업계에서 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 바람직하게는 비이온성 계면활제가 사용될 수 있다. 비이온성 계면활성의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르, 폴리소르베이트 및 슈가에스테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리소르베이트가 이용될 수 있다. 계면활성제의 사용량은, 일반적으로 리포좀 총 중량에 대하여 0.1-10 중량%일 수 있고, 바람직하게는 1-5.0 중량%일 수 있다.
상기에서 폴리올은 특별히 제한되지 않지만, 바림직하게는 글리세린, 프로필렌글라이콜, 디프로필렌글라이콜, 1,3-부틸렌글라이콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글라이콜, 판틸렌글라이콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 폴리올의 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 0.1-10 중량%일 수 있고, 바람직하게는 1-5.0 중량%일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.　 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1 내지 37의 제조
본 발명에서 사용된 테트라아세틸피토스핑고신(이하 TAPS)는 (주)두산에서 구입하였고, 사용되는 각 아미노산은 시그마사에서 구입하여 사용하였다. 아래의 제조예에 기재된 혼합비는 모두 중량비이다.
제조예 1은 테트라아세틸피토스핑고신이고, 제조예 2는 글라이신이고, 제조예 3은 히스티딘이고, 제조예 4는 발린:프롤린:트레오닌의 1:1:1 혼합물이고, 제조예 5는 메치오닌:시스틴:히스티딘의 1:1:1 혼합물이고, 제조예 6은 글라이신:세린:글루타민:아스파틱애씨드:류신의 4:2:2:1:1 혼합물이고, 제조예 7은 라이신:알지닌:타이로신:페닐알라닌:발린의 1.5:1.5:1:1:1 혼합물이고, 제조예 8은 프롤린:트레오닌:이소류신:히스티딘:시스틴의 2:2:2:1:1 혼합물이고, 제조예 9는 타이로신:페닐알라닌:발린:프롤린:트레오닌:이소류신:히스티딘:시스틴:메치오닌:트립토판의 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 혼합물이고, 제조예 10은 글라이신:세린:글루타민:아스파틱애씨드:류신:라이신:알지닌:타이로신:페닐알라닌:발린:프롤린:트레오닌:이소류신:히스티딘:시스틴:메치오닌:트립토판의 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 혼합물이다.
제조예 11은 제조예 1:제조예 2 의 1:1 혼합물이고, 제조예 12은 제조예 1:제조예 2의 1:10 혼합물이고, 제조예 13은 제조예 1:제조예 2의 10:1 혼합물이고, 제조예 14는 제조예 1:제조예 3의 1:1 혼합물이고, 제조예 15는 제조예 1:제조예 3의 1:10 혼합물이고, 제조예 16은 제조예 1:제조예 3의 10:1 혼합물이고, 제조예 17은 제조예 1:제조예 4의 1:1 혼합물이고, 제조예 18은 제조예 1:제조예 4의 1:10 혼합물이고, 제조예 19는 제조예 1:제조예 4의 10:1 혼합물이고, 제조예 20은 제조예 1:제조예 5의 1:1 혼합물이고, 제조예 21은 제조예 1:제조예 5의 1:10 혼합물이고, 제조예 22는 제조예 1:제조예 5의 10:1 혼합물이다.
제조예 23은 제조예 1:제조예 6의 1:1 혼합물이고, 제조예 24는 제조예 1:제조예 6의 1:10 혼합물이고, 제조예 25는 제조예 1:제조예 6의 10:1 혼합물이고, 제조예 26은 제조예 1:제조예 7의 1:1 혼합물이고, 제조예 27은 제조예 1:제조예 7의 1:10혼합물이고, 제조예 28은 제조예 1:제조예 7 의 10:1 혼합물이고, 제조예 29는 제조예 1:제조예 8의 1:1 혼합물이고, 제조예 30은 제조예 1:제조예 8의 1:10 혼합물이고, 제조예 31은 제조예 1:제조예 8의 10:1 혼합물이고, 32는 제조예 1:제조예 9의 1:1 혼합물이고, 제조예 33은 제조예 1:제조예 9의 1:10 혼합물이고, 제조예 34는 제조예 1:제조예 9의 10:1 혼합물이고, 35는 제조예 1:제조예 10의 1:1 혼합물이고, 제조예 36은 제조예 1:제조예 10의 1:10 혼합물이고, 제조예 37은 제조예 1:제조예 10의 10:1 혼합물이다.
제조예 1을 리포좀에 포접시킨 리포좀 TAPS의 제조
하기 표 1의 조성에 따라 본 발명의 유효성분인 테트라아세틸피토스핑고신(제조예 1)을 리포좀에 포접시킨 리포좀 TAPS를 제조하였다.
(단위 : 중량%)
상 성분 리포좀 TAPS
A 시토스테롤 2.0
레시친 3.0
하이드로제네이티드포스파티딜콜린 2.0
글리코리피드 1.0
B 글리세린 5.0
잔탄검 0.1
향, 방부제 적량
정제수 잔량
C 제조예 1 1.0
총합 100
A상과 B상을 80℃까지 가온하여 단일 용액으로 만든 후, 50℃에서 C상을 첨가하여 혼합한다. 이후 1000바(bar) 로 2회 고압유화기기를 통과시킨 후 냉각하여 본 발명의 리포좀 TAPS를 제조하였다.
제조예 38 내지 47의 제조
상기 제조된 리포좀 TAPS와 5종 이상의 아미노산의 혼합물을 함유하는 제조예 38 내지 47을 제조하였다. 제조예 38은 리포좀 TAPS:제조예 6의 1:1 혼합물이고, 제조예 39는 리포좀 TAPS:제조예 6의 1:10 혼합물이고, 제조예 40은 리포좀 TAPS:제조예 7의 1:1 혼합물이고, 제조예 41은 리포좀 TAPS:제조예 7의 1:10 혼합물이고, 제조예 42는 리포좀 TAPS:제조예 8의 1:1 혼합물이고, 제조예 43은 리포좀 TAPS:제조예 8의 1:10 혼합물이고, 제조예 44는 리포좀 TAPS:제조예 9의 1:1 혼합물이고, 제조예 45는 리포좀 TAPS:제조예 9의 1:10 혼합물이고, 제조예 46은 리포좀 TAPS:제조예 10의 1:1 혼합물이고, 제조예 47은 리포좀 TAPS:제조예 10의 1:10 혼합물이다.
비교제조예 1 내지 3의 제조 : 카페인을 함유하는 리포좀의 제조
본 발명에 따른 리포좀의 피부 침투력을 측정하기 위하여 상기 표 1의 조성에서 C상의 테트라아세틸피토스핑고신(제조예 1) 대신 카페인을 함유하는 리포좀(비교 제조예 1), 리포좀의 조성을 종래 공지된 리포좀 조성으로 변경하고 카페인을 함유하는 리포좀(비교 제조예 2) 및 카페인만을 함유하는 조성물(비교 제조예 3)을 제조하였다.
(단위 : 중량%)
상 성분 비교제조예1 비교제조예2 비교제조예3
A 글리세릴스테아레이트 - 2.0 -
세테아릴알콜 - 2.0 -
폴리소르베이트 60 - 1.2 -
소르비탄세스퀴올레이트 - 0.8 -
피이지-100 스테아레이트 - 1.0 -
스쿠알란 - 10.0 -
스쿠알란 - 10.0 -
시토스테롤 2.0 - -
레시친 3.0 - -
하이드로제네이티드포스파티딜콜린 2.0 2.0 -
글리코리피드 1.0 - -
B 글리세린 5.0 5.0 -
잔탄검 0.1 0.1 -
향, 방부제 적량 적량 적량
정제수 잔량 잔량 잔량
C 카페인 1.0 1.0 1.0
총합 100 100 100
A상과 B상을 80℃까지 가온하여 단일 용액으로 만든 후 50℃에서 C상을 첨가하여 혼합한 후 1000바(bar)로 2회 고압유화기기를 통과시킨 후 냉각하여 리포좀을 제조하였다. 비교 제조예 3은 실온에서 C상만을 녹여 최종 제품을 제조하였다.
실험예 1: 유효성분의 침투 효과 측정 (카페인 투과량)
본 발명에 따른 리포좀의 유효성분 침투 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
(단위 : 중량%)
상 성분 비교실시예1 비교실시예2 비교실시예3
A 향, 방부제 적량 적량 적량
정제수 잔량 잔량 잔량
B 비교제조예1 10 - -
비교제조예2 - 10 -
비교제조예3 - - 10
총합 100 100 100
피부 침투 효과 실험은, 동물 또는 사람의 피부를 홀더(holder)에 고정시킨 후 표피 쪽에서 액체 미디움 쪽으로 물질이 투과되는 양을 측정하는 장치인 수직형 확산 셀(Cell: Frenz Diffusion cell, Labfine, Korea)을 이용하여 비교 실시예 1, 2 및 3에 함유된 카페인의 피부 침투량을 측정하였다. 실험에는 인공 피부를 이용하였으며, 피부 면적은 0.64cm2, 사용한 미디움은 PBS(pH 7.4)이며, 비교 실시예 1, 2 및 3을 각각 0.50g을 적용하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 피부를 투과한 미디움 150 μg을 취해 HPLC를 이용하여 투과한 카페인의 함량을 측정하였다. 이때 비교 실시예 1, 2 및 3의 유효성분 침투효과를 극명하게 비교하기 위하여 비교 제조예 1, 2 및 3도 함께 실험하여 카페인 함량을 측정하였다. 이 평가를 토대로 피부를 침투한 카페인의 함량(투과된 카페인 함량(%))은 하기의 수학식 1에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
Figure 112017035802763-pat00002
제품 투과된 카페인 함량(%)
비교실시예 1 75%
비교실시예 2 50%
비교실시예 3 21%
상기 표 4의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 리포좀을 함유하는 화장료인 비교실시예 1은 종래의 리포좀만으로 이루어진 비교실시예 2 또는 리포좀을 함유하지 않은 비교실시예 3에 비해 우수한 '카페인 투과율'을 보여, 본 발명에 따라 제조된 리포좀의 피부 침투 효과가 우수한 것을 알 수 있다.
실험예 2: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 세포 상처 회복 효과(피부 재생 효과) 실험
사람 섬유아세포를 12 well plate에 well당 105개씩 seeding하여 90% 정도 자랄 때까지 1% 소태아혈청(FBS)을 함유한 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium; BRL, USA) 배지에서 배양하였다. 가는 팁을 이용해 일정 넓이로 바닥을 긁어 세포를 제거하고 제조예 1 내지 47을 각각 100ppm씩 첨가해 16시간 후에 세포가 자란 모습을 현미경으로 관찰하였다. 손상 1시간 경과 후와 제조예 1 내지 47 처리 후 16시간 후 세포가 비어있는 넓이(세포 손상 면적)를 측정하고 하기 수학식 2를 이용하여 상대적인 상처 회복능력(%)을 계산하여 표 5에 나타내었다.
Figure 112017035802763-pat00003
시료명 손상회복률
(%)		 시료명 손상회복률
(%)		 시료명 손상회복률
(%)
제조예 1 45.2 제조예 17 56.2 제조예 33 91.5
제조예 2 30.5 제조예 18 54.8 제조예 34 91.7
제조예 3 31.7 제조예 19 53.6 제조예 35 90.8
제조예 4 32 제조예 20 55 제조예 36 91.2
제조예 5 31.2 제조예 21 54.4 제조예 37 91.4
제조예 6 33.6 제조예 22 56.9 제조예 38 92.1
제조예 7 34.8 제조예 23 85.0 제조예 39 92.5
제조예 8 32.3 제조예 24 85.4 제조예 40 92.7
제조예 9 35.0 제조예 25 85.6 제조예 41 92.5
제조예 10 37.6 제조예 26 86.1 제조예 42 92.9
제조예 11 51.4 제조예 27 86.5 제조예 43 93.3
제조예 12 52.7 제조예 28 85.9 제조예 44 95.2
제조예 13 55.5 제조예 29 85.7 제조예 45 96.6
제조예 14 54.3 제조예 30 85.5 제조예 46 95.4
제조예 15 53.6 제조예 31 86.2 제조예 47 95.3
제조예 16 55.7 제조예 32 90.5 무처치 24.3
표 5에서 알 수 있듯이, DMEM 배지로만 처리한 대조군과 비교하여 상기 제조예 1 내지 47을 사용한 실험군에서는 세포 손상 면적이 감소하였으며, 특히 제조예 23 내지 37의 상처회복능이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 47 역시 월등히 우수한 세포재생 촉진 효과를 보였다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 세포 재생을 촉진시킬 수 있으며 피부 손상을 빠르게 회복시킬 수 있다.
실험예 3: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 DPPH 라디칼 소거능 분석
본 실험예 3는 제조예 1 내지 47의 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH법을 이용하여 항산화 효과(자유라디칼 소거율)를 측정하였다. DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 자유라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 피검 물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율(%)을 측정한다. 사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 자유라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.
측정방법으로서,
① 96-웰 플레이트에 0.1 mM DPPH 용액 0.15 ml에 시료 용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.
② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.
③ 시료 용액의 블랭크 (Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.
④ 공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.
⑤ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.
자유라디칼 소거율(%)의 결과는 수학식 3에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기의 표 6과 같다.
Figure 112017035802763-pat00004
St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 514nm에서의 흡광도
Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 514nm에서의 흡광도
So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 514nm에서의 흡광도
Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 514nm에서의 흡광도
시료명 SC50 (%) 시료명 SC50 (%) 시료명 SC50 (%)
제조예 1 0.28 제조예 17 0.26 제조예 33 0.04
제조예 2 >1 제조예 18 0.24 제조예 34 0.04
제조예 3 >1 제조예 19 0.26 제조예 35 0.05
제조예 4 >1 제조예 20 0.24 제조예 36 0.05
제조예 5 >1 제조예 21 0.24 제조예 37 0.04
제조예 6 >1 제조예 22 0.26 제조예 38 0.04
제조예 7 >1 제조예 23 0.1 제조예 39 0.05
제조예 8 >1 제조예 24 0.08 제조예 40 0.05
제조예 9 >1 제조예 25 0.08 제조예 41 0.04
제조예 10 >1 제조예 26 0.1 제조예 42 0.03
제조예 11 0.26 제조예 27 0.12 제조예 43 0.04
제조예 12 0.24 제조예 28 0.1 제조예 44 0.01
제조예 13 0.26 제조예 29 0.08 제조예 45 0.02
제조예 14 0.24 제조예 30 0.08 제조예 46 0.01
제조예 15 0.26 제조예 31 0.1 제조예 47 0.01
제조예 16 0.24 제조예 32 0.05
DPPH 자유라디칼을 50% 소거하는데 필요한 시료의 농도인 SC50을 확인한 결과, 제조예 23 내지 37이 우수한 항산화 효과를 보였고, 제조예 38 내지 47이 월등히 우수한 항산화 효과를 보였다.
실험예 4: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 아쿠아포린 3 생합성 촉진 실험
상기 제조예 1 내지 47에서 제조한 시료들의 아쿠아포린 3 생성 촉진 여부를 측정하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 인체 케라티노사이트(keratinocytes)를 24-웰 플레이트(Falcon, 미합중국)에 1× 104 cell/well이 되도록 접종한 후에 하루동안 배양하여 세포를 안정화시킨 다음, 제조예 1 내지 47을 각각 0.01%, 0.05% 0.1%씩 처리하여 2일 동안 무혈청 배지에서 배양하였다. 배양 후 상등액을 취하여 아쿠아포린3 측정용 키트 (Aquaporin 3 ELISA KIT, Gill Blood Group, 미합중국)를 이용하여 460nm에서 흡광도를 비교하여 아쿠아포린 3의 생성 정도를 비교하여 각 시료의 아쿠아포린 생합성에 미치는 영향을 분석하였다. 아쿠아포린3 생성정도를 표 7에 나타내었다.
처리 농도(중량%) 아쿠아포린3 생성정도 (460nm에서 흡광도) 처리 농도(중량%) 아쿠아포린3 생성정도 (460nm에서 흡광도)
0.01% 0.05% 0.10% 0.01% 0.05% 0.10%
제조예 1 0.357 0.529 0.618 제조예 25 0.525 1.031 1.421
제조예 2 0.028 0.057 0.121 제조예 26 0.529 1.089 1.427
제조예 3 0.026 0.053 0.132 제조예 27 0.535 1.121 1.415
제조예 4 0.024 0.061 0.117 제조예 28 0.524 1.045 1.432
제조예 5 0.021 0.055 0.127 제조예 29 0.511 1.025 1.425
제조예 6 0.021 0.062 0.134 제조예 30 0.509 1.089 1.436
제조예 7 0.025 0.063 0.115 제조예 31 0.524 1.001 1.423
제조예 8 0.031 0.071 0.125 제조예 32 0.615 1.111 1.525
제조예 9 0.036 0.065 0.154 제조예 33 0.609 1.119 1.533
제조예 10 0.028 0.069 0.134 제조예 34 0.603 1.121 1.521
제조예 11 0.052 0.115 0.275 제조예 35 0.612 1.114 1.535
제조예 12 0.053 0.105 0.211 제조예 36 0.613 1.139 1.513
제조예 13 0.062 0.108 0.259 제조예 37 0.605 1.122 1.562
제조예 14 0.054 0.113 0.262 제조예 38 0.581 1.145 1.545
제조예 15 0.055 0.107 0.254 제조예 39 0.594 1.141 1.566
제조예 16 0.051 0.104 0.265 제조예 40 0.585 1.143 1.559
제조예 17 0.073 0.112 0.294 제조예 41 0.583 1.142 1.577
제조예 18 0.067 0.113 0.307 제조예 42 0.591 1.147 1.581
제조예 19 0.059 0.115 0.314 제조예 43 0.581 1.151 1.585
제조예 20 0.056 0.117 0.307 제조예 44 0.683 1.311 1.681
제조예 21 0.062 0.114 0.285 제조예 45 0.672 1.314 1.695
제조예 22 0.066 0.113 0.306 제조예 46 0.689 1.289 1.713
제조예 23 0.515 1.011 1.425 제조예 47 0.695 1.312 1.722
제조예 24 0.509 1.081 1.426 무첨가 0.121
상기 표 7의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 제조예 1 내지 47은 피부 각질형성세포에서의 아쿠아포린 3의 생합성을 촉진하는 것을 알 수 있다. 특히 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물인 제조예 23 내지 37의 아쿠아포린 3 생합성 촉진효과가 우수하고, 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 47도 우수한 아쿠아포린 3 생합성 촉진효과를 보였다.
실험예 5: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 피부 각질형성세포 분화촉진효과
사람의 각질형성세포를 6웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후 70-80%로 자란 세포의 배지를 Serum-free DMEM로 교체하고 5시간 배양하였다. 5시간 배양 후 제조예 1 내지 47을 0.1% 처리하였다. 비교예로 제조예 대신 용매(DMSO)를 처리하였다. 이후 16시간 추가배양한 뒤 PBS로 워싱하고 RNA prep kit(Qiagen, 독일)으로 total RNA를 추출한 후 UV 흡광도를 통해 RNA의 양을 표준화하고 각질형성 세포 분화의 마커인 필라그린(filaggrin), 인볼루크린(involucrin), 케라틴1, 케라틴10 유전자의 발현량을 qRT-PCR을 이용하여 상대정량하였다. 위 유전자의 발현량은 GAPDH를 통해 보정해주었다. 그 결과를 표 8에 나타냈다.
시료/ 유전자명 mRNA 발현률(%) 시료/ 유전자명 mRNA 발현률(%)
필라그린 인볼루크린 케라틴1 케라틴10 필라그린 인볼루크린 케라틴1 케라틴10
제조예 1 131 141 138 135 제조예 25 252 232 231 225
제조예 2 102 107 104 106 제조예 26 251 231 227 230
제조예 3 103 105 103 104 제조예 27 253 224 230 227
제조예 4 102 106 105 103 제조예 28 254 229 229 224
제조예 5 105 105 107 104 제조예 29 251 231 228 225
제조예 6 112 113 113 111 제조예 30 253 235 231 231
제조예 7 109 108 107 110 제조예 31 250 238 228 229
제조예 8 116 111 110 112 제조예 32 283 247 243 248
제조예 9 110 109 112 110 제조예 33 284 246 249 246
제조예 10 108 110 108 109 제조예 34 280 244 246 251
제조예 11 135 139 139 133 제조예 35 278 240 244 247
제조예 12 139 141 140 135 제조예 36 282 239 242 248
제조예 13 138 141 139 134 제조예 37 285 238 241 249
제조예 14 138 142 141 138 제조예 38 295 243 234 251
제조예 15 139 143 142 140 제조예 39 296 237 232 250
제조예 16 136 145 140 138 제조예 40 290 242 235 249
제조예 17 141 144 140 143 제조예 41 297 244 237 251
제조예 18 139 149 142 141 제조예 42 292 247 240 253
제조예 19 140 147 143 142 제조예 43 293 243 232 251
제조예 20 141 146 146 140 제조예 44 324 265 267 279
제조예 21 138 148 145 143 제조예 45 321 264 263 270
제조예 22 142 146 148 141 제조예 46 322 277 265 274
제조예 23 261 229 221 220 제조예 47 327 275 269 275
제조예 24 259 225 225 221 무첨가 100 100 100 100
상기 표 8에 나타나는 바와 같이, 테트라아세틸피토스핑고신과 아미노산 5종 이상의 혼합물인 제조예 23 내지 37이 각질형성세포의 분화유도 단백질의 유전자발현을 촉진효과가 우수하고, 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 47도 우수한 각질형성세포의 분화유도 효과를 보였다.
실험예 6: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 B16F1 멜라닌형성세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과
본 실험예 6은 상기 제조예 1 내지 47의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다. 실험예 6에서 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다.
이 세포의 인공 배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 수행하였다.
B16F1 멜라닌 형성 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 제조예 1 내지 47을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율을 (%)은 하기 수학식 4에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 9에 기재하였다.
Figure 112017035802763-pat00005
A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양
B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양
처리 농도(중량%) 멜라닌생성저해율(%) 처리 농도(중량%) 멜라닌생성저해율(%)
0.01 0.05 0.1 0.01 0.05 0.1
제조예 1 11.15 22.21 30.48 제조예 25 43.95 61.39 84.14
제조예 2 3.4 5.7 6.2 제조예 26 43.52 62.35 83.45
제조예 3 5.1 5.3 6.3 제조예 27 44.12 62.85 83.76
제조예 4 3.7 5.2 5.8 제조예 28 43.15 61.78 84.24
제조예 5 3.9 5.8 5.9 제조예 29 44.91 62.65 83.86
제조예 6 3.7 5.8 6.8 제조예 30 44.12 62.1 86.24
제조예 7 3.8 5.9 6.9 제조예 31 43.51 61.65 86.27
제조예 8 4.1 6.1 6.7 제조예 32 46.37 69.88 91.34
제조예 9 4.2 6.2 6.4 제조예 33 45.95 70.25 91.36
제조예 10 3.9 5.8 6.2 제조예 34 47.15 69.71 92.24
제조예 11 13.41 24.52 37.5 제조예 35 45.91 68.65 91.82
제조예 12 12.51 24.32 38.61 제조예 36 46.75 69.39 91.14
제조예 13 14.15 24.83 35.81 제조예 37 45.65 70.84 92.25
제조예 14 15.29 25.01 35.17 제조예 38 48.52 66.35 91.45
제조예 15 16.65 25.34 36.89 제조예 39 47.12 66.81 91.76
제조예 16 15.16 24.98 36.76 제조예 40 47.15 67.78 91.37
제조예 17 17.59 24.63 35.98 제조예 41 45.95 67.65 91.86
제조예 18 16.12 24.15 38.59 제조예 42 48.12 64.1 92.11
제조예 19 17.29 23.85 38.49 제조예 43 49.51 65.65 91.77
제조예 20 17.65 24.15 37.58 제조예 44 57.15 76.54 95.35
제조예 21 18.16 25.34 38.15 제조예 45 56.23 75.78 96.24
제조예 22 18.59 26.17 37.35 제조예 46 55.95 77.65 96.86
제조예 23 43.12 64.25 85.67 제조예 47 57.12 75.23 96.34
제조예 24 44.12 61.23 84.34 알부틴200ppm 68.25
상기 표 9의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신과 아미노산 5종 이상의 혼합물인 제조예 23 내지 37, 특히 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 47이 B16F1 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 히아루론산 생합성 촉진 효과
사람의 섬유아세포를 10% FBS가 포함된 DMEM에 배양하여 24웰 플레이트에 2x104 cells/웰의 농도로 첨가하여 배양하였다. 24시간 후 70-80%로 자란 세포의 배지를 Serum-free DMEM로 교체하고 5시간 배양하였다. 5시간 배양 후 제조예 1 내지 47을 0.5% 처리하였다. 배양 3일 후 배지 내 총 히아루론산의 양을 Hyaluronan Quantikine ELISA Kit(R&D biosystem)을 이용하여 합성된 히아루론산의 양을 측정하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신과 아미노산 5종 이상의 혼합물인 제조예 23 내지 37, 특히 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 47이 섬유아세포에서 히아루론산의 생합성을 촉진하는 것을 확인할 수 있다.
　　 실험예 8: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 MMP -1 생성 억제 효과
본 실험예 8은 제조예 1 내지 47이 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과를 측정한 것이다.
인간 정상 피부 세포인 섬유아세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1× 106 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1 내지 47을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 혼합물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.　
배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 키트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 5에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 10에 나타내었다.
Figure 112017035802763-pat00006
처리 농도(중량%) MMP-1 생성 억제율(%) 처리 농도(중량%) MMP-1 생성 억제율(%)
0.10% 0.50% 1% 0.10% 0.50% 1%
제조예 1 11.5 18.54 37.31 제조예 25 53.53 74.35 82.14
제조예 2 5.01 8.72 10.65 제조예 26 53.35 76.21 83.25
제조예 3 5.31 7.16 11.12 제조예 27 52.34 77.35 83.47
제조예 4 5.34 8.36 15.47 제조예 28 53.14 75.78 83.68
제조예 5 5.14 8.45 14.35 제조예 29 54.87 76.48 84.33
제조예 6 7.54 11.15 20.53 제조예 30 52.43 79.85 83.87
제조예 7 7.64 12.01 21.35 제조예 31 53.08 76.38 83.47
제조예 8 7.15 11.37 22.75 제조예 32 52.34 74.58 88.54
제조예 9 7.34 12.13 21.65 제조예 33 53.13 75.05 87.12
제조예 10 7.61 12.34 21.05 제조예 34 56.19 76.54 88.94
제조예 11 12.5 18.67 38.15 제조예 35 55.98 77.14 89.15
제조예 12 11.8 18.43 37.98 제조예 36 54.87 75.21 89.33
제조예 13 11.46 18.92 38.54 제조예 37 55.35 76.21 90.25
제조예 14 12.14 19.42 39.53 제조예 38 53.11 72.14 90.57
제조예 15 13.51 20.98 38.64 제조예 39 52.16 74.68 89.69
제조예 16 12.47 20.57 40.15 제조예 40 51.35 75.21 89.25
제조예 17 12.69 19.58 42.5 제조예 41 52.44 75.85 89.51
제조예 18 13.11 21.34 43.7 제조예 42 53.21 76.18 90.11
제조예 19 14.34 20.43 40.1 제조예 43 52.57 75.65 90.15
제조예 20 13.25 20.54 40.45 제조예 44 61.38 81.54 94.65
제조예 21 13.87 19.87 41.62 제조예 45 62.57 82.65 95.15
제조예 22 14.1 21.3 42.4 제조예 46 62.48 82.56 94.54
제조예 23 52.57 78.65 82.41 제조예 47 61.35 81.21 94.25
제조예 24 52.34 78.58 82.54 TGF-β 200nM 83.8
상기 표 10의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신과 아미노산 5종 이상의 혼합물인 제조예 23 내지 37, 특히 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 47이 섬유아세포에서 MMP-1의 생성을 크게 억제하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 9. 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 콜라겐 합성 증진 효과
인간 정상 상피 세포인 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1 x 106 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다.　 상기 제조예 1 내지 47을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 혼합물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.　 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다.　 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 수학식 6에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 11에 나타내었다.
Figure 112017035802763-pat00007
처리 농도(중량%) 콜라겐 생합성 증가율(%) 처리 농도(중량%) 콜라겐 생합성 증가율(%)
0.01% 0.05% 0.10% 0.01% 0.05% 0.10%
제조예 1 15.4 21.7 49.7 제조예 25 81.5 105.9 149.8
제조예 2 3.1 4.7 8.9 제조예 26 82.4 106.7 148.1
제조예 3 4.1 4.9 9.2 제조예 27 82.5 106.8 148.4
제조예 4 3.2 5.1 8.8 제조예 28 83.4 107.4 149.6
제조예 5 2.8 4.6 9.4 제조예 29 83.1 108.2 148.7
제조예 6 2.1 4.3 9.6 제조예 30 82.6 107.6 150.4
제조예 7 3.2 5.2 10.1 제조예 31 83.2 108.6 149.2
제조예 8 2.5 4.8 9.4 제조예 32 94.6 116.2 156.8
제조예 9 3.4 5.1 9.5 제조예 33 94.3 115.1 156.3
제조예 10 3.6 5.2 10.2 제조예 34 96.45 115.4 158.7
제조예 11 16.9 22.75 56.7 제조예 35 95.37 117.1 160.3
제조예 12 16.6 23.3 56.9 제조예 36 95.8 118.3 159.5
제조예 13 16.8 24.4 50.3 제조예 37 96.6 114.5 160.1
제조예 14 17.1 24.4 50.7 제조예 38 89.2 116.4 158.6
제조예 15 17.3 25.5 52.5 제조예 39 89.7 117.2 157.7
제조예 16 16.7 24.5 57.6 제조예 40 89.8 116.4 158.6
제조예 17 16.9 25.6 52.5 제조예 41 89.2 115.2 157.7
제조예 18 17.3 26.8 51.8 제조예 42 90.6 116.6 160.5
제조예 19 17.4 27.1 56.7 제조예 43 91.3 115.1 160.4
제조예 20 17.4 29.8 56.3 제조예 44 101.5 129.1 172.5
제조예 21 18.3 29.15 56.4 제조예 45 102.4 131.8 175.1
제조예 22 18.4 28.8 57.6 제조예 46 101.6 128.7 174.5
제조예 23 81.3 105.4 148.7 제조예 47 101.5 125.4 172.6
제조예 24 80.7 106.2 145.6 TGF-β (200nM) 168.7
표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신과 아미노산 5종 이상의 혼합물인 제조예 23 내지 37, 특히 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 39이 섬유아세포에서 콜라겐 생합성을 크게 증진시키는 것을 확인할 수 있다.
실험예 10. 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과
실험예 10는 제조예 1 내지 47의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위한 것으로서, 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X104 개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model: F15TB, UV B 15W, Sankyo Dennki사 Japan)을 이용하여 자외선 10mj/cm2를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배 (DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 이에 평가하고자 하는 제조예 1 내지 47을 100ppm씩 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕을 취하여 IL-1α을 정량함으로써 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소 면역 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 정량화하였으며, 염증성 사이토 카인(IL-1α)의 발현 억제율(%)은 하기 수학식 7에 의해 계산하였다.
Figure 112017035802763-pat00008
Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
Bt : 자외선 조사하고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
St : 자외선 조사하고 시료 처리한 웰의 IL-1α 생성량
시료명 염증성 사이토 카인 발현 억제율 (%) 시료명 염증성 사이토 카인 발현 억제율 (%)
제조예1 29.8 제조예25 57.13
제조예2 11.35 제조예26 56.47
제조예3 10.57 제조예27 56.18
제조예4 11.56 제조예28 56.31
제조예5 11.91 제조예29 57.19
제조예6 12.17 제조예30 58.37
제조예7 11.58 제조예31 57.25
제조예8 12.24 제조예32 63.17
제조예9 12.61 제조예33 64.06
제조예10 13.51 제조예34 63.98
제조예11 30.05 제조예35 64.11
제조예12 30.13 제조예36 64.32
제조예13 31.52 제조예37 65.14
제조예14 31.17 제조예38 66.17
제조예15 30.87 제조예39 66.34
제조예16 30.36 제조예40 66.75
제조예17 35.75 제조예41 67.51
제조예18 36.48 제조예42 66.35
제조예19 36.94 제조예43 66.11
제조예20 37.15 제조예44 77.11
제조예21 38.45 제조예45 77.45
제조예22 38.16 제조예46 78.45
제조예23 55.43 제조예47 78.13
제조예24 55.98 인도메타신
(100ppm)		 61.23
상기 표 12의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신과 아미노산 5종 이상의 혼합물인 제조예 23 내지 37, 특히 본 발명에 따른 테트라아세틸피토스핑고신의 리포좀을 함유하는 제조예 38 내지 47이 섬유아세포에서 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 크게 억제하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 제조예는 동일 농도에서 염증성사이토카인 발현 억제물질인 인도메타신보다도 우수한 염증성 사이토카인 발현율을 보임을 알 수 있었다.
　 제형예 1: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물을 함유하는 화장료 조성물의 제조
제조예 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 42, 44 및 46을 각각 포함하는 화장료(제형예 1 내지 15)를 표 13 및 표 14의 조성을 갖도록 제조하였다. 또한, 효능의 비교를 위해 제조예 1, 11, 14, 17 및 20을 각각 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 1 내지 5) 및 혼합물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 6), 혼합물 대신에 주름개선 소재로 아데노신을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 7), 혼합물이나 보습제를 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 8), 혼합물 대신에 미백소재로서 니아신아마이드를 함유하는 화장료 조성물(비교제형예 9), 혼합물 대신에 피부재생 소재로서 마데카소사이드를 함유하는 화장료 조성물(비교제형예 10)를 하기 표 14 및 표 15에 조성을 갖도록 제조하였다.
구분 성분 제형예1 제형예 2 제형예3 제형예4 제형예5 제형예6 제형예7 제형예8 제형예9 제형예10
A 제조예 23 1 　- - - - - - - - -
　 제조예 24 - 1 - - - - - - - -
　 제조예 26 - - 1 - - - - - - -
　 제조예 27 - - - 1 - - - - - -
　 제조예 29 - - - - 1 - - - - -
　 제조예 30 - - - - - 1 - - - -
　 제조예 32 - - - - - - 1 - - -
　 제조예 33 - - - - - - - 1 - -
　 제조예 35 - - - - - - - - 1
　 제조예 36 - - - - - - - - - 1
　 EDTA-2Na 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02
　 정제수 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100
B 세토스테아릴알코올 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
　 글리세릴스테아레이트 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
　 마이크로크리스탈린 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
　 스쿠알란 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
　 유동파라핀 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
　 트리옥타노인 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
　 폴리솔베이트 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
　 솔비탄스테아레이트 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
　 토코페릴아세테이트 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
　 사이클로메치콘 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
　 BHT 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
C 향,방부제 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량
구분 성분 제형예 11 제형예 12 제형예 13 제형예 14 제형예 15 비교제형예 1 비교제형예 2 비교제형예 3 비교제형예 4 비교제형예 5
A 제조예 38 1 - - - - - - - - -
　 제조예 40 - 1 - - - - - - - -
　 제조예 42 - - 1 - - - - - - -
　 제조예 44 - - - 1 - - - - - -
　 제조예 46 - - - - 1 - - - - -
　 제조예 1 - - - - - 1 - - - -
　 제조예 11 - - - - - - 1 - - -
　 제조예 14 - - - - - - - 1 - -
　 제조예 17 - - - - - - - - 1 -
　 제조예 20 - - - - - - - - - 1
　 EDTA-2Na 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02
　 정제수 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100
　 세토스테아릴알코올 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
　 글리세릴스테아레이트 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
B 마이크로크리스탈린 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
　 스쿠알란 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
　 유동파라핀 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
　 트리옥타노인 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
　 폴리솔베이트 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
　 솔비탄스테아레이트 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
　 토코페릴아세테이트 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
　 사이클로메치콘 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
　 BHT 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
C 향,방부제 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량
구분 성분 비교제형예6 비교제형예7 비교제형예8 비교제형예9 비교제형예10
A 글리세린 5 - - - -
　 1,3-부틸렌글리콜 5 - - - -
　 아데노신 - 0.04 - - -
　 니아신아마이드 - - - 2 -
　 마데카소사이드 - - - - 5
　 EDTA-2Na 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02
　 정제수 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100
　 세토스테아릴알코올 2 2 2 2 2
　 글리세릴스테아레이트 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
B 마이크로크리스탈린 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
　 스쿠알란 5 5 5 5 5
　 유동파라핀 3 3 3 3 3
　 트리옥타노인 5 5 5 5 5
　 폴리솔베이트 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
　 솔비탄스테아레이트 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
　 토코페릴아세테이트 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
　 사이클로메치콘 3 3 3 3 3
　 BHT 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
C 향,방부제 적량 적량 적량 적량 적량
실험예 11: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 피부장벽기능 개선효과
상기 제형예 1 내지 15 및 비교제형예의 피부장벽기능 개선효가를 평가하였다. 20세 이상 성인 남녀 220명을 무작위로 10 명씩 22개 그룹 (1 내지 22그룹)으로 나눈 후, 220명의 전박에 1.0% SLS 수용액 20ul를 finn-chamber 적용하여 16시간 첩포함으로써 피부장벽기능을 일시적으로 손상시켰다. 그 후 1 내지 15 그룹에는 제형예 1 내지 15의 화장료 조성물을, 16 내지 20그룹에는 비교제형예 1 내지 5의 화장료 조성물을, 21그룹에는 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 6), 22그룹에는 혼합물 및 보습제를 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 8)을 각각 1일 2회씩 1주간 도포하게 하였다. 피부장벽기능 개선효과는 SLS 첩포전, 첩포후, 제형도포후 7일간 매일 경피수분손실량(Transepidermal Water Loss; TEWL)을 측정하였으며 결과를 표 16에 나타내었다.
　 시험전 SLS 첩포후 Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7
제형예 1 6.7 22.4 18.8 10.8 8.7 7.8 7 6.5 6.4
제형예 2 6.6 22.3 19.1 10.9 8.5 7.6 6.9 6.4 6.5
제형예 3 6.6 21.6 18.9 10.8 8.8 7.5 6.9 6.4 6.5
제형예 4 6.7 20.5 19 11 8.2 7.9 7.1 6.5 6.4
제형예 5 6.5 22.3 19.1 10.9 8.3 7.7 7 6.4 6.5
제형예 6 6.7 22.1 19.3 10.7 8.5 7.6 7 6.5 6.4
제형예 7 6.7 22.1 18.3 9.9 7.4 7.1 6.5 6.6 6.5
제형예 8 6.7 21.8 18.3 9.7 7.3 7.2 6.8 6.6 6.7
제형예 9 6.5 21.7 18.1 9.8 7.1 6.9 6.7 6.7 6.5
제형예 10 6.8 21.5 17.9 9.8 7.3 6.8 6.7 6.6 6.7
제형예 11 6.8 22.3 17.3 9.4 7.7 6.7 6.5 6.5 6.5
제형예 12 6.7 22.1 17.3 9.4 7.8 6.9 6.5 6.6 6.5
제형예 13 6.7 21.8 17.1 9.3 7.7 6.7 6.8 6.6 6.7
제형예 14 6.5 21.7 16.9 8.7 7.1 6.8 6.7 6.7 6.5
제형예 15 6.8 21.5 16.5 8.6 7.3 6.8 6.7 6.6 6.7
비교제형예 1 6.7 21.4 20.4 18.1 14.4 11.2 8.7 7.2 6.8
비교제형예 2 6.8 22 20.1 17.8 14.3 11.7 8.6 7.3 6.7
비교제형예 3 6.7 21.7 18.8 18.3 14.4 11.3 8.5 7.1 6.7
비교제형예 4 6.5 21.5 18.9 16.2 12.5 10.5 7.2 6.5 6.5
비교제형예 5 6.7 21.3 19.5 16.7 12.4 10.3 7.6 6.5 6.4
비교제형예 6 6.5 21.5 18.6 13.2 8.5 6.9 6.5 6.4 6.6
비교제형예 8 6.5 22.1 20.2 19.3 18.5 17.3 15.7 12.6 10.4
상기 표 16에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 제형예 1 내지 15 도포한 부위가 비교제형예 1 내지 5에 비해 더 빠르게 장벽기능을 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 12: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 보습 효과
상기 제형예 1 내지 15의 화장료 조성물에 대한 임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 220명을 무작위로 10 명씩 22개 그룹(1 내지 22그룹)으로 나눈 후, 1 내지 15 그룹에는 제형예 1 내지 15의 화장료 조성물을, 16 내지 20그룹에는 비교제형예 1 내지 5의 화장료 조성물을, 21그룹에는 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 6), 22그룹에는 혼합물 및 보습제를 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 8)을 각각 1일 2회씩 1주간 도포하게 하였다. 보습 효과는 실사용 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다.　 실험 결과는 하기 표 17에 나타내었다.
구분 사용 전 사용 2주 후 사용 4주 후
제형예 1 21.4 31.9 50.7
제형예2 23.5 32.5 51.1
제형예 3 22.9 31.4 50.3
제형예 4 22.4 32.7 50.1
제형예 5 22.3 32.5 50.8
제형예 6 21.6 33.5 50.5
제형예 7 21.8 37.3 52.7
제형예 8 22 36.9 52.3
제형예 9 23.1 37.1 53.4
제형예 10 22.5 37.5 53.5
제형예 11 22 36.9 52.3
제형예 12 23.1 37.1 53.4
제형예 13 22.5 37.5 53.5
제형예 14 21.8 40.3 56.1
제형예 15 21.7 39.3 56.2
비교제형예 1 23.4 23.8 25.3
비교제형예 2 22.8 23.5 25.4
비교제형예 3 23.2 24.3 26.1
비교제형예 4 23.5 24.1 25.8
비교제형예 5 21.4 22.3 24.2
비교제형예 6 23.3 37.4 49.7
비교제형예 8 22.2 24.8 23.8
상기 표 17에서 알 수 있는 바와 같이, 일반 다른 보습제를 함유한 화장료(비교제형예 6)와 비교하여도 본 발명의 혼합물 또는 리포좀을 함유한 화장료(제형예 1 내지 15)의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실험예 13: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 미백효과
본 발명의 혼합물을 함유하는 화장료의 피부 미백효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.
220명의 여성(30세 - 50세)을 대상으로 무작위로 10 명씩 22개 그룹(1 내지 22그룹)으로 나눈 후, 1 내지 15 그룹에는 제형예 1 내지 15의 화장료 조성물을, 16 내지 20 그룹에는 비교제형예 1 내지 5의 화장료 조성물을, 21 그룹에는 혼합물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 제형(비교제형예 6), 22그룹에는 혼합물 대신에 니아신아마이드 2중량%로 대체한 제형(비교제형예 9)을 각각 1일 2회씩 4주간 안면에 도포하게 하였다. 얼굴 양쪽면을 사용하여 Chromameter (Minolta CR300)로 밝기(L*)를 측정한 뒤 4주 후의 미백 효과를 확인하였다.　 미백 효과 결과는 하기의 표 18에 나타내었다.
구분 측정값(L*)
사용 전 사용 2주 후 사용 4주 후
제형예 1 57.8 61.3 62.7
제형예 2 58.6 60.4 63.1
제형예 3 58.7 61.5 63.5
제형예 4 58.6 61.2 63.2
제형예 5 58.5 60.9 62.8
제형예 6 58.4 61.1 62.9
제형예 7 57.8 62.4 64.9
제형예 8 58.1 62.5 64.3
제형예 9 58 62.1 65.1
제형예 10 58.6 62.2 64.7
제형예 11 58.7 63.8 65.1
제형예 12 58.6 62.5 65.2
제형예 13 58.1 62.6 64.9
제형예 14 58 64.1 68.1
제형예 15 58.6 64.4 68.2
비교제형예 1 58.2 59.4 59.7
비교제형예 2 57.9 58.5 59.2
비교제형예 3 58 58.7 59
비교제형예 4 58.6 59.4 59.5
비교제형예 5 58.7 58.6 59.1
비교제형예 6 58.1 58.5 58
비교제형예 9 58.2 61.4 65.9
상기 표 18에 나타낸 바와 같이, 미백성분을 함유한 화장료(비교제형예 9)와 비교하여도 본 발명의 혼합물을 함유한 화장료(제형예 1 내지 15)의 미백 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실험예 14 : 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 피부 탄력 개선 효과 측정
실험예 14는 본 발명의 혼합물을 포함하는 제형예 1 내지 15와 비교제형예 1 내지 5와 혼합물 대신에 보습제를 넣은 비교제형예 6에 따른 화장료 조성물의 피부 탄력 개선 효과를 알아보기 위하여, 30~40대의 탄력이 감소한 여성 210명을 대상으로 측정하였다.　 10명씩 21개 그룹으로 나눈 뒤, 1 내지 15그룹에는 제형예 1 내지 15를, 16 내지 20그룹에는 비교제형예 1 내지 5를 그리고 21그룹에는 비교제형예 6을 안면에 매일 아침, 저녁으로 2회씩 12주간 도포하게 한 후, 8주 후 피부 탄력을 측정하였다. 얼굴 부위의 탄력을 cutometer SEM575 (MPA 580, Courage+Khazaka GmbH, Germany)를 이용하여 측정하였으며, 피부 탄력을 나타내는 R2(biological elasticity)를 도포 전과 도포 후를 측정한 뒤 개선도(%)로 평가하였다. 그 결과는 하기 표 19에 나타내었으며, 결과는 각 군에 대한 개선도의 평균치이다.
실험제품 피부 탄력 개선도(%)
제형예 1 30.3
제형예 2 29.7
제형예 3 30.2
제형예 4 29.8
제형예 5 30.3
제형예 6 30.1
제형예 7 31.2
제형예 8 31.4
제형예 9 30.9
제형예 10 31.2
제형예 11 31.8
제형예 12 31.4
제형예 13 31.5
제형예 14 33.0
제형예 15 33.1
비교제형예 1 7.8
비교제형예 2 8.1
비교제형예 3 8.3
비교제형예 4 8.1
비교제형예 5 7.9
비교제형예 6 6.3
상기 표 19에 나타난 바와 같이, 혼합물이 함유된 제형예 1 내지 15는 비교제형예에 비하여 피부 탄력이 매우 향상됨을 알 수 있었다.
실험예 15: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 피부 주름 개선효과
본 발명의 혼합물을 함유하는 화장료의 피부 주름 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.
220명의 여성(30세 - 50세)을 대상으로 실험군을 각각 10명씩 22개의 그룹으로 무작위로 나눈 뒤, 1 내지 15그룹에는 제형예 1 내지 15를, 16 내지 20그룹에는 비교제형예 1 내지 5를, 21그룹에는 혼합물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 제형(비교제형예 6) 을, 22그룹에는 혼합물을 아데노신 0.04 중량%로 대체한 제형(비교제형예 7)을 매일 2회 8주간 도포한 뒤, 얼굴 양쪽면을 사용하여 8주 후의 주름 개선 효과를 육안 관찰 및 기기측정(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)을 통하여 평가하였으며, 실험 결과는 하기의 표 20에 나타낸 바와 같다.
　 주름 개선 효과 유효율(%)
우수 약간 없음
제형예 1 11 5 4 80
제형예 2 11 6 3 85
제형예 3 12 4 4 80
제형예 4 11 5 4 80
제형예 5 12 4 4 80
제형예 6 12 5 3 85
제형예 7 12 5 3 85
제형예 8 15 3 2 90
제형예 9 13 5 2 90
제형예 10 13 5 2 90
제형예 11 13 5 2 90
제형예 12 12 6 2 90
제형예 13 11 7 2 90
제형예 14 17 2 1 95
제형예 15 16 3 1 95
비교제형예 1 2 5 13 35
비교제형예 2 3 3 14 30
비교제형예 3 2 5 13 35
비교제형예 4 2 6 12 40
비교제형예 5 4 4 12 40
비교제형예 6 3 3 14 30
비교제형예 7 12 6 3 85
상기 표 20의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 혼합물을 함유한 제형예 1 내지 15의 화장료 조성물은 보습제를 함유하는 비교제형예 6에 비하여 약 3.0배 높은 주름개선 효과를 보여주었다. 또한, 주름 개선 효과가 있는 것으로 알려진 아데노신을 함유하는 비교제형예 7의 화장료와 유사한 결과가 나타났다.
실험예 16: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 진피치밀도 개선 효과 측정
본 발명의 혼합물을 함유하는 화장료의 진피치밀도 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.
220명의 여성(30세 - 50세)을 대상으로 실험군을 각각 10명씩 22개의 그룹으로 나눈뒤, 1 내지 15그룹에는 제형예 1 내지 15를, 16 내지 20 그룹에는 비교제형예 1 내지 5를, 21그룹에는 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 제형(비교제형예 6)을, 22그룹에는 혼합물을 아데노신 0.04 중량%로 대체한 제형(비교제형예 7)을 1일 2회 4주간 얼굴에 도포후, 얼굴 양쪽면을 사용하여 4주 후의 진피치밀도 개선 효과를 SkinScanner DUBcutis(tpm (terbana pro medicum), Luneburg, Germany)를 이용한 기기평가를 통해 확인하였다. 　진피치밀도 증가율은 하기의 수학식 8에 따라 계산하였으며 진피치밀도 개선 효과 결과는 하기의 표 21에 나타내었다.
Figure 112017035802763-pat00009
실험제품 진피치밀도 증가율(%)
제형예 1 28.3
제형예 2 27.7
제형예 3 28.4
제형예 4 28.5
제형예 5 28.5
제형예 6 28.1
제형예 7 30.9
제형예 8 30.7
제형예 9 30.4
제형예 10 31.1
제형예 11 30.7
제형예 12 30.5
제형예 13 31.1
제형예 14 32.9
제형예 15 32.7
비교제형예 1 4.7
비교제형예 2 5.1
비교제형예 3 5.5
비교제형예 4 6.1
비교제형예 5 6.7
비교제형예 6 3.5
비교제형예 7 25.1
상기 표 20에 나타난 바와 같이, 혼합물이 함유된 제형예 1 내지 15는 비교제형예에 비하여 피부 진피치밀도가 매우 개선됨을 알 수 있었다.
실험예 17: 테트라아세틸피토스핑고신 및 아미노산 혼합물의 피부 재생 및 상처 치유 효과
상기 제형예 1 내지 15의 화장료를 사용한 경우 피부 재생 및 상처 치유 개선 정도의 차이를 비교하였다. 구체적으로 레이저 시술 및 박피 시술을 받은 사람 220명을 대상으로 실험군을 각각 10명씩 22개의 그룹으로 나눈뒤, 1 내지 15그룹에는 제형예 1 내지 15를, 16 내지 20 그룹에는 비교제형예 1 내지 5를, 21그룹에는 혼합물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 제형(비교제형예 6)을, 22그룹에는 혼합물을 마데카소사이드 5중량%로 대체한 제형(비교 제형예 10)을 1일 2회 1주일 간 얼굴에 도포하도록 하였다. 이후 피부 재생 및 상처 치유 개선 정도에 대한 만족도를 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 22에 나타내었다.
구분 피부재생 및 상처치유 만족도(%)
매우만족 만족 보통 약간 불만족 불만족
제형예 1 45 30 20 5 0
제형예 2 50 25 25 0 0
제형예 3 50 20 25 5 0
제형예 4 45 20 30 5 0
제형예 5 50 25 25 0 0
제형예 6 45 25 30 0 0
제형예 7 60 20 20 0 0
제형예 8 55 25 20 0 0
제형예 9 60 25 15 0 0
제형예 10 60 20 10 0 0
제형예 11 55 30 15 0 0
제형예 12 60 25 15 0 0
제형예 13 60 25 15 0 0
제형예 14 65 25 10 0 0
제형예 15 65 25 10 0 0
비교제형예 1 20 25 45 10 0
비교제형예 2 25 25 35 5 10
비교제형예 3 25 20 40 10 5
비교제형예 4 25 25 40 10 0
비교제형예 5 25 15 45 10 5
비교제형예 6 20 25 40 10 5
비교제형예 10 55 30 15 0 0
상기 표 22의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 혼합물을 함유한 제형예 1 내지 15의 화장료 조성물은 보습제를 함유하는 비교제형예 6에 비하여 높은 피부 재생 및 상처 치유 개선 정도에 대한 만족도를 보였다. 또한, 상처치유 효과가 있는 것으로 알려진 마데카소사이드를 함유하는 비교제형예 10의 화장료와 유사한 결과가 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 테트라아세틸피토스핑고신; 및
    타이로신, 프롤린, 이소류신, 히스티딘, 시스틴, 메치오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린 및 페닐알라닌의 아미노산 혼합물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 테트라아세틸피토스핑고신; 및
    타이로신, 프롤린, 이소류신, 히스티딘, 시스틴, 메치오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린 및 페닐알라닌의 아미노산 혼합물을 함유하는 항산화용 화장료 조성물.
  3. 테트라아세틸피토스핑고신; 및
    타이로신, 프롤린, 이소류신, 히스티딘, 시스틴, 메치오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린 및 페닐알라닌의 아미노산 혼합물을 함유하는 보습용 화장료 조성물.
  4. 테트라아세틸피토스핑고신; 및
    타이로신, 프롤린, 이소류신, 히스티딘, 시스틴, 메치오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린 및 페닐알라닌의 아미노산 혼합물을 함유하는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
  5. 테트라아세틸피토스핑고신; 및
    타이로신, 프롤린, 이소류신, 히스티딘, 시스틴, 메치오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린 및 페닐알라닌의 아미노산 혼합물을 함유하는 미백용 화장료 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 테트라아세틸피토스핑고신은 리포좀에 포접된 것인, 화장료 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 혼합물은 글라이신, 세린, 글루타민, 아스파틱애씨드, 류신, 라이신 및 알지닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는, 화장료 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 혼합물은 글라이신, 세린, 글루타민, 아스파틱애씨드, 류신, 라이신 및 알지닌을 추가로 포함하는, 화장료 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 혼합물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30.0 중량% 함유되는, 화장료 조성물.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 테트라아세틸피토스핑고신은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 20.0 중량%로 함유되는, 화장료 조성물.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 리포좀은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 20.0 중량%로 함유되고,
    상기 리포좀에 포접된 테트라아세틸피토스핑고신은 리포좀의 총 중량에 대하여 0.00003 내지 2 중량%로 함유되는, 화장료 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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