JP2005501079A - 気管支呼吸困難の治療及び療法のための草本組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】
【解決手段】ロイコトリエン阻害剤、ＩＬ４合成阻害剤及びＴｈ１型免疫調節剤として有用な医薬組成物であって、前記組成物は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．ｋ）の葉若しくは植物の他の部分のいずれかから得られた凍結乾燥された水性又はアルコール性抽出物か、又はこれらの抽出物由来の生理活性画分の効果的な量と、任意に１以上の医薬的に許容される成分とを含む。
【解決手段】ロイコトリエン阻害剤、ＩＬ４合成阻害剤及びＴｈ１型免疫調節剤として有用な医薬組成物であって、前記組成物は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．ｋ）の葉若しくは植物の他の部分のいずれかから得られた凍結乾燥された水性又はアルコール性抽出物か、又はこれらの抽出物由来の生理活性画分の効果的な量と、任意に１以上の医薬的に許容される成分とを含む。
Description
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
この発明は、気管支呼吸困難の治療及び療法のための草本組成物に関する。この発明は、５−リポキシゲナーゼ活性を遮断し、ロイコトリエン（leukotrine）合成の阻害、ＩＬ４産生の抑制及びＩＦＮ ガンマ放出の増強を引き起こすのに有用な草本製剤に関する。より詳細には、この発明は、分離方法と、物理化学的特性付け方法と、気管支呼吸障害の治療及び療法に対するそれらの役割を明らかにするための、植物オオバゲッキツ（M.koenigii）（ナンヨウザンショウ、カレー・リーフ）及びキンマ（P. betle）の葉、樹皮、根及び種子を含むいずれかの植物部分の抽出物から得られた抽出物又は生理活性画分の生体応答評価の方法とを説明している。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
呼吸問題は、喘鳴、咳、胸部緊張等のような他の不快感を伴う呼吸の著しく重篤な障害に対するマイルド（mild）を含む。予防の処置、一般の認識キャンペーン及びモニタリング・システムにもかかわらず、呼吸障害にあっている人口は、世界中で、上昇している。これは西先進国、特に子供たちの間で真実である。オオバゲッキツ葉調製品を用いて、喘息の軽減及び治癒可能性が、既に本発明者らによる２０００年１０月１６日出願のＰＣＴ特許出願Ｎｏ：ＰＣＴ／ＩＮ／００１０２の出願（特許文献１参照）に示されている。２つの枝分かれした方策が、本発明で適応されている。
【０００３】
呼吸器疾患は、免疫系の異常に起因している病態生理学的徴候の結果である。即時徴候には、気管支の締めつけ、呼吸路の炎症及び粘液分泌による気道閉鎖を含む。対症薬物は、苦痛徴候の一時的な緩和により、軽減することができる。
【０００４】
このことは、オオバゲッキツ抽出物が、キンマから得られた抽出物と組み合わされると、驚くべき結果を示すことを明言している。より早く出願された未公開ＰＣＴ特許出願によれば、キンマ葉抽出物は、Ｔｈ１型細胞からＩＦＮ−γにおいて増加を、Ｔｈ２型細胞からＩＬ−４の減少を示していた。これは、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型へのシフトが、明らかに肥満細胞からＩｇＥ（喘息性容態を主に操縦する）の放出を減少させるので、喘息治療において明らかに効果的な処置である。従って、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＮ００／００１２７（特許文献２参照）の前の、出願人の初期所見は、アトピー型喘息治療のための新規薬剤として、オオバゲッキツ及びキンマのいずれかの植物部分からの合わせた抽出物に関する本出願と直接的に調和している。
【０００５】
呼吸問題の根本的問題は、対症薬物の開発者によっては、あまり取り上げられない。現在の知識の出現で、ロイコトリエンが呼吸問題の徴候を現すことにおいて、主なプレーヤーであることが見出されていることは、現在よく受け入れられている。
【０００６】
呼吸問題の主要な徴候は、初期応答および後期応答に分けることができる。初期応答は、アレルゲン暴露の数分以内に起こり、ヒスタミン、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンＤ２のようなメディエイタが主に関係する。これらメディエイタの効果は、気管支収縮及び粘液の蓄積を生じる。後期応答は、数時間後に起こり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＴＮＦ−アルファ、好酸球白血球遊走因子（ＥＣＦ）並びに血小板凝集因子（ＰＡＦ）を含む、更なるメディエイタが関係する。これらメディエイタの全体的な効果は、好酸球及び好中球を含む炎症細胞を補充することである。これらの細胞は、有毒な酵素を放出することによって、重要な組織損傷を引き起こすことができる。これらの発生は、粘液タンパク質および細胞破片を伴う気管支腔の閉塞、従って基底膜の肥厚、流体増強及び気管支平滑筋肥大につながる。粘液プラグがしばしば形成し、気管支壁に付着する。その粘液プラグは、分離した上皮細胞断片、好酸球、ある好中球及びクルシュマンらせん体として知られている気管支組織のらせん体の集団を含む（Immunology, J. Kuby; W.H. Freeman & Co., ニューヨーク; 3版1997（非特許文献１参照））。気管支喘息／気管支呼吸問題の発現に関する現在のメカニズムから見れば、薬物開発に対する最新の方策は、以下のアプローチを強調している。
【０００７】
これらには、ｉ）5-リポキシゲナーゼ-酵素を遮断することによるロイコトリエン合成の阻害（Legqis RAら、 New England J. Med. 323: 645,1990（非特許文献２参照））を含む。ロイコトリエンの形成は、アラキドン酸の酸化から始まるので、この反応の阻害により、ロイコトリエン合成の阻害に到る。さらに、ロイコトリエン受容体拮抗体はまた、喘息／呼吸問題に対する抗ロイコトリエン治療として導入される（Tien F.C., Medical J. Aust. 171: 378, 1999（非特許文献３参照））。現在承認されている薬物ゼルチン（zelutin）（アラキドン酸酸化の阻害を基にする）は、既に米国市場において独占的に導入されている。しかし、その使用は、肝毒性により制限される。１４歳以下の子供には、この薬は推薦されない。さらに、他の薬物を摂取している患者は、抗喘息薬としてゼルチンを摂取しているときには、検査される必要がある。さらに、他の薬物を摂取している患者は、抗喘息薬としてゼルチンを摂取しているときには、検査される必要がある。ｉｉ）抗ＩｇＥ抗体（人間化）によるか、又は高親和性ＩｇＥ受容体、ＦｃεＲ−Ｉを遮断することによるＩｇＥの中和（Heusser C, Jardiu P. Current Oppinio Immunol., 9: 805, 1999（非特許文献４参照））。Ｔｈ２サイトカインの抑制により、ＩｇＥ産生が減少するので、更なるアプローチは、これらのＴｈ２サイトカイン合成およびＴｈ１サイトカイン形成の増強の阻害を基にしている（Chung K.F.; Barens P.J. Thorax 54: 825, 1999（非特許文献５参照））。
【０００８】
対照的に、オオバゲッキツを基にした抗喘息用調製品は、7歳の若い子供と、80歳の老いたオクタゲナリアン（octagenarian）に試用され、なんの有害作用もなかった。
【０００９】
葉、樹皮、根及び種子を含む全ての植物部分から得られたオオバゲッキツ抽出物と同様、抽出物は、従って検査され、生理活性画分を同定した。これらは、ロイコトリエンの産生を阻害する能力に基づく。さらに、その画分は、Ｔｈ２応答のＴｈ１型へのシフトについても検査される。Ｔｈ１応答及びＴｈ２応答は、γ−インターフェロン（Ｔｈ１）及びＩＬ−４（Ｔｈ２）産生により、それぞれ測定される。あるオオバゲッキツ画分は、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害を示し、それはロイコトリエン合成の妨害とγ−インターフェロン産生における著しい増加（代わりにＩＬ−４産生を抑制する）とを意味する。一方、キンマ葉抽出物−画分の大部分は、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型へシフトするのを促進する結果となった。従って、これら２つの植物オオバゲッキツとキンマとからの特定の抽出物画分の混合物は、ロイコトリエン合成と、Ｔｈ１型へのＴｈ２応答のシフトとを主に阻害し、従って、気管支呼吸問題の治療、軽減及び療法のための独特な相乗作用的組成物として提案されている。従って、２つの方向の方策は、この新しい組成物の主要な目的であり、気管支呼吸問題の患者にとって治療の最も良い理学療法として考えられる。
【特許文献１】
国際公開第ＷＯ０２／３２４４０号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第ＷＯ０２／４９６５５号パンフレット
【非特許文献１】
J. Kuby 、「Immunology」、第3版、米国ニューヨーク、W.H. Freeman & Co., 1997年
【非特許文献２】
Legqis RAら、"New England J. Med."、1990年、第645巻、p.323頁
【非特許文献３】
Tien F.C.、"Medical J. Aust."、1999年、第378巻、p.171
【非特許文献４】
Heusser C, Jardiu P. 、"Current Oppinio Immunol."、1999年、第805巻、p.9
【非特許文献５】
Chung K.F.; Barens P.J.、"Thorax"、1999年、第825巻、p.54
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の目的）
本発明の主な目的は、生理活性画分を提供することであり、その生理活性画分は、オオバゲッキツ及びキンマの異なる植物部分の抽出物から得られる。
【００１１】
本発明の別な目的は、新規な医薬組成物を提供することであり、その医薬組成物は、オオバゲッキツ及びキンマの葉又は他のいずれかの植物部分由来の抽出物の組み合わせを含む。
【００１２】
本発明の別な目的は、新規な組成物を提供することであり、その組成物は、呼吸問題を治療するための、オオバゲッキツ及びキンマ植物部分から由来の生理活性画分の組み合わせを含む。
【００１３】
さらに本発明の別な目的は、呼吸問題の軽減、治療及び療法に有用な、オオバゲッキツ及びキンマの葉又は他のいずれかの植物部分からの抽出物を調製する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、呼吸問題の軽減、治療及び療法に有用な、オオバゲッキツ及びキンマの植物部分からの生理活性画分の単離方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、呼吸問題の治療、軽減及び療法に関連する生物的活性を有する、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分からの生理活性画分を単離する簡略化された方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、草本調製品を提供することであり、その草本調製品は、オオバゲッキツ及びキンマ葉から由来の抽出物か、又はオオバゲッキツ及びキンマの他の植物部分から得られた抽出物を含む。前記抽出物は、ヒト摂取に非常に適合性であり、呼吸問題の治療、軽減及び療法に用いることができる。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、呼吸問題の治療、軽減及び療法に関連する生物的活性を有する組成物の、簡略化された速くて安価な製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、草本組成物調製品を提供することであり、その草本組成物調製品は、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分から由来する生理活性画分と、活性因子とを含む。前記因子及び生理活性画分は、ヒト摂取並びに呼吸問題の治療、軽減及び療法に非常に適合性である。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、全ての植物部分オオバゲッキツと、キンマ葉の生理活性画分の各々を個々に又は組み合わせて検査することである。前記生理活性画分は、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害活性を有し、かつＴｈ２型応答のＴｈ１型へのシフトを促進する。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、オオバゲッキツ及びキンマ葉又は他の植物部分から得られた抽出物の各々を、個々におよび組み合わせて、５−リポキシゲナーゼ−媒介アラキドン酸酸化の阻害活性と、Ｔｈ２型応答のＴｈ１型へのシフトの誘導とについて、検査することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、個々に及び組み合わせて、オオバゲッキツ及びキンマ画分の存在下に、生体外（ex-vivo）全ヒト血液系における５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化をアッセイすることである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、ヒト多形核好中球（ＰＭＮ）で強化された生体外系において、オオバゲッキツ及びキンマ画分の存在下、個々に及び組み合わせて、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化をアッセイすることである。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、生体外ヒト全血液系において、オオバゲッキツ及びキンマ葉抽出物又はそれらの他の植物部分抽出物の存在下、個々に及び組み合わせて、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化をアッセイすることである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、フローサイトメトリーにより細胞内サイトカインの産生を検出することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分からの画分を有する生体外ヒト全血液において、個々に及び組み合わせて、Ｔｈ１及びＴｈ２型応答についてのそれぞれの公知の標識として知られる細胞内ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−４のプロファイルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
（本発明の要旨）
従って、本発明は、５リポオキシゲナーゼ活性を遮断し、ロイコトリエン合成の阻害、ＩＬ４産生の抑制及びＩＦＮガンマ放出の増強をもたらすのに有用な、草本製剤を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は気管支呼吸困難の治療及び療法のための草本製剤を提供する。本発明はまた、気管支呼吸困難の治療及び療法に対するそれらの役割を確立する目的で、生体応答を測定するために、植物オオバゲッキツ及びキンマの葉若しくは他の植物部分のいずれか又は種子からの抽出物の調製方法と、それらの選択的混合物の調製方法とを提供する。
【００２８】
さらに、本発明は、植物オオバゲッキツ及びキンマの葉又は他の植物部分のいずれかまたは種子から得られた生理活性画分を含む草本組成物と、気管支呼吸困難の治療及び療法のためのそれらの選択的な混合物とを提供する。本発明の別の観点は、気管支呼吸困難の治療及び療法に対するそれらの役割を確立するために、植物オオバゲッキツ及びキンマの葉、樹皮、根及び種子を含む植物のいずれかの部分の抽出物から得られた生理活性画分の分離、物理化学的特性付け及び生体応答評価の方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（本発明の詳細な記載）
従って、本発明は、ロイコトリエン阻害剤、ＩＬ４合成阻害剤及びＴｈ１型免疫調節剤（immunomudulator）として有用な医薬組成物を提供する。前記組成物は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉若しくはいずれかの他の植物部分から得られた凍結乾燥された水性若しくはアルコール性の抽出物か、又はこれら抽出物由来の生理活性画分の効果的な量と、任意に１以上の医薬的に許容される成分とを含む。
【００３０】
実施態様において、植物オオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）から得られた生理活性画分は、ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と名づけられる。
本発明の別の実施態様において、植物キンマ（ＰＢ）から得られた生理活性画分は、ＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃと名づけられる。
さらに別の実施態様において、用いられる植物の部分は、葉、茎、樹皮、果実、種子又は他のいずれかの植物部分から選択される。
【００３１】
さらに別の実施態様は、用いられる医薬的に許容される成分に関する。前記成分は、たんぱく質、炭水化物、ショ糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン−ゼラチンペーストのような栄養素及び／又は担体、賦形剤、希釈剤若しくは溶剤から選ばれる。
【００３２】
さらに別の実施態様は、前記組成物を吸入、経口、静脈内、筋肉内、皮下経路又は他の適当ないずれかの経路による投与することに関する。
【００３３】
さらに別の実施態様では、経口経路はカプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤又は顆粒剤の形態であり、経口経路により投与される量は、静脈内経路より多い。
【００３４】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋ抽出物の割合は、キンマ抽出物の量と同じまたはそれ以上である。
【００３５】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋ抽出物に対するキンマ（ＰＢ）抽出物の割合は、１：１〜１：５の範囲である。
【００３６】
さらに別の実施態様では、組成物は、１〜２０ｍｇ／体重のｋｇの投与量レベルで、少なくとも１日１回、少なくとも４週の間、投与される。
【００３７】
さらに別の実施態様では、組成物は、生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及び／又はＭＫ０５を含む。
【００３８】
さらに別の実施態様では、前記組成物は、生理活性画分ＪＢ０１Ｃ、ＭＫ０３、ＭＫ０４及び／又はＭＫ０５を含む。
【００３９】
さらに別の実施態様では、静脈内経路により投与される生理活性画分の量は、経口経路より少ない。
【００４０】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋからの生理活性画分の割合は、キンマの生理活性画分と同じ又はそれ以上である。
【００４１】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋ抽出物から得られた生理活性画分に対するキンマ抽出物から得られた生理活性画分の割合は、１：１〜１：５の範囲である。
【００４２】
別の実施態様では、組成物は、０．５〜１０．０ｍｇ／体重のｋｇの投与量レベルで、少なくとも１日１回、少なくとも４週間の間、呼吸状態に応じて投与される。
【００４３】
本発明の別の実施形態において、少なくとも４週から３ヶ月までの間、投与される組成物が提供される。
【００４４】
さらに別の実施態様は、組成物に関する。その組成物は、オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られた生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５の組み合わせであり、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性を遮断するための組成物であり、Ｔｈ１型免疫調節剤としての組成物である。
【００４５】
さらに別の実施態様において、組成物を提供する。その組成物は、オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られた生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と、キンマの葉及び他の植物部分から得られたＪＢ０１Ｃとの組み合わせであり、ロイコトリエン合成阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５−リポキシゲナーゼ活性を遮断し、かつ、ガンマインターフェロン放出を増強するための組成物である。
【００４６】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、気管支呼吸容態の治療に用いられる。
【００４７】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、哺乳類及び動物を治療するために用いられる。
【００４８】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、Ｔｈ２応答をＴｈ１応答にシフトするのに用いられる。
【００４９】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、全血液の好中球強化構成要素において、５−リポオキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化を阻害するのに用いられる。
【００５０】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、生体外ヒト全血液において、ＩＦＮ−ガンマを増強すること、及びＩＬ−４応答を軽減させることに用いられる。
【００５１】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、生体外ヒト全血液単核細胞（ＰＭＮ）において、ＩＦＮ−ガンマ応答を増強するのに用いられる。
【００５２】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、ヒト末梢全血液単核細胞において、ＩＬ−４応答を軽減させるのに用いられる。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様によれば、草本組成物が提供される。前記草本組成物は、ロイコトリエン合成の阻害、ＩＬ４産生の抑制を引き起こす５−リポキシゲナーゼ活性の遮断、及びＩＦＮガンマ放出の増強に有用である。前記組成物は、キンマ及びオオバゲッキツの葉又は他の植物部分のいずれかから得られた抽出物又は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の凍結乾燥抽出物の効果的な量を含む。
【００５４】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＭＫ０３と名づけられた生理活性画分が、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５ リポオキシゲナーゼ活性を遮断のためであり、前記生理活性画分がオオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 乾燥固体、融点９８〜１００℃、ＤＭＳＯに可溶性；
ｂ． 薄層クロマトグラフィーによれば、溶媒系の一つ−クロロホルム及びメタノール（１９：１）において、Ｒｆ０．４８を有する単一スポットを示し；
ｃ． ＨＰＬＣ分析によれば、インターセル（intersel）ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）分析カラムおよび溶媒系メタノールを用いて、０．５ｍｌ／分の流速で、検出を２１０ｎｍで行って、保持時間８．５分の単一ピークを示し、
ＨＰＬＣ：カラムＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）流速−０．５ｍｌ／分；
２１０ｎｍでのピーク；保持時間−３．５分；溶媒系−メタノール、
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, CDCl3):153.34, 153.29, 148.94, 140.73, 134.78, 131.58, 128.61, 124.22, 120.36, 119.97, 118.23, 118.02, 117.39, 116.63, 108.36, 104,39, 97.16, 78.03, 40.68, 25.67, 25.60, 22.70, 17.53 及び 15.97 ; 並びに
ｅ． 画分「ＭＫ０３」は、純粋な含窒化合物のようであった。
【００５５】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＭＫ０４と名づけられた生理活性画分が、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性の遮断のためであり、前記生理活性画分が、オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． ジメチルスルホキシドに可溶性な暗色粘着性物質；
ｂ． 生理活性物質のＴＬＣによれば、クロロホルム及びメタノール（１９：１）の溶媒系においてＲｆ０．３８の単一スポットを示し；
ｃ． インターシル（intersil）ＯＤＳ−３分析カラム、溶媒系メタノール及び流速１．０ｍｌ／分、２５４ｎｍでの検出を用いる生理活性物質のＨＰＬＣ分析によれば、保持時間５：６９分の１つのピークが示され；
ｄ． NMR (300MH2, CDCl3) δ 0.94, 1.30, 1.60, 2.04-2.10, 2.27-2.34, 2.78-2.82, 3.53-3.81, 3.85-3.92, 4.00, 4.24-4.26, 及び 5.26-5.41; 並びに
ｅ． 画分ＭＫ０４は、糖脂質である。
【００５６】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＭＫ０５と名づけられた生理活性画分が、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性の遮断するためであり、前記生理活性画分がオオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 暗色固体、ＤＭＳＯおよび水に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．６６の単一スポットが示され；
ｃ． この画分の溶媒系メタノール−水（１：９）、流速０．５ｍｌ／分および２１７ｎｍで検出するＨＰＬＣ分析によれば、保持時間２１分のピークが示され；
ｄ．13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 175.82, 169.22, 159.00, 147.63, 147.02, 144.76, 135.72, 131.28, 131.10, 129.90, 129.63, 129.20, 128.20, 127.59, 123.30, 116.81, 116.39, 115.80, 114.79, 81.77, 76.26, 76.15, 74.20, 73.79, 73.64, 73.49, 72.84, 72.16, 71.34, 70.29, 69.89, 68.83, 67.96, 63.71, 63.14, 58.22, 56.62, 56.19, 54.47, 54.42, 54.37, 41.90, 36.87 及び 20.93 ; 並びに
ｅ． 画分ＭＫ０５は、糖が結合した芳香族化合物のようである。
【００５７】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＪＢ０１Ａと名づけられた生理活性画分が、キンマの葉及び他の植物部分から得られ、前記生理活性画分がガンマ インターフェロン放出の増強のためであり、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 白色固形物質及びＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．０７の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、溶媒系 水−メタノール（１：９）、流速０．５ｍｌ／分、２１７ｎｍでの検出およびインターシルＯＤＳ−３分析カラムで、保持時間８．４分（ＪＢ０１Ａ，ピーク−１）のピークを示し；
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 109.71, 108.417, 107.94, 104.17, 100.27, 84.38, 81.79, 81.53, 80.74, 77.03, 75.58, 73.85, 73.42, 71.71, 71.27, 70.74, 70.38, 69.12, 61.71, 61.00 及び 60.54 ; 並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ａは、オリゴ糖である。
【００５８】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＪＢ０１Ｂと名づけられた生理活性画分が、キンマの葉及び他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、ガンマ インターフェロン放出の増強のためであり、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 白色固体ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．２７の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、前記と同じカラム条件下で、保持時間８．８分（ＪＢ０１Ｂ，ピーク−２）のピークを示し；
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 169.48, 104.30, 98.86, 98.55, 92.60, 81.82, 76.98, 76.07, 74.57, 73.52, 73.23, 71.78, 71.46, 70.02, 69.84, 69.74, 69.30, 68.92, 68.77, 67.01, 66.43, 62.95, 62.02, 61.61, 48.67, 44.62, 38.88 ; 並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ｂは、オリゴ糖誘導体。
【００５９】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＪＢ０１Ｃと名づけられた生理活性画分が、キンマの葉及び他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、ガンマ インターフェロン放出の増強のためであり、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．３４の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、前記と同じ条件下で、保持時間９．８分（ＪＢ０１Ｃ，ピーク−３）の単一ピークが示され；
ｄ． NMR (300 MH2, D2O). 2.34. 3.27, 3.28, 3.44-3.47, 3.51, 3.60-3.63, 3.68, 3.92-3.99, 4.08, 4.92 及び 5.36 ; 並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ｃは、オリゴ糖である。
【００６０】
本発明のさらなる実施態様は、気管支呼吸容態の患者を治療する方法に関し、前記方法は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉又は他の植物部分のいずれかから得られた凍結乾燥された水性又はアルコール性抽出物、又はこれらの抽出物由来の生理活性画分と、任意に１以上の医薬的に許容される成分とを組み合わせて含む医薬組成物の効果的な量を前記患者に投与することを含む。
【００６１】
別の実施態様において、前記組成物は、経口、静脈内、筋肉内、吸入又は皮下経路により投与される。
【００６２】
さらに別の実施態様において、前記経口経路は、カプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤又は顆粒剤の形態である。
【００６３】
本発明の別の実施態様において、ロイコトリエン及びＩＬ４合成阻害剤として、並びにＴｈ１型免疫調節剤として有用な医薬組成物が提供される。前記組成物は、医薬的に許容される添加剤と任意に関連づけるか、または組み合わせて、キンマ（ＰＢ）の植物部分の抽出物から得られたＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃと名づけられた生理活性画分の１以上と、オオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉抽出物から得られたＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と名づけられた生理活性画分の１以上の効果的な量を含む。
【００６４】
本発明のさらなる実施態様は、気管支呼吸容態の患者を治療する方法に関する。前記方法は、医薬的に許容される添加剤と任意に関連づけるか、または組み合わせて、キンマ（ＰＢ）の植物部分の抽出物から得られたＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃと名づけられた生理活性画分の１以上と、オオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉抽出物から得られたＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と名づけられた生理活性画分の１以上の効果的な量を、前記患者に投与することを含む。
【００６５】
本発明の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分からの生理活性画分は、新鮮に抜き取られたヒト血と混合される。
【００６６】
本発明の別の実施態様において、生体外ヒト血系における細胞は、カルシウムイオノフォア（inophor）等で活性化される。
【００６７】
本発明の別の実施態様において、生理活性画分は、溶媒分留、ＴＬＣ、ＨＰＴＬＣ、ＨＰＬＣ等のような技術により、オオバゲッキツ及びキンマの樹皮、根、葉及び種子を含む植物の部分全てから分離される。
【００６８】
本発明の別の実施態様において、全ての植物部分からの抽出物は、新鮮な、又は日陰乾燥されたオオバゲッキツ及びキンマから製造される。
【００６９】
本発明の別の実施態様において、植物材料は、抽出器又は当該分野で知られた装置において、メタノール、水又は緩衝液のような適当な溶媒での抽出に用いられる。
【００７０】
本発明の別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマ植物部分の抽出物は、減圧下に濃縮されて、有効成分を取り出す。
【００７１】
本発明のさらに別の実施態様において、濃縮物は、凍結乾燥されて、減らされた水及び他の残存溶媒が除去される。
【００７２】
本発明のさらに別の実施態様において、凍結乾燥された固体は、シリカゲル又はセファデックスＬＨ−２０を用いてクロマトグラフィーで精製され、純粋な画分を単離する。
【００７３】
本発明のさらに別の実施態様において、Ｍ．Ｋ及びＰ．Ｂの単離された画分は、生体外全ヒト血において、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害剤として活性であることが見出された。
【００７４】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分の抽出物から得られた画分は、Ｔｈ２型応答からＴｈ１応答へシフトするのに活性であることが見出された。
【００７５】
本発明のさらに別の実施態様において、生理活性画分は、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から選択され、全血液から好中球強化画分において、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化を阻害する。
【００７６】
本発明のさらに別の実施態様において、生理活性画分は、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から選択され、生体外全ヒト血において、ＩＦＮ−ガンマ応答を増強することが見出された。
【００７７】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマ抽出物から選択される生理活性画分は、生体外ヒト全好中球（ＰＭＮ）において、ＩＮＦ−ガンマ応答を増強することが見出された。
【００７８】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から選択される生理活性画分は、ヒト末梢血単核細胞において、ＩＬ−４応答を減少させることが見出された。
【００７９】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から得られた画分は、全血液の保温後、アセッセイされて５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害剤であることが見出され、アッセイのときに細胞を溶解させることが、組成物調製のために選択される。
【００８０】
本発明のさらに別の実施態様において、凍結乾燥された固体は、シリカゲル又はセファデックスＬＨ−２０でクトマトグラフィーで精製され、オオバゲッキツ及びキンマの葉及び全ての他の植物部分に存在する、呼吸問題の治療及び治癒のための純粋な生理活性画分を単離する。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、従って、本発明の範囲を限定するために解釈されるものではない。
【実施例１】
【００８２】
植物材料の収集
オオバゲッキツ及びキンマの植物の葉及び他の植物部分全てを、インドの西ベンガルの異なる領域から、低木及び這い登る植物からそれぞれ収集した。証明試料は、インド化学生物研究所（Indian Institute of Chemical Biology, 4 Raja S.C. Mullick Road, Calcutta-700032）の医薬品化学部（the department of Medicinal Chemistry）に寄託した。
【実施例２】
【００８３】
生理活性物質の調製品
パートＩ（オオバゲッキツ）
オオバゲッキツの新鮮な葉及び樹皮、根及び種子を含む他の植物部分全てを、地方の供給者から入手した後、収集し、きれいにし、水で洗浄し、原料として用いた。
【００８４】
オオバゲッキツの新鮮な葉及び他の植物部分４１０ｇｍを、混合物ブレンダー中、メタノール（１０００ｍｌ）中でペーストにし、ガラス抽出器（５リットル容量）中に入れ、１０００ｍｌのメタノールを添加した。これを室温で１６時間（終夜）保持した。抽出物をワットマンＮｏ．１濾紙でろ過し、ろ液を集めた。抽出のプロセスを４回繰り返し、合わせた抽出物を、温度を４０℃（浴）に保ちながら、ロータリーエバポレーターで減圧下に蒸発乾固させた。固形状残存物は、外見は粘着性であり、さらに凍結乾燥により乾燥させた。収量は２５．６３ｇｍ（ＭＫＯＣ）である。画分方法の概略図は、工程図Ｉに示す。
【００８５】
【化１】
【実施例３】
【００８６】
滅菌水中でよく洗浄したオオバゲッキツの新鮮な葉１５０ｇｍを、７５０ｍｌのガラス蒸留水で、混合物ブレンダー中、均質化し、その後５回連続で各回５分間、超音波浴中で超音波処理した。ワットマンＮｏ．１濾紙でろ過して分離した材料を水で抽出した。このタイプの処理を３回繰り返した。合わせた抽出物を凍結乾燥して、粉末状材料（ＭＫＯＣ）重量１１ｇｍを得た。
【実施例４】
【００８７】
パートＩＩ（キンマ）抽出物
キンマの新鮮な葉又は植物部分の全てを、地方の供給者から収集し、原料として用いた。
【００８８】
キンマの新鮮な葉（１．５ｋｇ）を蒸留水（５００ｍｌ）で混合物ブレンダー中、均質化し、その後、３回連続で各回１５分間、超音波浴中で超音波処理した。それを、終夜又は１６時間の間、抽出させた。ワットマンＮｏ．１濾紙でろ過して分離した材料を水で抽出した。このタイプの処理を３回繰り返した。合わせた抽出物を４０℃でフラッシュエバポレーターで減圧下に蒸発乾固させた。残存する物質をその後高真空下にデシケーター中で乾燥させ、半固体（１４．９２ｇｍ）（ＪＢ０１）が残った。画分方法の概略図は、工程図ＩＩに示す。
【実施例５】
【００８９】
（オオバゲッキツの抽出物及びキンマの抽出物）
オオバゲッキツの抽出物３ｇｍと、キンマの抽出物３ｇｍとを、２、３滴の水を加えて、均質に混合した。抽出物全体を凍結乾燥機で蒸発乾固させた。この抽出物で生物活性の試験をした（ＭＫＯＣ＋ＪＢ０１）。
【実施例６】
【００９０】
（ＭＫ＋ＰＢ）
各植物部分２００ｇを、３００ｍｌのメタノールで混合物ブレンダー中で個々に均質化した。それをその後、３回連続で各回１５分間、超音波浴中で超音波処理した。その抽出物をワットマンＮｏ．１濾紙でろ過してろ液を集めた。この抽出プロセスを３回繰り返した。合わせた抽出物を凍結乾燥して、半固体塊重量６．３２ｇを得た。
【実施例７】
【００９１】
オオバゲッキツ（７０ｇｍ）とキンマ（５００ｇｍ）の新鮮な葉を混合し、蒸留水でよく洗浄した。それを蒸留水（３００ｍｌ）で混合物ブレンダー中均質化した。その後、それを３回連続で各回１５分間、超音波浴中で超音波処理した。その抽出物をワットマンＮｏ．１濾紙でろ過してろ液を集めた。この抽出プロセスを３回繰り返した。合わせた抽出物を凍結乾燥して、半固体塊（１０ｇｍ）を得た。その後、これで生物活性の試験をした（ＭＫＯｃ＋ＪＢ０１）。
【００９２】
両方の植物の葉が、インドにおいて様々な植物調製品を製造するのに広く用いられているので、その生体適合性や毒性は誰も心配する必要がない。さらに、両方の植物は広く普及している。呼吸問題の軽減、治療及び治癒に有用なオオバゲッキツ及びキンマの葉における生理活性因子の存在は、ここで示され、その調製品は、素早く、便利がよく、安価である。動物に葉抽出物を与えても、有害効果を全く生じなかった。
【００９３】
この抽出物の一部（４．００ｇｍ）をセファデックスＬＨ−２０カラムでクロマトグラフィー精製した。単離された画分の中で、ＪＢ０１Ａ（０．１７ｇ又は７０ｍｇ）、ＪＢ０１Ｂ（０．３３ｇ又は３３０ｍｇ）及びＪＢ０１Ｃ（０．９４ｇ又は９４０ｍｇ）と呼ばれる３つが、活性であると認められた。
【００９４】
【化２】
【実施例８】
【００９５】
生理活性因子の調製方法は、以下を含む：
１． 新鮮な葉及び他の植物部分全てを地方の供給者から集め、
２． その植物部分を日陰で適度な度合いまで乾燥させるか、又は原料として新鮮な植物部分を取り、
３． 当該分野で公知の装置で、乾燥した各植物部分を別々に粉末化するか、または均質化し、
４． 石油エーテル（Ｂ．Ｐ．４０−６０℃）、石油エーテル（Ｂ．Ｐ．−６０℃−８０℃）、ペンタン、ヘキサン、ベンゼン等のような炭化水素溶媒、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素等のような塩素化溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のようなエーテル溶媒、アセトン、シクロペンタノン等のようなケトン溶媒；酢酸エチル、ギ酸エチル等のようなエステル溶媒；メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール等のような全てのアルコール類、水及び緩衝液を選択し、大量の適当な溶媒のもと、抽出器に粉末化又は均質化したものを入れ、
５． 浸出された植物材料を、１〜１２０時間の範囲の時間の間、抽出器又は当該分野で現在公知の器具若しくは装置を用いて抽出し、
６． 当該分野で現在公知の器具又は装置を用いて、減圧下に溶媒を蒸発させ、
７．当該分野で現在公知の器具又は装置でその材料を凍結乾燥又は乾燥させ、涼しく乾燥した場所において、気密容器中で、加工した材料を保管し、
８． シリカゲル及びセファデックスＬＨ−２０のクロマトグラフィーで個々の生理活性化区分を単離し、
９． 対生物活性を測定するためのマーカーとして用いるため、抽出物中に存在する純粋な化合物の特徴づけをし、
１０． 涼しく乾燥した場所において、気密容器中で、加工した材料を保管し、
１１． その物質の対生物活性を測定する。
【実施例９】
【００９６】
アラキドン酸酸化の阻害を測定する方法の説明
ＰＢＳで半分希釈された５００μｌのヘパリン化ヒト末梢血液を、２４−ウエル組織培養皿の各ウエルに入れた。１０μｇ／ｍｌ濃度の各抽出物サンプルを各ウエルに添加した。細胞をその後３７℃で時々振りながら３時間培養した。１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を、各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、その酸素含有量を高感度オキシグラフ（Oxygraph）計器の助力でモニターした。
【実施例１０】
【００９７】
方法：ＰＢＳで半分希釈された５００μｌのヘパリン化ヒト末梢血液を、２４−ウエル組織培養皿の各ウエルに入れた。１μｇ／ｍｌの濃度の各サンプルを各ウエルに添加した。混合物の場合、その画分を１：１の比で混合し、最終調製品を作り、それを１．０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。その細胞をその後３７℃で時々振りながら３時間培養した。１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を、各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、その酸素含有量を高感度オキシグラフ計器の助力でモニターした。
【実施例１１】
【００９８】
５００μｌの半分希釈されたヒト末梢血液を、１０μｇ／ｍｌの各抽出物と共に３７℃で時々振りながら３時間培養した。その後、１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を、各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量を１ｍｌのＰＢＳ＋５００μｌの水を添加して２ｍｌまでにし、細胞を溶解させた。細胞溶解物の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【実施例１２】
【００９９】
方法：５００μｌの半分希釈されたヒト末梢血液を、１μｇ／ｍｌの各画分と共に３７℃で時々振りながら３時間培養した。混合物の場合、その画分は１：１比で混合して、最終調製品を作り、それを１．０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。その後１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量を１ｍｌのＰＢＳ＋５００μｌの水を添加して２ｍｌまでにし、細胞を溶解させた。細胞溶解物の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【実施例１３】
【０１００】
ヘパリン化ヒト末梢血を２％ゼラチンのＰＢＳ溶液の等容量と混合し、３０分間の間放置すると、ＲＢＣが底に沈殿した。好中球強化単核細胞を含む上層を遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳ中に懸濁させた。５００μｌのこの細胞懸濁液（３×１０6細胞／ウエル）を１０μｇ／ｍｌの各サンプルと共に３７℃で３時間の間、培養した。その後、アラキドン酸溶液１０μｌ／ｍｌ（１２．２ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、細胞懸濁液の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【０１０１】
従って、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物を、呼吸問題の軽減、治療及び治癒に関連して、生物活性についてスクリーニングし、処理した抽出物を、薄層クロマトグラフィー及びＨＴＰＬＣで分析した。混合された抽出物を適当な溶媒に溶解させ、完全に懸濁させ、試験システム（生体外全ヒト血）で用いて、規定された生体応答を確立した。
【実施例１４】
【０１０２】
方法
ヘパリン化ヒト末梢血を２％ゼラチンのＰＢＳ溶液の等容量と混合し、３０分間の間放置すると、ＲＢＣが底に沈殿した。好中球強化単核細胞を含む上層を遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳ中に懸濁させた。５００μｌのこの細胞懸濁液（３×１０6細胞／ウエル）を１μｇ／ｍｌの各サンプルと共に３７℃で３時間の間、培養した。混合物の場合、その画分を１：１の比で混合し、最終調製品を作り、それを１．０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。その後、アラキドン酸溶液１０μｌ／ｍｌ（１２．２ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、細胞懸濁液の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【０１０３】
従って、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分の抽出物からの生理活性画分を、喘息性容態の軽減、治療及び治癒に関連して、生物活性についてスクリーニングし、このように処理した画分を、薄層クロマトグラフィー及びＨＰＬＣ、ＮＭＲスペクトルで分析し、適当な溶媒に溶解させ、完全に懸濁させ、試験システム（生体外全ヒト血）で用いて、規定された生体応答を確立した。
【実施例１５】
【０１０４】
細胞内インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）のフローサイトメトリーによる調製品
ヘパリン化全血液（２４ウエルプレートの０．１ｍｌ／ウエル、正常な個人から収集）を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清と植物凝集素（ＰＨＡ、１０μｇ／ｍｌ）とを含む１．０ｍｌのローズウエル・パーク・メモリアル・インスティテュート（Rosewell Park Memorial Institute）（ＲＰＭＩ）培地の全容量中、３７℃で５％ＣＯ2中、６時間の間、キンマ及びオオバゲッキツ葉抽出物（各１．０ｍｇ／ｍｌ）を単独又は組み合わせて、存在下又は不在下に、培養した。新たに合成されたたんぱく質の細胞内蓄積を生じさせるため、ブレフェルジン（brefeldin）A（１０μｇ／ｍｌ）を少なくとも４時間の間、細胞に添加した。培養期間の終点で、その細胞をＲＢＣを溶解させるため、ＦＡＣＳ（登録商標）溶解溶液（米国、ベクトン・ディキンソン社（Becton Dickinson））で処理した。細胞をその後洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間の間処理して浸透化した。洗浄緩衝液（１％アルブミン、０．１％サポニン及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）で洗浄した後、浸透化細胞を、ＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮγモノクローナル抗体又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４モノクローナル抗体のいずれかで２０分間の間、室温、暗所で処理した。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、その後、プログラム細胞探求でファックスキャリバー（ＦＡＣＳ Calibur）(米国、ベクトン・ディキンソン社)を用いる単一色フローサイトメトリー分析のため、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。１０，０００の細胞を各サンプルについて収集し、その蛍光強度を対数目盛で測定した。細胞内ＩＦＮγ又はＩＬ−４のみが検出されることを確実にするため、浸透化前に細胞をＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮγ又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４抗体で染色し、各染色に、０．２％より少ない蛍光性の細胞を与えた。無関係なアイソタイプ対応コントロール抗体も、ほんの０．１％より少ない蛍光性細胞を生じた。
【０１０５】
オオバゲッキツ及びキンマから得られた抽出物の存在下又は不在下で、植物凝集素と共に培養した後、生体外ヒト単核細胞細胞中におけるフローサイトメトリーでの細胞内ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−４の測定。我々のデータは、キンマからの抽出物がＩＦＮ−ガンマ陽性細胞を増加させ、ＩＬ−４陽性細胞を著しく減少させたことを示した。オオバゲッキツ抽出物は、ＩＬ−４陽性をＩＦＮ−ガンマ陽性細胞と同様、減少させた。これら２つの抽出物の組み合わせは、ＩＦＮ−ガンマ陽性細胞をコントロールレベルまで増加させ、さらにＩＬ−４陽性のレベルを減少させたままに維持する。
【実施例１６】
【０１０６】
オオバゲッキツ抽出物（８．０１ｇ）の一部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、生物的に活性な画分の中から画分を単離した。これらは画分ＭＫ０３（７０ｍｇ）、ＭＫ０４（２７０ｍｇ）及びＭＫ０５（１１０ｍｇ）と命名された。
【実施例１７】
【０１０７】
ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５、ＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃの物理化学的特性付け
画分ＭＫ０３：
１． 乾燥固体、融点９８〜１００℃、ＤＭＳＯに可溶性；
２． 薄層クロマトグラフィーによれば、溶媒系の一つ−クロロホルム及びメタノール（１９：１）において、Ｒｆ ０．４８を有する単一スポットを示し；
３． ＨＰＬＣ分析によれば、インターセルＯＤＳ−３（４．６ｘ２５０ｍｍ）分析カラムおよび溶媒系メタノールを用いて、０．５ｍｌ／分の流速で、検出を２１０ｎｍで行って、保持時間８．５分の単一ピークを示し、
ＨＰＬＣ：カラムＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）流速−０．５ｍｌ／分；２１０ｎｍでのピーク；保持時間−３．５分；溶媒系−メタノール；
【０１０８】
4. 13CNMR, ppm (125 MH2, CDCl3):153.34, 153.29, 148.94, 140.73, 134.78, 131.58, 128.61, 124.22, 120.36, 119.97, 118.23, 118.02, 117.39, 116.63, 108.36, 104,39, 97.16, 78.03, 40.68, 25.67, 25.60, 22.70, 17.53 及び 15.97 ;
５． 画分「ＭＫ０３」は、純粋なアルカロイドのようであった。
【０１０９】
画分ＭＫ０４：
１． ジメチルスルホキシドに可溶性な暗色粘着性物質；
２． 生理活性物質のＴＬＣによれば、クロロホルム及びメタノール（１９：１）の溶媒系においてＲｆ０．３８の単一スポットを示し；
３． インターシルＯＤＳ−３分析カラム、溶媒系メタノール及び流速１．０ｍｌ／分、２５４ｎｍでの検出を用いる生理活性物質のＨＰＬＣ分析によれば、保持時間５：６９分の１つのピークが示され；
４． NMR (300MH2, CDCl3) δ 0.94, 1.30, 1.60, 2.04-2.10, 2.27-2.34, 2.78-2.82, 3.53-3.81, 3.85-3.92, 4.00, 4.24-4.26, 及び 5.26-5. 41；
５． 画分ＭＫ０４は、糖脂質である。
【０１１０】
画分ＭＫ０５：
１． 暗色固体、ＤＭＳＯおよび水に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．６６の単一スポットが示され；
３． この画分の溶媒系メタノール−水（１：９）、流速０．５ｍｌ／分および２１７ｎｍで検出するＨＰＬＣ分析によれば、保持時間２１分のピークが示され；
４． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 175.82, 169.22, 159.00, 147.63, 147.02, 144.76, 135.72, 131.28, 131.10, 129.90, 129.63, 129.20, 128. 20, 127.59, 123.30, 116.81, 116.39, 115.80, 114.79, 81.77, 76.26, 76.15, 74.20, 73.79, 73.64, 73.49, 72.84, 72.16, 71.34, 70.29, 69.89, 68.83, 67.96, 63.71, 63.14, 58.22, 56.62, 56.19, 54.47, 54.42, 54.37, 41.90, 36.87 及び 20.93 ；
５． 画分ＭＫ０５は、糖が結合した芳香族化合物のようである。
【０１１１】
画分ＪＢ０１Ａ：
１． 白色固形物質及びＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．０７の単一スポットが示され；
３． ＨＰＬＣによれば、溶媒系 水−メタノール（９：１）、流速０．５ｍｌ／分、２１７ｎｍでの検出およびインターシルＯＤＳ−３分析カラムで、保持時間８．４分（ＪＢ０１Ａ，ピーク−１）のピークを示し；
４． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2Ｏ): 109.71, 108.417, 107.94, 104.17, 100.27, 84.38, 81.79, 81.53, 80.74, 77.03, 75.58, 73.85, 73.42, 71.71, 71.27, 70.74, 70.38, 69.12, 61.71, 61.00 及び 60.54 ;
５．画分ＪＢ０１Ａは、オリゴ糖である。
【０１１２】
画分ＪＢ０１Ｂ：
１． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．２７の単一スポットが示され；
３． ＨＰＬＣによれば、前記と同じカラム条件下で、保持時間８．８分（ＪＢ０１Ｂ，ピーク−２）のピークを示し；
４． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 169.48, 104.30, 98.86, 98.55, 92.60, 81.82, 76.98, 76.07, 74.57, 73.52, 73.23, 71.78, 71.46, 70.02, 69.84, 69.74, 69.30, 68.92, 68.77, 67.01, 66.43, 62.95, 62.02, 61.61, 48.67, 44.62, 38.88 ；
５． 画分ＪＢ０１Ｂは、オリゴ糖誘導体。
【０１１３】
画分ＪＢ０１Ｃ：
１． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．３４の単一スポットが示され；
３． ＨＰＬＣによれば、前記と同じ条件下で、保持時間９．８分（ＪＢ０１Ｃ，ピーク−３）の単一ピークが示され；
４． NMR (300 MH2, D2O). 2.34. 3.27, 3.28, 3.44-3.47, 3.51, 3.60-3.63, 3.68, 3.92-3.99, 4.08, 4.92 及び 5.36 ；
５． 画分ＪＢ０１Ｃは、オリゴ糖である。
【実施例１８】
【０１１４】
フローサイトメトリーによる細胞内インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）を分析するための試験の説明
方法：ヘパリン化全血液（２４ウエルプレートの０．１ｍｌ／ウエル、正常な個人から収集）を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清と、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）と、イノミシン（inomycin）又はＬＰＳとを含む１．０ｍｌのローズウエル・パーク・メモリアル・インスティテュート（ＲＰＭＩ）培地の全容量中、３７℃で５％ＣＯ2中、６時間の間、キンマ及びオオバゲッキツの全ての植物部分からの画分（各５０．０μｇ／ｍｌ）を単独又は組み合わせて、存在下又は不在下に、培養した。新たに合成されたたんぱく質の細胞内蓄積を生じさせるため、ブレフェルジンA（１０μｇ／ｍｌ）を少なくとも４時間の間、細胞に添加した。培養期間の終点で、その細胞をＲＢＣを溶解させるため、ＦＡＣＳ（登録商標）溶解溶液（米国、ベクトン・ディキンソン社）で処理した。細胞をその後洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間の間処理して浸透化した。洗浄緩衝液（１％アルブミン、０．１％サポニン及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）で洗浄した後、浸透化細胞を、ＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４モノクローナル抗体のいずれかで２０分間の間、室温、暗所で処理した。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、その後、プログラム細胞探求でファックスキャリバー （米国、ベクトン・ディキンソン社）を用いる単一色フローサイトメトリー分析のため、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。１０，０００の細胞を各サンプルについて収集し、その蛍光強度を対数目盛で測定した。細胞内ＩＦＮγ又はＩＬ−４のみが検出されることを確実にするため、浸透化前に細胞をＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮγ又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４抗体で染色し、各染色に、０．２％より少ない蛍光性の細胞を与えた。無関係なアイソタイプ対応コントロール抗体も、ほんの０．１％より少ない蛍光性細胞を生じた。
【０１１５】
実施例９の結果
画分 Ｏ2摂取の阻害％
なし ――
ＭＫ０Ｃ ８１．１
ＪＢ０１ ３
ＭＫ０Ｃ＋ＪＢ０１ ７７．７３
【０１１６】
実施例１１の結果
画分 Ｏ2摂取の阻害％
なし ――
ＭＫ０Ｃ ８９．６２
ＪＢ０１ ５．４２
ＭＫ０Ｃ＋ＪＢ０１ ８３．２０
【０１１７】
実施例１３の結果
画分 Ｏ2摂取の阻害％
なし ――
ＭＫ０Ｃ ８８．７６
ＪＢ０１ ４．５８
ＭＫ０Ｃ＋ＪＢ０１ ８５．９４
【０１１８】
【表１】
【実施例１９】
【０１１９】
呼吸性障害の治療のための、オオバゲッキツ樹皮及びキンマ葉抽出物の組み合わせにより開発された調製品の治療的評価の結果
【０１２０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、オオバゲッキツから得られた生理活性画分（ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５）及びキンマから得られた生理活性画分（ＪＢ０１Ｃ）の存在下又は不在下に、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）及びカルシウムイオノフォア（ionomycin）と共に培養した後、生体外ヒト単核細胞における細胞内ＩＦＮ−ガンマのフローサイトメトリー測定について説明する。我々のデータは、生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５及びＪＢ０１Ｃが、ＩＦＮ−ガンマ産生を増強したことを示した。
【図２】図２は、画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５及びＪＢ０１Ｃの存在下又は不在下に、ＬＰＳと共に培養した後、生体外ヒト好中球における細胞内ＩＬ−４のフローサイトメトリー測定について説明する。我々のデータは、キンマの画分ＪＢ０１ＣがＩＬ−４産生細胞を著しく減少させたことを示した。一方、オオバゲッキツの画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５は、ＩＬ−４産生の阻害に関して、僅かな効果を示したのみであった。興味あることに、オオバゲッキツの生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５と、キンマの生理活性画分ＪＢ０１Ｃの組み合わせは、ＩＬ−４産生を徹底的に減少させた。
【図３】図３は、オオバゲッキツ及びキンマから得られた抽出物の存在下又は不在下に、植物凝集素と共に培養した後、生体外ヒト単核細胞における細胞内ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−４のフローサイトメトリー測定について説明する。我々のデータは、キンマからの抽出物がＩＦＮ−ガンマ陽性細胞を増加させ、ＩＬ−４陽性細胞を著しく減少させることを示した。オオバゲッキツ抽出物は、ＩＬ−４陽性をＩＦＮ−ガンマ陽性細胞と同様、減少させた。これら２つの抽出物の組み合わせは、ＩＦＮ−ガンマ陽性細胞をコントロールレベルまで増加させ、さらにＩＬ−４活性のレベルを減少させたままに維持した。
【０００１】
（技術分野）
この発明は、気管支呼吸困難の治療及び療法のための草本組成物に関する。この発明は、５−リポキシゲナーゼ活性を遮断し、ロイコトリエン（leukotrine）合成の阻害、ＩＬ４産生の抑制及びＩＦＮ ガンマ放出の増強を引き起こすのに有用な草本製剤に関する。より詳細には、この発明は、分離方法と、物理化学的特性付け方法と、気管支呼吸障害の治療及び療法に対するそれらの役割を明らかにするための、植物オオバゲッキツ（M.koenigii）（ナンヨウザンショウ、カレー・リーフ）及びキンマ（P. betle）の葉、樹皮、根及び種子を含むいずれかの植物部分の抽出物から得られた抽出物又は生理活性画分の生体応答評価の方法とを説明している。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
呼吸問題は、喘鳴、咳、胸部緊張等のような他の不快感を伴う呼吸の著しく重篤な障害に対するマイルド（mild）を含む。予防の処置、一般の認識キャンペーン及びモニタリング・システムにもかかわらず、呼吸障害にあっている人口は、世界中で、上昇している。これは西先進国、特に子供たちの間で真実である。オオバゲッキツ葉調製品を用いて、喘息の軽減及び治癒可能性が、既に本発明者らによる２０００年１０月１６日出願のＰＣＴ特許出願Ｎｏ：ＰＣＴ／ＩＮ／００１０２の出願（特許文献１参照）に示されている。２つの枝分かれした方策が、本発明で適応されている。
【０００３】
呼吸器疾患は、免疫系の異常に起因している病態生理学的徴候の結果である。即時徴候には、気管支の締めつけ、呼吸路の炎症及び粘液分泌による気道閉鎖を含む。対症薬物は、苦痛徴候の一時的な緩和により、軽減することができる。
【０００４】
このことは、オオバゲッキツ抽出物が、キンマから得られた抽出物と組み合わされると、驚くべき結果を示すことを明言している。より早く出願された未公開ＰＣＴ特許出願によれば、キンマ葉抽出物は、Ｔｈ１型細胞からＩＦＮ−γにおいて増加を、Ｔｈ２型細胞からＩＬ−４の減少を示していた。これは、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型へのシフトが、明らかに肥満細胞からＩｇＥ（喘息性容態を主に操縦する）の放出を減少させるので、喘息治療において明らかに効果的な処置である。従って、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＮ００／００１２７（特許文献２参照）の前の、出願人の初期所見は、アトピー型喘息治療のための新規薬剤として、オオバゲッキツ及びキンマのいずれかの植物部分からの合わせた抽出物に関する本出願と直接的に調和している。
【０００５】
呼吸問題の根本的問題は、対症薬物の開発者によっては、あまり取り上げられない。現在の知識の出現で、ロイコトリエンが呼吸問題の徴候を現すことにおいて、主なプレーヤーであることが見出されていることは、現在よく受け入れられている。
【０００６】
呼吸問題の主要な徴候は、初期応答および後期応答に分けることができる。初期応答は、アレルゲン暴露の数分以内に起こり、ヒスタミン、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンＤ２のようなメディエイタが主に関係する。これらメディエイタの効果は、気管支収縮及び粘液の蓄積を生じる。後期応答は、数時間後に起こり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＴＮＦ−アルファ、好酸球白血球遊走因子（ＥＣＦ）並びに血小板凝集因子（ＰＡＦ）を含む、更なるメディエイタが関係する。これらメディエイタの全体的な効果は、好酸球及び好中球を含む炎症細胞を補充することである。これらの細胞は、有毒な酵素を放出することによって、重要な組織損傷を引き起こすことができる。これらの発生は、粘液タンパク質および細胞破片を伴う気管支腔の閉塞、従って基底膜の肥厚、流体増強及び気管支平滑筋肥大につながる。粘液プラグがしばしば形成し、気管支壁に付着する。その粘液プラグは、分離した上皮細胞断片、好酸球、ある好中球及びクルシュマンらせん体として知られている気管支組織のらせん体の集団を含む（Immunology, J. Kuby; W.H. Freeman & Co., ニューヨーク; 3版1997（非特許文献１参照））。気管支喘息／気管支呼吸問題の発現に関する現在のメカニズムから見れば、薬物開発に対する最新の方策は、以下のアプローチを強調している。
【０００７】
これらには、ｉ）5-リポキシゲナーゼ-酵素を遮断することによるロイコトリエン合成の阻害（Legqis RAら、 New England J. Med. 323: 645,1990（非特許文献２参照））を含む。ロイコトリエンの形成は、アラキドン酸の酸化から始まるので、この反応の阻害により、ロイコトリエン合成の阻害に到る。さらに、ロイコトリエン受容体拮抗体はまた、喘息／呼吸問題に対する抗ロイコトリエン治療として導入される（Tien F.C., Medical J. Aust. 171: 378, 1999（非特許文献３参照））。現在承認されている薬物ゼルチン（zelutin）（アラキドン酸酸化の阻害を基にする）は、既に米国市場において独占的に導入されている。しかし、その使用は、肝毒性により制限される。１４歳以下の子供には、この薬は推薦されない。さらに、他の薬物を摂取している患者は、抗喘息薬としてゼルチンを摂取しているときには、検査される必要がある。さらに、他の薬物を摂取している患者は、抗喘息薬としてゼルチンを摂取しているときには、検査される必要がある。ｉｉ）抗ＩｇＥ抗体（人間化）によるか、又は高親和性ＩｇＥ受容体、ＦｃεＲ−Ｉを遮断することによるＩｇＥの中和（Heusser C, Jardiu P. Current Oppinio Immunol., 9: 805, 1999（非特許文献４参照））。Ｔｈ２サイトカインの抑制により、ＩｇＥ産生が減少するので、更なるアプローチは、これらのＴｈ２サイトカイン合成およびＴｈ１サイトカイン形成の増強の阻害を基にしている（Chung K.F.; Barens P.J. Thorax 54: 825, 1999（非特許文献５参照））。
【０００８】
対照的に、オオバゲッキツを基にした抗喘息用調製品は、7歳の若い子供と、80歳の老いたオクタゲナリアン（octagenarian）に試用され、なんの有害作用もなかった。
【０００９】
葉、樹皮、根及び種子を含む全ての植物部分から得られたオオバゲッキツ抽出物と同様、抽出物は、従って検査され、生理活性画分を同定した。これらは、ロイコトリエンの産生を阻害する能力に基づく。さらに、その画分は、Ｔｈ２応答のＴｈ１型へのシフトについても検査される。Ｔｈ１応答及びＴｈ２応答は、γ−インターフェロン（Ｔｈ１）及びＩＬ−４（Ｔｈ２）産生により、それぞれ測定される。あるオオバゲッキツ画分は、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害を示し、それはロイコトリエン合成の妨害とγ−インターフェロン産生における著しい増加（代わりにＩＬ−４産生を抑制する）とを意味する。一方、キンマ葉抽出物−画分の大部分は、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型へシフトするのを促進する結果となった。従って、これら２つの植物オオバゲッキツとキンマとからの特定の抽出物画分の混合物は、ロイコトリエン合成と、Ｔｈ１型へのＴｈ２応答のシフトとを主に阻害し、従って、気管支呼吸問題の治療、軽減及び療法のための独特な相乗作用的組成物として提案されている。従って、２つの方向の方策は、この新しい組成物の主要な目的であり、気管支呼吸問題の患者にとって治療の最も良い理学療法として考えられる。
【特許文献１】
国際公開第ＷＯ０２／３２４４０号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第ＷＯ０２／４９６５５号パンフレット
【非特許文献１】
J. Kuby 、「Immunology」、第3版、米国ニューヨーク、W.H. Freeman & Co., 1997年
【非特許文献２】
Legqis RAら、"New England J. Med."、1990年、第645巻、p.323頁
【非特許文献３】
Tien F.C.、"Medical J. Aust."、1999年、第378巻、p.171
【非特許文献４】
Heusser C, Jardiu P. 、"Current Oppinio Immunol."、1999年、第805巻、p.9
【非特許文献５】
Chung K.F.; Barens P.J.、"Thorax"、1999年、第825巻、p.54
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の目的）
本発明の主な目的は、生理活性画分を提供することであり、その生理活性画分は、オオバゲッキツ及びキンマの異なる植物部分の抽出物から得られる。
【００１１】
本発明の別な目的は、新規な医薬組成物を提供することであり、その医薬組成物は、オオバゲッキツ及びキンマの葉又は他のいずれかの植物部分由来の抽出物の組み合わせを含む。
【００１２】
本発明の別な目的は、新規な組成物を提供することであり、その組成物は、呼吸問題を治療するための、オオバゲッキツ及びキンマ植物部分から由来の生理活性画分の組み合わせを含む。
【００１３】
さらに本発明の別な目的は、呼吸問題の軽減、治療及び療法に有用な、オオバゲッキツ及びキンマの葉又は他のいずれかの植物部分からの抽出物を調製する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、呼吸問題の軽減、治療及び療法に有用な、オオバゲッキツ及びキンマの植物部分からの生理活性画分の単離方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、呼吸問題の治療、軽減及び療法に関連する生物的活性を有する、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分からの生理活性画分を単離する簡略化された方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、草本調製品を提供することであり、その草本調製品は、オオバゲッキツ及びキンマ葉から由来の抽出物か、又はオオバゲッキツ及びキンマの他の植物部分から得られた抽出物を含む。前記抽出物は、ヒト摂取に非常に適合性であり、呼吸問題の治療、軽減及び療法に用いることができる。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、呼吸問題の治療、軽減及び療法に関連する生物的活性を有する組成物の、簡略化された速くて安価な製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、草本組成物調製品を提供することであり、その草本組成物調製品は、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分から由来する生理活性画分と、活性因子とを含む。前記因子及び生理活性画分は、ヒト摂取並びに呼吸問題の治療、軽減及び療法に非常に適合性である。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、全ての植物部分オオバゲッキツと、キンマ葉の生理活性画分の各々を個々に又は組み合わせて検査することである。前記生理活性画分は、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害活性を有し、かつＴｈ２型応答のＴｈ１型へのシフトを促進する。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、オオバゲッキツ及びキンマ葉又は他の植物部分から得られた抽出物の各々を、個々におよび組み合わせて、５−リポキシゲナーゼ−媒介アラキドン酸酸化の阻害活性と、Ｔｈ２型応答のＴｈ１型へのシフトの誘導とについて、検査することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、個々に及び組み合わせて、オオバゲッキツ及びキンマ画分の存在下に、生体外（ex-vivo）全ヒト血液系における５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化をアッセイすることである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、ヒト多形核好中球（ＰＭＮ）で強化された生体外系において、オオバゲッキツ及びキンマ画分の存在下、個々に及び組み合わせて、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化をアッセイすることである。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、生体外ヒト全血液系において、オオバゲッキツ及びキンマ葉抽出物又はそれらの他の植物部分抽出物の存在下、個々に及び組み合わせて、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化をアッセイすることである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、フローサイトメトリーにより細胞内サイトカインの産生を検出することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分からの画分を有する生体外ヒト全血液において、個々に及び組み合わせて、Ｔｈ１及びＴｈ２型応答についてのそれぞれの公知の標識として知られる細胞内ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−４のプロファイルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
（本発明の要旨）
従って、本発明は、５リポオキシゲナーゼ活性を遮断し、ロイコトリエン合成の阻害、ＩＬ４産生の抑制及びＩＦＮガンマ放出の増強をもたらすのに有用な、草本製剤を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は気管支呼吸困難の治療及び療法のための草本製剤を提供する。本発明はまた、気管支呼吸困難の治療及び療法に対するそれらの役割を確立する目的で、生体応答を測定するために、植物オオバゲッキツ及びキンマの葉若しくは他の植物部分のいずれか又は種子からの抽出物の調製方法と、それらの選択的混合物の調製方法とを提供する。
【００２８】
さらに、本発明は、植物オオバゲッキツ及びキンマの葉又は他の植物部分のいずれかまたは種子から得られた生理活性画分を含む草本組成物と、気管支呼吸困難の治療及び療法のためのそれらの選択的な混合物とを提供する。本発明の別の観点は、気管支呼吸困難の治療及び療法に対するそれらの役割を確立するために、植物オオバゲッキツ及びキンマの葉、樹皮、根及び種子を含む植物のいずれかの部分の抽出物から得られた生理活性画分の分離、物理化学的特性付け及び生体応答評価の方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（本発明の詳細な記載）
従って、本発明は、ロイコトリエン阻害剤、ＩＬ４合成阻害剤及びＴｈ１型免疫調節剤（immunomudulator）として有用な医薬組成物を提供する。前記組成物は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉若しくはいずれかの他の植物部分から得られた凍結乾燥された水性若しくはアルコール性の抽出物か、又はこれら抽出物由来の生理活性画分の効果的な量と、任意に１以上の医薬的に許容される成分とを含む。
【００３０】
実施態様において、植物オオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）から得られた生理活性画分は、ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と名づけられる。
本発明の別の実施態様において、植物キンマ（ＰＢ）から得られた生理活性画分は、ＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃと名づけられる。
さらに別の実施態様において、用いられる植物の部分は、葉、茎、樹皮、果実、種子又は他のいずれかの植物部分から選択される。
【００３１】
さらに別の実施態様は、用いられる医薬的に許容される成分に関する。前記成分は、たんぱく質、炭水化物、ショ糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン−ゼラチンペーストのような栄養素及び／又は担体、賦形剤、希釈剤若しくは溶剤から選ばれる。
【００３２】
さらに別の実施態様は、前記組成物を吸入、経口、静脈内、筋肉内、皮下経路又は他の適当ないずれかの経路による投与することに関する。
【００３３】
さらに別の実施態様では、経口経路はカプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤又は顆粒剤の形態であり、経口経路により投与される量は、静脈内経路より多い。
【００３４】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋ抽出物の割合は、キンマ抽出物の量と同じまたはそれ以上である。
【００３５】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋ抽出物に対するキンマ（ＰＢ）抽出物の割合は、１：１〜１：５の範囲である。
【００３６】
さらに別の実施態様では、組成物は、１〜２０ｍｇ／体重のｋｇの投与量レベルで、少なくとも１日１回、少なくとも４週の間、投与される。
【００３７】
さらに別の実施態様では、組成物は、生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及び／又はＭＫ０５を含む。
【００３８】
さらに別の実施態様では、前記組成物は、生理活性画分ＪＢ０１Ｃ、ＭＫ０３、ＭＫ０４及び／又はＭＫ０５を含む。
【００３９】
さらに別の実施態様では、静脈内経路により投与される生理活性画分の量は、経口経路より少ない。
【００４０】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋからの生理活性画分の割合は、キンマの生理活性画分と同じ又はそれ以上である。
【００４１】
さらに別の実施態様では、Ｍ．Ｋ抽出物から得られた生理活性画分に対するキンマ抽出物から得られた生理活性画分の割合は、１：１〜１：５の範囲である。
【００４２】
別の実施態様では、組成物は、０．５〜１０．０ｍｇ／体重のｋｇの投与量レベルで、少なくとも１日１回、少なくとも４週間の間、呼吸状態に応じて投与される。
【００４３】
本発明の別の実施形態において、少なくとも４週から３ヶ月までの間、投与される組成物が提供される。
【００４４】
さらに別の実施態様は、組成物に関する。その組成物は、オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られた生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５の組み合わせであり、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性を遮断するための組成物であり、Ｔｈ１型免疫調節剤としての組成物である。
【００４５】
さらに別の実施態様において、組成物を提供する。その組成物は、オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られた生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と、キンマの葉及び他の植物部分から得られたＪＢ０１Ｃとの組み合わせであり、ロイコトリエン合成阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５−リポキシゲナーゼ活性を遮断し、かつ、ガンマインターフェロン放出を増強するための組成物である。
【００４６】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、気管支呼吸容態の治療に用いられる。
【００４７】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、哺乳類及び動物を治療するために用いられる。
【００４８】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、Ｔｈ２応答をＴｈ１応答にシフトするのに用いられる。
【００４９】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、全血液の好中球強化構成要素において、５−リポオキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化を阻害するのに用いられる。
【００５０】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、生体外ヒト全血液において、ＩＦＮ−ガンマを増強すること、及びＩＬ−４応答を軽減させることに用いられる。
【００５１】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、生体外ヒト全血液単核細胞（ＰＭＮ）において、ＩＦＮ−ガンマ応答を増強するのに用いられる。
【００５２】
さらに別の実施態様において、前記組成物は、ヒト末梢全血液単核細胞において、ＩＬ−４応答を軽減させるのに用いられる。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様によれば、草本組成物が提供される。前記草本組成物は、ロイコトリエン合成の阻害、ＩＬ４産生の抑制を引き起こす５−リポキシゲナーゼ活性の遮断、及びＩＦＮガンマ放出の増強に有用である。前記組成物は、キンマ及びオオバゲッキツの葉又は他の植物部分のいずれかから得られた抽出物又は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の凍結乾燥抽出物の効果的な量を含む。
【００５４】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＭＫ０３と名づけられた生理活性画分が、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５ リポオキシゲナーゼ活性を遮断のためであり、前記生理活性画分がオオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 乾燥固体、融点９８〜１００℃、ＤＭＳＯに可溶性；
ｂ． 薄層クロマトグラフィーによれば、溶媒系の一つ−クロロホルム及びメタノール（１９：１）において、Ｒｆ０．４８を有する単一スポットを示し；
ｃ． ＨＰＬＣ分析によれば、インターセル（intersel）ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）分析カラムおよび溶媒系メタノールを用いて、０．５ｍｌ／分の流速で、検出を２１０ｎｍで行って、保持時間８．５分の単一ピークを示し、
ＨＰＬＣ：カラムＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）流速−０．５ｍｌ／分；
２１０ｎｍでのピーク；保持時間−３．５分；溶媒系−メタノール、
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, CDCl3):153.34, 153.29, 148.94, 140.73, 134.78, 131.58, 128.61, 124.22, 120.36, 119.97, 118.23, 118.02, 117.39, 116.63, 108.36, 104,39, 97.16, 78.03, 40.68, 25.67, 25.60, 22.70, 17.53 及び 15.97 ; 並びに
ｅ． 画分「ＭＫ０３」は、純粋な含窒化合物のようであった。
【００５５】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＭＫ０４と名づけられた生理活性画分が、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性の遮断のためであり、前記生理活性画分が、オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． ジメチルスルホキシドに可溶性な暗色粘着性物質；
ｂ． 生理活性物質のＴＬＣによれば、クロロホルム及びメタノール（１９：１）の溶媒系においてＲｆ０．３８の単一スポットを示し；
ｃ． インターシル（intersil）ＯＤＳ−３分析カラム、溶媒系メタノール及び流速１．０ｍｌ／分、２５４ｎｍでの検出を用いる生理活性物質のＨＰＬＣ分析によれば、保持時間５：６９分の１つのピークが示され；
ｄ． NMR (300MH2, CDCl3) δ 0.94, 1.30, 1.60, 2.04-2.10, 2.27-2.34, 2.78-2.82, 3.53-3.81, 3.85-3.92, 4.00, 4.24-4.26, 及び 5.26-5.41; 並びに
ｅ． 画分ＭＫ０４は、糖脂質である。
【００５６】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＭＫ０５と名づけられた生理活性画分が、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性の遮断するためであり、前記生理活性画分がオオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 暗色固体、ＤＭＳＯおよび水に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．６６の単一スポットが示され；
ｃ． この画分の溶媒系メタノール−水（１：９）、流速０．５ｍｌ／分および２１７ｎｍで検出するＨＰＬＣ分析によれば、保持時間２１分のピークが示され；
ｄ．13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 175.82, 169.22, 159.00, 147.63, 147.02, 144.76, 135.72, 131.28, 131.10, 129.90, 129.63, 129.20, 128.20, 127.59, 123.30, 116.81, 116.39, 115.80, 114.79, 81.77, 76.26, 76.15, 74.20, 73.79, 73.64, 73.49, 72.84, 72.16, 71.34, 70.29, 69.89, 68.83, 67.96, 63.71, 63.14, 58.22, 56.62, 56.19, 54.47, 54.42, 54.37, 41.90, 36.87 及び 20.93 ; 並びに
ｅ． 画分ＭＫ０５は、糖が結合した芳香族化合物のようである。
【００５７】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＪＢ０１Ａと名づけられた生理活性画分が、キンマの葉及び他の植物部分から得られ、前記生理活性画分がガンマ インターフェロン放出の増強のためであり、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 白色固形物質及びＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．０７の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、溶媒系 水−メタノール（１：９）、流速０．５ｍｌ／分、２１７ｎｍでの検出およびインターシルＯＤＳ−３分析カラムで、保持時間８．４分（ＪＢ０１Ａ，ピーク−１）のピークを示し；
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 109.71, 108.417, 107.94, 104.17, 100.27, 84.38, 81.79, 81.53, 80.74, 77.03, 75.58, 73.85, 73.42, 71.71, 71.27, 70.74, 70.38, 69.12, 61.71, 61.00 及び 60.54 ; 並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ａは、オリゴ糖である。
【００５８】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＪＢ０１Ｂと名づけられた生理活性画分が、キンマの葉及び他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、ガンマ インターフェロン放出の増強のためであり、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 白色固体ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．２７の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、前記と同じカラム条件下で、保持時間８．８分（ＪＢ０１Ｂ，ピーク−２）のピークを示し；
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 169.48, 104.30, 98.86, 98.55, 92.60, 81.82, 76.98, 76.07, 74.57, 73.52, 73.23, 71.78, 71.46, 70.02, 69.84, 69.74, 69.30, 68.92, 68.77, 67.01, 66.43, 62.95, 62.02, 61.61, 48.67, 44.62, 38.88 ; 並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ｂは、オリゴ糖誘導体。
【００５９】
本発明のさらなる実施態様は、組成物に関する。前記組成物において、ＪＢ０１Ｃと名づけられた生理活性画分が、キンマの葉及び他の植物部分から得られ、前記生理活性画分が、ガンマ インターフェロン放出の増強のためであり、前記生理活性画分が、以下の物理化学的特性を有する：
ａ． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．３４の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、前記と同じ条件下で、保持時間９．８分（ＪＢ０１Ｃ，ピーク−３）の単一ピークが示され；
ｄ． NMR (300 MH2, D2O). 2.34. 3.27, 3.28, 3.44-3.47, 3.51, 3.60-3.63, 3.68, 3.92-3.99, 4.08, 4.92 及び 5.36 ; 並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ｃは、オリゴ糖である。
【００６０】
本発明のさらなる実施態様は、気管支呼吸容態の患者を治療する方法に関し、前記方法は、キンマ（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉又は他の植物部分のいずれかから得られた凍結乾燥された水性又はアルコール性抽出物、又はこれらの抽出物由来の生理活性画分と、任意に１以上の医薬的に許容される成分とを組み合わせて含む医薬組成物の効果的な量を前記患者に投与することを含む。
【００６１】
別の実施態様において、前記組成物は、経口、静脈内、筋肉内、吸入又は皮下経路により投与される。
【００６２】
さらに別の実施態様において、前記経口経路は、カプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤又は顆粒剤の形態である。
【００６３】
本発明の別の実施態様において、ロイコトリエン及びＩＬ４合成阻害剤として、並びにＴｈ１型免疫調節剤として有用な医薬組成物が提供される。前記組成物は、医薬的に許容される添加剤と任意に関連づけるか、または組み合わせて、キンマ（ＰＢ）の植物部分の抽出物から得られたＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃと名づけられた生理活性画分の１以上と、オオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉抽出物から得られたＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と名づけられた生理活性画分の１以上の効果的な量を含む。
【００６４】
本発明のさらなる実施態様は、気管支呼吸容態の患者を治療する方法に関する。前記方法は、医薬的に許容される添加剤と任意に関連づけるか、または組み合わせて、キンマ（ＰＢ）の植物部分の抽出物から得られたＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃと名づけられた生理活性画分の１以上と、オオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の葉抽出物から得られたＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と名づけられた生理活性画分の１以上の効果的な量を、前記患者に投与することを含む。
【００６５】
本発明の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分からの生理活性画分は、新鮮に抜き取られたヒト血と混合される。
【００６６】
本発明の別の実施態様において、生体外ヒト血系における細胞は、カルシウムイオノフォア（inophor）等で活性化される。
【００６７】
本発明の別の実施態様において、生理活性画分は、溶媒分留、ＴＬＣ、ＨＰＴＬＣ、ＨＰＬＣ等のような技術により、オオバゲッキツ及びキンマの樹皮、根、葉及び種子を含む植物の部分全てから分離される。
【００６８】
本発明の別の実施態様において、全ての植物部分からの抽出物は、新鮮な、又は日陰乾燥されたオオバゲッキツ及びキンマから製造される。
【００６９】
本発明の別の実施態様において、植物材料は、抽出器又は当該分野で知られた装置において、メタノール、水又は緩衝液のような適当な溶媒での抽出に用いられる。
【００７０】
本発明の別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマ植物部分の抽出物は、減圧下に濃縮されて、有効成分を取り出す。
【００７１】
本発明のさらに別の実施態様において、濃縮物は、凍結乾燥されて、減らされた水及び他の残存溶媒が除去される。
【００７２】
本発明のさらに別の実施態様において、凍結乾燥された固体は、シリカゲル又はセファデックスＬＨ−２０を用いてクロマトグラフィーで精製され、純粋な画分を単離する。
【００７３】
本発明のさらに別の実施態様において、Ｍ．Ｋ及びＰ．Ｂの単離された画分は、生体外全ヒト血において、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害剤として活性であることが見出された。
【００７４】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分の抽出物から得られた画分は、Ｔｈ２型応答からＴｈ１応答へシフトするのに活性であることが見出された。
【００７５】
本発明のさらに別の実施態様において、生理活性画分は、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から選択され、全血液から好中球強化画分において、５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化を阻害する。
【００７６】
本発明のさらに別の実施態様において、生理活性画分は、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から選択され、生体外全ヒト血において、ＩＦＮ−ガンマ応答を増強することが見出された。
【００７７】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマ抽出物から選択される生理活性画分は、生体外ヒト全好中球（ＰＭＮ）において、ＩＮＦ−ガンマ応答を増強することが見出された。
【００７８】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から選択される生理活性画分は、ヒト末梢血単核細胞において、ＩＬ−４応答を減少させることが見出された。
【００７９】
本発明のさらに別の実施態様において、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物から得られた画分は、全血液の保温後、アセッセイされて５−リポキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化の阻害剤であることが見出され、アッセイのときに細胞を溶解させることが、組成物調製のために選択される。
【００８０】
本発明のさらに別の実施態様において、凍結乾燥された固体は、シリカゲル又はセファデックスＬＨ−２０でクトマトグラフィーで精製され、オオバゲッキツ及びキンマの葉及び全ての他の植物部分に存在する、呼吸問題の治療及び治癒のための純粋な生理活性画分を単離する。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、従って、本発明の範囲を限定するために解釈されるものではない。
【実施例１】
【００８２】
植物材料の収集
オオバゲッキツ及びキンマの植物の葉及び他の植物部分全てを、インドの西ベンガルの異なる領域から、低木及び這い登る植物からそれぞれ収集した。証明試料は、インド化学生物研究所（Indian Institute of Chemical Biology, 4 Raja S.C. Mullick Road, Calcutta-700032）の医薬品化学部（the department of Medicinal Chemistry）に寄託した。
【実施例２】
【００８３】
生理活性物質の調製品
パートＩ（オオバゲッキツ）
オオバゲッキツの新鮮な葉及び樹皮、根及び種子を含む他の植物部分全てを、地方の供給者から入手した後、収集し、きれいにし、水で洗浄し、原料として用いた。
【００８４】
オオバゲッキツの新鮮な葉及び他の植物部分４１０ｇｍを、混合物ブレンダー中、メタノール（１０００ｍｌ）中でペーストにし、ガラス抽出器（５リットル容量）中に入れ、１０００ｍｌのメタノールを添加した。これを室温で１６時間（終夜）保持した。抽出物をワットマンＮｏ．１濾紙でろ過し、ろ液を集めた。抽出のプロセスを４回繰り返し、合わせた抽出物を、温度を４０℃（浴）に保ちながら、ロータリーエバポレーターで減圧下に蒸発乾固させた。固形状残存物は、外見は粘着性であり、さらに凍結乾燥により乾燥させた。収量は２５．６３ｇｍ（ＭＫＯＣ）である。画分方法の概略図は、工程図Ｉに示す。
【００８５】
【化１】
【００８６】
滅菌水中でよく洗浄したオオバゲッキツの新鮮な葉１５０ｇｍを、７５０ｍｌのガラス蒸留水で、混合物ブレンダー中、均質化し、その後５回連続で各回５分間、超音波浴中で超音波処理した。ワットマンＮｏ．１濾紙でろ過して分離した材料を水で抽出した。このタイプの処理を３回繰り返した。合わせた抽出物を凍結乾燥して、粉末状材料（ＭＫＯＣ）重量１１ｇｍを得た。
【実施例４】
【００８７】
パートＩＩ（キンマ）抽出物
キンマの新鮮な葉又は植物部分の全てを、地方の供給者から収集し、原料として用いた。
【００８８】
キンマの新鮮な葉（１．５ｋｇ）を蒸留水（５００ｍｌ）で混合物ブレンダー中、均質化し、その後、３回連続で各回１５分間、超音波浴中で超音波処理した。それを、終夜又は１６時間の間、抽出させた。ワットマンＮｏ．１濾紙でろ過して分離した材料を水で抽出した。このタイプの処理を３回繰り返した。合わせた抽出物を４０℃でフラッシュエバポレーターで減圧下に蒸発乾固させた。残存する物質をその後高真空下にデシケーター中で乾燥させ、半固体（１４．９２ｇｍ）（ＪＢ０１）が残った。画分方法の概略図は、工程図ＩＩに示す。
【実施例５】
【００８９】
（オオバゲッキツの抽出物及びキンマの抽出物）
オオバゲッキツの抽出物３ｇｍと、キンマの抽出物３ｇｍとを、２、３滴の水を加えて、均質に混合した。抽出物全体を凍結乾燥機で蒸発乾固させた。この抽出物で生物活性の試験をした（ＭＫＯＣ＋ＪＢ０１）。
【実施例６】
【００９０】
（ＭＫ＋ＰＢ）
各植物部分２００ｇを、３００ｍｌのメタノールで混合物ブレンダー中で個々に均質化した。それをその後、３回連続で各回１５分間、超音波浴中で超音波処理した。その抽出物をワットマンＮｏ．１濾紙でろ過してろ液を集めた。この抽出プロセスを３回繰り返した。合わせた抽出物を凍結乾燥して、半固体塊重量６．３２ｇを得た。
【実施例７】
【００９１】
オオバゲッキツ（７０ｇｍ）とキンマ（５００ｇｍ）の新鮮な葉を混合し、蒸留水でよく洗浄した。それを蒸留水（３００ｍｌ）で混合物ブレンダー中均質化した。その後、それを３回連続で各回１５分間、超音波浴中で超音波処理した。その抽出物をワットマンＮｏ．１濾紙でろ過してろ液を集めた。この抽出プロセスを３回繰り返した。合わせた抽出物を凍結乾燥して、半固体塊（１０ｇｍ）を得た。その後、これで生物活性の試験をした（ＭＫＯｃ＋ＪＢ０１）。
【００９２】
両方の植物の葉が、インドにおいて様々な植物調製品を製造するのに広く用いられているので、その生体適合性や毒性は誰も心配する必要がない。さらに、両方の植物は広く普及している。呼吸問題の軽減、治療及び治癒に有用なオオバゲッキツ及びキンマの葉における生理活性因子の存在は、ここで示され、その調製品は、素早く、便利がよく、安価である。動物に葉抽出物を与えても、有害効果を全く生じなかった。
【００９３】
この抽出物の一部（４．００ｇｍ）をセファデックスＬＨ−２０カラムでクロマトグラフィー精製した。単離された画分の中で、ＪＢ０１Ａ（０．１７ｇ又は７０ｍｇ）、ＪＢ０１Ｂ（０．３３ｇ又は３３０ｍｇ）及びＪＢ０１Ｃ（０．９４ｇ又は９４０ｍｇ）と呼ばれる３つが、活性であると認められた。
【００９４】
【化２】
【００９５】
生理活性因子の調製方法は、以下を含む：
１． 新鮮な葉及び他の植物部分全てを地方の供給者から集め、
２． その植物部分を日陰で適度な度合いまで乾燥させるか、又は原料として新鮮な植物部分を取り、
３． 当該分野で公知の装置で、乾燥した各植物部分を別々に粉末化するか、または均質化し、
４． 石油エーテル（Ｂ．Ｐ．４０−６０℃）、石油エーテル（Ｂ．Ｐ．−６０℃−８０℃）、ペンタン、ヘキサン、ベンゼン等のような炭化水素溶媒、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素等のような塩素化溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のようなエーテル溶媒、アセトン、シクロペンタノン等のようなケトン溶媒；酢酸エチル、ギ酸エチル等のようなエステル溶媒；メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール等のような全てのアルコール類、水及び緩衝液を選択し、大量の適当な溶媒のもと、抽出器に粉末化又は均質化したものを入れ、
５． 浸出された植物材料を、１〜１２０時間の範囲の時間の間、抽出器又は当該分野で現在公知の器具若しくは装置を用いて抽出し、
６． 当該分野で現在公知の器具又は装置を用いて、減圧下に溶媒を蒸発させ、
７．当該分野で現在公知の器具又は装置でその材料を凍結乾燥又は乾燥させ、涼しく乾燥した場所において、気密容器中で、加工した材料を保管し、
８． シリカゲル及びセファデックスＬＨ−２０のクロマトグラフィーで個々の生理活性化区分を単離し、
９． 対生物活性を測定するためのマーカーとして用いるため、抽出物中に存在する純粋な化合物の特徴づけをし、
１０． 涼しく乾燥した場所において、気密容器中で、加工した材料を保管し、
１１． その物質の対生物活性を測定する。
【実施例９】
【００９６】
アラキドン酸酸化の阻害を測定する方法の説明
ＰＢＳで半分希釈された５００μｌのヘパリン化ヒト末梢血液を、２４−ウエル組織培養皿の各ウエルに入れた。１０μｇ／ｍｌ濃度の各抽出物サンプルを各ウエルに添加した。細胞をその後３７℃で時々振りながら３時間培養した。１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を、各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、その酸素含有量を高感度オキシグラフ（Oxygraph）計器の助力でモニターした。
【実施例１０】
【００９７】
方法：ＰＢＳで半分希釈された５００μｌのヘパリン化ヒト末梢血液を、２４−ウエル組織培養皿の各ウエルに入れた。１μｇ／ｍｌの濃度の各サンプルを各ウエルに添加した。混合物の場合、その画分を１：１の比で混合し、最終調製品を作り、それを１．０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。その細胞をその後３７℃で時々振りながら３時間培養した。１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を、各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、その酸素含有量を高感度オキシグラフ計器の助力でモニターした。
【実施例１１】
【００９８】
５００μｌの半分希釈されたヒト末梢血液を、１０μｇ／ｍｌの各抽出物と共に３７℃で時々振りながら３時間培養した。その後、１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を、各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量を１ｍｌのＰＢＳ＋５００μｌの水を添加して２ｍｌまでにし、細胞を溶解させた。細胞溶解物の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【実施例１２】
【００９９】
方法：５００μｌの半分希釈されたヒト末梢血液を、１μｇ／ｍｌの各画分と共に３７℃で時々振りながら３時間培養した。混合物の場合、その画分は１：１比で混合して、最終調製品を作り、それを１．０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。その後１０μｌ／ｍｌのアラキドン酸溶液（アルゴン雰囲気下で−２０℃で保管されていた１２．２ｍｇ／ｍｌの無水アルコール）を各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞懸濁液の容量を１ｍｌのＰＢＳ＋５００μｌの水を添加して２ｍｌまでにし、細胞を溶解させた。細胞溶解物の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【実施例１３】
【０１００】
ヘパリン化ヒト末梢血を２％ゼラチンのＰＢＳ溶液の等容量と混合し、３０分間の間放置すると、ＲＢＣが底に沈殿した。好中球強化単核細胞を含む上層を遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳ中に懸濁させた。５００μｌのこの細胞懸濁液（３×１０6細胞／ウエル）を１０μｇ／ｍｌの各サンプルと共に３７℃で３時間の間、培養した。その後、アラキドン酸溶液１０μｌ／ｍｌ（１２．２ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、細胞懸濁液の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【０１０１】
従って、オオバゲッキツ及びキンマの抽出物を、呼吸問題の軽減、治療及び治癒に関連して、生物活性についてスクリーニングし、処理した抽出物を、薄層クロマトグラフィー及びＨＴＰＬＣで分析した。混合された抽出物を適当な溶媒に溶解させ、完全に懸濁させ、試験システム（生体外全ヒト血）で用いて、規定された生体応答を確立した。
【実施例１４】
【０１０２】
方法
ヘパリン化ヒト末梢血を２％ゼラチンのＰＢＳ溶液の等容量と混合し、３０分間の間放置すると、ＲＢＣが底に沈殿した。好中球強化単核細胞を含む上層を遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳ中に懸濁させた。５００μｌのこの細胞懸濁液（３×１０6細胞／ウエル）を１μｇ／ｍｌの各サンプルと共に３７℃で３時間の間、培養した。混合物の場合、その画分を１：１の比で混合し、最終調製品を作り、それを１．０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。その後、アラキドン酸溶液１０μｌ／ｍｌ（１２．２ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに５分間の間添加し、その後２０μｇ／ｍｌの濃度でカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を添加し、さらに１０分間培養を続けた。細胞の容量をＰＢＳで２ｍｌまでにし、細胞懸濁液の酸素含有量を高感度オキシグラフ計器でモニターした。
【０１０３】
従って、オオバゲッキツ及びキンマの全ての植物部分の抽出物からの生理活性画分を、喘息性容態の軽減、治療及び治癒に関連して、生物活性についてスクリーニングし、このように処理した画分を、薄層クロマトグラフィー及びＨＰＬＣ、ＮＭＲスペクトルで分析し、適当な溶媒に溶解させ、完全に懸濁させ、試験システム（生体外全ヒト血）で用いて、規定された生体応答を確立した。
【実施例１５】
【０１０４】
細胞内インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）のフローサイトメトリーによる調製品
ヘパリン化全血液（２４ウエルプレートの０．１ｍｌ／ウエル、正常な個人から収集）を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清と植物凝集素（ＰＨＡ、１０μｇ／ｍｌ）とを含む１．０ｍｌのローズウエル・パーク・メモリアル・インスティテュート（Rosewell Park Memorial Institute）（ＲＰＭＩ）培地の全容量中、３７℃で５％ＣＯ2中、６時間の間、キンマ及びオオバゲッキツ葉抽出物（各１．０ｍｇ／ｍｌ）を単独又は組み合わせて、存在下又は不在下に、培養した。新たに合成されたたんぱく質の細胞内蓄積を生じさせるため、ブレフェルジン（brefeldin）A（１０μｇ／ｍｌ）を少なくとも４時間の間、細胞に添加した。培養期間の終点で、その細胞をＲＢＣを溶解させるため、ＦＡＣＳ（登録商標）溶解溶液（米国、ベクトン・ディキンソン社（Becton Dickinson））で処理した。細胞をその後洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間の間処理して浸透化した。洗浄緩衝液（１％アルブミン、０．１％サポニン及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）で洗浄した後、浸透化細胞を、ＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮγモノクローナル抗体又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４モノクローナル抗体のいずれかで２０分間の間、室温、暗所で処理した。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、その後、プログラム細胞探求でファックスキャリバー（ＦＡＣＳ Calibur）(米国、ベクトン・ディキンソン社)を用いる単一色フローサイトメトリー分析のため、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。１０，０００の細胞を各サンプルについて収集し、その蛍光強度を対数目盛で測定した。細胞内ＩＦＮγ又はＩＬ−４のみが検出されることを確実にするため、浸透化前に細胞をＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮγ又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４抗体で染色し、各染色に、０．２％より少ない蛍光性の細胞を与えた。無関係なアイソタイプ対応コントロール抗体も、ほんの０．１％より少ない蛍光性細胞を生じた。
【０１０５】
オオバゲッキツ及びキンマから得られた抽出物の存在下又は不在下で、植物凝集素と共に培養した後、生体外ヒト単核細胞細胞中におけるフローサイトメトリーでの細胞内ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−４の測定。我々のデータは、キンマからの抽出物がＩＦＮ−ガンマ陽性細胞を増加させ、ＩＬ−４陽性細胞を著しく減少させたことを示した。オオバゲッキツ抽出物は、ＩＬ−４陽性をＩＦＮ−ガンマ陽性細胞と同様、減少させた。これら２つの抽出物の組み合わせは、ＩＦＮ−ガンマ陽性細胞をコントロールレベルまで増加させ、さらにＩＬ−４陽性のレベルを減少させたままに維持する。
【実施例１６】
【０１０６】
オオバゲッキツ抽出物（８．０１ｇ）の一部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、生物的に活性な画分の中から画分を単離した。これらは画分ＭＫ０３（７０ｍｇ）、ＭＫ０４（２７０ｍｇ）及びＭＫ０５（１１０ｍｇ）と命名された。
【実施例１７】
【０１０７】
ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５、ＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃの物理化学的特性付け
画分ＭＫ０３：
１． 乾燥固体、融点９８〜１００℃、ＤＭＳＯに可溶性；
２． 薄層クロマトグラフィーによれば、溶媒系の一つ−クロロホルム及びメタノール（１９：１）において、Ｒｆ ０．４８を有する単一スポットを示し；
３． ＨＰＬＣ分析によれば、インターセルＯＤＳ−３（４．６ｘ２５０ｍｍ）分析カラムおよび溶媒系メタノールを用いて、０．５ｍｌ／分の流速で、検出を２１０ｎｍで行って、保持時間８．５分の単一ピークを示し、
ＨＰＬＣ：カラムＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）流速−０．５ｍｌ／分；２１０ｎｍでのピーク；保持時間−３．５分；溶媒系−メタノール；
【０１０８】
4. 13CNMR, ppm (125 MH2, CDCl3):153.34, 153.29, 148.94, 140.73, 134.78, 131.58, 128.61, 124.22, 120.36, 119.97, 118.23, 118.02, 117.39, 116.63, 108.36, 104,39, 97.16, 78.03, 40.68, 25.67, 25.60, 22.70, 17.53 及び 15.97 ;
５． 画分「ＭＫ０３」は、純粋なアルカロイドのようであった。
【０１０９】
画分ＭＫ０４：
１． ジメチルスルホキシドに可溶性な暗色粘着性物質；
２． 生理活性物質のＴＬＣによれば、クロロホルム及びメタノール（１９：１）の溶媒系においてＲｆ０．３８の単一スポットを示し；
３． インターシルＯＤＳ−３分析カラム、溶媒系メタノール及び流速１．０ｍｌ／分、２５４ｎｍでの検出を用いる生理活性物質のＨＰＬＣ分析によれば、保持時間５：６９分の１つのピークが示され；
４． NMR (300MH2, CDCl3) δ 0.94, 1.30, 1.60, 2.04-2.10, 2.27-2.34, 2.78-2.82, 3.53-3.81, 3.85-3.92, 4.00, 4.24-4.26, 及び 5.26-5. 41；
５． 画分ＭＫ０４は、糖脂質である。
【０１１０】
画分ＭＫ０５：
１． 暗色固体、ＤＭＳＯおよび水に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．６６の単一スポットが示され；
３． この画分の溶媒系メタノール−水（１：９）、流速０．５ｍｌ／分および２１７ｎｍで検出するＨＰＬＣ分析によれば、保持時間２１分のピークが示され；
４． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 175.82, 169.22, 159.00, 147.63, 147.02, 144.76, 135.72, 131.28, 131.10, 129.90, 129.63, 129.20, 128. 20, 127.59, 123.30, 116.81, 116.39, 115.80, 114.79, 81.77, 76.26, 76.15, 74.20, 73.79, 73.64, 73.49, 72.84, 72.16, 71.34, 70.29, 69.89, 68.83, 67.96, 63.71, 63.14, 58.22, 56.62, 56.19, 54.47, 54.42, 54.37, 41.90, 36.87 及び 20.93 ；
５． 画分ＭＫ０５は、糖が結合した芳香族化合物のようである。
【０１１１】
画分ＪＢ０１Ａ：
１． 白色固形物質及びＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．０７の単一スポットが示され；
３． ＨＰＬＣによれば、溶媒系 水−メタノール（９：１）、流速０．５ｍｌ／分、２１７ｎｍでの検出およびインターシルＯＤＳ−３分析カラムで、保持時間８．４分（ＪＢ０１Ａ，ピーク−１）のピークを示し；
４． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2Ｏ): 109.71, 108.417, 107.94, 104.17, 100.27, 84.38, 81.79, 81.53, 80.74, 77.03, 75.58, 73.85, 73.42, 71.71, 71.27, 70.74, 70.38, 69.12, 61.71, 61.00 及び 60.54 ;
５．画分ＪＢ０１Ａは、オリゴ糖である。
【０１１２】
画分ＪＢ０１Ｂ：
１． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．２７の単一スポットが示され；
３． ＨＰＬＣによれば、前記と同じカラム条件下で、保持時間８．８分（ＪＢ０１Ｂ，ピーク−２）のピークを示し；
４． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 169.48, 104.30, 98.86, 98.55, 92.60, 81.82, 76.98, 76.07, 74.57, 73.52, 73.23, 71.78, 71.46, 70.02, 69.84, 69.74, 69.30, 68.92, 68.77, 67.01, 66.43, 62.95, 62.02, 61.61, 48.67, 44.62, 38.88 ；
５． 画分ＪＢ０１Ｂは、オリゴ糖誘導体。
【０１１３】
画分ＪＢ０１Ｃ：
１． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
２． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．３４の単一スポットが示され；
３． ＨＰＬＣによれば、前記と同じ条件下で、保持時間９．８分（ＪＢ０１Ｃ，ピーク−３）の単一ピークが示され；
４． NMR (300 MH2, D2O). 2.34. 3.27, 3.28, 3.44-3.47, 3.51, 3.60-3.63, 3.68, 3.92-3.99, 4.08, 4.92 及び 5.36 ；
５． 画分ＪＢ０１Ｃは、オリゴ糖である。
【実施例１８】
【０１１４】
フローサイトメトリーによる細胞内インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）を分析するための試験の説明
方法：ヘパリン化全血液（２４ウエルプレートの０．１ｍｌ／ウエル、正常な個人から収集）を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清と、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）と、イノミシン（inomycin）又はＬＰＳとを含む１．０ｍｌのローズウエル・パーク・メモリアル・インスティテュート（ＲＰＭＩ）培地の全容量中、３７℃で５％ＣＯ2中、６時間の間、キンマ及びオオバゲッキツの全ての植物部分からの画分（各５０．０μｇ／ｍｌ）を単独又は組み合わせて、存在下又は不在下に、培養した。新たに合成されたたんぱく質の細胞内蓄積を生じさせるため、ブレフェルジンA（１０μｇ／ｍｌ）を少なくとも４時間の間、細胞に添加した。培養期間の終点で、その細胞をＲＢＣを溶解させるため、ＦＡＣＳ（登録商標）溶解溶液（米国、ベクトン・ディキンソン社）で処理した。細胞をその後洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間の間処理して浸透化した。洗浄緩衝液（１％アルブミン、０．１％サポニン及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）で洗浄した後、浸透化細胞を、ＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４モノクローナル抗体のいずれかで２０分間の間、室温、暗所で処理した。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、その後、プログラム細胞探求でファックスキャリバー （米国、ベクトン・ディキンソン社）を用いる単一色フローサイトメトリー分析のため、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。１０，０００の細胞を各サンプルについて収集し、その蛍光強度を対数目盛で測定した。細胞内ＩＦＮγ又はＩＬ−４のみが検出されることを確実にするため、浸透化前に細胞をＦＩＴＣ−ラベルされた抗ＩＦＮγ又はＰＥ−ラベルされた抗ＩＬ−４抗体で染色し、各染色に、０．２％より少ない蛍光性の細胞を与えた。無関係なアイソタイプ対応コントロール抗体も、ほんの０．１％より少ない蛍光性細胞を生じた。
【０１１５】
実施例９の結果
画分 Ｏ2摂取の阻害％
なし ――
ＭＫ０Ｃ ８１．１
ＪＢ０１ ３
ＭＫ０Ｃ＋ＪＢ０１ ７７．７３
【０１１６】
実施例１１の結果
画分 Ｏ2摂取の阻害％
なし ――
ＭＫ０Ｃ ８９．６２
ＪＢ０１ ５．４２
ＭＫ０Ｃ＋ＪＢ０１ ８３．２０
【０１１７】
実施例１３の結果
画分 Ｏ2摂取の阻害％
なし ――
ＭＫ０Ｃ ８８．７６
ＪＢ０１ ４．５８
ＭＫ０Ｃ＋ＪＢ０１ ８５．９４
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
呼吸性障害の治療のための、オオバゲッキツ樹皮及びキンマ葉抽出物の組み合わせにより開発された調製品の治療的評価の結果
【０１２０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、オオバゲッキツから得られた生理活性画分（ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５）及びキンマから得られた生理活性画分（ＪＢ０１Ｃ）の存在下又は不在下に、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）及びカルシウムイオノフォア（ionomycin）と共に培養した後、生体外ヒト単核細胞における細胞内ＩＦＮ−ガンマのフローサイトメトリー測定について説明する。我々のデータは、生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５及びＪＢ０１Ｃが、ＩＦＮ−ガンマ産生を増強したことを示した。
【図２】図２は、画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５及びＪＢ０１Ｃの存在下又は不在下に、ＬＰＳと共に培養した後、生体外ヒト好中球における細胞内ＩＬ−４のフローサイトメトリー測定について説明する。我々のデータは、キンマの画分ＪＢ０１ＣがＩＬ−４産生細胞を著しく減少させたことを示した。一方、オオバゲッキツの画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５は、ＩＬ−４産生の阻害に関して、僅かな効果を示したのみであった。興味あることに、オオバゲッキツの生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４、ＭＫ０５と、キンマの生理活性画分ＪＢ０１Ｃの組み合わせは、ＩＬ−４産生を徹底的に減少させた。
【図３】図３は、オオバゲッキツ及びキンマから得られた抽出物の存在下又は不在下に、植物凝集素と共に培養した後、生体外ヒト単核細胞における細胞内ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−４のフローサイトメトリー測定について説明する。我々のデータは、キンマからの抽出物がＩＦＮ−ガンマ陽性細胞を増加させ、ＩＬ−４陽性細胞を著しく減少させることを示した。オオバゲッキツ抽出物は、ＩＬ−４陽性をＩＦＮ−ガンマ陽性細胞と同様、減少させた。これら２つの抽出物の組み合わせは、ＩＦＮ−ガンマ陽性細胞をコントロールレベルまで増加させ、さらにＩＬ−４活性のレベルを減少させたままに維持した。
Claims (36)
- ロイコトリエン阻害剤、ＩＬ４合成阻害剤及びＴｈ１型免疫調節剤として有用な医薬組成物であって、キンマ（Piper betle）（ＰＢ）及びオオバゲッキツ（Murrya koenigii）（Ｍ．ｋ）の葉若しくは他の植物部分のいずれかから得られた凍結乾燥された水性若しくはアルコール性抽出物か、又はこれらの抽出物由来の生理活性画分の効果的な量と、任意に１以上の医薬的に許容される成分とを含む医薬組成物。
- 植物オオバゲッキツ（Ｍ．Ｋ）の生理活性画分が、ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と呼ばれている請求項１に記載の医薬組成物。
- 植物キンマ（ＰＢ）の生理活性画分が、ＪＢ０１Ａ、ＪＢ０１Ｂ及びＪＢ０１Ｃと呼ばれている請求項１に記載の医薬組成物。
- 用いられた前記植物部分が、葉、茎、樹皮、果実、種子および他のいずれかの植物部分から選択される請求項１に記載の組成物。
- 用いられた前記医薬的成分が、たんぱく質、炭水化物、ショ糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン−ゼラチンペーストのような栄養素及び／又は担体、賦形剤、希釈剤若しくは溶剤から選択される請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、吸入、経口、静脈内、筋肉内、皮下経路又は他の適当な経路のいずれかにより投与される請求項１に記載の組成物。
- 前記経口経路が、カプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤又は顆粒剤の形態である請求項１に記載の組成物。
- 静脈内経路で投与される量が、経口経路より少ない請求項１に記載の組成物。
- Ｍ．ｋ抽出物の割合が、キンマ（ＰＢ）抽出物の量と同一またはより大きい請求項１に記載の組成物。
- Ｍ．ｋ抽出物に対するキンマ（ＰＢ）抽出物の比が、１：１〜１：５の範囲である請求項１に記載の組成物。
- 少なくとも４週間の間、少なくとも１日１回、１〜２０ｍｇ／体重ｋｇの投与量レベルで投与される請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及び／又はＭＫ０５を含む請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、生理活性画分ＪＢ０１Ｃ、ＭＫ０３、ＭＫ０４及び／又はＭＫ０５を含む請求項１に記載の組成物。
- 静脈内経路により投与された生理活性画分の量が、経口経路により投与された量より少ない請求項１に記載の組成物。
- Ｍ．ｋからの生理活性画分の割合が、（ＰＢ）キンマの生理活性画分と同一またはより大きい請求項１に記載の組成物。
- Ｍ．ｋ抽出物から得られた生理活性画分に対するキンマ（ＰＢ）抽出物から得られた生理活性画分の割合が、１：１〜１：５の範囲である請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも４週間の間、少なくとも１日１回、呼吸状態に応じて、０．５〜１０．０ｍｇ／体重ｋｇの投与量レベルで投与される請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも４週間の間、３ヶ月までの期間、投与される請求項１に記載の組成物。
- ５リポオキシゲナーゼ活性を遮断するための、オオバゲッキツの葉及び他の植物部分から得られた生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５の組み合わせが、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こし、Ｔｈ１型免疫調節剤としての請求項１に記載の組成物。
- ５リポオキシゲナーゼ活性を遮断するための、オオバゲッキツ（Ｍ．ｋ）の葉及び他の植物部分から得られた生理活性画分ＭＫ０３、ＭＫ０４及びＭＫ０５と、キンマの葉及び他の植物部分から得られた生理活性画分ＪＢ０１Ｃとの組み合わせが、ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こし、ガンマ インターフェロン放出の増強のためになる請求項１に記載の組成物。
- 気管支呼吸容態の治療に用いられる請求項１に記載の組成物。
- 哺乳類及び動物を治療するために用いられる請求項１に記載の組成物。
- Ｔｈ２応答からＴｈ１応答へシフトさせるのに用いられる請求項１に記載の組成物。
- 全血液の好中球強化構成要素において、５−リポオキシゲナーゼ媒介アラキドン酸酸化を阻害するのに用いられる請求項１に記載の組成物。
- 生体外ヒト全血液において、ＩＦＮ−ガンマを増強させ、ＩＬ−４応答を軽減させるために用いられる請求項１に記載の組成物。
- 生体外ヒト全血液単核細胞（ＰＭＮ）におけるＩＦＮ−ガンマ応答の増強に用いられる請求項１に記載の組成物。
- ヒト末梢全血液の単核細胞におけるＩＬ−４の応答を軽減させるのに用いられる請求項１に記載の組成物。
- ＭＫ０３と名づけられた前記生理活性画分が、
オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、
ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性を遮断するためであり、
以下の物理化学的特性：
ａ． 乾燥固体、融点９８〜１００℃、ＤＭＳＯに可溶性；
ｂ． 薄層クロマトグラフィーによれば、溶媒系の一つ−クロロホルム及びメタノール（１９：１）において、Ｒｆ０．４８を有する単一スポットを示し；
ｃ． ＨＰＬＣ分析によれば、インターセルＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）分析カラムおよび溶媒系メタノールを用いて、０．５ｍｌ／分の流速で、検出を２１０ｎｍで行って、保持時間８．５分の単一ピークを示し、
ＨＰＬＣ：カラムＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）流速−０．５ｍｌ／分；
２１０ｎｍでのピーク；保持時間−３．５分；溶媒系−メタノール、
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, CDCl3):153.34, 153.29, 148.94, 140.73, 134.78, 131.58, 128.61, 124.22, 120.36, 119.97, 118.23, 118.02, 117.39, 116.63, 108.36, 104,39, 97.16, 78.03, 40.68, 25.67, 25.60, 22.70, 17.53 及び 15.97 ;並びに
ｅ． 画分「ＭＫ０３」は、純粋な含窒化合物のようであった、
を有する請求項１に記載の組成物。 - ＭＫ０４と名づけられた生理活性画分が、
オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、
ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性を遮断するためであり、
以下の物理化学的特性：
ａ． ジメチルスルホキシドに可溶性な暗色粘着性物質；
ｂ． 生理活性物質のＴＬＣによれば、クロロホルム及びメタノール（１９：１）の溶媒系においてＲｆ０．３８の単一スポットを示し；
ｃ． インターシルＯＤＳ−３分析カラム、溶媒系メタノール及び流速１．０ｍｌ／分、２５４ｎｍでの検出を用いる生理活性物質のＨＰＬＣ分析によれば、保持時間５：６９分の１つのピークが示され；
ｄ． NMR (300MH2, CDCl3) δ 0.94, 1.30, 1.60, 2.04-2.10, 2.27-2.34, 2.78-2.82, 3.53-3.81, 3.85-3.92, 4.00, 4.24-4.26, 及び 5.26-5. 41;並びに
ｅ． 画分ＭＫ０４は、糖脂質である、
を有する請求項１に記載の組成物。 - ＭＫ０５と名づけられた生理活性画分が、
オオバゲッキツの葉および他の植物部分から得られ、
ロイコトリエン合成の阻害、インターロイキン−４産生の抑制を引き起こす５リポオキシゲナーゼ活性を遮断するためであり、
以下の物理化学的特性：
ａ． 暗色固体、ＤＭＳＯおよび水に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．６６の単一スポットが示され；
ｃ． この画分の溶媒系メタノール−水（１：９）、流速０．５ｍｌ／分および２１７ｎｍで検出するＨＰＬＣ分析によれば、保持時間２１分のピークが示され；
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 175.82, 169.22, 159.00, 147.63, 147.02, 144.76, 135.72, 131.28, 131.10, 129.90, 129.63, 129.20, 128.20, 127.59, 123.30, 116.81, 116.39, 115.80, 114.79, 81.77, 76.26, 76.15, 74.20, 73.79, 73.64, 73.49, 72.84, 72.16, 71.34, 70.29, 69.89, 68.83, 67.96, 63.71, 63.14, 58.22, 56.62, 56.19, 54.47, 54.42, 54.37, 41.90, 36.87 及び 20.93 ；並びに
ｅ． 画分ＭＫ０５は、糖が結合した芳香族化合物のようである、
を有する請求項１に記載の組成物。 - ＪＢ０１Ａと名づけられた生理活性画分が、
キンマの葉及び他の植物部分から得られ、
ガンマ インターフェロン放出の増強のためである、
以下の物理化学的特性：
ａ． 白色固形物質並びにＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．０７の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、溶媒系 水−メタノール（１：９）、流速０．５ｍｌ／分、２１７ｎｍでの検出およびインターシルＯＤＳ−３分析カラムで、保持時間８．４分（ＪＢ０１Ａ，ピーク−１）のピークを示し；
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 109.71, 108.417, 107.94, 104.17, 100.27, 84.38, 81.79, 81.53, 80.74, 77.03, 75.58, 73.85, 73.42, 71.71, 71.27, 70.74, 70.38, 69.12, 61.71, 61.00 及び 60.54 ;並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ａは、オリゴ糖である、
を有する請求項１に記載の組成物。 - ＪＢ０１Ｂと名づけられた生理活性画分が、
キンマの葉及び他の植物部分から得られ、
ガンマ インターフェロン放出の増強のためである、
以下の物理化学的特性：
ａ． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．２７の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、前記と同じカラム条件下で、保持時間８．８分（ＪＢ０１Ｂ，ピーク−２）のピークを示し；
ｄ． 13CNMR, ppm (125 MH2, D2O): 169.48, 104.30, 98.86, 98.55, 92.60, 81.82, 76.98, 76.07, 74.57, 73.52, 73.23, 71.78, 71.46, 70.02, 69.84, 69.74, 69.30, 68.92, 68.77, 67.01, 66.43, 62.95, 62.02, 61.61, 48.67, 44.62, 38.88 ;並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ｂは、オリゴ糖誘導体、
を有する請求項１に記載の組成物。 - ＪＢ０１Ｃと名づけられた生理活性画分が、
キンマの葉及び他の植物部分から得られ、
ガンマ インターフェロン 放出の増強のためである、
以下の物理化学的特性：
ａ． 白色固体、ＤＭＳＯおよび水の両方に可溶性；
ｂ． ＴＬＣによれば、溶媒系ｎ−ブタノール−酢酸−水（９：５：７）においてＲｆ０．３４の単一スポットが示され；
ｃ． ＨＰＬＣによれば、前記と同じ条件下で、保持時間９．８分（ＪＢ０１Ｃ，ピーク−３）の単一ピークが示され；
ｄ． NMR (300 MH2, D2O). 2.34. 3.27, 3.28, 3.44-3.47, 3.51, 3.60-3.63, 3.68, 3.92-3.99, 4.08, 4.92 及び 5.36 ；並びに
ｅ． 画分ＪＢ０１Ｃは、オリゴ糖である、
を有する請求項１に記載の組成物。 - 気管支呼吸容態の患者を治療する方法であって、効果的な量の請求項１に記載の組成物を前記患者に投与することを含む方法。
- 前記組成物が、経口、静脈内、筋肉内、吸入又は皮下経路により投与される請求項３７に記載の方法。
- 前記経口経路が、カプセル剤、シロップ剤、濃縮物、散剤又は顆粒剤の形態である請求項３７に記載の方法。
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