PL124349B1

PL124349B1 - Process for preparing maytansinol

Info

Publication number: PL124349B1
Application number: PL1977221358A
Authority: PL
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-15
Publication date: 1983-01-31
Also published as: SE8302517D0; NL188102B; DE2746209C2; CA1107212A; IT7821818A0; PT67854B; NL7711274A; SE446004B; PL201541A1; SE442873B; DK458877A; IT1094308B; IE46064L; DE2746209A1; SE8302517L; PL122289B1; HU178359B; GB1586688A; YU245377A; IE46064B1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia maytansinolu stanowiacego antybiotyk C— —15003—PO o wzorze 1.Znany z Journal of the America Chemical So- ciety tom 97, 5294—5295 (1975) sposób wytwarza¬ nia maytansinolu polega na traktowaniu maytan- butiny, czyli zwiazku o wzorze ogólnym 2, w któ¬ rym R oznacza grupe o wzorze —O—CO—CH/ /CH3/—N/CH3/—CO—CH/CH3/2, wodorkiem litowo- glinowym w suchym czterowodorofuranie, w tem¬ peraturze —23°C w ciagu 3 godzin. Wydajnosc reakcji wynosi 40%.Sposób ten ma wiec wady polegajace na dosc niskiej wydajnosci, koniecznosci prowadzenia reak¬ cji w znacznie obnizonej temperaturze a ponadto na malej dostepnosci zwiazku wyjsciowego. May- tanbutine otrzymuje sie przez ekstrakcje Putter- lickia verrucosa alkoholem, co opisano równiez we wspomnianym artykule. Wydajnosc ekstrakcji may- tanbutiny jest bardzo niska i w najlepszym przy¬ padku wynosi tylko 4,5 mg/kg surowca. Surowiec ten, czyli roslina znana jako Putterlickia verrucosa wymaga dluzszego czasu najpierw na wzrost a na¬ stepnie na obróbke, która doprowadza do otrzy¬ mania substancji nadajacej sie do ekstrakcji, taka jak rozdrabnianie, suszenie i spulchnianie.Wspomniane wady powoduja, ze znany sposób wytwarzania maytansinolu z- maytanbutiny otrzy¬ manej przez ekstrakcje nie nadaje sie do stosowa¬ nia w przemysle. 10 15 20 30 Sposobem wedlug wynalazku zwiazek o wzorze 1, czyli antybiotyk C^15003—PO, wytwarza sie przez poddanie redukcyjnej hydrolizie antybiotyk C—'15003 o ogólnym wzorze 2, w którym R ozna¬ cza ugrupowanie o wzorze —CO—CH/CHj/a, —COCH2CH2—CH3 lub —CO—CH*—CH/CH3/2.Termin„antybiotyk C—-15003" oznacza wiec zwia¬ zek o ogólnym wzorze 2, w którym R oznacza jed¬ no, dwa lub trzy sposród wymienionych wyzej ugrupowan. Zwiazek, w którym R oznacza grupe —CO—CH/CH3/2 okresla sie nazwa „antybiotyk C—15003 P—3" lub w skrócie symbolem C^15003 P—3, zwiazek w którym R oznacza grupe —CO— —/CH2/2—CH3 okresla sie nazwa „antybiotyk C— —15003 P—3" lub w skrócie symbolem C—15003 P—3*, a zwiazek, w którym R oznacza grupe —CO—CHj-^CH/CH3/2 okresla sie nazwa „anty¬ biotyk C^15003 P—4" lub w skrócie symbolem C—115003 P—4. Zwiazek, w którym R oznacza atom wodoru, czyli zwiazek o wzorze i, okresla sie nazwa „antybiotyk C—15003—PO" lub w skrócie symbolem C—'15003 P—0.Sposób wedlug wynalazku rózni sie tym od zna¬ nego sposobu wytwarzania tego antybiotyku, ze stosuje sie nowy zwiazek wyjsciowy, który zosta¬ nie opisany dokladniej w dalszym ciagu opisu, dostepny bez ograniczen w wiekszej ilosci a po¬ nadto, ze przebiega ze znacznie wyzsza wydajno¬ scia i w nie tak surowych warunkach jak znany proces. 124349124 349 3 Antybiotyk C—15003 jest nowym produktem otrzymanym w procesie hodowli szczepu gatunku Nocardia, który wytwarza ten antybiotyk w brze¬ czce hodowlanej. Szczep gatunku Nocardia wy¬ odrebniono z gleby w wyniku przeprowadzenia badan skriningowych szeregu próbek róznych gleb i stwierdzenia, ze pewne mikroorganizmy nalezace do gatunku Nocardia wykazuja zdolnosc wytwa¬ rzania nowego antybiotyku, w procesie hodowli tych mikroorganizmów w odpowiednim srodowis¬ ku; Jako przyklad szczepu mikroorganizmu wytwa¬ rzajacego antybiotyk C^15003 mozna wymienic szczep actinomycete C—1$003, wyizolowany z gle¬ by i innych- materialów w ramach poszukiwan skriningowych mikroorganizmu wytwarzajacych ^antybiotyki, i ""TroerobiologicznaJ charakterystyke szczepu C—15003 okreslono sposobami analogicznymi do zaproponowanowanych przez Schirlinga i Gottieba (International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313—340 (1966)). Wyniki obserwacji prowadzo¬ nych w temperaturze 28°C w ciagu 21 dni sa na¬ stepujace: 1) Charakterystyka morfologiczna Grzybnia wegetatywna rozprzestrzenia sie do¬ brze i (rozwija w rozgalezienia, zarówno na agarze jak i w pozywce plynnej. Wiele sposród strzepków ma srednice 0,8 do 1,2 jun, a w pewnych przy¬ padkach moga one dzielic sie na fragmenty przy¬ pominajace bakterie paleczkowe lub na krótkie odgalezienia. Szczep daje dobre wzrosty na róz¬ nych pozywkach taksonomicznych, z grzybnia po¬ wietrzna nalozona na grzybnie wegetatywna, choc czesto przyjmuje postac tworów podobnych do ko- remii (50—200 X 200^1000 jun), na których naste¬ puje dalszy wzrost powietrzny. Grzybnia powietrz¬ na czesto jest falista, a czasami napotyka sie kon¬ figuracje proste lub w postaci luznej spirali.Mikroskopowe badania starszych hodowli wyka¬ zuja, ze jedynie w nielicznych przypadkach komór¬ ki koridalne wystepuja w lancuchach, natomiast zawiesiny komórkowe uzyskane z powierzchni ta¬ kich hodowli wykazuja w badaniach mikroskopo¬ wych wiele tworów w ksztalcie wydluzonej elipsoi¬ dy (0,8-^1,2 (im X 4,8—6,8 Jim) i elipsoidalnych (0,8-^1,2 i|im X 1,0—2,0 ^m), przypominajacych ar- trOspory Obserwacje pod mikroskopem elektronowym wy¬ kazuja, ze powierzchnia powyzszych tworów jest gladka. 2) Skladniki komórek Szczep hodowano na wstrzasarce, w zmodyfiko¬ wanej pozywce ISP nr 1, w temperaturze 28°C, w ciagu 66 do 90 godzin. Po zakonczeniu hodowli komórki zbierano i przemywano. Sposobem B. Bec¬ kera i innych (Applied Microbiology 12, 421 (1964)) i sposobem M. P. Lechebaliera (Journal of Labo- ratory and Clinical Medicins 71, 934 (1968)) cale komórki badano na obecnosc kwasu dwuaminopi- melinowego i udzial cukrów. Stwierdzono, ze kwas dwuaminopimelinowy jest w konfiguracji mezo i znaleziono plamy odpowiadajace galaktozie i ara- binozie. 5 3) Charakterystyka na pozywkach taksonomicz¬ nych Szczep wykazal stosunkowo dobry wzrost na róznych pozywkach, z grzybnia wegetatywna bez¬ barwna do jasnozóltej w poczatkowych fazach ho- 10 dowli i jasnozóltawobrazowa do zóltawobrazowej w fazach pózniejszych. W róznych pozywkach tak¬ sonomicznych szczep produkuje rozpuszczalne pig¬ menty, zólte do zóltawobrazowych. Grzybnia po¬ wietrzna jest proszkowata i zwykle daje umiarko- 15 wany wzrost, barwy bialej do zóltej lub jasnozól- tawobrazowej. Charakterystyke szczepu w róznych pozywkach taksonomicznych przedstawiono w ta¬ blicy 1. 30 Tablica 1 . Charakterystyka hodowlana szczepu C—15003 na pozywkach taksonomicznych A) Agar sacharozowo-azotanowy: Wzrost (G): bujny, barwa jasnozólta, melonowa 25 (3 ia) * do bursztynowej (3 lc) * tworza sie ciala podobne do koremii Grzybnia powietrzna (AM): skapa, barwy bialej Rozpuszczalny pigment (SP): brak lub jasnozólta- wobrazowy 30 B) Agar glicerynowo-azotanowy: G. umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca) *, tworza sie ciala podobne do koremii AM: umiarkowana, barwy bialej SP: brak 35 C) Agar glukozowo-asparaginowy: G: umiarkowany, barwa jasnej nogietki (3 pa) * do jasnozóltej (2 pa) * AM: skapa, barwy bialej SP: jasnozólty (2 pa) * 40 D) Agar glicerynowo-asparaginowy: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)*, tworza sie ciala podobne do koremii AM: skapa, barwy bialej SP: brak 45 E) Agar skrobiowy: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do pszenicznej (2 ca)*, tworza sie ciala podob¬ ne do koremii AM: obfita, barwy kosci sloniowej (2 ca)* 50 SP: brak F) Agar odzywczy: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca) * do zólcieni kolonialnej (2 ga) *, tworza sie ciala podobne do koremii 55 AM: skapa, barwy bialej SP: brak G) Agar z jablczanem wapnia: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do pszenicznej (2 ea) *, tworza sie ciala podobne 60 do koremii AM: umiarkowana, barwy bialej do kosci slonio¬ wej (2 ca)* SP: brak H) Agar z ekstraktem z drozdzy i z ekstraktem 85 slodowym:5 124 349 6 G: umiarkowany, barwy bursztynowej (3 lc) * do jasnozóltej (3 la)*, tworza sie ciala podobne do koremii I) Agar z maka owsiana: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do zólcieni kolonialnej (2 ga) *, tworza sie ciala podobne do koremii AM: skapa, barwy bialej do jasnozóltej SP: brak J) Agar z peptonem, ekstraktem z drozdzy i ze¬ lazem: G; umiarkowany, barwy zólcieni kolonialnej (2 ga) * AM: brak SP: zólcien kolonialna (2 ga) * K) Agar tyrozynowy: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do jasnozóltej melonowej (3 ea)*, tworza sie ciala podobne do koremii AM: umiarkowana, barwy bialej do kosci slonio¬ wej {2 ca) * SP: wielbladzi (3 ie)* Oznaczenie barw wedlug Color Harmony Manu¬ al, wydanie czwarte (Container Corporation of America, 1958) 4) Charakterystyka fizjologiczna Charakterystyke fizjologiczna szczepu przedsta¬ wiono w tablicy II.Zakres temperatury wzrostu: 12—38°C. Dobry wzrost powietrzny na agarze (ISP nr 2) wystepuje w zakresie temperatur 20—35°C.Tablica II Fizjologiczna charakterystyka szczepu C-15003 zakres temperatury dla wzrostu zakres temperatury dla wzrostu powietrznego uplynnianie zelatyny: hydroliza skrobi: redukcja azotanów: peptonizacja mleka: koagulacja mleka: rozklad kazeiny wytwarzanie pigmentów melanoi- dowych: rozklad tyrozyny: rozklad ksantyny: rozklad hipoksantyny: tolerancja na lizozym: tolerancja na chlorek sodu: 12—38°C 20—35°C dodatnie dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemne (agar z peptonem, ekstrak¬ tem z drozdzy i zelazem) dodatnie (agar ty¬ rozynowy) dodatni ujemny ujemny dodatnia 2% 5) Utylizacja zródel wegla Utylizacje róznych zródel wegla badano stosujac pozywke opisana przez Pridhama i Gottlieba (Jour¬ nal of Bacteriology 56, 107 (1948)) i pozywke pod¬ stawowa o tym samym skladzie + 0,lV© ekstraktu z drozdzy.Uzyskane wyniki przedstawione w tablicy III. 5 T a b 1 i c a III Utylizacja zródel wegla przez szczep nr C-15Ó03 Zródlo wegla D-ksyloza L-arabinoza D-glukoza D-galaktoza D-fruktoza L-ramnoza D-mannoza sacharoza rafinoza i-inozytol D-mannitol ] gliceryna skrobia rozpuszczalna laktoza maltoza trehaloza j ' kontrola j Wzrost . + ++* + + - \ + + + + + ¦ + + + + + + + + : + ¦++ + + + + + + ± -± — — ++ -M- — ± + -h ~ ± — + + + 1 * pozywka podstawowa + 0,1% ekstraktu z drozdzy Skala ocen: + + + wzrost obfity, + + wzrost 4o- bry, + wzrost, + wzrost slaby, — brak wzrostu 6) Dalsza charakterystyka Komórki zbierano sposobem opisanym w 2), a 35 DNA preparowano sposobem analogicznym do opi¬ sanego przez J. Marmura i innych (Journal of Mo- lecular Biology, 3„ 208, 1961). Zawartosc G—C (guanina-cytozyna) w DNA wynosi okolo 71 mol%.Wybarwianie Grama grzybni wegetatywnej szcze- 40 Pu 3est dodatnie.Powyzsza charakterystyke szczepu nr C-15003 po¬ równano z opisanymi w dzielach S. A. Waksmana „The Actinomycetes" tom 2 (The Williams and Wilkins Co., 1961) i R. E. Buchanana i N. E. Gib- 45 bonsa „Bergey^ Manual of Determinative. Bacterio- logy" wydanie ósme, 1974 oraz w innej literaturze.Chociaz sadzono, ze szczep C—(15003 nalezy do grupy III rodzaju Nocardia to z faktu, ze opisana charakterystyka nie odpowiada zadnemu ze zna- 50 nych szczepów wynika, ze szczep C—(15003 jest mikroorganizmem nowego gatunku.Szczep C^15003 zdeponowano w Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FEBM) z numerem 3992 i w In- 55 stitute for Fermentation, Osaka (IFO) z numerem IFO 13726 oraz w The American Type Culture Collection (ATCC), Meryland, USA, z numerem 31281.Jak wspomniano, szczep C—15003 jest nowym 60 gatunkiem rodzaju Nocardia. Jest on podatny, jak ogólnie mikroorganizmy, na zmiany i mutacje, spontaniczne lub nastepujace pod wplywem czyn¬ ników mutagennych.Przykladowo, wiele wariantów szczepu, uzyski- -65 walnych przez napromieniowanie promieniami rent-124 349 7 8 genowskimi, promieniami swiatlem nadfioletowym itp., izolacje pojedynczych komórek, hodowle w pozywkach zawierajacych rózne chemikalia lub innymi zabiegami mutagennymi, jak równiez spon¬ taniczne mutanty szczepu winny byc uwazane nie za inne gatunki mikroorganizmów lecz za szczep C—(15003, a zdolne do wtywarzania antybiotyków C-^15003- P-3, P-3' i/lub P-4 moga byc stosowane w sposobie wedlug wynalazku jako ten szczep.Przykladowo, poddajac szczep C—45003 róznym za¬ biegom mutagennym uzyskuje sie mutanty prawie nie majace zdolnosci wytwarzania rozpuszczalnych pigmentów, mutanty z grzybnia substratowa bez¬ barwna, zóltawozielona, czerwonawobrazowa lub pomaranczowo-czerwona, mutanty, których strzep¬ ki latwo rozdzielaja sie na elementy paleczkowe lub krótkie, rozgalezione fragmenty oraz mutanty z obfita grzybnia powietrzna barwy bialej lub nie wytwarzajace grzybni powietrznej.Jako pozywke do hodowli szczepu wytwarzaja¬ cego antybiotyk C—(15003 mozna stosowac jaka¬ kolwiek pozywke plynna lub stala, zawierajaca skladniki odzywcze utylizowane przez szczep. W ce¬ lu uzyskania wysokiej wydajnosci korzystnie jest stosowac pozywke plynna.Pozywka zawiera zródla wegla i azotu asymilo- wane i metabolizowane przez szczep, skladniki nie¬ organiczne, sladowe Skladniki odzywcze itp. Jako przyklady zródel wegla mozna wymienic glukoze, laktoze, sacharoze, maltoze, dekstryne, skrobie, gli¬ ceryne, mannit, sorbit, itp., tluszcze i oleje (np. olej sojowy, olej smakowy, olej kurzy, itp.) i inne.Zródlem azotu moze byc. np. ekstrakt miesny, su¬ szone drozdze, maka sojowa, namok kukurydziany, pepton, kazeina, maka z nasienia bawelny, odpa¬ dowa melasa, mocznik, sole amonowe (np. siarczan amonu, chlorek amonu, azotan amonu, octan amo¬ nu itp.) i inne.Pozywka moze ponadto zawierac sole sodu, po¬ tasu, wapnia, magnezu, zelaza, manganu, cynku, kobaltu, niklu itp., sole kwasu fosforowego, kwasu borowego itp. oraz sole kwasów organicznych, jak octany i propioniany. Do pozywki mozna równiez dodac róznych aminokwasów, jak np. kwas gluta¬ minowy, kwas asparaginowy, alanina, glicyna, li¬ zyna, metionina, prolina itp., peptydów, np. dwu- peptydów, trójpeptydów itp., witamin, np. B^ Ba, kwasu nikotynowego, Bu, C, E itp., kwasów nukle¬ inowych, np. puryny, pirymidyny i ich pochod¬ nych itp. W celu doprowadzenia pH do pozadanej wartosci mozna do pozywki dodac nieorganicznych lub organicznych kwasów, zasad, buforów itp.Jako czynniki przeciwdzialajace pienieniu mozna stosowac w pozywce odpowiednie ilosci olejów, tluszczów, srodków powierzchniowo czynnych itp.Hodowle mozna prowadzic stacjonarnie, na wstrzasarce, podpowierzchniowo aerobowo i w in¬ nych warunkach. W celu uzyskania wysokiej wy¬ dajnosci korzystnie jest oczywiscie prowadzic ho¬ dowle podpowierzchniowo aerobowo.Warunki hodowli sa oczywiscie zalezne od wlas¬ ciwosci fizycznych i skladu pozywki, szczepu, spo¬ sobu hodowli i innych czynników, jednak zwykle korzystnie jest prowadzic inkubacje w temperatu¬ rze 20 do 35°C, przy poczatkowej wartosci pH 7,0 lub zblizonej.Szczególnie pozadana jest temperatura od 23 do 30°C w przejsciowym etapie hodowli, z poczatko¬ wa wartoscia pH 6,5 do 7,5. Czas inkubacji rów¬ niez jest zmienny, w zaleznosci od wyzej wymie¬ nionych czynników. Zaleca sie prowadzic inkuba¬ cje do uzyskania maksymalnej wartosci miana po¬ zadanego antybiotyku. W przypadku hodowli na wstrzasarce lub podpowierzchniowej hodowli aero- bowej, czas inkubacji wynosi zwykle od okolo 48 do 144 godzin.Aktywnosc antybiotyku oznacza sie stosujac jako organizm testowy Tetrahymena pyriformis. W. Po¬ wyzszy organizm hoduje sie na pozywce testowej (20 g proteozy-peptonu (Difco), 1 g ekstraktu z drozdzy (Difco), 2 g glukozy, 1000 ml wody desty¬ lowanej i 10 ml 1 M buforu fosforanowego (pH 7,0) w temperaturze 28°C, w ciagu 44 do 48 godzin, a aktywnosc antybiotyku oznacza metoda seryj¬ nych rozcienczen, mierzac metnosc hodowli oraz technika chromatografii cienkowarstwowej (TLC), co zostanie opisane dalej.Nowy antybiotyk C—15003 P-3, P-3' i/lub P-4 jest wytwarzany i akumuluje sie w brzeczce ho¬ dowlanej zarówno pozakomórkowo jak i wewnatrz- komórkowo.Powyzsze substancje wykrywa sie równiez chro¬ matografia cienkowarstwowa. Przez saczenie lub wirowanie brzeczke fermentacyjna rozdziela sie na komórki i ciecz, a ciecz ekstrahuje w stosunku 1 :1 octanem etylu. Komórki zalewa sie w stosun¬ ku 1 :1 70*/o wodnym acetonem, miesza sie w cia¬ gu godziny w temperaturze 20°C i odsacza zawie¬ sine. Z przesaczu odpedza sie aceton, a otrzymany roztwór wodny ekstrahuje octanem etylu.Kazdy z ekstraktów zateza sie do 1/100 objetosci poczatkowej i poddaje chromatografii cienkowar¬ stwowej na plytkach z zelem krzemionkowym (Merck, RFN, Kieselgal 60 F254, warstwa grubosci 0,25 mm, wymiary plyty 20X20, uklad rozpusz¬ czalników chloroform-metanol 9 :1). Aktywnosc okresla sie na podstawie intensywnosci plam wy¬ krywanych przez napromieniowanie swiatlem nad¬ fioletowym 2537 A.Poniewaz C^15003 P-3, P-3' i/lub P-4, wytwo¬ rzone w ten sposób w brzeczce fermentacyjnej sa zwiazkami lipofilowymi i obojetnymi, mozna je dogodnie odzyskac metodami wyodrebniania i oczy¬ szczania zwykle stosowanymi do odzyskiwania ta¬ kich metabolików. Przykladowo, mozna zastoso¬ wac sposoby czyniace uzytek z róznicy rozpusz¬ czalnosci antybiotyku i zanieczyszczen, frakcjono¬ wanie wykorzystujace róznice w powinowactwie adsorpcyjnym na róznych adsorbentach, jak wegiel aktywny, makroporowate zywice niejonowe, zel krzemionkowy, tlenek glinu itp., usuwanie zanie¬ czyszczen za pomoca zywic jonitowych itp*, od¬ dzielnie lub w odpowiedniej kombinacji lub po¬ wtórzeniach.Poniewaz, jak wspomniano, C—15003 P-3, P-3' i P-4 wystepuja zarówno w plynie jak i w komór¬ kach, antybiotyk wyodrebnia sie i oczyszcza za pomoca adsorbentu, jezeli takowy jest stosowany, badz to bezposrednio badz tez po ekstrakcji roz- 10 15 20 25 30 35 40 50 55 609 124 349 10 puszczalnikiem w przypadku plynu lub po eks¬ trakcji rozpuszczalnikiem w przypadku komórek.Ekstrakcje rozpuszczalnikiem mozna przeprowa¬ dzic np. (1) z brzeczki hodowlanej przed oddziele¬ niem komórek (2) z komórek i plynu uzyskanego przez saczenie, wirowanie lub innymi sposobami.Niezalezna ekstrakcje plynu i komórek mozna ko¬ rzystnie przeprowadzic nizej opisanym sposobem.Rozpuszczalnikami odpowiednimi do ekstrakcji plynu sa nie mieszajace sie z woda rozpuszczalniki organiczne, jak estry kwasów tluszczowych, np. octan etylu i octan amylu, alkohole, -np. butanol, chlorowcowane weglowodory, np. chloroform i ke¬ tony, np. keton metyloizobutylowy.Ekstrakcje przeprowadza sie przy odczynie bli¬ skim obojetnemu, korzystnie plyn hodowlany do¬ prowadzony do pH 7 ekstrahuje sie octanem ety¬ lu. Ekstrakt przemywa sie woda i zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentratu dodaje sie niepolarnego rozpuszczalnika, jak eter naftowy lub heksan, uzyskujac surowy produkt I, zawiera¬ jacy zwiazek czynny. Poniewaz w chromatografii cienkowarstwowej wykrywa sie szereg plam ppza odpowiadajacymi antybiotykowi C—15003, produkt 1 poddaje sie oczyszczaniu. Uzyteczne sa rutyno¬ we procedury, zwlaszcza chromatografia adsorp- cyjna na takich, zwykle stosowanych adsorbentach, jak zel krzemionkowy, makropórowate niejonowe zywice adsorpcyjne itp.Najkorzystniejszym adsorbentem do oczyszczania surowego produktu I jest zel krzemionkowy. Chro- matogram mozna rozwijac poczatkowo eterem naf¬ towym i heksanem, a elucje antybiotyku C—U5003 prowadzic dodajac rozpuszczalnika polarnego, jak octan etylu, aceton, etanol, lub metanol. W typo¬ wym procesie z zastosowaniem jako nosnika zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm) chro¬ matografie kolumnowa prowadzi sie mieszanina heksanu z octanem etylu o wzrastajacym stezeniu drugiego skladnika. Eluat zbiera sie i bada chro¬ matografia cienkowarstwowa, a frakcje zawiera¬ jace C—15003 laczy i zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentratu dodaje sie eteru naf¬ towego lub heksanu, uzyskujac surowy produkt II.Poniewaz produkt ten nadal zawiera zanieczysz¬ czenia, oczyszcza sie go dalej, np. na drugiej ko¬ lumnie z zelem krzemionkowym, stosujac inny uklad rozpuszczalników.Stosowany do tego celu uklad rozwijajacy moze skladac sie z chlorowcowanego weglowodoru, jak dwuchlorometan lub chloroform, z dodatkiem roz¬ puszczalnika polarnego, jak alkohol, np. etanol lub metanol, ketonu, np. acetonu lub ketonu metylo- etylowego itp. W powyzszy sposób wyodrebnia sie antybiotyk C^15003. Kolejnosc ukladów rozpusz¬ czalników dla pierwszej i drugiej kolumny mozna odwrócic, a jezeli to jest konieczne, lacznie z po¬ wyzszymi ukladami mozna uzyc innych, zwyklych rozpuszczalników organicznych.W przypadku oczyszczania surowego produktu II za pomoca makropórowatej zywicy adsorpcyjnej, elucje antybiotyku C—15003 przeprowadza sie mie¬ szanina wody z nizszym alkoholem, nizszym keto¬ nem lub estrem. Nizszym alkpholem moze byc np. metanol, etanol, propanol lub butanol, a nizszym ketonem, np. aceton lub keton metyloetylowy.Estrem moze byc np. octan etylu.W typowej procedurze, surowy produkt II roz¬ puszcza sie w 60°/o wodnym metanolu i adsorbuje na kolumnie z sorbentem Diaion HP-10 (Mitsu¬ bishi Kasei K.K.). Kolumne przemywa sie lOPh wodnym metanolem, a nastepnie eluuje 90p/o wod¬ nym metanolem, uzyskujac antybiotyk C—15Ó03.W kazdym z wyzej opisanych procesów frakcje zawierajace antybiotyk C—15003 laczy sie i odpa¬ rowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Do suchego produktu dodaje sie 5 do 8 objetosci octanu etylu i pozostawia mieszanine w spoczynku, co powo¬ duje wydzielenie krysztalów antybiotyku C—15003.Krysztaly te zawieraja C^15003 P-3, P-3' i P-4.Zwiazki oddziela sie od siebie stosujac adsorbent, jak wyzej wspomniane. Frakcjonowana elucje mo¬ zna przeprowadzic np. stosujac zel krzemionkowy lub makroporowata niejonowa zywice i wyzej po¬ dane rozpuszczalniki. Jezeli stosuje sie np. zel krzemionkowy, to rozwijanie prowadzi sie heksa¬ nem, octanem etylu lub mieszanina chloroform- -metanol, uzyskujac kolejno C—15003 P-4, P-3' i P-3. Po analizie chromatografia cienkowarstwowa, frakcje zawierajace C—15003 P-4, P-3' i P-3 zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, a do koncen¬ tratu dodaje octanu etylu.W ten sposób odpowiednie zwiazki uzyskuje sie w postaci krysztalów. Przy stosowaniu jako adsor¬ bentu makroporowatej zywicy niejonowej, elucje prowadzi sie gradientowo, stosujac mieszanine al¬ koholu, ketonu lub estru z woda, o zmiennym udziale skladników. Przykladowo, elucje gradiento¬ wa z zastosowaniem 60Vo wodnego metanolu i 95% wodnego metanolu z dodatkiem 5°/o chlorku sodu, uzyskuje sie C^15O03 P-3, P-3' i P-4 w wyzej po¬ danej kolejnosci. Po zebraniu i detekcji z zasto¬ sowaniem chromatografii cienkowarstwowej, kazda z grup aktywnych frakcji odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i krystalizuje z octanu etylu. Wydzielone krysztaly zawieraja octan etylu jako rozpuszczalnik krystalizacji, a po suszeniu nad pieciotlenkiem fosforu w temperaturze 70°C w ciagu 8 godzin wykazuja wlasciwosci fizyczne i chemiczne przedstawione w tablicy IV.Na podstawie wyzej podanego wzoru sumarycz¬ nego i dalej przedstawionej aktywnosci przeciw- mikrobowej i przeciwnowotworowej, porównano antybiotyk C^15003 ze znanymi grupami antybio¬ tyków.W literaturze nie znaleziono wyraznej grupy podobnej do antybiotyku C—15003, jednak poszu¬ kiwanie substancji o absorpcji w nadfiolecie po¬ dobnej do wykazanej przez C-^15003 posród zwiaz¬ ków pochodzenia roslinnego i innych organicz¬ nych zwiazków pochodzenia naturalnego dopro¬ wadzilo do grupy maytanacyny, a na podstawie wzorów sumarycznych przyjeto, ze antybiotyk C— —15003 nalezy do zwiazków z grupy maytanacy¬ ny, zawierajacych dwa atomy azotu. Maytariacy- na zostala otrzymana jako skladnik roslinny i opi¬ sana we wspomnianym poprzednio Journal of Ame- 10 10 20 25 30 35 40 45 50 55 6011 124 349 Tablica IV 12 1 l Temperatura topnienia (°C) Skrecalnosc wlasciwa [a] 1 Analiza elementarna Znaleziono (•/#) 1 Analiza elementarna Obliczono (%) 1 Widmo absorpcji w nadfiolecie nm Oe) (w metanolu) 1 Widmo absorpcji w podczer- 1 wieni (cm-1) KBr 1 Widmo magnetycznego rezo- 1 nansu jadrowego (ppm) ioo mhz w coch 1 Widmo masowe (m/e) Rozpuszczalnosc ] Reakcje barwne Antybiotyk C—15003 | P-3 C3»H43C1N209=635,169 2 190—192 -136° ±10° (6=0,375 CHC13) C 60,06 H 7,04 N 4,33 Cl 5,37 C 60,51 H 6,82 N 4,41 Cl 5,58 233 (30250), 240 (prze¬ giecie, 28450), 252 (27640), 280 (5750) 288 (5700) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 1.27 (d) (3H) 1.28 (d) (3H) 573, 485, 470, 450 P-3' C3jH43ClN209=635,169 3 182^185 -134° ± 10° (6=0,11 CHCI3) 60,09 7,02 4,34 5,99 60,51 6,82 4,41 5,58 233 (30155), 240 (prze¬ giecie 2850) 252 (27600), 280 (5750) 288 (5700) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 •1,06 (t) (3H) 573, 485, 470, 450 P-4 C33H45ClNi09=649,196 | 4 | 177^180 | -142° ±10° (6=0,522 CHCI3) 1 60,65 7,05 4,25 5,23 | 61,05 6,99 4,32 5,46 | 233 (29900), 240 (prze¬ giecie 28240) 252 (27590), 280 (5712), 288 (5680) | 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 | 1,03 (d) (6H) 587, 485, 470, 450 | Nierozpuszczalny w eterze naftowym, heksanie i wodzie, slabo roz¬ puszczalny w benzenie i eterze, rozpuszczalny w chloroformie, octa¬ nie etylu, acetonie, etanolu, metanolu, pirydynie, czterowodorofuranie i dwumetylosulfotlenku Dragendorfa: dodatnia Beilstaina: dodatnia dodatnia dodatnia | dodatnia dodatnia | rican Chemical Society 97, 5294 (1975). Widmo masowe maytanacyny jest nastepujace: M+—(a) M+—(a+b) 485—CH3 485—Cl 545 485 470 450 (a) = H2O + HNCO (b) = R—COOH Obecnosc pasm m/s 485, 470 i 450 w widmach masowych C^15003 P—3, P—3' i P—4 przekonuje, ze powyzsze zwiazki maja szkieletowa strukture identyczna jak maytanacyna, a od maytanacyny rózni je rodnik acylowy w polozeniu 3. Z po¬ wyzszego wynika, ze antybiotyk C—15003 jest no¬ wym zwiazkiem. Przy degradacji C^15003 P—3, P—3* i P—4 zasadami i analizie chromatografia gazowa uwolnionych kwasów karboksylowych zna¬ leziono odpowiednio kwas izomaslowy, maslowy i izowalerianowy.Antybiotyki C—15003 P—3, P—3' i P-4 sa no¬ wymi zwiazkami uzytecznymi jako zwiazki wyj¬ sciowe do wytwarzania sposobem wedlug wyna¬ lazku innych farmaceutycznie uzytecznych zwiaz¬ ków. W drodze deacylacji uzyskuje sie z nich P—15003 P—O, czyli matytansinol posiadajacy gru¬ pe wodorotlenowa w polozeniu 3. Poniewaz rod¬ nik acylowy znajduje sie w polozeniu {3 w stosun- 45 50 55 ku do grupy karbonylowej, z dobrym wynikiem mozna stosowac konwencjonalne reakcje reduk¬ cyjnej hydrolizy.W reakcji redukcji stosuje sie kompleksowy wo¬ dorek metalu, np. wodorek litowoglinowy, LiAlH4, w niskiej temperaturze, przy czym wiazanie O- -estrowe w polozeniu 3, bez naruszenia innych grup funkcyjnych, np. karbonylowej, epoksydowej, podwójnego wiazania wegiel-wegiel itp., ulega hy- drolitycznemu rozszczepieniu, przy czym uzyskuje sie maytansinol. Wlasciwosci fizyczne i chemiczne tak uzyskanego maytansinolu sa zgodne z danymi podanymi przez Kupchana i innych w The Jour¬ nal of American Chemical Society 97, 5294—5295 (1975).Sposób wedlug wynalazku jest zilustrowany po¬ nizszymi przykladami. Jezeli nie zaznaczono ina¬ czej, „czesci" oznaczaja czesci wagowe, stosunek miedzy „czesciami objetosciowymi" odpowiada stosunkowi miedzy „gramami" a mililitrami", a „•/o" odnosi sie do „wagi/objetosc".Przyklad I. Hodowla szczegu Nocardia C— —15003 (IFO/13726, FERM 3992, ATCC 31281) na agarze z ekstraktem z drozdzy i ekstraktem slo-13 124 349 14 dowym szczepi sie fermentor o objetosci 200 cze¬ sci, zawierajacy 40 czesci objetosciowych pozywki hodowli posiewowej (2% glukozy, 3% skrobi roz¬ puszczalnej, li% surowej maki sojowej, 1% mamoku kukurydzianego, 0,5% poliptodonu, 0,3% NaCl, 0,5% CaCOs, pH 7,0).Zaszczepiona pozywke inkubuje sie w tempera¬ turze Z8°C w ciagu 48 godzin, otrzymujac inoku¬ lum. 0,5 czesci objetosciowych tak otrzymanego inokulum przenosi sie do fermentora o pojemnosci 200 czysci objetosciowych, zawierajacych 40 cze¬ sci abgetosciowych pozywki fermentacyijnaj, zlozo¬ nej z 5% dekstryny, 3% namoku kukurydzianego, 0,1% polipeptonu i 0,5% CaC03 (pH 7,0) i w tem¬ peraturze 28°C, w ciagu 90 godzin prowadzi ler- mentacje, otrzymujac inokulum (hodowle posie- wowa).Z oznaczenia metoda seryjnych rozcienczen, z za¬ stosowaniem jako organizmu testowego Tetrahy- mena pyriformis i antybiotyku C—15003 P—3 ja¬ ko standardu, miano hodowli wynosi 25 jjun/mL Przyklad II. 10 czesci objetosciowycn inoku¬ lum (posiewu) otrzymanego w przykladzie I prze¬ nosi sie do iermentora o objetosci 2000 czesci, za¬ wierajacego 500 czesci objetosciowycn pozywki no- dowli posiewowej (jak powyzsza) i inkuouje w temperaturze 28°C w ciagu 48 godzin. 500 czesci objetosciowych otrzymanej hodowli przenosi sie do tanku z nierdzewnej stali o pojemnosci 50 000 czesci objetosciowych, zawierajacego 30 000 czesci objetosciowycn pozywki hodowli posiewowej i pro¬ wadzi fermentacje w temperaturze 28°C, przy na¬ powietrzeniu (30 000 czesci objetosciowycn/minuta), mieszaniu (280 obrotów/minuta/l/2DT), pod we¬ wnetrznym cisnieniem 0,9d0665X102 kPa uzyskujac hodowle posiewowa.Hodowla ta posiewa sie zbiornik z nierdzewnej stali o pojemnosci 200 000 czesci objetosciowych, zawierajacy 100 000 czesci objetosciowycn pozywki fermentacyjnej, podobnej do stosowanej w przy¬ kladzie I, stosujac inokulum w objetosci 10% po¬ zywki. Zaszczepiona pozywke inkubuje sie w tem¬ peraturze 28°C, przy napowietrzaniu (100 000 czesci objetosciowych/minuta), mieszaniu (200 obrotów/mi¬ nuta (1/2DT)), pod wewnetrznym cisnieniem 0,980665X102 kPa, w ciagu 90 godzin. Z oznaczenia sposobem opisanym w przykladzie I, miano ho¬ dowli wynosi 25 ng/ml.Przyklad III. 95 000 czesci objetosciowycn ho¬ dowli otrzymanej w przykladzie II zadaje sie 2000 czesci sorbentu Hyflo-supercel (R) (Jones and Man- ville Products, USA). Po dokladnym wymieszaniu ^aczy sie na filtrze cisnieniowym, uzyskujac 85 000 czesci objetosciowych przesaczu i 32 000 czesci wil¬ gotnych komórek. Przesacz (85 000 czesci objetos¬ ciowych) miesza sie i ekstrahuje 30 000 czesci octa¬ nu etylu. Powyzszy zabieg powtarza sie. Ekstrakty laczy sie, dwukrotnie przemywa 30 000 czesci obje¬ tosciowych wody, suszy dodatkiem 500 czesci bez¬ wodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cis¬ nieniem zateza do 200 czesci objetosciowych. Do koncentratu dodaje sie eteru naftowego i odsacza wytracony osad (53 czesci). Powyzszy surowy pro¬ dukt I miesza sie z 100 czesciami objetosciowymi octanu etylu i odsacza czesci nierozpuszczone.Przesacz miesza sie z 10 czesciami zelu krzemion¬ kowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm) i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odpedza octan etylu. Pozosta¬ losc nanosi sie na góre kolumny z zelem krze- 5 mionkowym (400 czesci objetosciowych). Elucje prowadzi sie 500 czesciami objetosciowymi heksa¬ nu, 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny hek- san-octan etylu (3 :1), 500 czesciami objetosciowy¬ mi mieszaniny heksan-octan etylu (1 :1), 500 czes- 10 ciami objetosciowymi mieszaniny heksan-octan ety¬ lu (1 :3), 500 czesciami objetosciowymi octanu ety¬ lu, 1000 czesci objetosciowych mieszaniny octan etylu-metanol (50 :1) i 1000 czesci objetosciowych mieszaniny octan etylu-metanol (25:1), zbierajac 15 wyciek frakcjami po 100 czesci objetosciowych.Z kazdej frakcji I czesc objetosciowa odpar - wuje sie do sucha, a do pozostalosci dodaje 0,1 czesci objetosciowej octanu etylu. Wytracona mie¬ szanine nanosi sie na plyte szklana, powleczona 20 warstwa zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 60 F254, 0,25 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dol¬ nej krawedzi i na dlugosci okolo 17 cm rozwija ukladem rozpuszczalników octan etylu-metanol (19 :1). Po rozwinieciu przeprowadza sie detekcje 25 w swietle nadfioletowym (2537 nm).Frakcje czynne nr 23—28 o Rf 0,6—0,65 zbiera sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci po okolo 20 czesci objetosciowych. Do koncentratów dodaje sie po 150 czesci objetoscio- 30 wych eteru naftowego, otrzymujac 15 czesci suro¬ wego produktu II.Przyklad IV. Przy mieszaniu, 32 000 czesci wilgotnych komórek uzyskanych w przykladzie III ekstrahuje sie 50 000 czesci objetosciowych 70% 35 wodnego acetonu i saczenia powtarza sie. Przesa¬ cze laczy sie i pod zmniejszonym cisnieniem od¬ pedza z nich aceton. Uzyskany uklad wodny prze¬ puszcza sie przez kolumne z 5000 czesci objetos¬ ciowych sorbentu Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei 40 K.K.).Kolumne przemywa sie 2000 czesci objetoscio¬ wych wody i 50% wodnego metanolu, a nastepnie eluuje 15 000 czesci objetosciowych wodnego meta¬ nolu. Wyciek odparowuje sie pod zmniejszonym 45 cisnieniem do 3000 czesci objetosciowych i wstrza¬ sa z 3000 czesci objetosciowych octanu etylu. Po¬ wyzsza procedure powtarza sie. Ekstrakty orga¬ niczne laczy sie, przemywa woda, suszy dodaniem bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym 5Q cisnieniem odparowuje do 200 czesci objetoscio¬ wych. Po dodaniu eteru naftowego odsacza sie wytracony osad (28 czesci). Powyzszy produkt oczyszcza sie na kolumnie z zelem krzemionko¬ wym, otrzymujac 8,0 czesci surowego produktu II. 55 Przyklad V. W 10 czesciach objetosciowych octanu etylu rozpuszcza sie 1,5 czesci surowego produktu II otrzymanego w przykladzie III, a roz¬ twór dokladnie miesza z 4 czesciami zelu krze¬ mionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm). Pod 60 zmniejszonym cisnieniem odpedza sie octan etylu.Pozostalosc nanosi sie na góre kolumny z 300 czes¬ ciami objetosciowymi zelu krzemionkowego, po czym przemywa kolumne wpierw 500 czesciami objetosciowymi chloroformu, a nastepnie eluuje 65 kolejno 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny124349 17 znaleziono: C 59,65%, H 6,58%, N 5,02%, Cl 6,91%, wartosci obliczone dla CjsHstCINjOs: C 59,52%, H 6,60%, N 4,96%, Cl 6,27%. Absorpcja w podczer¬ wieni: 1715, 1670, 1580 cm"1.Widmo w nadfiolecie (nm): 232 (32750), 244 (prze¬ giecie, 30850), 252 (31650), 281 (5750), 288 (5700).Wlasciwosci produktu sa identyczne z wlasci¬ wosciami maytansinolu.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania maytansinolu o wzorze 1, znamienny tym, ze poddaje sie redukcyjnej hydro- 18 lizie antybiotyk C—15003 o wozrze 2, w którym R oznacza ugrupowania o wzorze —CO—CH/CH3/2, —COCI^CH^CHs lub —CO—CH»—CH/CH3/2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze redukcyjna hydrolize przeprowadza sie za pomoca kompleksowego wodorku metalu. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako kompleksowy wodorek metalu stosuje sie wo- 10 dorek litowoglinowy.HO K^O?"* H0 ^Jn^IP^ ch, CKO CH3 CHji Wzórl X CH, o 9-Rir 124 349 Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6. 308/84 Cena 100 zl PL PL PL

Claims

1.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania maytansinolu o wzorze 1, znamienny tym, ze poddaje sie redukcyjnej hydro- 18 lizie antybiotyk C—15003 o wozrze 2, w którym R oznacza ugrupowania o wzorze —CO—CH/CH3/2, —COCI^CH^CHs lub —CO—CH»—CH/CH3/2.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze redukcyjna hydrolize przeprowadza sie za pomoca kompleksowego wodorku metalu.

3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako kompleksowy wodorek metalu stosuje sie wo- 10 dorek litowoglinowy. HO K^O?"* H0 ^Jn^IP^ ch, CKO CH3 CHji Wzórl X CH, o 9-Rir 124 349 Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6. 308/84 Cena 100 zl PL PL PL