CN108129541A - 一种从灵芝中提取的三萜类化合物及其方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从灵芝中提取的三萜类化合物及其方法和应用，以干燥灵芝子实体为原料，经乙醇提取、浓缩、乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱分离纯化、过滤、C18反相色谱填料高压制备分离等步骤后提取得到一种具有药理活性的新的药用化合物，自命名为Ganosinensic acid C，该化合物具有在细胞毒活性方面的用途，不仅为发掘灵芝三萜类化合物在抗癌、抗肿瘤等方面提供了一定的药用参考价值，更为现有病毒细胞的研究提供治理方案。

Description

一种从灵芝中提取的三萜类化合物及其方法和应用
技术领域
本发明是一种从灵芝中提取的三萜类化合物及其方法和应用，具体涉及从灵芝药材中提取分离的具有药理活性的化合物及其方法和用途，属于植物化学技术领域。
背景技术
灵芝（Ganoderma lucidum）又名灵芝草、仙草、瑞草，为担子菌岗多孔菌科灵芝属真菌赤芝[Ganoderma lucidum(leyss.Ex.Fr.) Karst] 和紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd]的干燥子实体。灵芝是一种我国传统的名贵滋补中药材，受到国内外的普遍关注。对于其药用价值的研究在我国有着悠久的历史。其始载于《神农本草经》，书中记载灵芝具有滋身健体、保肝益气、固本培元、延年益寿等功效。《本草纲目》也阐述了该药材的功效，书中记载其对关节有利、保神、益精气、治痔、疗虚劳、久服延年。现代研究表明，灵芝中含有多糖、三萜、生物碱、核苷、呋喃类衍生物、多肽氨基酸、甾醇类、油脂类、有机锗等化学成分。而灵芝三萜化合物是灵芝的主要有效成分之一，具有抗肿瘤、抗前列腺癌、抗炎、抑制HIV-1蛋白酶等重要生物活性。因此，其药理活性越来越受到研究者的青睐，具有极为广阔的开发前景。目前，关于灵芝三萜新结构的报道从未间断过，但对与五环骨架体系的结构较特殊的灵芝三萜类化合物的报道却很少。
现有专利文献CN101747400A（具抗肿瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物及制备方法和应用，2010.06.23）公开了一种由灵芝子菌丝体或子实体经乙醇提取、石油醚和乙酸乙酯萃取、高效液相色谱分离后，即得到如下式（1）所示的羊毛甾烷型三萜化合物，该羊毛甾烷型三萜化合物或其可药用的盐具有在制备抗肿瘤药物中的用途。
（1）。
现有专利文献CN105037470A（一种新的三萜类化合物及其制备方法和医药用途，2015.11.11）公开了一种由灵芝经醇提取、石油醚萃取脱脂、乙酸乙酯萃取、碱性溶液萃取、色谱分离后得到如下式（2）所示的新的三萜类化合物，该三萜类化合物或其衍生物具有在制备治疗肿瘤药物中的应用。
（2）。
现有专利文献CN104478983A（从灵芝中提取分离的两种药用化合物及其方法和用途，2015.04.01）公开了一种由灵芝经乙醇提取、乙酸乙酯萃取、甲醇溶解、硅胶柱色谱分离纯化、C18反相色谱分离后得到如下式（3）、（4）所示的三萜类化合物，该三萜类化合物具有在作用制备抗菌药物中的用途。
（3）（4）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从灵芝中提取的三萜类化合物，通过从灵芝中药材中提取得到具有药理活性的新的药用化合物，拓展了现有灵芝中药材资源的应用领域。
本发明的另一目的在于提供一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，以干燥灵芝子实体为原料，经乙醇提取、浓缩、乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱分离纯化、过滤、C18反相色谱填料高压制备分离处理等步骤后提取得到一种新的药用化合物，操作步骤简单易控制，实际操作过程中，三萜类化合物的提取率可以控制在80%以上，纯度可以控制在98%以上。
本发明的另一目的在于提供一种从灵芝中提取的三萜类化合物在细胞毒活性方面的用途，为发掘灵芝三萜类化合物在抗癌、抗肿瘤等方面提供了一定的药用参考价值，为研究开发新型抗癌、抗肿瘤药物提供依据。
本发明通过下述技术方案实现：一种从灵芝中提取的三萜类化合物，所述三萜类化合物是从灵芝中分离提纯而得到，其结构式为：
。
自命名为：Ganosinensic acid C。
所述三萜类化合物为10%硫酸乙醇显色呈紫红色。
所述三萜类化合物的分子量为512，分子式为C30H40O7。
一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，所述提取步骤包括：
A．以干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用乙醇加热回流提取，再经减压浓缩后得到提取浓缩液；
B．将提取浓缩液用水分散后，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
C．将乙酸乙酯萃取物用甲醛溶解后，进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用甲醇溶解后，经过滤、C18反相色谱填料高压制备分离后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到三萜类化合物，其结构式为：
。
所述步骤A中，粉碎后的灵芝子实体用其重量8～10倍的浓度为75～95%W/W的乙醇进行加热回流提取3～5次，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液。
所述步骤B中，将提取浓缩液用其体积5～8倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，得到乙酸乙酯萃取物。
所述步骤C中，将乙酸乙酯萃取物用浓度为80～95%的甲醛进行溶解。
所述步骤C中，以1.0～1.5倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化。
所述步骤D中，所得固体用浓度为80～90%的甲醇分散后，再用0.45μm的滤膜过滤；所述C18反相色谱填料高压制备分离过程中：A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm。
一种从灵芝中提取的三萜类化合物的应用，包括结构式为：
的三萜类化合物在细胞毒活性方面的用途。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明涉及的三萜类化合物是采用提取分离纯化的方式从干燥灵芝药材中获得的一种具有细胞毒活性的新化合物。作为首次报道的化合物，据核磁二维等相关数据确定了化合物相对构型，据电喷雾电离质谱ESI-MS确定其分子量，据解析结果确定其分子式为C30H40O7，自命名为Ganosinensic acid C。
（2）本发明明确了化合物的细胞毒活性，并进一步发掘了具有药用价值的结构新颖的灵芝三萜类化合物，对于研发新型抗癌药物具有一定的参考价值。据报道，灵芝三萜化合物是灵芝的主要有效成分之一，具有抗癌、抗前列腺癌、抗炎、抑制HIV-1蛋白酶等重要生物活性。本研究细胞毒活性试验表明，该化合物对肿瘤细胞95D（人高转移肺癌细胞株）、Hela（人宫颈癌细胞株）具有抑制活性。研究结果表明该化合物在研制新型抗癌药物方面，能够作为一种潜体结构进行开发利用。
（3）本发明方法提取分离容易，实际操作时，目标化合物可由高浓度的乙醇，通过加热回流的方式，从灵芝药材中提取出来，经过有机试剂乙酸乙酯萃取除杂，得到粗产品；再经硅胶柱色谱分离后，得到目标段；目标段用甲醇溶解，过滤，经过C18反相色谱填料高压制备分离，得到目标化合物。该提取分离方法简单，适用于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本实施例提出了一种从灵芝中提取的三萜类化合物，该三萜类化合物为10%硫酸乙醇显色呈紫红色，分子量为512，分子式为C30H40O7，其结构式为：
。
本实施例涉及的三萜类化合物是从灵芝中分离提纯而得到的，具体的分离提纯步骤如下：
A．以干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用乙醇加热回流提取，再经减压浓缩后得到提取浓缩液；
B．将提取浓缩液用水分散后，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
C．将乙酸乙酯萃取物用甲醛溶解后，进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用甲醇溶解后，经过滤、C18反相色谱填料高压制备分离后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到该三萜类化合物。
实施例2：
本实施例提出了一种从灵芝中提取的三萜类化合物，该三萜类化合物为10%硫酸乙醇显色呈紫红色，分子量为512，分子式为C30H40O7，其结构式为：
。
本实施例涉及的三萜类化合物是从灵芝中分离提纯而得到的，具体的分离提纯步骤如下：
A．以干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量8倍的浓度为75%W/W的乙醇进行加热回流提取5次，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液。
B．将提取浓缩液用其体积5倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯萃取物。
C．将乙酸乙酯萃取物用浓度为80%的甲醛溶解后，以1.0倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为80%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
经电喷雾电离质谱ESI-MS显示：负离子 511.20[M-H]-，即该化合物分子量为512，分子式为C30H40O7。
实施例3：
本实施例提出了一种从灵芝中提取的三萜类化合物，该三萜类化合物为10%硫酸乙醇显色呈紫红色，分子量为512，分子式为C30H40O7，其结构式为：
。
本实施例涉及的三萜类化合物是从灵芝中分离提纯而得到的，具体的分离提纯步骤如下：
A．以干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量10倍的浓度为95%W/W的乙醇进行加热回流提取3次，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液。
B．将提取浓缩液用其体积8倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取物。
C．将乙酸乙酯萃取物用浓度为95%的甲醛溶解后，以1.5倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为90%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
经电喷雾电离质谱ESI-MS显示：负离子 511.20[M-H]-，即该化合物分子量为512，分子式为C30H40O7。
实施例4：
本实施例提出了一种从灵芝中提取的三萜类化合物，该三萜类化合物为10%硫酸乙醇显色呈紫红色，分子量为512，分子式为C30H40O7，其结构式为：
。
本实施例涉及的三萜类化合物是从灵芝中分离提纯而得到的，具体的分离提纯步骤如下：
A．以干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量9倍的浓度为80%W/W的乙醇进行加热回流提取4次，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液。
B．将提取浓缩液用其体积5倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯萃取物。
C．将乙酸乙酯萃取物用浓度为85%的甲醛溶解后，以1.5倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为85%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
经电喷雾电离质谱ESI-MS显示：负离子 511.20[M-H]-，即该化合物分子量为512，分子式为C30H40O7。
实施例5：
本实施例提出了一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，具体的提取步骤如下：
A．以5kg干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量8倍的浓度为95%W/W的乙醇进行加热回流提取3次，每次2小时，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液3000ml。
B．将提取浓缩液用其体积8倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，得到乙酸乙酯萃取物600g。
C．将乙酸乙酯萃取物用400ml浓度为90%的甲醛溶解后，以1.0倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为85%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物350mg。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
实施例6：
本实施例提出了一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，具体的提取步骤如下：
A．以5kg干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量10倍的浓度为95%W/W的乙醇进行加热回流提取5次，每次2小时，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液3000ml。
B．将提取浓缩液用其体积5倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，得到乙酸乙酯萃取物620g。
C．将乙酸乙酯萃取物用400ml浓度为85%的甲醛溶解后，以1.5倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为85%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物360mg。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
实施例7：
本实施例提出了一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，具体的提取步骤如下：
A．以5kg干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量8倍的浓度为95%W/W的乙醇进行加热回流提取4次，每次2小时，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液3000ml。
B．将提取浓缩液用其体积5倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，得到乙酸乙酯萃取物615g。
C．将乙酸乙酯萃取物用浓度为90%的甲醛溶解后，以1.0倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为90%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物340g。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
实施例8：
本实施例提出了一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，具体的提取步骤如下：
A．以10kg干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量10倍的浓度为80%W/W的乙醇进行加热回流提取5次，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液6000ml。
B．将提取浓缩液用其体积8倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，得到乙酸乙酯萃取物1220g。
C．将乙酸乙酯萃取物用800ml浓度为95%的甲醛溶解后，以1.5倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为85%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物790mg。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
将上述实施例5～实施例8得到的白色粉末化合物进行结构鉴定，鉴定过程如下：
该白色粉末化合物的电喷雾电离质谱ESI-MS显示：负离子 511.20[M-H]-，即该化合物分子量为512。
该白色粉末化合物13C-NMR给出了30个碳信号，结合HSQC，可以判断δ C216.1,213.1, 198.6, 178.2, 154.9, 154.6, 136.2, 83.0, 61.5, 48.6, 47.3, 46.6为12个季碳信号，δ C125.3, 67.8, 56.9, 55.3, 50.4, 35.5为6个次甲基碳信号，δ C 48.2, 37.1,36.5, 36.2, 29.6为5个亚甲基碳信号，δ C 26.9, 21.8, 20.4, 19.1, 18.6, 18.4, 17.6为7个甲基碳信号。其中δ C 216.1, 213.1, 198.6为酮羰基碳信号，δ C178.2为羧基信号，δ C154.9，154.6, 136.2, 125.3为双键碳信号。
该白色粉末化合物在1H-NMR中δ H1.03（3H，s）, δ H1.13（3H，s）, δ H1.36（9H，m）, δ H1.68（3H,s）, δ H2.28(3H,s)均为甲基氢信号，其中δ H1.36（9H，m）处的m峰，结合HSQC,可以判断此处包含两个季碳相连的单峰甲基：δ H1.34（3H,s）, δ H1.38(3H,s)；以及一个次甲基相连的双峰甲基信号：δ H 1.36（3H,d）。δ H 2.28(3H,s)信号偏向低场，说明与它相连的官能团起到了去屏蔽作用，该甲基与双键相连。
根据1H-1H COSY，结合为HSQC，δ H 6.31（δ C 125.3）与δ H 2.28(δ C 21.8)和δ H3.20(δ C48.2)处显示较弱的相关，说明该处信号为间位相连。结合HMBC中，δ H6.31与δ C198.6,154.6，50.4，21.8间有较强的相关信号，加之δ H 2.28与δ C50.4、125.3、154.6、198.6处较强的信号，以及δ H 1.36与δ C48.2，35.5，178.2的相关信号，确定该化合物的支链结构。其次，据1H-1HCOSY，结合为HSQC：δ H 5.20（δ C 125.3）与δ H 2.04(δ C 29.6)和δ H 2.37（δ C 29.6）间有较强的相关信号，δ H 2.80（δ C 56.9）与δH 3.03(δ C 36.2)和δH 2.48（δ C 36.2）相关，δH3.25（δ C50.4）与δ H2.68(δ C 37.1)处的相关信号，再根据HMBC的相关信号，确定灵芝酸的四环体系结构。δ H5.20(δ C 67.8)与δ C83.0的化学位移显示该处应该连接官能团-OH。比较特别的是，根据HMBC的相关信号，δ H2.80（δ C56.9）与δ C83.0,154.9，以及10位碳处的甲基信号δC18.4（δ H1.68）和10位碳δC48.6相关，证明1位碳（δ C56.9，δH 2.80）与11位碳（δ C 83.0）直接相连，构成五环体系的灵芝酸母核结构体系。据以上信息，我们确定了所述化合物的平面结构。
根据1H-1H ROESY,1位δ H 2.80与19位甲基δ H 1.68有较强的相关信号，说明此处化学键具有相同的超向。5位δ H 2.01与10位δ H 2.01处无相关信号，说明此处化学键具有相反的超向。30位δ H 1.38与17位δ H 3.25有相关信号，说明此处化学键具有相同的超向。30位δ H1.38与18位δ H 19.1无相关信号，说明此处化学键具有相反的朝向。据上所述，我们确定该化合物的相对构型，如式（Ⅰ）所示。同时，结合化合物质谱信息，确定化合物分子式为C30H40O7。
该白色粉末化合物的1H-NMR和13C-NMR数据见下表1。
表1 白色粉末化合物核磁数据
通过1H-NMR、13C-NMR以及和核磁二维HSQC，HMBC，1H-1HCOSY，ROESY等分析技术手段，确定了该化合物的相对构型，将其自命名为：Ganosinensic acid C，具体结构式为：
。
实施例9
本实施例提出了一种从灵芝中提取的三萜类化合物在细胞毒活性方面的用途。
本实施例中涉及的三萜类化合物是采用分离提纯的方式从灵芝子实体中得到的新的具有药理活性的化合物。具体涉及的分离提纯过程如下：
A．以8kg干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用其重量8倍的浓度为90%W/W的乙醇进行加热回流提取5次，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液4800ml。
B．将提取浓缩液用其体积6倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，得到乙酸乙酯萃取物980g。
C．将乙酸乙酯萃取物用浓度为90%的甲醛溶解后，以1.0倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B= （20：1)→(5：1) V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D．将所得固体用浓度为85%的甲醇分散后，经0.45μm的滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离（以A：乙腈、B：0.5%醋酸水，A：B=（38：62）V/V为流动相，检测波长为252nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到白色粉末化合物550mg。
经TLC鉴别，（二氯甲烷：甲醇=15：1），10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物，其结构式为：
。
经更深入的研究表明，该三萜类化合物是具有一定细胞毒活性的新的化合物，在制备抗癌药物中具有一定的开发利用前景。
本实施例对该三萜类化合物进行了如下的化合物细胞毒活性实验：
1.1实验材料
药品：上述实施例9提取分离得到的白色粉末化合物。
1.2人体癌细胞
人高转移肺癌细胞株95D（Human highly metastatic lung carcinoma 95D），人宫颈癌细胞株 Hela (Human cervical cancer cell line Hela)。该两种细胞株均购于上海细胞所。
1.3实验方法
用MTT法测定化合物对人高转移肺癌细胞株95D（Human highly metastatic lungcarcinoma 95D）、人宫颈癌细胞株 Hela (Human cervical cancer cell line Hela)的抑制效果。把培养好的两株细胞制成单细胞悬液，用细胞板计数并稀释至细胞浓度为6×104个/mL.于96孔板中接种细胞，每孔80uL。另设2孔无细胞、仅有80uL培养液[Dulbecco＇smodified Eagle＇s media (DMEM, Gibeo, USA)+10%小牛血情]的用于仪器调零的空白对照孔。置37℃，5% CO2的培养箱中培养24 h，然后加入20 uL用培养液稀释好的样品。同时，往阳性对照孔加20 uL顺铂，往阴性对照孔和空白对照孔各加入20uL培养液。继续培养72h，每孔加10uL5mg/mL MTT。37℃反应4h，每孔加100uL 10%SDS-0.01moL/L HCL溶液过夜。酶标仪比色测定（测定波长570nm，参考波长655nm）。对癌细胞的抑制率计算方法为（阴性对照组OD值-实验组OD值）/（阴性对照组OD值-空白组OD值）×100%。采用SPSS软件计算IC50值。
1.4实验结果
实验结果显示，白色粉末化合物对人高转移肺癌细胞株95D IC50值为10.5 uM，对宫颈癌细胞株Hela的IC50值为13.2 uM。以上实验数据表明白色粉末化合物对人高转移肺癌细胞株95D 与人宫颈癌细胞株Hela显示了较强的抑制活性。
由此可见，本实施例所述的三萜类化合物在对体外细胞毒活性的测试过程中，是具有较强的抑制作用的，通过后续筛查与研究，可进一步的拓展灵芝提取物用途的多样性，并为研制新型抗癌药物提供依据。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从灵芝中提取的三萜类化合物，其特征在于：所述三萜类化合物是从灵芝中分离提纯而得到，其结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种从灵芝中提取的三萜类化合物，其特征在于：所述三萜类化合物为10％硫酸乙醇显色呈紫红色。
3.根据权利要求1所述的一种从灵芝中提取的三萜类化合物，其特征在于：所述三萜类化合物的分子量为512，分子式为C30H40O7。
4.一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，其特征在于：所述提取步骤包括：
A.以干燥的灵芝子实体为原料，粉碎后用乙醇加热回流提取，再经减压浓缩后得到提取浓缩液；
B.将提取浓缩液用水分散后，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
C.将乙酸乙酯萃取物用甲醛溶解后，进行硅胶柱色谱分离纯化，收集目标化合物后，减压浓缩得到固体；
D.将所得固体用甲醇溶解后，经过滤、C18反相色谱填料高压制备分离后，收集相对应的色谱峰,再经浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到三萜类化合物，其结构式为：
5.根据权利要求4所述的一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，其特征在于：所述步骤A中，粉碎后的灵芝子实体用其重量8～10倍的浓度为75～95％W/W的乙醇进行加热回流提取3～5次，再经减压浓缩至无醇后，得到提取浓缩液。
6.根据权利要求4所述的一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，其特征在于：所述步骤B中，将提取浓缩液用其体积5～8倍的水分散后，用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，得到乙酸乙酯萃取物。
7.根据权利要求4所述的一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，其特征在于：所述步骤C中，将乙酸乙酯萃取物用浓度为80～95％的甲醛进行溶解。
8.根据权利要求4所述的一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，其特征在于：所述步骤C中，以1.0～1.5倍硅胶为载体，干燥后，湿法上样，以A：二氯甲烷、B：甲醇，A：B＝(20：1)→(5：1)V/V为流动相进行硅胶柱色谱分离纯化。
9.根据权利要求4所述的一种从灵芝中提取三萜类化合物的方法，其特征在于：所述步骤D中，所得固体用浓度为80～90％的甲醇分散后，再用0.45μm的滤膜过滤；所述C18反相色谱填料高压制备分离过程中：A：乙腈、B：0.5％醋酸水，A：B＝(38：62)V/V为流动相，检测波长为252nm。
10.一种从灵芝中提取的三萜类化合物的应用，其特征在于：包括结构式为：
的三萜类化合物在细胞毒活性方面的用途。
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