DE69535365T2 - Paralleles selex-verfahren - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Produkten ausgehend von Reaktanten, wobei die Reaktion, vorzugsweise ein Bindungsbildung, zwischen den Reaktanten durch eine Nucleinsäure mit erleichternden Eigenschaften gefördert wird. Die Erfindung umfasst ebenfalls die durch die Verfahren hergestellten Produkte. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung Verfahren für die Coevolution einer erleichternden Nucleinsäure und das Produkt, dass durch die Vermittlung der erleichternden Nucleinsäure hergestellt wird. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifikation von Nucleinsäuren mit erleichternden Eigenschaften sowie die Nucleinsäuren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es wurde ein Verfahren für die In-vitro-Evolution von Nucleinsäuremolekülen mit stark spezifischer Bindung an Zielmoleküle entwickelt. Dieses Verfahren, das SELEX genannt wird (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment = Auswahl von Liganden über exponentielle Anreicherung), wird in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/536.428 mit dem Titel „Systematic Evoluion of Ligands by Exponential Enrichment", jetzt fallen gelassen; in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/714.131, eingereicht am 10. Juni 1991 mit dem Titel „Nucleic Acid Ligands", in der US-Patentanmeldung Nr. 07/931.473, eingereicht am 17. August 1992 mit dem Titel „Nucleic Acid Ligands", jetzt US-Patent Nr. 5.270.163 (siehe auch PCT/US91/04078), beschrieben. Jede dieser Anmeldungen, die hierin mit der Sammelbezeichnung SELEX-Patentanmeldungen bezeichnet werden, beschreibt ein grundlegend neues Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäureliganden für ein beliebiges Zielmolekül.
  • Das SELEX-Verfahren umfasst die Auswahl aus einem Gemisch von Kandidaten-Oligonucleotiden und die schrittweise Iteration von Binden, Trennen und Amplifikation unter Einsatz desselben allgemeinen Auswahlschemas, um praktisch jedes erwünschte Kriterium in Bezug auf Bindungsaffinität und -selektivität zu erhalten. Aus gehend von einem Gemisch von Nucleinsäuren, die vorzugsweise ein Segment randomisierter Sequenz umfasst, umfasst das SELEX-Verfahren Schritte des Kontaktierens des Gemischs mit dem Target unter für eine Bindung günstigen Bedingungen, des Trennens von ungebundenen Nucleinsäuren von den Nucleinsäuren, die spezifisch an Zielmoleküle gebunden sind, des Dissoziierens der Nucleinsäure-Target-Komplexe, des Amplifizierens der von den Nucleinsäure-Target-Komplexen dissoziierten Nucleinsäuren, um ein mit Liganden angereichertes Nucleinsäuregemisch zu erhalten, sowie des Wiederholens der Schritte des Bindens, des Trennens, des Dissoziierens und des Amplifizierens in einer gewünschten Anzahl von Zyklen, um Nucleinsäureliganden mit einer hoch spezifischen Affinität für das Zielmolekül zu erhalten.
  • Es wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung erkannt, dass das SELEX-Verfahren zeigt, dass Nucleinsäuren als chemische Verbindungen eine weite Reihe von Formen, Größen und Konfigurationen annehmen können und in der Lage sind, weitaus mehr Bindungsarten und andere Funktionen auszuführen als jene, die in biologischen Systemen gezeigt werden.
  • Viele Jahre lang bestand der Grundsatz, dass Nucleinsäuren hauptsächlich eine Informationsrolle erfüllen. Durch die Anwendung von SELEX ist den Erfindern der vorliegenden Erfindung klar geworden, dass Nucleinsäuren eine dreidimensionale Strukturdiversität aufweisen, die jener von Proteinen nicht unähnlich ist. So haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung erkannt, dass SELEX oder SELEX-ähnliche Verfahren eingesetzt werden könnten, um Nucleinsäuren zu identifizieren, die eine bestimmte Reaktion erleichtern, indem Nucleinsäureliganden für ein beliebiges Target identifiziert werden können. In der Theorie behaupten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass es in einem Kandidatengemisch von etwa 1013 bis 1018 Nucleinsäuren zumindest eine Nucleinsäure gibt, die die geeignete Form aufweist, um eine Vielzahl von physikalischen und chemischen Wechselwirkungen zu erleichtern.
  • Bisher wurden in Studien nur wenige Nucleinsäuren identifiziert, die nur einen engen Teilsatz an erleichternden Fähigkeiten aufweisen. Es sind einige RNA-Katalysatoren bekannt (Cech, Science 236: 1532-1539 (1987), und McCorkle et al., Concepts Biochem. 64, 221-226 (1987)). Bisher wurde nur gezeigt, dass diese natürlich vorkommenden RNA-Enzyme (Ribozyme) auf Oligonucleotidsubstraten wirken. Außerdem verfügen diese Moleküle nur über eine geringe Bandbreite an chemischen Möglichkeiten, die weitgehend mit Phosphodiesterbindungskondensation/-hydrolyse verbunden sind, mit Ausnahme der möglichen Beteiligung von RNA an Proteinbiosynthese. Obwohl in letzter Zeit intensive Forschung zur Identifikation von RNA- und DNA-Katalysatoren durchgeführt wurde, konnten nur wenige Erfolge verzeichnet werden. Phosphodiester-Spaltung, Hydrolyse von Aminoacylestern (Piccirilli et al., Science 256, 1420-1424 (1992)), Ligation von einem Oligonucleotid mit einem 3'-OH an ein 5'-Triphosphat-Ende des Katalysators (Bartel et al., Science 261, 1411-1418 (1993)), Amidbindungsspaltung (Dai et al., Science 267, 237-240 (1995)), Biphenylisomeraseaktivität (Schultz et al., Science 264, 1924-1927 (1994)) und Polynucleotidkinaseaktivität (Lorsch et al., Nature 371, 31-36 (1994)) wurden beobachtet. Illangasekare et al. (Science 267, 643-647 (1995)) beschreiben die ersten RNA-Moleküle, die die Bildung einer Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung katalysieren. Die bisher bekannten Nucleinsäurekatalysatoren weisen gewisse Mängel in Bezug auf ihre Wirksamkeit in Bezug auf Reaktionen zur Bildung/Spaltung von Bindungen auf. Einer der Nachteile ist, dass sie im Vergleich zu Proteinenzymen langsam wirken und dass sie, wie oben beschrieben, über eine geringe Bandbreite von chemischen Möglichkeiten verfügen.
  • Green et al., Methods in Enzymology 2, 75-86 (1991), offenbaren ein Verfahren zur Identifikation, Auswahl und Amplifizierung eines Ribonucleinsäuremoleküls mit einer vorbestimmten Funktion, nämlich eines Ribozyms. Die Wechselwirkungspartner sind RNA-Moleküle aus einer teilweise randomisierten RNA-Bibliothek und ein bestimmtes RNA-Oligomer. Die Reaktion zwischen den beiden RNA-Molekülen, die stattfindet, ist die Ligation des RNA-Oligomers an das aktive Ribozym-Molekül. Ribozyme, die die Reaktion erfolgreich katalysieren, werden dann durch eine PCR identifiziert. Zusätzliche Auswahl- und Amplifikationsrunden werden eingesetzt, um die Population von aktiven Molekülen weiter anzureichern.
  • Das grundlegende SELEX-Verfahren wurde verändert, um eine Reihe von bestimmten Zielen zu erreichen. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/960.093, eingereicht am 14. Oktober 1992, mit dem Titel „Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure" beschreibt beispielsweise den Einsatz von SELEX in Kombination mit einer Gelelektrophorese, um Nucleinsäuremoleküle mit bestimmten Strukturmerkmalen, wie z.B. bent-DNA, auszuwählen. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/123.935, eingereicht am 17. September 1993, mit dem Titel „Photoselection of Nucleic Acid Ligands" beschreibt ein auf SELEX basierendes Verfahren zur Auswahl von Nucleinsäureliganden, die photoreaktive Gruppen umfassen, die in der Lage sind, ein Zielmolekül zu binden und/oder zu photovernetzen und/oder zu photoinaktivieren. Die Parallelanmeldung PCT/US94/10562, eingereicht am 19. September 1994, die eine Continuation-in-Part zu US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/123.935 ist, offenbart, dass bestimmte Nucleinsäuresequenzen, die 5-Ioduracil-Reste umfassten und kovalent an ein HIV-1-Rev-Protein binden, identifiziert wurden. US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/134.028, eingereicht am 7. Oktober 1993, mit dem Titel „High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine" beschreibt ein Verfahren zur Identifikation von äußerst spezifischen Nucleinsäureliganden, die in der Lage sind, zwischen nahe verwandten Molekülen zu unterschieden, wobei dieses Verfahren als Counter-SELEX bezeichnet wird. US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/143.564, eingereicht am 25. Oktober 1993, mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX" beschreibt ein auf SELEX basierendes Verfahren, das eine hochwirksame Trennung von Oligonucleotiden mit hoher und geringer Affinität in Bezug auf ein Zielmolekül erzielt. US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/400.440, eingereicht am 8. März 1995, mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX" beschreibt Verfahren, um einen Nucleinsäureliganden kovalent an sein Target zu binden.
  • Das SELEX-Verfahren umfasst die Identifikation von hochaffinen Nucleinsäureliganden, die veränderte Nucleotide enthalten, die dem Liganden verbesserte Eigenschaften verleihen, wie z.B. verbesserte In-vivo-Stabilität oder verbesserte Abgabeeigen schaften. Beispiele für solche Modifikationen umfassen chemische Substitutionen an den Ribose- und/oder Phosphat- und/oder Basenposition. Mittels SELEX identifizierte Nucleinsäureliganden, die modifizierte Nucleotide enthalten, werden in US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/117.991, eingereicht am 8. September 1993, mit dem Titel „High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides" beschrieben, welche Oligonucleotide beschreibt, die chemisch an den 5- und 2'-Positionen von Pyrimidinen modifizierte Nucleotidderivate umfassen. US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/134.028, s.o., beschreibt hochspezifische Nucleinsäureliganden, die ein oder mehrere Nucleotide umfassen, die mit 2'-Amino (2'-NH2), 2'-Fluor (2'-F) und/oder 2'-O-Methyl (2'-OMe) modifiziert wurden. US-Patentanledung mit der Seriennummer 08/264.029, eingereicht am 22. Juni 1994, mit dem Titel „Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement" beschreibt Oligonucleotide, die verschiedene 2'-modifizierte Pyrimidine umfassen.
  • Das SELEX-Verfahren umfasst die Kombination der ausgewählten Oligonucleotide mit anderen ausgewählten Oligonucleotiden und funktionellen Einheiten, die keine Oligonucleotide sind, wie in US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/284.063, eingereicht am 2. August 1994, mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX" bzw. US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/234.997, eingereicht am 28. April 1994, mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX" beschrieben. Diese Anmeldungen ermöglichen die Kombination von einer weiten Reihe von Formen und anderen Eigenschaften, und von wirksamen Amplifikations- und Replikationseigenschaften, von Oligonucleotiden mit den erwünschten Eigenschaften von anderen Molekülen.
  • In letzter Zeit wurden einige Versuche unternommen, kombinatorische Chemie zur Entdeckung von neuen Arzneimitteln einzusetzen. Einige sorgfältig entwickelte Schemen zur Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken mit einer Reihe von verschiedenen Strukturen wurden ausgearbeitet. Die Strukturen in Verbindung mit bekannten kombinatorischen Bibliotheken umfassen Nucleinsäuren, wie zuvor für das SELEX-Verfahren beschrieben, Peptide (Brenner et al., PNAS 89, 5381-5383 (1992); Needles et al., PNAS 90, 10700-10704 (1993); Alper, Science 264, 1399-1401 (1994); Longman, In Vivo, 23-31 (1994); Fodor et al., Science 251, 767-773 (1991)) und eine viel geringere Zahl, die auf kleine organische Moleküle ausgerichtet ist (Ohlmeyer et al., PNAS 90, 10922-10926 (1993)). Es gibt einige Nachteile in Bezug auf die bekannten Ansätze im Zusammenhang mit kombinatorischen Bibliotheken.
  • Zunächst erfordern manche Schemen zur Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken von Peptiden oder kleinen Molekülen genaue Aufzeichnungssysteme, um festzuhalten, welche chemische Zusammensetzungen an einem beliebigen Punkt in der Reihe/der Matrix aufgetreten sind. Außerdem können Peptide und kleine organische Moleküle nicht amplifiziert werden, und deshalb müssen relativ große Mengen von jedem einzelnen Produkt in der Bibliothek vorhanden sein, um das Testen und die Identifikation der erwünschten Produkte zu ermöglichen. Um ausreichend große Mengen von bestimmten Produkten zu erhalten, müssen die Reaktionen, die die Reihe bilden, äußerst wirksam sein. Noch bedeutender ist, dass es bei diesen Ansätzen nicht möglich ist, ein Gemisch aus Produkten und Nebenprodukten an derselben Stelle in der Reihe zu haben. Diversität entsteht durch eine polymere Kombination in mehreren Schritten, wobei jeder dieser Schritte aus einer einzigen Reaktion mit einem vorhersagbaren Ergebnis besteht. Das Ausmaß der polymeren Kombination ist jedoch durch die Einschränkungen in Bezug auf Ausbeute und Aufzeichnungen begrenzt.
  • Eine weitere Beschränkung von kombinatorischen Ansätzen in Zusammenhang mit kleinen Molekülen ist, dass die Schemen im Allgemeinen die bindungsbildenden Reaktionen ausschließen, die neue Stereozentren durch asymmetrische Reaktionen herstellen. Durch die Eliminierung der asymmetrischen Reaktionen stellen diese Ansätze keine chemische Diversität, die in einem einzigen Schritt erzielt werden kann, bereit. Asymmetrische Reaktionen sind oft schwer zu steuern, und wenn somit Reaktionen, die neue Chiralitätszentren bilden, Teil des kombinatorischen Schemas sind, wäre es wahrscheinlich, dass racemische Produktgemische das Ergebnis sind. Ra cemische Produktgemische können zu Hintergrund-Problemen führen. Es ist beispielsweise möglich, dass die idealen Atome und Gruppen zur Assemblierung eingeführt werden, aber dass die Chiralität des Produkts wesentlich für die erwünschten Eigenschaften ist und das korrekte Enantiomer nur als kleiner Prozentsatz des Gesamten vorhanden ist. In diesem Beispiel ist es sehr wahrscheinlich, dass das korrekte Enantiomer nicht in einer ausreichenden Menge vorhanden sein wird, um identifiziert zu werden. Außerdem ist es nicht möglich, die Chiralität jeder einzelnen Reaktion genau vorherzusagen, wenn eine große Anzahl von Reaktanten an einer asymmetrischen Transformation beteiligt ist. Deshalb ist es unwahrscheinlich, dass die Schwierigkeiten in Zusammenhang mit racemischen Gemischen durch herkömmliche Mittel überwunden werden können. Die Mühe und die Zeit, die erforderlich sind, damit asymmetrische Katalyse Teil von herkömmlichen Ansätzen für kombinatorische Bibliotheken ist, sind im Allgemeinen praktisch nicht anwendbar. Deshalb werden asymmetrische Reaktionen im Allgemeinen ausgeschlossen, um die beschriebenen Probleme zu umgehen.
  • Dennoch umfassen asymmetrische Reaktionen eine des stärksten bindungsbildenden Reaktionstyps. Das Fehlen von asymmetrischen Reaktionen in kombinatorischen Bibliotheken schränkt die Art von Produkten, die hergesellt werden können, sowie die Breite der Bibliothek deutlich ein. Das folgende Beispiel veranschaulicht die große Diversität, die durch asymmetrische Reaktionen erzielt wird. Im Allgemeinen beträgt die Zahl der möglichen Produkte, die aus einer Matrix von Reaktanten produziert werden, M × 2n, worin M = die Zahl der Reaktanten und n = die Zahl der Chiralitätszentren ist. Es wird eine Matrix in Betracht gezogen, die bindungsbildende Reaktionen umfasst, wobei eine asymmetrische Bindung gebildet wird. Die Anzahl der möglichen Produkte steigt auf das Doppelte des Produkts der Matrix. Es ist anzumerken, dass bei jeder gebildeten Bindung die Möglichkeit zur Bildung von zwei Chiralitätszentren besteht, so dass die Anzahl der möglichen Kombinationen für eine einzige Transformation 4 oder 22 ist. Es wird ein bestimmtes Beispiel einer asymmetrischen Reaktion, die Diels-Alder-Reaktion, in Betracht gezogen, bei der zwei Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen gebildet werden und das Potenzial zur Herstellung von 4 Chiralitätszentren besteht.
    Figure 00080001
  • Für die Diels-Alder-Reaktion wird die relative Stereochemie der beiden Enden des Dienophil-Reaktanten gekoppelt wie die beiden Enden des Dien-Reaktanten, wodurch die Anzahl der Möglichkeiten für jedes Dien/Dienophil-Paar auf 23 gesenkt wird. Das bedeutet, dass die Anzahl von möglichen Produktmolekülen für eine einziges Dienophil in Kombination mit 10 Dienen 1 × 10 × 23 = 80 beträgt (1 erster Reaktant und 80 zweite Reaktanten). Um dasselbe Ausmaß an Diversität unter Einsatz von herkömmlichen kombinatorischen Ansätzen mit nur einem bindungsbildenden Schritt zu erzielen, wäre die direkte Synthese von 81 Verbindungen erforderlich. Für eine Reihe von 10 × 10 Reaktanten ergibt ein herkömmlicher kombinatorischer Ansatz eine Ausbeute von 100 Verbindungen. Die Ausweitung der asymmetrischen Diels-Alder-Reaktionsreihe auf 10 × 10 Reaktanten weist das Potenzial auf, ausgehend von den 20 ursprünglichen 800 neue Verbindungen zu erhalten. Derzeitige kombinatorische Strategien können keine Prüfung in Bezug auf alle potenziellen Produkte von asymmetrischen Transformationen durchführen, da es im Allgemeinen nicht möglich ist, alle erwünschten Produkte zu erhalten. Wie oben erläutert stellt die Eliminierung von asymmetrischen Reaktionen eine starke Einschränkung von herkömmlichen Ansätzen in Bezug auf kombinatorische Bibliotheken dar.
  • Ein idealer Ansatz in Bezug auf eine kombinatorische Bibliothek würde das SELEX-Verfahren ergänzen, wobei die Ausbeute aufgrund der Möglichkeit, die Oligonucleotidprodukte zu amplifizieren, nicht von Bedeutung wäre und man dennoch kleine organische Moleküle erhalten würde, die im Allgemeinen oral wirksam und in der Herstellung relativ günstig sind. Die vorliegende Erfindung kombiniert die Leistung von SELEX mit einem neuen Ansatz zur Herstellung einer großen, strukturell verschiedenen Produktbibliothek. Der Ansatz der vorliegenden Erfindung überwindet viele der Unzulänglichkeiten der anderen Ansätze im Zusammenhang mit kombinatorischen Bibliotheken und stellt ein revolutionäres Konzept für die Zukunft der Arzneimittelentwicklung dar.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Produktbibliotheken bereit, die gleichzeitig mit dem entsprechenden Nucleinsäure-Erleichterer hergestellt wurden, der erforderlich war, um jedes Element der Bibliothek aus einem oder mehreren chemischen Reaktanten herzustellen. Von größerer Bedeutung ist, dass Produkte aus der Produktbibliothek identifiziert werden können, die vorbestimmte, erwünschte Eigenschaften aufweisen. Dieses Verfahren, dass hierin als Parallel-SELEX bezeichnet wird, ist ein SELEX-ähnliches Verfahren, das eingesetzt wird, um eine solche Produktbibliothek herzustellen und anschließend Produkte mit gewünschten Eigenschaften zu identifizieren. Wie bei dem SELEX-Verfahren wird ein umfassendes, vielfältiges Nucleinsäure-Testgemisch bereitgestellt. Jede Nucleinsäure wird an einen chemischen Reaktanten gebunden. Die Erfindung beruht auf der Annahme, dass in einer ausreichend großen Nucleinsäurebibliothek Nucleinsäuren in dem Nucleinsäure-Testgemisch identifiziert werden können, die in der Lage sind, eine chemische Reaktion zwischen dem an die Nucleinsäure gebundenen chemischen Reaktanten und einem freien chemischen Reaktanten zu vermitteln. Außerdem sind einige der Nucleinsäuren der Teilmenge in der Lage, eine chemische Reaktion zu vermitteln, und einige sind hoch spezifisch für die Produktion von allen oder einem wesentlichen Anteil von allen möglichen Produkten. Deshalb umfasst die Produktbibliothek zumindest einige aller möglichen Produkte einer bestimmten Reaktion. Die Nucleinsäure stellt eine erleichternde Spezifizität für das Produkt bereit, und das Produkt stellt wiederum eine Spezifizität für eine vorbestimmte, erwünschte Wirkung auf ein Target bereit.
  • Parallel-SELEX mindert viele der Nachteile der Ansätze in Bezug auf kombinatorische Bibliotheken nach dem Stand der Technik. In seiner grundlegendsten Form umfasst Parallel-SELEX die Bildung einer Produktbibliothek durch das Kontaktieren von zwei oder mehreren Reaktanten, wobei einer der Reaktanten an eine Nucleinsäure gebunden ist, die in der Lage ist, die Bindungsbildung zu vermitteln, die Auswahl von Produkten, die vorbestimmte, erwünschte Eigenschaften aufweisen, und die Identifikation der Produkte unter Einsatz des SELEX-Verfahrens zur Amplifikation. Eine schematische Darstellung des Parallel-SELEX-Verfahrens wird in 1 bereitgestellt.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifikation eines gewünschten Produkts aus einer Produktbibliothek bereit, wobei das gewünschte Produkt aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt wird, eine vorbestimmte Wirkung auf ein Target auszuüben, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Herstellung eines Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs, das Nucleinsäuren umfasst, die eine Region mit einer randomisierten Sequenz aufweisen und jeweils an den ersten Reaktanten gebunden sind; Umsetzung des Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs mit einem freien Reaktanten zur Bildung eine Produktbibliothek, die aus Nucleinsäuren besteht, die an ein Produkt gebunden sind, das durch die Reaktion des ersten und des freien Reaktanten gebildet wurde; und Trennen der Elemente der Produktbibliothek ausgehend von ihrer relativen Fähigkeit, die vorbestimmte Funktion zu erfüllen, wobei die erwünschten Produkte identifiziert werden können.
  • Die Erfindung stellt eine Produktbibliothek bereit, die aus einem Gemisch von Produkten besteht, die das Ergebnis einer Reaktion zwischen zumindest einem gebundenen Reaktanten und einem freien Reaktanten sind, wobei der gebundene Reaktant an die Nucleinsäure gebunden ist, die die Reaktion zwischen den Reaktanten erleichtert hat.
  • Parallel-SELEX erfordert weder eine Aufzeichnung einer Produkt-Matrix und deren chemischer Zusammensetzung noch hochwirksame und schnelle Reaktionen. Dieser Vorteil beruht auf der Tatsache, dass die Produktbildung durch bestimmte Nucleinsäuren gesteuert wird. Dieser gerichtete Ansatz steht im Gegensatz zu dem kodierten Ansatz anderer Ansätze in Bezug auf kombinatorische Bibliotheken. Die Nucleinsäure, die die erwünschte Produktbildung spezifisch erleichtert, kann leicht amplifiziert werden, und das Produkt kann in folgenden Produktionsrunden verlässlich reproduziert werden. Dieses Verfahren ermöglicht, dass anfänglich eine Vielzahl von Reaktionen stattfindet, die später aussortiert werden können, wenn bestimmt wurde, dass Produkte hergestellt wurden, die vorbestimmte, erwünschte Eigenschaften aufweisen. Durch dieses Verfahren können Produkte ohne detaillierte Strukturinformationen entwickelt werden.
  • Parallel-SELEX kann die Bildung von Produktbibliotheken unter Einsatz von asymmetrischen Reaktionen umfassen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Ansätzen im Zusammenhang mit kombinatorischen Bibliotheken, können, auch wenn es nicht möglich ist, das stereochemische Ergebnis zu Beginn der Reaktion vorherzusagen, asymmetrische Reaktionen eingesetzt werden. Diese spezifische chemische Zusammensetzung muss nicht aufgezeichnet werden, damit Parallel-SELEX wirksam sein kann. Die einzige Voraussetzung ist, dass die Nucleinsäure zumindest eine endliche Teilmenge der Gesamtanzahl der möglichen Reaktionen vermittelt.
  • In einer anderen Ausführungsform werden erleichternde Nucleinsäuren bereitgestellt. Nucleinsäuren, die erleichternde Eigenschaften aufweisen, sind in der Lage, chemische Reaktionen, wie z.B. Bindungsbildung oder Bindungsspaltung, zu fördern. Die Nucleinsäuren können auf verschiedene Weisen modifiziert werden, um andere chemische Gruppen zu umfassen, die zusätzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbindungen, elektrostatische Wechselwirkung und Fluxionalität bereitstellen, die die Vermittlung der chemischen Reaktion unterstützen. Die anderen chemischen Gruppen können unter anderem Alkylgruppen, Aminosäureseitenketten, verschiedene Cofaktoren und organometallische Gruppierungen umfassen. Die Erfindung erfordert, dass die erleichternden Nucleinsäuren die Synthese von Produkten steuern, die vorbestimmte, erwünschte Eigenschaften aufweisen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Produkte umfassen, und Verfahren zur Verabreichung der Zusammensetzungen sind Teil der Erfindung. Diagnostische Reagenzien, landwirtschaftliche Zusammensetzungen und die Herstellung von Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Produkte umfassen, sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung des Parallel-SELEX-Verfahrens in seiner grundlegendsten Form.
  • 2 zeigt eine schematische Darstellung des Parallel-SELEX-Verfahrens, wobei eine erleichternde Nucleinsäure eine generische Diels-Alder-Reaktion zwischen einem Dien und einem Dienophil fördert.
  • 3 zeigt, wie Ligationssequenzen genutzt werden können, um die Reihe von zweiten Reaktantenmolekülen in Parallel-SELEX auszuweiten. 3A-E veranschaulichen fünf der 16.384 Möglichkeiten in Übereinstimmung mit 2.
  • 4 zeigt eine schematische Darstellung des Parallel-SELEX-Verfahrens, wobei eine erleichternde Nucleinsäure eine generische, bindungsbildende Aldol-Kondensationsreaktion zwischen einem Keton und einem Aldehyd fördert.
  • 5A-C zeigen den Einfluss der in 4 beschriebenen gemischten Aldol-Reaktion auf die strukturelle Vielfalt der Produkte. 5A zeigt die Reaktanten. 5B zeigt Diastereomere, die gebildet werden, wenn A das Nucleophil und B das Elektrophil ist. 5C zeigt Diastereomere, die gebildet werden, wenn B das Nucleophil und A das Elektrophil ist. Nur Diastereomere werden angeführt, und jede Struktur würde ein entsprechendes Enantiomer aufweisen.
  • 6A zeigt die Cyclotrimerisation von drei Alkinen, wodurch ein substituierter Benzolring entsteht. 6B zeigt eine Matrix von Möglichkeiten für die Zusammenstellung von Benzolverbindungen durch Cyclotrimerisation von den drei in 6A dargestellten Alkinen. Nur eines der möglichen Produkte wird angeführt.
  • 7 zeigt eine mögliche Strategie für die Retrosynthese eines typischen, erfindungsgemäßen Produkts.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Parallel-SELEX stellt Produktbibliotheken bereit, die durch die Kombination eines Pools von ersten chemischen Reaktanten, die an eine Nucleinsäure gebunden sind; mit einem Pool von freien chemischen Reaktanten gebildet wird. Die gebundene Nucleinsäure ist in der Lage, die chemische Reaktion, die zur Bildung der Produktbibliothek führt, zu fördern, und weiters ist die Nucleinsäure amplifizierbar, wodurch ein Produkt, das eine vorbestimmte, erwünschte Eigenschaft aufweist, angereichert werden und ausgehend von der Produktbibliothek identifiziert werden kann.
  • In seiner allgemeinsten Form kann Parallel-SELEX wie in 1 beschrieben werden. Ein Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch wird gebildet, indem ein erster Reaktant (R) an jede Nucleinsäure in einem Testgemisch (umfassend 102 bis 1018 Nucleinsäuren mit randomisierten Sequenzen) gebunden wird. Das Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch wird mit anderen freien Reaktanten (als Dreieck, Fünfeck oder Sechseck dargestellt) behandelt, die in Kombination mit dem ersten Reaktanten (R) verschiedene Produkte bilden. Es ist wichtig, anzumerken, dass ausgehend von dem Nucleinsäure-Testgemisch (NA) diskrete Nucleinsäuresequenzen damit in Verbindung gebracht werden, dass sie die Bildung der verschiedenförmigen Produkte, wie in 1 durch Sequenz-A, Sequenz-B und Sequenz-C dargestellt, erleichtern. Die Produkte können sich in Form, Reaktivität oder sowohl Form als auch Reaktivität unterscheiden. Das Trennen der erwünschten Produktform oder -reaktivität erfolgt durch die Bindung an ein oder die Umsetzung mit einem Target. Proteine, kleine Moleküle, Lipide, Saccharide etc. sind Beispiele für Targets (T). Nach der Bindung an ein oder die Umsetzung mit einem Target werden die Produkte, die keine Wechselwirkung aufweisen und, wie in 1 dargestellt, an Sequenz-B und Sequenz-C gebunden sind, von Sequenz-A abgetrennt und verworfen. Die Nucleinsäuresequenz-A wird dann durch eine Vielzahl von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, amplifiziert. Sequenz-A wird dann eingesetzt, um die Zusammenstellung des erwünschten Produkts zu erleichtern, indem die spezifische Reaktion zur Bildung des ausgewählten Produkts bei der Behandlung mit dem Gemisch der Ausgangsreaktanten erleichtert wird. In einer typischen Reaktion kann Sequenz-A erneut an den ersten Reaktanten gebunden werden, jedoch ist diese erneute Bindung nicht immer erforderlich. Dies stellt einen Idealfall dar, und bei vielen Beispielen kann der Nucleinsäure-Erleichterer mehr als ein Produkt aus dem Ausgangsgemisch ansammeln, jedoch weisen alle ausgewählten Produkte die gewünschten Eigenschaften in Bezug auf die Bindung an oder die chemische Umsetzung mit dem Target auf.
  • I. DEFINITIONEN
  • Bestimmte Bezeichnungen, die verwendet werden, um die Erfindung hierin zu beschreiben, sind wie folgt definiert:
    „Nucleinsäure" bezeichnet DNA, RNA, einsträngig oder doppelsträngig, sowie beliebige chemische Modifikationen derselben. Modifikationen umfassen folgenden, sind aber nicht auf diese beschränkt: Modifikationen, die andere chemische Gruppen bereitstellen, die zusätzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbindung, elektrostatische Wechselwirkung und Fluxionalität in die einzelnen Nucleinsäurebasen oder die Nucleinsäure als Ganzes einbringen. Solche Modifikationen umfassen modifizierte Basen, wie z.B. Basenmodifikationen an der 2'-Position, Pyrimidinmodifikationen an der 5-Position, Purinmodifikationen an der 8-Position, Modifikationen an den exozyklischen Cytosin-Aminen, Substitution von 5-Brom-Uracil; Hauptkettenmodifikationen, Methylierungen, ungewöhnliche Basenpaar-Kombinationen, wie z.B. der Isobasen Isocytidin und Isoguanidin und dergleichen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Modifikationen können auch 3'- und 5'-Modifikationen, wie z.B. Verkappen, umfassen. Modifikationen, die nach jeder Amplifikationsrunde durchgeführt werden, sind ebenfalls mit dieser Erfindung vereinbar. Modifikationen nach der Amplifikation können reversibel oder irreversibel nach jeder Amplifikationsrunde vorgenommen werden. Praktisch jede Modifikation der Nucleinsäure wird von dieser Erfindung in Betracht gezogen. Die Länge des randomisierten Abschnitts der Nucleinsäure beträgt im Allgemeinen zwischen 8 und 250 Nucleotide, vorzugsweise zwischen 8 und 160 Nucleotide.
  • Das „Nucleinsäure-Testgemisch" ist ein Gemisch aus Nucleinsäuren mit verschiedenen, randomisierten Sequenzen, umfassend einige, die eine Form aufweisen, die es ihnen ermöglicht, die Bildung und/oder Spaltung von chemischen Bindungen zu fördern. Der Ursprung eines „Nucleinsäure-Testgemischs" können natürlich vorkommende Nucleinsäuren oder Fragmente davon, chemisch synthetisierte Nucleinsäuren, enzymatisch synthetisierte Nucleinsäuren oder Nucleinsäuren, die durch eine Kombination der vorhergehenden Techniken hergestellt werden, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform weist jede Nucleinsäure fixierte Sequenzen auf, die eine randomisierte Region umgeben, um das Amplifikationsverfahren zu erleichtern.
  • „Nucleinsäure mit erleichternden Eigenschaften" oder „erleichternde Nucleinsäure" oder „Nucleinsäure-Erleichterer" bezeichnet eine beliebige Nucleinsäure, die in der Lage ist, eine chemische Reaktion zu fördern oder zu erleichtern. Die chemische Reaktion kann eine Bindungsbildungs- oder eine Bindungsspaltungsreaktion sein. Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auf Bindungsbildungsreaktionen ausgerichtet. Die Nucleinsäure muss nicht notwendigerweise einen katalytischen Umsatz aufweisen, um als erleichternd zu gelten. Die Reaktionsgeschwindigkeit der Produktbildung kann durch die Gegenwart der Nucleinsäure gesteigert werden, jedoch ist eine gesteigerte Reaktionsgeschwindigkeit keine Voraussetzung für erleichternde Eigenschaften. Eine erleichternde Nucleinsäure faltet so, dass ihre dreidimensionale Struktur eine spezifische chemische Reaktion erleichtert. Die Nucleinsäure kann die chemische Reaktion entweder allein oder in Kombination mit einer anderen katalytischen Gruppierung, die direkt an die Nucleinsäure gebunden ist, oder in Kombination mit einer anderen katalytischen Gruppierung, die in der Lösung vorgefunden werden kann, vermitteln. Die anderen katalytischen Gruppierungen können organometallische Gruppierungen, Metallionen etc. umfassen. Die Nucleinsäure kann die Bildung von verschiedenen Stereoisomeren hervorrufen. Die Nucleinsäure kann die Bildung oder Spaltung von verschiedenen Bindungsarten vermitteln, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich, die folgenden: Kondensations/Hydrolysereaktionen, Cycloadditionsreaktionen (wie z.B. Diels-Alder-Reaktion, En-Reaktion, 1,3-Dipolar-Reaktion), konjugierte Addition an α,β-ungesättigte Verbindungen, Aldol-Kondensationen, Claisen-Reaktion, Glykosylierung von Peptiden, Zu ckern und Lipiden. Zusätzlich dazu kann es, wenn die Nucleinsäuremodifikation eine organometallische Gruppierung umfasst, zu anderen Reaktionen kommen, die symmetrische oder asymmetrische Produkte bilden könnten, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Cyclopropanisierung, Epoxidierung, Aziridinierung, Hydrierung, Cyclotrimerisation von Alkinen, [3+2]- und [4+1]-Cycloaddition von ungesättigten Molekülen sowie Olefinmetathese.
  • „Reaktant" bezieht sich auf eine beliebige chemische Einheit, die Teil einer bindungsbildenden oder bindungsspaltenden Reaktion sein könnte und mit der thermischen und chemischen Stabilität von Nucleinsäuren, sowie den oben erläuterten Modifikationen, kompatibel ist. Die Bezeichnung „Reaktant" kann sich auf eine einzige chemische Einheit oder eine Klasse von chemischen Verbindungen, die mehrere Reaktanten mit mehreren allgemeinen chemischen Strukturen oder mehrere Reaktanten mit verschiedenen allgemeinen chemischen Strukturen umfassen, beziehen. Ein Reaktant weist typischerweise ein Molekulargewicht im Bereich von 2 bis 1000, vorzugsweise von etwa 26 bis 500, auf. Besonders bevorzugte Reaktanten umfassen kleine organische Moleküle, wie z.B. Alkene, Alkine, Alkohole, Aldehyde, Ketone, Ester, Carbonsäuren, aromatische Carbocyclen, Heterocyclen, Diene, Thiole, Sulfide, Disulfide, Epoxide, Ether, Amine, Imine, Phosphate, Amide, Thioether, Sulfonate und halogenierte Verbindungen. Anorganische Reaktanten werden von dieser Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen. In manchen Ausführungsformen der Erfindung können jedoch auch größere Reaktanten, wie z.B. Polymere oder Proteine, eingesetzt werden. Die Auswahl der verwendeten chemischen Reaktanten kann zufällig oder unter Berücksichtigung einer Reihe von Kriterien erfolgen, wie der Natur des erwünschten Produkts, der Aktivität, die das Produkt aufweisen soll, oder von Informationen, die sich auf die Natur des Targets bezieht, auf das das Produkt wirken soll.
  • „Gebundener Reaktant" oder „Erster Reaktant" oder „Erster chemischer Reaktant" bezieht sich auf die oben beschriebenen Reaktanten, die an eine Nucleinsäure gebunden sind, um ein Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch zu bilden. Die Bindung des ersten Reaktanten an die Nucleinsäure kann entweder kovalent oder nicht kovalent erfolgen. Der erste chemische Reaktant kann eine einzige chemische Einheit sein oder eine Klasse von chemischen Molekülen, umfassend mehrere Reaktanten mit mehreren allgemeinen chemischen Strukturen oder mehrere Reaktanten mit verschiedenen allgemeinen chemischen Strukturen. Der erste Reaktant kann beispielsweise ein Alken (z.B. 1-Propen) oder 10 verschiedene Alkene oder 10 verschiedene Alkene und 10 verschiedene Alkine sein.
  • „Freier Reaktant" oder „Zweiter Reaktant" oder „Freier chemischer Reaktant" bezieht sich auf die Reaktanten, die nicht an eine Nucleinsäure gebunden sind. Eine Reaktion kann mehr als einen freien Reaktanten umfassen, wie z.B. in einer Cyclotrimerisationsreaktion. Die freien Reaktanten können dieselben oder verschiedene sein und sie können dieselben wie der gebundene Reaktant oder andere als der gebunden Reaktant sein. Der freie Reaktant kann beispielsweise 10 verschiedene Alkene oder 10 verschiedene Alkene und 10 verschiedene Alkine sein.
  • „Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch" bezeichnet ein Gemisch aus Nucleinsäuren, wobei jede an einen ersten chemischen Reaktanten gebunden ist. Die Bindung kann kovalent oder nicht kovalent, direkt oder über einen Linker zwischen der Nucleinsäure und dem Reaktanten erfolgen. Das Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch wird mit einem Pool von freien chemischen Reaktanten kontaktiert, um die Bildung einer Produktbibliothek zu ermöglichen.
  • „Produkt" bezieht sich auf eine Verbindung, die durch eine bindungsbildende oder einer bindungsspaltende Reaktion zwischen einem oder mehreren Reaktanten entsteht, die durch eine Nucleinsäure vermittelt wurde. In der bevorzugten Ausführungsform wird das Produkt typischerweise durch die Reaktion zwischen einem gebundenen Reaktanten und einem freien Reaktanten gebildet. Zwei Reaktanten, die reagieren, um das Produkt herzustellen, müssen nicht notwendigerweise verschiedene chemische Strukturen aufweisen. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Produkte kleine organische Moleküle, die medizinisch aktiv sein können und therapeutisch wirksam oder als Diagnosewirkstoffe oder landwirtschaftliche Wirkstoffe einsetzbar sind. Das typische Molekulargewicht des Produkts liegt im Bereich von etwa 40 bis 2000, vorzugsweise von etwa 100 bis 1000. Bei manchen, weniger bevorzug ten Ausführungsformen können die Produkte jedoch größere Moleküle sein, wie z.B. Peptide, Proteine, Polymere etc. Bei manchen, weniger bevorzugten Ausführungsformen ist die Reaktion eine bindungsspaltende Reaktion und kann nur mit dem gebundenen Reaktanten oder zwischen zwei oder mehreren Reaktanten stattfinden.
  • „Produktbibliothek" bezieht sich auf die Sammlung von Produkten, die durch die chemische Reaktion zwischen einem Reaktanten, der an eine erleichternde Nucleinsäure gebunden ist, und vorzugsweise zumindest einem freien Reaktanten gebildet wird. Aufgrund der Natur der Erfindung kann eine Produktbibliothek viele verschiedene Produkte mit variierenden chemischen Strukturen umfassen.
  • „Produkt, das in der Lage ist, eine vorbestimmte Funktion in Bezug auf ein Target zu erfüllen", oder „Produkt mit einer vorbestimmten Eigenschaft" oder „Erwünschtes Produkt" bezieht sich auf ein Produkt, dass auf ein Target auf eine vorbestimmte, erwünschte Weise einwirkt. Beispiele für vorbestimmte, erwünschte Wirkungen auf ein Target umfassen folgende, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Binden des Targets, katalytische Veränderung des Targets, Reaktion mit dem Target, so dass das Target oder die funktionelle Aktivität des Targets modifiziert/verändert wird, kovalente Bindung an das Target wie in einem Suizidinhibitor, Erleichtern der Reaktion zwischen dem Target und einem anderen Molekül. Ein Produkt in einer Produktbibliothek, das eine vorbestimmte Eigenschaft aufweist, ist beispielsweise eines, das ein Target mit größerer Affinität bindet als der Hauptteil der Population. In einer beliebigen Produktbibliothek kann es mehr als ein Produkt geben, das eine vorbestimmte Eigenschaft in Bezug auf ein bestimmtes Target aufweist. Die Produkte, die die vorbestimmten Eigenschaften aufweisen, können sich voneinander in Bezug auf ihre Bindungsaffinitäten für das Target oder in Bezug auf andere Fähigkeiten, auf das Target zu wirken, unterscheiden.
  • „Target" bezieht sich auf eine beliebige Verbindung, auf die ein durch das Parallel-SELEX-Verfahren identifiziertes Produkt auf eine vorbestimmte, erwünschte Weise wirken kann. Ein Targetmolekül kann ohne Einschränkung ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Glycoprotein, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Vi rus, Substrat, Metabolit, Übergangszustandanalogon, Cofaktor, Inhibitor, Arzneimittel, Farbstoff, Nährstoff, Wachstumsfaktor, eine Zelle, Gewebe etc. sein.
  • „Trennen" bezeichnet ein beliebiges Verfahren, in dem Elemente des Nucleinsäure-Testgemischs oder des Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs von dem Hauptteil des Testgemischs getrennt werden, basierend auf der Fähigkeit der Nucleinsäure, eine Reaktion mit dem an sie gebundenen Reaktanten zu fördern, wodurch ein erwünschtes Produkt entsteht. Das Trennen kann durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren erfolgen. Filterbindung, Affinitätschromatographie, Flüssig-Flüssig-Trennen, Filtration, Gelshift, Dichtegradientenzentrifugation, Molekulargewicht-Filtertrennung, Größenausschlusschromatographie, Größenaussschluss-Membrantrennung und isoelektrische Fokussierung sind alle Beispiele für geeignete Trennverfahren. Die Wahl des Trennverfahrens hängt von den Eigenschaften des Targets und dem Produkt ab und kann gemäß den Prinzipien und Eigenschaften erfolgen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
  • Zusätzlich dazu kann es wünschenswert sein, als ersten Trennschritt Nucleinsäuren, die an Produkte gebunden sind (und deshalb erleichternde Nucleinsäuren sind), von jenen, die nur an einen ersten Reaktanten gebunden sind (nicht-erleichternde Nucleinsäuren), zu trennen. Dieser Trennschritt kann durch zahlreiche Verfahren erfolgen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, z.B. Klassiersäulen, Affinitätschromatographie etc. Nach einem solchen Trennschritt wäre das Nucleinsäure-Testgemisch mit erleichternden Nucleinsäuren angereichert.
  • „Amplifizieren" bezeichnet ein beliebiges Verfahren oder eine Kombination von Verfahrensschritten, die die Menge oder Anzahl an Kopien eines Moleküls oder einer Klasse von Molekülen steigert. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Amplifikation durchgeführt, nachdem Elemente des Testgemischs abgetrennt wurden, wobei die erleichternde Nucleinsäure, die an ein erwünschtes Produkt gebunden ist, amplifiziert wird. Die Amplifikation von RNA-Molekülen kann beispielsweise durch eine Reihe von drei Reaktionen erfolgen: Anfertigen von cDNA-Kopien der ausgewählten RNAs, Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion zur Steigerung der Kopienanzahl jeder cDNA und Transkribieren der cDNA-Kopien, um RNA-Moleküle zu erhalten, die dieselben Sequenzen wie die ausgewählten RNAs aufweisen. Eine beliebige Reaktion oder Kombination von Reaktionen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, kann, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, wie geeignet eingesetzt werden, z.B. direkte DNA-Replikation, direkte RNA-Amplifikation und dergleichen. Das Amplifikationsverfahren sollte dazu führen, dass die Anteile des amplifizierten Gemischs die Anteile der verschiedenen Sequenzen in dem Gemisch vor der Amplifikation im Wesentlichen repräsentieren. Es ist bekannt, dass viele Modifikationen in Bezug auf Nucleinsäuren mit enzymatischer Amplifikation kompatibel sind. Modifikationen, die nicht mit Amplifikation kompatibel sind, können, wenn erforderlich, nach jeder Amplifikationsrunde durchgeführt werden.
  • „Randomisiert" ist eine Bezeichnung, die verwendet wird, um ein Nucleinsäuresegment zu beschreiben, das im Prinzip eine beliebige mögliche Sequenz über eine bestimmte Länge aufweist. Randomisierte Sequenzen weisen verschiedene Längen, je nach Wunsch, auf, die von 8 bis zu mehr als 100 Nucleotiden reichen. Die chemischen oder enzymatischen Reaktionen, durch die zufällige Sequenzsegmente hergestellt werden, ergeben aufgrund von unbekannten Einflüssen oder Nucleotidpräferenzen, die vorliegen können, keine mathematisch zufälligen Sequenzen. Die Bezeichnung „randomisiert" wird statt „zufällig" verwendet, um der Möglichkeit solcher Abweichungen vom Nicht-Idealfall Rechnung zu tragen. Bei den derzeit bekannten Techniken, z.B. chemische Sequenzanalyse, ist nicht bekannt, dass es zur großen Abweichungen kommt. Bei kürzeren Segmenten mit 20 Nucleotiden oder weniger würde eine geringere Beeinflussung, die vorhanden sein könnte, vernachlässigbare Auswirkungen haben. Je länger die Sequenzen einer einzigen Synthese sind, desto größer ist die Wirkung einer Beeinflussung.
  • Eine Beeinflussung kann absichtlich in eine randomisierte Sequenz eingeführt werden, beispielsweise indem die Molverhältnisse von Vorläufernucleosid- (oder -desoxynucleosid-) Triphosphaten in der Synthesereaktion geändert werden. Eine beabsichtigte Beeinflussung kann erwünscht sein, um beispielsweise die sekundäre Struktur zu beeinflussen, um eine Einfluss auf Moleküle einzuführen, deren erleich ternde Aktivität bekannt ist, um bestimmte strukturelle Merkmale einzuführen, oder kann auf vorhergehenden Ergebnissen beruhen.
  • Das „SELEX"-Verfahren umfasst die Kombination einer Auswahl von Nucleinsäureliganden, die mit einem Target auf gewünschte Weise in Wechselwirkung treten, beispielsweise in Form der Bindung an ein Protein, wobei die ausgewählten Nucleinsäuren amplifiziert werden. Wiederholte Zyklen der Auswahl-/Amplifikationsschritte ermöglichen die Auswahl von einer oder einer kleinen Anzahl von Nucleinsäuren, die mit dem Target am stärksten in Wechselwirkung treten, aus einem Pool mit einer äußerst großen Anzahl von Nucleinsäuren. Zyklen des Auswahl-/Amplifikationsverfahrens werden wiederholt, bis ein ausgewähltes Ziel erreicht wird. In der vorliegenden Erfindung wird das SELEX-Verfahren eingesetzt, um die Nucleinsäure, die mit einem gewünschten Produkt in Verbindung steht, zu amplifizieren.
  • „Parallel-SELEX" ist ein Verfahren, bei welchem Nucleinsäuren in einem Nucleinsäure-Testgemisch an einen chemischen Reaktanten gebunden sind, welcher dann mit einem Pool von anderen freien chemischen Reaktanten unter günstigen Bedingungen für eine erleichterte Bindungsbildung kontaktiert wird, um eine Produktbibliothek herzustellen. Die Produktbibliothek wird untersucht, um Produkte mit vorbestimmten, erwünschten Eigenschaften zu identifizieren. Das Produkt kann in Bezug auf seine Fähigkeit, auf eine vorbestimmte Weise auf ein bestimmtes Target einzuwirken (z.B. Bindung an das Target, Modifizieren des Targets auf eine Weise etc.), getestet werden. Die erwünschten Produkte können dann von den unerwünschten Produkten getrennt werden. Das erwünschte Produkt bleibt an die erleichternde Nucleinsäure gebunden, die seine Synthese gesteuert hat. Die erleichternde Nucleinsäure kann von dem Rest des Pools getrennt werden und, wie bei dem SELEX-Verfahren beschrieben, amplifiziert werden. Die erleichternde Nucleinsäure kann alleine oder gemeinsam mit ihrem assoziierten Reaktionsprodukt getrennt werden. Die amplifizierten Nucleinsäuren werden in Bezug auf die Nucleinsäuren, die in der Lage sind, die erwünschten Produkte herzustellen, angereichert. Die amplifizierten Nucleinsäuren werden dann erneut an den ersten Reaktanten gebunden, erneut mit den freien Reaktanten kontaktiert, und die wiederholten Zyklen der Auswahl-/Amplifikations schritte des SELEX-Verfahrens werden übernommen, um erwünschte Produkte zu synthetisieren, auszuwählen und zu identifizieren. Die ausgewählten Nucleinsäuren produzieren letztendlich eine ausreichende Menge des erwünschten Produkts, so dass die Struktur bestimmt werden kann.
  • II. DIE REAKTION
  • A. Die Nucleinsäure
  • Parallel-SELEX hängt von der Fähigkeit einer Nucleinsäure ab, die Produktbildung zu fördern. Das Verfahren erfordert zunächst die Herstellung eines Nucleinsäure-Testgemischs. Im Allgemeinen entsprechen das Grundprinzip und die Verfahren zur Herstellung des Nucleinsäure-Testgemischs den in den zuvor beschriebenen SELEX-Patentanmeldungen erläuterten Vorgehensweisen. Kurz gefasst wird ein Nucleinsäure-Testgemisch mit verschiedenen Sequenzen hergestellt. Jede Nucleinsäure in dem Testgemisch umfasst im Allgemeinen Regionen mit fix angeordneten Sequenzen (d.h. jedes Element des Testgemischs umfasst dieselben Sequenzen an derselben Stelle) und Regionen mit randomisierten Sequenzen. Die fix angeordneten Sequenz-Regionen werden ausgewählt, um (a) die detailliert in den SELEX-Patenten beschriebenen Amplifikationsschritte zu unterstützen, (b) eine Sequenz, von der bekannt ist, dass sie eine Reaktion fördert, nachzuahmen, oder (c) die Konzentration von Nucleinsäuren mit einer bestimmten strukturellen Anordnung in dem Testgemisch zu erhöhen. Die randomisierten Sequenzen können vollständig randomisiert (d.h. dass die Wahrscheinlichkeit, eine Base an einer beliebigen Stelle vorzufinden, 1 zu 4 ist) oder teilweise randomisiert (z.B. die Wahrscheinlichkeit, eine Base an einer beliebigen Stelle vorzufinden, kann auf einer beliebigen Ebene zwischen 0 und 100% ausgewählt werden) sein. Die Nucleinsäuren, die in dem Nucleinsäure-Testgemisch zu finden sind, umfassen jene, die in der Lage sind, auf geeignete Weise zu falten, um verschiedene chemische Reaktionen spezifisch zu fördern.
  • Das Nucleinsäure-Testgemisch kann auf verschiedene Weisen modifiziert werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die Nucleinsäuren erleichternde Eigen schaften aufweisen. Die Modifikationen, die von dieser Erfindung in Betracht gezogen werden, sind Modifikationen, die andere chemische Gruppen einführen, die die richtige Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbindung, elektrostatische Wechselwirkung oder Fluxionalität aufweisen und die Form annehmen können, die für das Durchführen der Reaktion erforderlich ist. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass die Mechanismen zur Durchführung der Reaktion die Stabilisierung des Reaktionsübergangszustands, die Erleichterung bestimmter chemischer Reaktionen und die Bindung an den freien Reaktanten auf eine Weise, die diesen nahe an den gebunden Reaktanten heranbringt, umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Die Modifikationen, die die Anzahl der aktiven Stellen der Nucleinsäure steigern können, umfassen hydrophile Gruppierungen, hydrophobe Gruppierungen, Metallatome in verschiedenen Oxidationszuständen, stabile Strukturen, funktionelle Gruppen, die an aktiven Protein-Enzym-Stellen vorkommen, wie z.B. Imidazole, primäre Alkohole, Carboxylate, Guanidiumgruppen, Aminogruppen, Thiole und dergleichen. Zusätzlich dazu können organometallische und anorganische Metallkatalysatoren als die andere chemische Gruppe der Nucleinsäure als Redox-Reaktanten integriert werden.
  • Die einzelnen Komponenten eines Nucleinsäure-Testgemischs können auf verschiedene Weisen modifiziert werden. Geeignete Modifikationen umfassen folgende Modifikationen, sind aber nicht auf diese beschränkt: Modifikationen an jedem Rest der Nucleinsäure, an zufälligen Resten, an allen Pyrimidinen oder Purinen oder allen spezifischen Basen (d.h. G, C, A, T oder U) oder eine Modifikation pro Nucleinsäure. Es wird auch anerkannt, dass bestimmte Moleküle (z.B. Metallkatalysatoren und dergleichen) in Lösung vorliegen können, nicht an die Nucleinsäure gebunden, und für die Vermittlung der Reaktion gemeinsam mit der fördernden Wirkung der Nucleinsäure zweckdienlich sein können. Es wird angenommen, dass, solange die Nucleinsäure, die an den ersten chemischen Reaktanten gebunden ist, auf irgendeine Weise mit der Vermittlung der chemischen Reaktion in Verbindung steht, das Verfahren und die Produkte Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind. Es wird ebenfalls anerkannt, dass Modifikation keine Voraussetzung für die erleichternde Aktivität der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren ist.
  • Unter manchen Umständen kann es wünschenswert sein, Nucleinsäuren, die an ein Target binden, vorab auszuwählen. In dieser Ausführungsform wird der zufällige Nucleinsäure-Pool mehreren SELEX-Runden (1-10) gegen das Zielmolekül unterzogen, bevor der Reaktant an den Nucleinsäure-Pool gebunden wird.
  • i. Modifizieren von Nucleotiden mit anderen chemischen Gruppen
  • Die Nucleotide können auf eine beliebige Art modifiziert werden, umfassend Modifikationen der Ribose- und/oder Phosphat- und/oder Basenpositionen. Bestimmte Modifikationen werden in den US-Parallelanmeldungen Nr. 08/117.991 mit dem Titel „High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides" und Nr. 08/076.735 mit dem Titel „Method for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products" beschrieben. In einer Ausführungsform sind Modifikationen jene, worin eine andere chemische Gruppe an die 5-Position eines Pyrimidins, die 8-Position einer Purins oder die 2'-Position eines Zuckers gebunden ist. Es gibt keine Beschränkung in Bezug auf die Art der anderen chemischen Gruppe, die in die einzelnen Nucleotide inkorporiert werden kann. In den bevorzugten Ausführungsformen ist das resultierende modifizierte Nucleotid amplifizierbar oder kann nach den Amplifikationsschritten modifiziert werden.
  • Als Beispiel, das die Erfindung nicht auf irgendeine Weise einschränken soll, kann eine biomimetische erleichternde Nucleinsäure angeführt werden. Eine Wahl in Bezug auf die Modifikation von Nucleinsäuren ist die Modifikation, die bestimmte Basen in Bezug auf ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften mehr wie Proteine erscheinen lassen würde. Bestimmte Modifikationen von Pyrimidin- und Purinnucleotidbasen können vorgenommen werden, um die Nucleinsäure so wirken zu lassen, als würde sie „Seitenketten", die den Aminosäureseitenketten von Proteinen ähnlich sind, aufweisen. Verschiedene synthetische Verfahren stehen zur Verfügung, um andere chemische Gruppen, in diesem Fall Aminosäuren-Derivate, an die 5-Position eines Pyrimidins oder die 8-Position eines Purins zu binden. Verfahren zur Modifikation von Pyrimidinen an der 5-Position wurden in den US-Patentanmeldungen 08/076.735, 08/347.600 und 08/458.421 gemeinsam mit anderen veröffentlichten Verfahren beschrieben. Zahlreiche veröffentlichte Verfahren sind dafür bekannt, dass sie Nucleinsäuren modifizieren, wie z.B., jedoch nicht ausschließlich, P. A. Limbach et al., Nucleic Acids Res. 22, 2183-2196 (1994), und darin zitierte Verweise; H. Hayakawa et al., Tetrahedron 41, 1675-1683 (1985); G. J. Crouch et al., Nucleosides Nucleotides 13, 939-944 (1994); K. H. Scheit, Chem. Ber. 99, 3884 (1966); D. E. Bergstrom et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 1587-1589 (1975); D. E. Bergstrom et al., J. Am. Chem. Soc. 100, 8106-8112 (1978); D. E. Bergstrom et al., J. Org. Chem. 43, 2870 (1978); D. E. Bergstrom et al., J. Org. Chem. 46, 1432-1441 (1981); D. E. Bergstrom, Nucleosides Nucleotides 1, 1-34 (1982); G. T. Crisp et al., Tetrahedon Lett. 31, 1347-1350 (1990); F. W. Hobbs Jr., J. Org. Chem. 54, 3420-3422 (1989); K. Hirota et al., Synthesis, 213-215 (1993); T. Nagamachi et al., J. Med. Chem. 17, 403-406 (1974); D. H. R. Barton et al., Tetathedron Lett., 279-280 (1979); K. Hirota et al., J. Org. Chem. 57, 5268 (1992); P. Mamos et al., Tetrahedron Lett. 33, 2413-2416 (1992); J. L. Sessler et al., J. Am. Chem. Soc. 115, 10418-10419 (1993); R. A. Long et al., J. Org. Chem. 32, 2751-2756 (1967); T. P. Prakash et al., Tetrahedron 49, 4035 (1993); A. J. Janokowski et al., Nucleosides Nucleotides 8, 339 (1989); A. R. Norris et al., J. Inorg. Biochem. 22, 11-20 (1984); J. G. Moffatt, Nucleoside Analogues, 71-163, R. T. Walker, E. DeClercq, F. Eckstein (Hrsg.), Plenum Press, New York (1979); L. B. Townsend, Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, 59-67, Plenum Press, New York (1988); J. P. H. Verheyden et al., J. Org. Chem. 36, 250-254 (1971); D. Wagner et al., J. Org. Chem. 37, 1876-1878 (1972); B. S. Sproat et al., Oligonucleotides and Analogues. A Pracitcal Approach, 49-86, F. Eckstein (Hrsg.), Oxford University Press, New York (1991); E. A. Lesnik et al., Biochemistry 32, 7832-7838 (1993); B. S. Sproat et al., Nucleic Acids Res. 19, 733-738 (1991); A. Matsuda et al., J. Med. Chem. 34, 234-239 (1991); C. Schmit, Synlett, 238-240 (1994); M. Imazawa et al., J. Org. Chem. 44, 2039-4 (1979); C. Schmit, Synlett, 241-242 (1994); S. W. McCombie et al., Tetrahedron Let. 28, 383-386 (1987); M. Imazawa et al., Chem. Pharm. Bull. 23, 604-610 (1975); K. J. Divakar et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 969-974 (1990); J. H. Marriott et al., Carbohydrate Res. 216, 257-269 (1991); K. J. Divakar et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1625-1628 (1982); J. H. Marriott et al., Tetrahedron Lett. 31, 2646-2657 (1990).
  • Die oben beschriebenen, durch Aminosäuren modifizierten Nucleotide können für native Nucleotide substituiert werden und in die Sequenzen des Nucleinsäure-Testgemischs inkorporiert werden. Nucleotide, die anstatt der oben beschriebenen Aminosäuren mit anderen chemischen Gruppen modifiziert wurden, werden durch diese Erfindung ebenfalls berücksichtigt. Oft kann eine korrekte Vermutung in Bezug darauf angestellt werden, welche modifizierten Nucleotide für die Zugabe zu dem Nucleinsäure-Testgemisch am wünschenswertesten wären. Wenn die Reaktion, die vermittelt werden soll, beispielsweise eine Aldol-Kondensation ist, die durch die Struktur der Klasse-1-Aldolasen geleitet wird, könnte die erforderliche andere chemische Gruppe ein Aminosäure-Derivat sein, das eine primäre Aminogruppe umfasst, um mit dem Carbonylsubstrat ein Imin zu bilden, und eine andere basische Gruppe, um die Bildung des Enamins, das in der Reaktion als Nucleophil dient, zu erleichtern.
  • ii. Modifizieren der Nucleinsäure mit organometallischen Gruppen
  • Eine weitere Modifikation, die in Bezug auf das Nucleinsäure-Testgemisch von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, ist das Inkorporieren eines organometallischen Reagenten in die Sequenzen, die das Nucleinsäure-Testgemisch bilden. Die Verwendung von organometallischen Katalysatoren in der Synthese von komplizierten organischen Strukturen hat die organischen Synthesen revolutioniert. Ein organometallischer Katalysator ist eine beliebige metallische oder organische Ligandensphäre, die in der Lage ist, eine Reaktion zu vermitteln. Die Liganden, die die Koordinationssphäre bilden können, sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Pyridinliganden, Phosphinliganden, Oximliganden, Porphyrine, Isocyanate, Cyanate, Carboxylate, Thiole, Kohlenmonoxid, Alkene, Ether und dergleichen. Zweckdienliche Metalle umfassen Nickel, Rhodium, Cobalt, Palladium, Zirkonium, Aluminium, Eisen, Mangan, Titan, Ruthenium, Molybdän und Bor. Pyridinium-Nickel-Komplexe sind beispielsweise dafür bekannt, dass sie Harnstoff-Hydrolyse katalysieren; Rhodiumacetat-Katalysatoren erleichtern Cyclopropanisierung; Cobalt-Komplexe katalysieren Cyclotrimerisation und [3+2]-Cycloaddition; Palladium katalysiert Hydrierung und [3+2]-Cycloaddition; Ruthenium- und Molybdän-Komplexe katalysieren Olefinmetathese. Zusammengenommen können diese Reak tionen Ringe mit 3, 4, 5, 6 und 7-Elementen herstellen, von denen alle bekannterweise in der Struktur von vielen medizinischen Verbindungen zweckdienlich sind. Größere Ringe können durch eine π-Allyl-Palladium-Katalyse hergestellt werden. Die Bildung von Chiralitätszentren ist wesentlich für die Synthese von vielen biologisch aktiven Verbindungen, und in vielen Fällen kann das falsche Enantiomer schädliche pharmakologische Auswirkungen haben. Eine asymmetrische Hydrierung zur Bildung von einzelnen Enantiomeren wurde durch Palladium- und Zirkonium-Komplexe erzielt.
  • In dieser Ausführungsform stehen verschiedene Optionen zur Verfügung, um den organometallischen Komplex an das Oligonucleotid zu binden. Der organometallische Komplex kann direkt an die Nucleotidbase gebunden werden, wie z.B. an die 5-Position von einem Pyrimidin. Das modifizierte Oligonucleotid sollte mit guter Integrität amplifizierbar sein.
  • In manchen Fällen sollte die Bindung zwischen der Nucleinsäure und dem organometallischen Komplex spaltbar sein, wobei das Oligonucleotid intakt bleiben sollte. Beispiele für spaltbare Bindungen umfassen folgende, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: photochemisch labile Linker, Disulfide und Carbonate. Diese chemischen Bindungseigenschaften sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und könnten eingesetzt werden, um den organometallischen Komplex an das 5'- oder 3'-Ende einer Nucleinsäure oder die 5-Position von Pyrimidinresten in der Nucleinsäure zu binden.
  • Eine weitere Option wäre es, ein Kassetten-Oligonucleotid einzusetzen, das so hergestellt werden kann, dass es einen organometallischen Komplex umfasst. Die Kassetten-Oligonucleotid-Ausführungsform würde eine fix angeordnete Nucleinsäuresequenz umfassen, an die ein organometallischer Komplex gebunden ist, der zu Beginn jeder Auswahlrunde an die Nucleinsäure ligiert werden könnte. Jedes Element des Nucleinsäure-Testgemischs würde eine idente, fix angeordnete Region umfassen, die zu der fix angeordneten Sequenzen der Kassette komplementär ist. Dieses Kassetten-Oligonucleotid kann dem Bedarf nach anderen Konjugationsverfahren vorbeugen.
  • Es kann auch wünschenswert sein, den organometallischen Katalysator in ein Oligonucleotid einzuschließen. Bei manchen dieser Ausführungsformen können die Modifikationen nach jeder Amplifikationsrunde erfolgen. Wenn ein organometallischer Komplex in das Oligonucleotid eingeschlossen wird, kann mehr als eine spaltbare Bindung wünschenswert sein, und die chemische Zusammensetzung jeder spaltbaren Bindung muss einzigartig sein. In dem untenstehenden Schema wird der Bipyridin-Ligand als Beispiel angeführt.
    Figure 00280001
    • X = S-S
    • Y = O-Si[CH(CH3)2]2
    • DTT = Dithiothreit
  • Weil die mit A und B bezeichneten Oligonucleotid-Komponenten chemoselektiv von dem Träger abgespalten werden können, können ihre Sequenzen unabhängig voneinander bestimmt werden. Zusätzlich dazu können A und B aus relativ kurzen Sequenzen bestehen, die leicht durch chemische Methoden hergestellt werden können. Für manche organometallische Komplexe ist es erforderlich, dass das Metall nach der Synthese oder Transkription inkorporiert wird. In diesen Fällen würden die chelatbildenden Liganden, die das Metall binden, wie oben erläutert an das Oligonucleotid gebunden werden und das Metall nach einer Nucleinsäuresynthese oder einer Amplifikation durch Ligandenaustauschreaktionen eingeführt werden.
  • Wie aus den oben bereitgestellten Beispielen ersichtlich wird, gibt es zahlreiche Möglichkeiten, um die Nucleinsäure zu modifizieren und sie so in die Lage zu versetzen, chemische Reaktionen, wie z.B. Bindungsbildung oder Bindungsspaltung, zu vermitteln. Alle Modifikationen von Nucleinsäure werden von dieser Erfindung berücksichtigt.
  • B. Die Reaktanten
  • Im weitesten Sinn bezieht sich die Bezeichnung Reaktanten auf eine beliebige chemische Einheit, die mit der thermischen und chemischen Stabilität von Nucleinsäuren, die an einer bindungsbildenden oder bindungsspaltenden Reaktion beteiligt sein könne, kompatibel sind. Diese Erfindung sollte nicht durch die Art des Reaktanten eingeschränkt werden. Die folgenden Arten von kleinen organischen Molekülen sollen als Beispiele für mögliche Reaktanten, jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung dienen: Alkene, Alkine, Alkohole, Aldehyde, Ketone, Ester, Carbonsäuren, aromatische Carbocyclen, Heterocyclen, Diene, Thiole, Sulfide, Disulfide, Epoxide, Ether und halogenierte Verbindungen. Die Reaktanten weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht im Bereich von 2 bis 1000 auf, besonders bevorzugt im Bereich von 26 bis 500. Wenn die erwünschten Produkte größere Moleküle sind, sind auch die Reaktanten größer, wie z.B. Peptide, Proteine und Polymere. Die Reaktanten können mehr als eine der angeführten Funktionalitäten und Chiralitätszentren aufweisen. Im Allgemeinen steht die Bezeichnung Reaktanten für eine Art von chemischen Reaktanten, die durch ihre chemisch reaktive Einheit (z.B. Dien, Ester etc.) definiert ist. Der chemische Reaktant kann beispielsweise eine Art von Reaktanten sein, die 1 bis 10n verschiedene Elemente der Art umfasst. Die Reaktanten, die für eine bestimmte Reaktion ausgewählt werden, können auch verschiedene Arten von Reaktanten umfassen.
  • An einem Punkt in dem Verfahren der Bestimmung der geeigneten Reaktanten für das Parallel-SELEX-Verfahren muss ein Target identifiziert werden, und eine Wirkungsweise, mit welcher ein erwünschtes Produkt auf dieses Target einwirken würde, muss bestimmt werden. Wenn diese Bestimmung erfolgt ist, kann eine Klasse von Produkten ausgewählt werden, von denen angenommen wird, dass sie die erwünschten Eigenschaften wahrscheinlich aufweisen. Geeignete Reaktanten, die wahrscheinlich zur Herstellung der gewünschten Klasse von Produkten führen, können dann ausgewählt und in das Parallel-SELEX-Verfahren integriert werden.
  • Die Auswahl von Reaktanten kann zufällig bestimmt werden. Vorzugsweise kann die Wahl der Reaktanten jedoch auf einer Reihe von Kriterien beruhen, wie beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, die Auswahl von Reaktanten basierend auf der erwünschten Produktklasse, die durch die ursprünglichen strukturellen Annahmen bestimmt werden kann, die auf der Ähnlichkeit mit bekannten Verbindungen beruht, die eine erwünschte Eigenschaft aufweisen, auf anderen bekannten Liganden, auf Computermodellsimulationen, auf NMR- und Röntgendaten/-Strukturen, auf enzymatischen und chemischen Footprinting-Experimente. Wenn eine Produktklasse identifiziert wurde, werden die Reaktanten so ausgewählt, dass die Variabilität, die erzielt werden kann, maximiert wird. Oft werden Retrosynthese-Verfahren eingesetzt, um mögliche Reaktanten auszuwählen. Zahlreiche Klassen von Reaktanten können gleichzeitig eingesetzt werden.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung wird der Reaktant, der an die Nucleinsäure gebunden ist, als erster Reaktant oder gebundener Reaktant bezeichnet. Typischerweise wird der erste Reaktant mit einer Vielzahl von verschiedenen freien Reaktanten unter für eine erleichterte Bindungsbildung günstigen Bedingungen kontaktiert, und das resultierende Produkt wird getestet, um zu bestimmen, ob es eine vorbestimmte erwünschte Eigenschaft aufweist. Es wird angenommen, dass ein erster Reaktant mit mehr als einem anderen Reaktanten (d.h. einem zweiten, dritten, vierten etc. Reaktanten) chemisch umgesetzt werden kann, um ein Produkt zu bilden. Es wird ebenfalls angenommen, dass mehr als eine Art einer chemischen Reaktion gleichzeitig erfolgen kann. Es wird auch in Betracht gezogen, dass viele Reaktionen gleichzeitig erfolgen, wobei möglicherweise zahlreiche Nucleinsäuren eingesetzt werden, um verschiedene Teile der Produktbildung zu erleichtern. Idealerweise werden Reaktanten so ausgewählt, dass, abhängig von der Fähigkeit der erleichternden Nucleinsäuren, Produkte spezifisch herzustellen, eine Produktbibliothek gebildet wird.
  • C. Binden des Reaktanten an die Nucleinsäure
  • Parallel-SELEX erfordert, dass der erste Reaktant an die Nucleinsäure mit erleichternden Eigenschaften, die in dem Nucleinsäure-Testgemisch vorhanden ist, gebunden ist. Der erste Reaktant ist entweder kovalent oder nicht kovalent an die Nucleinsäure gebunden. Die Bindung kann theoretisch irgendwo an der Nucleinsäure erfolgen. Für praktische Zwecke erfolgt die Bindung jedoch gewöhnlicherweise an den 5'- oder 3'-Enden der Nucleinsäure. Typischerweise erfolgt die Bindung durch eine Ligationsreaktion, aber jede beliebige, bekannte Bindungsreaktion ist akzeptabel. Die Bindung kann direkt sein, wie z.B. durch ein 5'-GMPS oder ein 3'-Didesoxy mit terminaler Transferase oder dergleichen.
  • Die Bindung zwischen der Nucleinsäure und dem Reaktanten kann auch eine Linkergruppe umfassen. Eine solche Linkergruppe kann ermöglichen, dass sich die Nucleinsäure in einer günstigeren Konformation faltet, so dass sie besser mit den Reaktanten in Wechselwirkung treten kann, um die bindungsbildenden Reaktion zu fördern. Die Linkergruppe kann auch ermöglichen, dass der erste Reaktant die gesamte Oberfläche und alle katalytischen Taschen der gefalteten Nucleinsäure sondiert.
  • Die Linkergruppe kann eine beliebige Spacer-Gruppierung sein. Die Linkergruppe sollte ausreichend lang sein, vorzugsweise aus Polymereinheiten bestehen, um eine flexible Bindung zu ermöglichen, die verschiedenen Reaktanten den Zugang zu der gesamten Oberfläche und den Bindungstaschen der gefalteten Nucleinsäure ermöglichen würde. Die optimale Größer des Linkers hängt von der Größe der Nucleinsäure ab. Im Allgemeinen sollte die Größe der Linkergruppe zwischen 10 und 1000 Å, vorzugsweise zwischen 50 und 300 Å, liegen. Die Linkergruppe kann in dem Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch variiert werden, um eine optimale Länge für eine erwünschte Reaktion auszuwählen. Die Linkergruppe sollte auch unter den Reaktionsbedingungen leicht löslich sein. Beispiele für geeignete Linkergruppen sind PEG, Polyvinylalkohol, Polyacrylate und Polypeptide.
  • Die Bindung zwischen der Linkergruppe und der Nucleinsäure ist vorzugsweise spaltbar, wobei die Nucleinsäure intakt bleibt. Beispiele für geeignete spaltbare Bindungen umfassen photochemisch labile Linker, Disulfide und Carbonate, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Bindung kann auch durch Enzyme, wie z.B. DNAse und Proteinasen, spaltbar sein.
  • Zusätzlich dazu kann die Bindung durch das in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/234.997, eingereicht am 28. April 1994, beschriebene „Splint-Blended-SELEX-Verfahren" erfolgen.
  • D. Produktbildung
  • Eine chemische Reaktion findet statt, wenn ein erster Reaktant und zumindest ein zweiter Reaktant in Wechselwirkung treten und ein Produkt bilden oder wenn ein erster Reaktant auf eine Weise gespalten wird, die durch die an ihn gebundene Nucleinsäure gefördert wird. Eine beliebige Anzahl von chemischen Reaktionen ist mit dem Parallel-SELEX-Verfahren kompatibel. Die einzige Voraussetzung ist, dass die Reaktion durch die Nucleinsäure, die an den ersten Reaktanten gebunden ist, vermittelt wird. Vorzugsweise erfolgt die Vermittlung durch die Nucleinsäure spezifisch für die Reaktanten und das gewünschte Produkt, was jedoch nicht immer der Fall ist. Die chemische Reaktionen umfassen bindungsbildende und bindungsspaltende Reaktionen. Verschiedene bindungsbildende Reaktionen werden von dieser Erfindung berücksichtigt, und als Beispiele können Kondensations-/Hydrolysereaktionen, Cycloadditionsreaktionen, wie z.B. Diels-Alder- und En-Reaktion, konjugierte Additionen an α,β-ungesättigte Verbindungen, Aldol-Kondensationen, die Glykosylierung von Peptiden, Zuckern und Lipiden angeführt werden. Zusätzlich dazu können, wenn die Nucleinsäuren in dem Testgemisch modifiziert werden, um einen organometallischen Katalysator in die Nucleinsäure zu integrieren, auch andere Reaktionen, wie beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, Cyclopropanisierung, Hydrierung, Cyclotrimerisation von Alkinen, [3+2]- und [4+1]-Cycloaddition von ungesättigten Molekülen und Olefinmetathese, erfolgen, von welchen alle asymmetrische Moleküle bilden könnten. Diese Erfindung zieht die Verwendung von diesen Reaktionen allein oder gemeinsam in einer beliebigen Kombination in Betracht. Diese Erfindung zieht ebenfalls aufeinander folgende Reaktionen in Betracht, bei welchen ein erstes Produkt mit zwei oder mehreren Reaktanten hergestellt werden kann und dieses Produkt dann ein „Reaktant" mit anderen freien Reaktanten werden kann, um ein zweites Produkt zu bilden, etc.
  • Bindungsspaltende Reaktionen sind auch Teil des Umfangs dieser Erfindung. Eine bindungsspaltende Reaktion hat mehrere Ausführungsformen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, die Spaltung des ersten Reaktanten zur Bildung eines Produkts, das mit einem Target in Wechselwirkung tritt, Spaltung des ersten Reaktanten, so dass er besser in der Lage ist, mit dem zweiten Reaktanten zur Bildung eines neuen Produkts zu reagieren, etc.
  • Die Erfindung umfasst auch Ausführungsformen, in welchen die Produkte, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gebildet werden, an andere Moleküle gebunden werden, wie z.B., jedoch nicht ausschließlich, Markierungen, Antikörper, andere kleine Moleküle etc.
  • Die Reaktion kann/die Reaktionen können unter verschiedenen Bedingungen erfolgen, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind und den Stabilitätsanforderungen der Nucleinsäuren entsprechen. Die Reaktion kann in einem beliebigen gepufferten oder nicht gepufferten wässrigen Lösungsmittel erfolgen, wie z.B. Wasser, Tris, HEPES etc., oder in einem organischen Lösungsmittelsystem mit geeigneten Alkylammonium- oder ähnlichen Gegenionen, wie z.B. Methanol/Wasser, DMSO, DMF/Wasser, mit Triethylammonium-Salz. Der Temperaturbereich ist im Allgemeinen -10°C bis 100°C, vorzugsweise 10°C bis 50°C. Die Konzentration des randomisierten Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs liegt im Allgemeinen im Bereich von 1 pM bis 10 mM, vorzugsweise von 1 bis 100 μM, und die Konzentration des zweiten Reaktanten liegt im Allgemeinen im Bereich von 1 μM bis 10 M, vorzugsweise von 10 μM bis 10 mM.
  • E. Abtrennen der Produkte mit vorbestimmten, erwünschten Eigenschaften
  • Wenn eine chemische Reaktion stattgefunden hat, muss die Produktbibliothek in Bezug auf Produkte, die vorbestimmte, erwünschte Eigenschaften aufweisen, untersucht werden. Wie zuvor beschrieben, können vorbestimmte, erwünschte Eigenschaften das Binden an ein Target, die katalytische Veränderung des Targets, die chemische Umsetzung mit einem Target auf eine Weise, die das Target oder die funktionelle Aktivität des Targets verändert/modifiziert, und die kovalente Bindung an ein Target wie in einem Suizidinhibitor umfassen.
  • Das Target kann eine beliebige Verbindung sein, die von Interesse ist. Das Target kann ohne Einschränkung ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Glycoprotein, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Virus, Substrat, Metabolit, Übergangszustandanalogon, Cofaktor, Inhibitor, Arzneimittel, Farbstoff, Nährstoff, Wachstumsfaktor, eine Zelle, Gewebe etc. sein. Die Bedingungen, unter welchen die Produkte untersucht werden, sind nicht auf die Bedingungen, die für die Produktbildung in Abschnitt D beschrieben wurden, beschränkt. Die Untersuchungsbedingungen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • Produkte, die vorbestimmte, erwünschte Eigenschaften aufweisen, können vom Rest der Produktbibliothek durch verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, abgetrennt werden, während sie weiterhin an die Nucleinsäure gebunden bleiben, die ihre Bildung erleichtert hat. Der Schlüssel ist es, die erwünschten Produkte von der gesamten Produktbibliothek abzutrennen, ohne die gebundene Nucleinsäure chemisch zu beschädigen, so dass die Nucleinsäuren amplifizierbar bleiben. Die Nucleinsäure kann dann amplifiziert werden, während sie weiterhin an das erwünschte Produkt gebunden ist oder nachdem sie von dem erwünschten Produkt getrennt wurde, wie das grundlegende SELEX-Verfahren lehrt.
  • In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wirkt das erwünschte Produkt auf ein Target, ohne dass es zu einer Wechselwirkung zwischen der an das erwünschte Produkt gebundenen Nucleinsäure und dem Target kommt. Die Nucleinsäure erleich tert die Reaktion zwischen dem gebundenen Reaktanten und einem freien Reaktanten, wodurch das erwünschte Produkt gebildet wird, und ist auch so amplifizierbar, dass das erwünschte Produkt in der Folge reproduziert werden und letztendlich in der großen Produktbibliothek identifiziert werden kann. Es wird jedoch in dieser bevorzugten Ausführungsform nicht angenommen, dass die Nucleinsäure direkt mit dem Target in Wechselwirkung tritt.
  • Die Nucleinsäure kann vor dem Kontaktieren mit dem Target modifiziert werden, um sicherzustellen, dass sie nicht mit dem Target in Wechselwirkung tritt. Die Modifikation kann auf mehrere Weisen erfolgen, so kann man die Nucleinsäure beispielsweise doppelsträngig machen, so dass sie weniger in der Lage ist, mit dem Target in Wechselwirkung zu treten. In einer etwas weniger bevorzugten Ausführungsform kann die Nucleinsäure auf das Target wirken, entweder unabhängig von oder gemeinsam mit dem erwünschten Produkt, dessen Synthese sie erleichtert hat. In dieser Ausführungsform könnte das Endprodukt eine Kombination des Produkts mit der gebundenen Nucleinsäure sein.
  • In einer Ausführungsform bindet das Produkt an das Target, und der gebundene Nucleinsäure-Produkt-Target-Komplex kann von ungebundenen Produkten durch eine Reihe von Verfahren getrennt werden. Die Verfahren umfassen Nitrocellulosefilterbindung, Säulenchromatographie, Filtration, Affinitätschromatographie, Zentrifugation und andere bekannte Verfahren. Kurz gesagt, wird die Produktbibliothek einem Trennverfahren unterzogen, wie z.B. durch eine Säule, an die das Target gebunden ist. Alle Nucleinsäuren, die keine Produkte gebildet haben, oder jene, die an unerwünschte Produkte gebunden sind, passieren die Säule oder können mittels Counter-SELEX entfernt werden. Erwünschte Produkte werden an die Säule gebunden und können durch die Veränderung der Bedingungen der Säule (z.B. Salz etc.) eluiert werden, oder die Nucleinsäure, die an das erwünschte Produkt gebunden ist, kann von dem Produkt abgespalten und direkt eluiert werden.
  • Zusätzlich dazu können Produkte, die mit einem Target reagieren, von den Produkten, die nicht mit dem Target reagieren, getrennt werden. In einem Beispiel kann ein Produkt, das kovalent an das Target bindet (wie z.B. ein Suizidinhibitor) unter sehr stringenten Bedingungen gewaschen werden. Der resultierende Produkt-Target-Komplex kann mit Proteinase, DNAse oder anderen geeigneten Reaktionsmitteln behandelt werden, um einen Linker zu spalten und die an die erwünschten Produkte gebundenen Nucleinsäuren freizusetzen. Die freigesetzten Nucleinsäuren können amplifiziert werden.
  • In einem anderen Beispiel ist die vorbestimmte, erwünschte Eigenschaft des erwünschten Produkts die Fähigkeit, eine chemische Gruppe auf das Target zu übertragen (wie z.B. Acyltransfer) und dabei das Target zu inaktivieren. Man könnte eine Produktbibliothek haben, in welcher alle Produkte eine chemische Thioestergruppe aufweisen. Bei Kontakt mit dem Target übertragen die erwünschten Produkte die chemische Gruppe auf das Target, wodurch sie gleichzeitig das erwünschte Produkt von einem Thioester in ein Thiol umwandeln. Deshalb ermöglicht ein Trennverfahren, das die Produkte, die nun Thiole (statt Thioester) sind, identifizieren würde, die Auswahl der erwünschten Produkte und die Amplifikation der mit diesen verbundenen Nucleinsäure.
  • Es gibt andere Trenn- und Untersuchungsverfahren, die mit dieser Erfindung kompatibel sind und einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. In einer Ausführungsform können die Produkte durch eine Reihe von herkömmlichen Verfahren fraktioniert werden, und dann wird jede Fraktion in Bezug auf ihre Aktivität untersucht. Das Fraktionierungsverfahren kann Größe, pH-Wert, Hydrophobizität etc. umfassen.
  • Wie zuvor beschrieben, kann das SELEX-Verfahren andere Ausführungsformen umfassen, die für das erfolgreiche Abtrennen der erwünschten Produkte angewandt werden könnten, und die Photo-SELEX, Counter-SELEX etc. umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
  • In einer Ausführungsform wird die Nucleinsäure vor dem Schritt des Trennens so behandelt, dass es weniger wahrscheinlich ist, dass sie mit dem Target in Wechselwir kung tritt. Beispielsweise kann die Nucleinsäure vor dem Trennen doppelsträngig gemacht werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Nucleinsäure-Testgemisch, bevor der Reaktant an die Nucleinsäure gebunden wird, durch Counter-SELEX getrennt werden, um Nucleinsäuren zu eliminieren, die direkt auf das Target wirken.
  • F. Amplifikation
  • Die Amplifikation der Nucleinsäure, die die Synthese des Produkts mit erwünschten Eigenschaften steuert, erfolgt wie in Zusammenhang mit dem grundlegenden SELEX-Verfahren beschrieben, wobei Verfahren eingesetzt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Wenn erforderlich oder erwünscht, kann jede Modifikation oder jedes andere zugesetzte Merkmal (wie z.B. die Linkergruppe) vor der Amplifikation entfernt werden. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist beispielsweise ein Verfahren zur Amplifizierung von Nucleinsäuren. Beschreibungen von PCR-Verfahren sind beispielsweise in Saiki et al., Science 230, 1350-1354 (1985); Saiki et al., Nature 324, 163-166 (1986); Scharf et al., Science 233, 1076-1078 (1986); Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 9436-9440 (1988); und in US-Patent Nr. 4.683.195 (Mullis et al.) und US-Patent Nr. 4.683.202 (Mullis et al.) zu finden. In ihrer grundlegenden Form umfasst die PCR-Amplifikation wiederholte Zyklen der Replikation der erwünschten einsträngigen DNA oder cDNA-Kopie einer RNA unter Einsatz von spezifischen Oligonucleotid-Primern, die zu den 3'- und 5'-Enden der ssDNA komplementär sind, die Primer-Extension mit einer DNA-Polymerase und DNA-Denaturierung. Produkte, die durch die Extension eines Primers erzeugt werden, dienen als Matrize für die Extension von dem anderen Primer. Andere bekannte Amplifikationsverfahren werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
  • Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) ist ein Beispiel für ein alternatives Trennverfahren (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 392-396 (1992); Walker et al., Nucleic Acids Research 20, 1691-1696 (1992)). SDA ist eine Technik für die Amplifikation von ssDNA ausgehend von ssDNA, die einige Ähnlichkeiten mit PCR hat. Wie die PCR setzt die SDA einen Satz von zwei konvergenten Primern ein, um die DNA zu amplifizieren, die zwischen den Primern liegt, und erfordert die Aktivität einer DNA-Polymerase, um das zu erreichen. Die SDA nutzt auch ein exponentielles Amplifikationsschema, in dem die neu synthetisierte DNA als Matrize für eine weitere DNA-Synthese dient. Anders als die PCR wird die SDA bei einer konstanten Temperatur (~ 40°C) durchgeführt und beruht auf der Fähigkeit einer bestimmten Art von Polymerasen, einen zuvor synthetisierten DNA-Strang aus der Matrize zu verdrängen, während sie einen neuen Strang synthetisiert. Das ersetzt den thermischen Denaturierungsschritt, der bei der PCR eingesetzt wird. Die SDA erfordert das Einwirken eines zusätzlichen Enzyms, einer Restriktions-Endonuclease, um einen Bruch in einer ds-DNA-Matrize zu erzeugen. Die DNA auf der 3'-Seite des Bruchs dient als Primer für eine neue DNA-Synthese, während die DNA auf der 5'-Seite des Bruchs durch die DNA-Polymerase in die Lösung verdrängt wird, wo sie sich wieder mit einem der SDA-Primer verbinden und als Matrize für eine weitere DNA-Synthese dienen kann. Wenn DNA-Liganden erwünscht sind, weist die SDA eine Reihe von Vorteilen für ein Parallel-SELEX-Verfahren auf. Das SDA-Verfahren nutzt die DNA-Polymerase-Klenow-Exo(-) für die Synthese von DNA, eine gut beschriebene Polymerase, von der bekannt ist, dass sie bestimmte modifizierte dNTPs leicht hinzufügt. Da sie gut beschrieben ist, sollte es einfacher sein, angemessene Entscheidungen in Bezug zu treffen, welche modifizierten dNTPs hergestellt werden sollen. Ein einfaches Schema könnte ausgearbeitet werden, in dem eine Primer-Extension die Ligation für die Bindung des DNA-Liganden an die gebundene reaktive Gruppe ersetzt. SDA weist ähnliche Amplifikationseigenschaften wie eine PCR auf (für DNA, die < 200 nt lang ist), kann aber unter Einsatz von weniger spezialisierter Ausstattung in kürzerer Zeit durchgeführt werden.
  • Die amplifizierte Nucleinsäure wird dann, wenn erforderlich, einer Post-Amplifikations-Modifikation unterzogen, erneut an den ersten Reaktanten gebunden, und das Verfahren wird wie oben beschrieben fortgesetzt. Das Verfahren wird so oft wiederholt wie notwendig ist, um die Nucleinsäuren so anzureichern, dass sie die geeignete erleichternde Aktivität aufweisen und/oder bis die erwünschten Produkte, die die maximal erwünschten Eigenschaften aufweisen, erhalten werden. Es ist absolut möglich, dass eine Runde Parallel-SELEX ausreicht, um ein Produkt mit erwünsch ten Eigenschaften zu erhalten. Der Endpunkt kann durch viele Verfahren bestimmt werden, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Bindungskurven, durch IC50-Werte bestimmte Inhibition, Inaktivierungsraten, Toxizitätsprofile, Bioverfügbarkeit, Pharmakokinetik etc.
  • G. Analyse der erwünschten Produkte
  • Nach der Amplifikation der erleichternden Nucleinsäure und der Herstellung einer ausreichenden Menge des erwünschten Produkts kann die Struktur eines oder einer Reihe von erwünschten Produkten durch herkömmliche spektroskopische Verfahren bestimmt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Dafür müssen die ursprünglichen Reaktionsbedingungen auf geeignete Weise wiederholt werden. Der erste Reaktant sollte erneut an die erleichternde Nucleinsäure gebunden, das resultierende Nucleinsäure-Reaktanten-Gemisch mit dem Pool von zweiten Reaktanten gemischt und das resultierende, erwünschte Produkt gebildet und isoliert werden. Die Annahme, aufgrund derer dieses Verfahren am wirksamsten ist, besteht darin, dass die Nucleinsäure die einzelnen Reaktionen oder zumindest eine relativ kleine Anzahl von Reaktionen, umfassend die erwünschte Reaktion, spezifisch erleichtern wird. Die herkömmlichen spektroskopischen Verfahren umfassen folgende, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: NMR-Spektroskopie, Massenspektroskopie, HPLC-Spektroskopie, Infrarot-Spektroskopie, UV-VIS-Spektroskopie, Zirkulardichroismus, Polarimetrie und Röntgenkristallographie. Wenn die Struktur des erwünschten Produkts identifiziert wurde, kann es in großen Mengen hergestellt werden, entweder durch herkömmliche chemische Syntheseverfahren oder durch Verfahren, die hierin für die Herstellung unter Einsatz einer erleichternden Nucleinsäure erläutert werden.
  • III. Allgemeine Beispiele
  • Die folgenden allgemeinen Beispiele werden angeführt, um das Parallel-SELEX-Verfahren zusätzlich zu beschreiben. Das grundlegendste Schema für das Parallel-SELEX-Verfahren wird in 1 dargestellt. Die folgenden Beispiele beschreiben eine das Untersuchen von Reaktionen, die von der Erfindung berücksichtigt werden, detaillierter. Diese Bespiele sollen der Veranschaulichung dienen und nicht den Umfang der Erfindung auf irgendeine Weise einschränken.
  • a. Eine Diels-Alder Reaktion
  • Die folgende Erläuterung beschreibt, wie RNA-Erleichterer und ein niedermolekulares Cyclohexenprodukt, die an ein generisches Target binden, unter Einsatz der in 2 dargestellten Diels-Alder-Reaktion gemeinsam hergestellt werden können. Eine weitere Version dieses Beispiels für ein Parallel-SELEX-Verfahren könnte DNA einsetzen, und in manchen Fällen kann DNA gegenüber RNA zu bevorzugen sein.
  • Die Ausgangs-RNA (A in 2) würde fix angeordnete 3'- und 5'-Regionen umfassen, um Transkription zu ermöglichen, sowie eine Ligationsstelle für die Konjugation an einen PEG-Spacer, der wiederum an ein Dienophil, das als erster Reaktant dient, gebunden ist. Die Ausgangs-RNA (A) weist randomisierte Regionen auf, die aus etwa 4N verschiedenen Sequenzen bestehen, wobei N der Anzahl der Nucleotide in der RNA-Sequenz entspricht; die genaue Anzahl hängt von der Länge der zufälligen Region und dem für die Herstellung verwendeten Maßstab für die RNA-Synthese ab. Der PEG-Spacer würde eine ausreichende Anzahl an Polymereinheiten umfassen, um eine flexible Bindung zu ermöglichen, die dem ersten Reaktanten, einem Dienophil, Zugang zu der gesamten Oberfläche und den Bindungstaschen der gefalteten RNA (C und D in 2) ermöglicht. Die Ausgangs-RNA (A), die an den ersten Reaktanten gebunden ist, wird der Klarheit wegen als lineare Struktur dargestellt. Die tatsächlichen RNA-Strukturen bestehen aus verschiedenen gefalteten Motiven, wie durch C und D dargestellt.
  • In diesem Beispiel umfasst Schritt 1 einen Pool von 10 zweiten Reaktanten, Diensubstraten, die als B1-10 bezeichnet sind, worin die Gruppen R1, R2 und R3 nicht Wasserstoff sind. Es gibt keinen Grund, dass der Pool nicht ausgeweitet werden könnte, um die zweiten Reaktanten, Diene, zu umfassen, in welchen eine oder alle der Gruppen R1, R2 und R3 Wasserstoff sind. Das würde nur zur Bildung einer gerin geren Anzahl von Stereozentren führen. Die Strukturen C und D stellen zwei Möglichkeiten für den Ansatz des ersten Reaktanten, eines Dienophils, dar. Jedes Regioisomer weist vier mögliche Stereoisomere auf, die gebildet werden können, und wenn alle hergestellt werden, werden 11 Verbindungen in 80 umgewandelt. Die im Diagramm dargestellten Strukturelemente a und b stellen theoretische Ausbauchungen in der RNA dar, die mit dem zweiten Reaktanten, einem Dien, oder dem ersten Reaktanten, einem Dienophil, in Wechselwirkung treten können, um die Orientierung des zweiten Reaktanten, des Diens, und den Ansatz des zweiten Reaktanten, des Diens, im Übergangszustand zu bestimmen. Wenn für E1-10 beispielsweise R3 kleiner als R2 ist, würde die bevorzugte Orientierung des Diens die Bildung von E/E* und F/F* im Gegensatz zu G/G* und H/H* begünstigen, da es zu sterischen Interferenzen zwischen den RNA-Merkmalen b und der Dienophil-Gruppe R2 kommt. Bei Ansatz C werden die Enantiomere E/E* und F/F* gebildet. Die anziehende Wechselwirkung, wie z.B. Wasserstoffbindung, zwischen dem Dienophil-Carboxylat-Sauerstoff und der mit a bezeichneten RNA-Region würde die Bildung der Endo-Produkte erleichtern. Anziehungskräfte zwischen R1 und der mit b bezeichneten RNA-Oberfläche könnte ebenfalls einen Endo-Angriff begünstigen. Im Gegensatz dazu könnten die RNA-Strukturmerkmale a und b in abstoßende Wechselwirkung mit dem Carboxylat und R1 des Dienophils treten, wodurch Exo-Produkte gebildet werden würden. Es ist anzumerken, dass das Verhältnis zwischen den Paaren E/E* und F/F* diastereomer ist, so dass sie selbst bei identischen Substituenten R1, R2 und R3 verschiedene physikalische Eigenschaften aufweisen. Bei Ansatz D werden die Enantiomere G/G* und H/H* gebildet, und das Verhältnis zwischen den Paaren G/G* und H/H* ist diastereomer. Weil das Oligonucleotid jedoch eine inhärente Chiralität aufweist, weist die erleichternde Stelle der RNA eine energetisch verschiedene, diastereomere Wechselwirkung mit dem Übergangszustand der enantiomeren Paare auf, was eine hohe Enantioselektivität ermöglichen könnte, auch wenn der Energieunterschied gering ist (ΔΔGǂ 3-4 kcal/mol).
  • Die Auswahl der erwünschten Cyclohexen-Produkte wird in Schritt 2 beschrieben. Wenn das Target ein Protein ist und das erwünschte Produkt so ausgewählt wird, dass es an das Target bindet, könnte Schritt 2 anfangs unter Target-Protein- Überschuss erfolgen, und die Proteinkonzentration wurde dann gesenkt werden, wenn die Anreicherung des erwünschten Cyclohexenprodukts zunimmt. Beispiele für Target-Proteine könnten Enzyme, Hormone, Zellrezeptoren, Zelladhäsionsmoleküle etc. umfassen. In einem kompetitiven Test werden die erwünschten Produkte mit der höchsten Affinität gebunden. Das könnte anfangs zu der Auswahl der vollständigen Gruppen, wie z.B. E/E* und F/F*, führen. Für dieses Beispiel wird angenommen, dass ein Enantiomer-Satz ausgewählt wird, z.B. E, weil es fester an das Target-Protein bindet, und für die Zwecke des Beispiels weisen nur 5 der 10 möglichen Strukturen eine vergleichbare Affinität auf. (Es ist anzumerken, dass a priori kein Grund für die Annahme besteht, dass erwünschte Produkte, die von jedem der Diastereomere stammen, nicht erhalten werden könnten.)
  • Die ausgewählten erwünschten Produkte und die an sie gebundenen, mit ihnen gebildeten RNA-Erleichterer werden von den unerwünschten Produkten getrennt, und die RNA-Erleichterer werden mittels der herkömmlichen SELEX-Verfahren von Schritt 3 bis 5 amplifiziert. Nach Schritt 5 waren die RNAs an erleichternder Aktivität angereichert, die besonders die Gruppe E der Verbindungen bildet. Es könnten mehr als 5 RNAs an diesem Punkt vorhanden sein. Um weitere SELEX-Runden durchzuführen, wäre Schritt 6 erforderlich, im Zuge dessen der ursprüngliche PEG-Spacer mit dem ersten Reaktanten, dem Dienophil, an den neuen angereicherten RNA-Pool ligiert wird. Die Wiederholung der Schritte 1 bis 6 könnte die erleichternde Aktivität der nach Schritt 5 erhaltenen RNA weiter anreichern. Zusätzlich dazu könnte die Bindungsaffinität der erwünschten Cyclohexen-Produkte ein Maximum erreichen. Wenn man annimmt, dass der RNA-Pool nun nicht zufällig ist, könnten die einzelnen RNA-Moleküle durch Klonieren und Sequenzieren der verschiedenen RNAs in Bezug auf ihre erleichternde Aktivität getestet werden. Die Behandlung dieser RNA-Moleküle mit demselben ersten und zweiten Reaktanten, Dienophil und Dien, würde notwendigerweise zu der Bildung des erwünschten, gleichzeitig entwickelten Cyclohexen-Produkts führen. Nach der Herstellung von ausreichenden Mengen des RNA-Erleichterers wird die Struktur eines oder einer Reihe von erwünschten Cyclohexen-Produkten durch herkömmliche spektroskopische Verfahren bestimmt.
  • Das oben angeführte Beispiel betraf einen einzelnen ersten Reaktanten, Dienophil, der mit einem Pool von 10 zweiten Reaktanten, Dienen, behandelt wurde. Die Anzahl der als erste Reaktanten dienenden Dienophile, die an dem Coevolutionsverfahren beteiligt sind, kann auch erweitert werden, indem einfach eine Reihe von verschiedenen ersten Reaktanten, Dienophilen, an die Ligationssequenz gebunden wird. Nach der Coevolution, dem Klonieren und Sequenzieren der einzelnen RNA-Erleichterer würden sie dann mit dem Gemisch aus ersten und zweiten Reaktanten, Dienen und Dienophilen, behandelt werden, so dass die einzelnen erwünschten Produkte, die durch die erleichternde RNA gebildet wurden, in ausreichender Menge hergestellt werden würden, um eine spektroskopische Strukturidentifikation durchführen zu können. Da in dem oben angeführten Parallel-SELEX-Beispiel der erste Reaktant, das Dienophil, an die RNA gebunden ist, wird angenommen, dass die erleichternde RNA spezifisch für die Reaktion des gebundenen ersten Reaktanten, des Dienophils, ist, im Gegensatz zu den an andere RNAs gebundenen. Es kann sich herausstellen, dass die Behandlung einer einzigen erleichternden RNA mit einem Pool von ersten und zweiten Reaktanten, Dienen und Dienophilen, zu einer sehr spezifischen Reaktion in Bezug auf den zweiten Reaktanten, Dien, führt, da das ausgewählt wurde, jedoch eine geringe Selektivität für den ersten Reaktanten, das Dienophil, aufweist, da dieses während der Auswahl gebunden ist.
  • Andererseits könnte, wenn die ersten und die zweiten Reaktanten variiert werden, eine Spezifizität für beide Reaktanten erzielt werden. Es wäre eine verbesserte Ausführungsform, wenn die Ligationssequenz eingesetzt werden würde, um für den ersten Reaktanten, das Dienophil, zu kodieren, das an eine bestimmte Nucleinsäure, wie in 3 dargestellt, gebunden ist, wodurch eine Ausweitung der Matrix ermöglicht würde. Unter Einsatz dieses Ansatzes würde beim Klonieren und Sequenzieren der einzelnen erleichternden RNAs die Sequenz der Ligationsstelle den ersten Reaktanten, Dienophil, anzeigen, der durch eine PEG-Linker an sie gebunden wurde. Auf diese Weise würde der erste Reaktant, das Dienophil, das einer bestimmten erleichternden RNA entspricht, letztlich für die Herstellung des entwickelten, erwünschten Produkts herangezogen werden. Es ist anzumerken, dass es keinen Grund gibt, warum ein komplementäres Experiment zu dem in 2 vorgeschlagenen nicht einge setzt werden könnte, wobei ein einziger erster Reaktant, ein Dien, an die RNA-Ligationssequenz gebunden wird und ein Pool von zweiten Reaktanten, Dienophilen, in Schritt 1 eingeführt wird. Es ist ebenfalls möglich, mehrere erste Reaktanten und einen zweiten Reaktanten einzusetzen.
  • Die Diels-Alder-Reaktion ist nur eine einer Reihe von sehr leistungsstarken, asymmetrischen bindungsbildenden Reaktionen.
  • b. Eine Aldol-Reaktion
  • Eine weitere Reaktionsart, die in der synthetischen und biosynthetischen Chemie zweckdienlich ist, ist die Aldol-Kondensation. Die grundlegenden Prinzipien, die in Zusammenhang mit der Diels-Alder-Reaktion erläutert wurden, gelten auch für die Aldol-Reaktion, wobei ein oder mehrere Aldehyde ein Reaktant sind und ein oder mehrere Ketone ein anderer Reaktant sind. Eine logische Variation für die Anpassung eines Parallel-SELEX-Verfahrens an eine Aldol-Kondensation wird im folgenden Beispiel sowie in 4 beschrieben. Die RNA (oder DNA) umfasst eine fix angeordnete 3'- und 5'-Region für die Transkription. An die RNA ist ein PEG-Linker (20-50 Ethyleneinheiten lang) gebunden, an den wiederum ein erster Reaktant, ein Aldehyd, gebunden ist. Der erste Reaktant, der Aldehyd, dient als Elektrophil in der Aldol-Reaktion, da er im Vergleich mit dem zweiten Reaktanten, dem Keton, eine höhere Aktivität aufweist. Der mit A bezeichnete Pool von RNA-Sequenzen würde sich zu verschiedenen strukturellen Motiven falten. Die mit B1-10 bezeichneten Ketone, die als zweiter Reaktant dienen, weisen verschiedene chemische Gruppen R1 und R2 auf und würden mit A in Schritt 1 von 4 behandelt werden. Die RNA müsste ein Amin umfassen, das in der Lage ist, an das Carbonyl der Ketone zu binden und ein Enamin zu bilden, das mit C1-10, D1-10, E1-10 und F1-10 bezeichnet ist. Die Form der RNA bestimmt, ob das E- oder Z-Enamin gebildet wird. Das Enamin würde dann als Nucleophil in der Aldol-Reaktion mit dem gebundenen Aldehyd dienen. Das sterische und elektronische Umfeld der RNA, die das Enamin umgibt, bestimmt das Ausmaß der Enantioselektivität, die für eine bestimmte RNA-Sequenz beobachtet wird.
  • Für die Zwecke dieses Beispiels stammen die Aldol-Kondensationsprodukte G1-10, H1-10, G*1-10 und H*1-10 von dem Angriff des ersten Reaktanten, des Aldehyds, aus derselben Fläche. Es ist möglich, dass dasselbe Produkt durch einen Ansatz von der gegenüberliegenden Fläche aus gewonnen wird, wenn ein anderes Enamin und eine andere relative Orientierung des ersten Reaktanten, des Aldehyds, vorliegt, und dass das vorkommt, ist wahrscheinlich. Es ist wichtig, dass die zwei neuen Chiralitätszentren so gebildet werden, dass alle 40 Produkte als G1-10, H1-10, G*1-10 und H*1-10 dargestellt werden. Die Aldol-Produkte G1-10/G*1-10 sind wie H1-10/H*1-10 Enantiomere.
  • In Wasser ist die Imin-Bindung von G1-10, H1-10, G*1-10 und H*1-10 reversibel und wird hydrolysiert, um die entsprechenden β-Ketoalkoholprodukte zu erhalten. Die Auswahl der erwünschten β-Ketoalkoholprodukte mit der höchsten Affinität erfolgt durch die Trennung der resultierenden Produktbibliothek, wobei das Target-Protein an ein Biotin oder einen Säulenträger gebunden ist. Nachdem eine Äquilibrierung möglich gemacht wurde, wird die ausgewählte RNA durch herkömmliche SELEX-Techniken, wie in den Schritten 3-5 in 3 dargestellt, amplifiziert.
  • Wenn ein maximales Erleichterungsausmaß erreicht wurde oder sich die Bindungsaffinität in Bezug auf das Target einpendelt, würde die an die erwünschten Produkte gebundene, erleichternde RNA kloniert und sequenziert werden. Die erleichternde RNA könnte dann getrennt hergestellt werden, und die Synthese der entsprechenden, erwünschten β-Ketoalkoholprodukte würde in einem Ausmaß erfolgen, das für die Isolation ausreicht, gefolgt von der strukturellen Charakterisierung durch spektroskopische Verfahren.
  • Wie bei dem Diels-Alder-Beispiel könnte der Satz an als erster Reaktant dienenden Aldehyden, die in dem Parallel-SELEX-Verfahren eingesetzt werden, dadurch erweitert werden, dass andere Aldehyde als erster Reaktant an den PEG-Linker gebunden werden und die Ligationssequenz kodieren, für die der erste Reaktant, die Aldehyde, an die Nucleinsäuren gebunden wurden.
  • Ausgehend von dem oben erläuterten Diels-Alder-Reaktionsbeispiel wird ein Faktor von 4 für die Bildung von zwei Stereozentren erhalten. Die Aldol-Kondensation weist jedoch das Potential auf, weitaus mehr Möglichkeiten als diese zu bilden. Man muss nur die gemischte Aldol-Reaktion in Betracht ziehen, im Zuge derer zwei Ketone als erster und zweiter Reaktant eingesetzt werden, die eine vergleichbare Elektrophilie am Carbonylkohlenstoff und eine ähnliche Nucleophilie an den α-Kohlenstoffen aufweisen (5). Typischerweise wird bei einer organischen Synthese diese Reaktionsart vermieden, da ein sehr komplexes Produktgemisch entstehen kann. In der Parallel-SELEX-Strategie könnte diese gesteigerte Diversität einen zusätzlichen Vorteil bringen. Die Strukturen C, D, E, F, G, H, I und J sind alle verschiedene Diastereomere. Jedes dieser Produkte weist ein entsprechendes Enantiomer auf, was bedeutet, dass in der gemischten Aldol-Kondensationsreaktion aus 4 1600 Produkte mit verschiedenen Strukturen ausgehend von den ursprünglichen 20 (A1-10 und B1-10) gebildet werden.
  • c. [2+2+2]-Cyclotrimerisationsreaktionen
  • Die parallele Auswahl und Coevolution der erleichternden RNA und des erwünschten Produkts ist nicht auf die Bildung von Produkten mit Strukturen beschränkt, die Chiralitätszentren schaffen. Viele wichtige medizinische Verbindungen umfassen achirale aromatische Gruppen mit daran gebundenen chiralen Substituenten. Eines der leistungsstärksten Verfahren zur Konstruktion von Produkten, die aromatische Ringsysteme (z.B. Benzole, Naphthaline, Pryridine etc.) umfassen, ist eine durch Cyclopentadienylcobalt (CpCo) vermittelte Cyclotrimerisation von einem ersten, zweiten und dritten Reaktanten, alles Alkine. Es ist anzumerken, dass eine [2+2+2]-Cyclotrimerisation nicht auf Alkin-Reaktanten beschränkt ist und dass nicht-aromatische Ring-Produkte mit 6 Elementen durch die Kombination von Alkin- und Alken-Reaktanten gebildet werden können.
  • Das hierin erläuterte Beispiel umfasst die Ausführungsform der Erfindung, wobei ein organometallischer Katalysator in die RNA (oder DNA) integriert wird, und die Verwendung in einem Parallel-SELEX-Verfahren. Die oben beschriebenen und in 2 und 4 dargestellten Schritte 1-6 haben alle Parallel-SELEX-Verfahren gemein, weshalb nur der Einfluss der Cyclotrimerisation auf die mögliche Anzahl der Produktstrukturen hier erläutert wird. Für die Cyclotrimerisation von drei Alkin-Reaktanten zur Bildung eines Produkts, das einen Benzolring umfasst, wird die maximale Anzahl an Möglichkeiten erhalten, wenn drei verschiedene Alkin-Reaktanten, die verschiedene, an jedes Ende jedes Reaktanten gebundene Substituenten aufweisen, eingesetzt werden (Darstellung in 6).
  • Bei einer wie in 6 dargestellten Cyclotrimerisation von Alkin-Reaktanten gibt es 4MN2 mögliche Regioisomerprodukte, wobei M = die Zahl der nicht symmetrischen Alkine, die als erste Reaktanten an die RNA gebunden sind, und N = die Anzahl der freien, nicht symmetrischen Alkine ist, die als zweite und dritte Reaktanten dienen und mit dem Gemisch aus RNA und dem ersten Reaktanten kontaktiert werden. 6 zeigt die Matrix der Möglichkeiten für 3 Alkin-Reaktanten, wobei der erste Reaktant an die RNA gebunden ist und der zweite und dritte Reaktant ungebunden sind. Wenn das Parallel-SELEX-Verfahren auf 10 Alkine als erste Reaktanten, die an die RNA-Moleküle gebunden sind, und 10 zweite und dritte Reaktanten ausgeweitet wird, könnten 4.000 Benzolprodukte hergestellt werden.
  • Der Mechanismus einer durch CpCo katalysierten Cyclotrimerisation von Alkin-Reaktanten wird in dem untersten Feld von 6 angeführt. Indem CpCo (oder ein anderer Metallkomplex, der in der Lage ist, Alkine zu zyklisieren) an ein wie oben beschriebenes Oligonucleotid gebunden wird, kann es möglich sein, eine cyclotrimerisierende, erleichternde RNA zu bilden. RNA-Strukturen, die um das organometallische Zentrum herum gefaltet sind, stellen eine Tasche bereit, die in einem der in 6. B→C oder C→D dargestellten, bindungsbildenden Schritte Selektivität verleihen. Der Einsatz der Trennung von Parallel-SELEX sollte die Spezifizität für die Synthese der erwünschten Benzolprodukte zur Verfügung stellen. Beim Klonieren und der Herstellung von ausreichenden Mengen der erleichternden RNA können die mitentwickelten aromatischen Produkte/das mitentwickelte aromatische Produkt hergestellt werden, indem die RNA mit dem Alkinreaktanten-Gemisch, das bei der Auswahl ein gesetzt wird, behandelt wird. Das so erhaltene aromatische Produkt kann dann durch herkömmliche Verfahren strukturell charakterisiert werden.
  • d. Retrosynthetische Strategien
  • Im Allgemeinen wird angenommen, dass alle Parallel-SELEX-Schemen die Schritte 1-6, wie oben beschrieben und in den 2 und 4 dargestellt, gemeinsam haben. Verschiedene chemische Zusammensetzungen verändern nur die Art und die Anzahl der gebildeten Produkte. Wenn erwogen wird, welche chemische Zusammensetzung oder welche chemische Zusammensetzungen am besten in dem Parallel-SELEX-Verfahren eingesetzt werden soll, kann es hilfreich sein, eine retrosynthetische Analyse der strukturellen Produktklasse von Interesse durchzuführen. Betrachten Sie 7 und die möglichen Trennungen für das angeführte Produkt. Die Trennung A würde eine Diels-Alder-Transformation und B eine Aldol-Kondensation umfassen. Diese beiden bindungsbildenden Verfahren wurden oben erläutert. Es gibt viele weitere Trennungen, die für dieses Produkt erfolgen könnten. Im Allgemeinen sind retrosynthetische Strategien, die ringbildenden Produkttransformationen umfassen, wünschenswert, da die größte Anzahl an Bindungen oder Stereozentren gebildet wird. Wenn erwogen wird, welche Reaktionsarten für Parallel-SELEX am leistungsstärksten sind, müssen möglicherweise andere Faktoren in Betracht gezogen werden. Beispielsweise die Verfügbarkeit von Reagenzien und die Reaktivität und die Stabilität von Oligonucleotiden unter den Reaktionsbedingungen. Die Anzahl der möglichen Stereo- oder Regioisomerprodukte, die gebildet werden können, ist von besonderer Bedeutung. Während Diels-Alder- und Aldol-Kondensationsreaktionen das Potential aufweisen, eine große Anzahl an Produkten in der Folge von der Bildung von neuen Stereozentren zu schaffen, kann der retrosynthetische Weg C eine große Anzahl an Regioisomerprodukten bereitstellen. Es wird in Betracht gezogen, dass die Erfindung verschiedene chemische Reaktionen umfassen kann, an welchen eine oder mehrere erleichternde Nucleinsäuren und zwei oder mehrere verschiedene Reaktanten, entweder gleichzeitig oder aufeinander folgend, beteiligt sind, um die erfindungsgemäßen Produkte herzustellen.
  • IV. Verabreichung und Verwendungen
  • Anwendungen der erfindungsgemäßen erwünschten Produkte umfassen verschiedene therapeutische, prophylaktische, diagnostische und kosmetische Verwendungen. Jede beliebige Verwendung, bei der ein chemisches Produkt wünschenswert sein könnte, ist Teil des Umfangs dieser Erfindung. Spezifische Erkrankungsarten umfassen folgende, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Entzündung, kardiovaskuläre Störungen, neoplastische Erkrankungen, Stoffwechselstörungen, parasitische Erkrankungen und infektiöse Krankheiten. Genauer gesagt sind die erfindungsgemäßen Produkte wirksam bei der Behandlung oder Prävention von Krebs, Angina, Arthritis, Asthma, Allergien, Rhinitis, Schockzuständen, chronisch entzündlicher Darmerkrankung, niedrigem Blutdruck und für die systemische Behandlung von Schmerz und Entzündung, lokalen Traumata, wie z.B. Wunden, Verbrennungen, Ausschlägen.
  • Die erfindungsgemäßen erwünschten Produkte können, sobald sie durch das Parallel-SELEX-Verfahren identifiziert wurden, für die Herstellung auf dem herkömmlichen chemischen Syntheseweg oder durch den Einsatz einer erleichternden Nucleinsäure zur Vermittlung der Reaktion zwischen den Reaktanten hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Produkte können ein asymmetrisches Atom umfassen. Das asymmetrische Atom kann aus Kohlenstoff, Phosphor, Silicium, Schwefel, um nur einige aufzuzählen, ausgewählt werden. Demnach umfasst die Erfindung die einzelnen Stereoisomere und Gemische aus diesen. Die einzelnen Isomere können durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannt Verfahren hergestellt oder isoliert werden.
  • Die erwünschten Produkte können durch ein beliebiges, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekanntes Verfahren verabreicht werden. Die Verabreichungsarten umfassen die folgenden, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: enterale (orale) Verabreichung, parenterale (intravenöse, subkutane und intramuskuläre) Verabreichung, topische Anwendung und Schleimhautanwendung (nasal, über die Atemwege etc.).
  • Das Verfahren zur Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die interne oder topische Verabreichung einer wirksamen Menge des erwünschten Produkts an ein Subjekt, das einer Behandlung bedarf. Dosen der erwünschten Produkte in dem erfindungsgemäßen Verfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen, die dieselben enthalten, umfassen eine wirksame, nicht toxische Menge, die im Allgemeinen im Bereich von 0,01 bis 500 mg/kg des erwünschten Produkts gewählt wird, vorzugsweise 0,1 bis 50 mg/kg. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können unter Einsatz von klinischen Routinetests die optimale Dosis für ein bestimmtes Leiden, das behandelt wird, bestimmen. Die erwünschte Dosis wird einem Subjekt im allgemeinen 1- bis 6-mal täglich intravenös, oral, rektal, parenteral, topisch oder durch Inhalation verabreicht. Die Wirksamkeit der erwünschten Produkte dieser Erfindung kann durch herkömmliche Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, bestimmt werden.
  • Die Herstellung von Produkten zur Verabreichung in pharmazeutischen Präparaten kann durch verschiedene Verfahren erfolgen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Geeignete, pharmazeutisch annehmbare Salze, die Teil des Umfangs der Erfindung sind, sind jene, die von Mineralsäuren, wie z.B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure; sowie von organischen Säuren, wie z.B. Weinsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Oxalsäure, Ethylsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und dergleichen, stammen, wodurch man jeweils ein Hydrochlorid-, Sulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Methansulfonat-, Tartrat-, Benzolsulfonat-, p-Toulolsulfonatsalz und dergleichen erhält.
  • Erfindungsgemäße, erwünschte Produkte können für parenterale Verabreichung in wässrigen Injektionslösungen formuliert werden, die Antioxidationsmittel, Puffer, bakteriostatische Wirkstoffe, solubilisierende Wirkstoffe, Chemoschutzmittel etc. umfassen. Extemporierte Injektionslösungen können aus sterilen Pillen, Granulaten oder Tabletten hergestellt werden, die Verdünnungsmittel, Dispergiermittel und Tenside, Bindemittel und Gleitmittel umfassen können, wobei diese Materialien Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
  • Bei oraler Verabreichung können feine Pulver oder Granulate des erwünschten Produkts formuliert werden, mit Verdünnungsmitteln, Dispergiermitteln und Tensiden, und können in Wasser oder in einem Sirup, in Kapseln in trockenem Zustand oder in einer nicht-wässrigen Suspension, wobei dann ein Suspensionsmittel enthalten sein kann, hergestellt werden. Die erwünschten Produkte können auch in Tablettenform gemeinsam mit fakultativen Bindemitteln und Gleitmitteln oder in einer Suspension in Wasser oder Sirup oder einem Öl oder in einer Wasser/Öl-Emulsion oder in einer kontrolliert-freisetzenden Darreichungsform aus biologisch abbaubaren oder bioerodierbaren Polymeren verabreicht werden und können Geschmacks-, Konservierungs-, Suspensions- und Verdickungsmittel sowie Emulgatoren enthalten. Die Granulate oder Tabletten für orale Verabreichung können beschichtet sein, oder es können andere pharmazeutisch annehmbare Wirkstoffe und Formulierungen verwendet werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind.
  • Feste oder flüssige Träger können ebenfalls eingesetzt werden. Feste Träger umfassen Stärke, Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Terra alba, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pectin, Akaziengummi, Magnesiumstearat und Stearinsäure. Flüssige Träger umfassen Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Salzlösung und Wasser. Salben und Cremen werden unter Einsatz von bekannten hydrophilen und hydrophoben Grundstoffen hergestellt. Topische Reservoirs werden auf geeignete Weise unter Einsatz bekannter Polymermaterialien, wie z.B. verschiedene auf Acryl basierende Polymere, hergestellt, die so ausgewählt werden, dass sie die erwünschten Freisetzungseigenschaften aufweisen. Suppositorien werden aus herkömmlichen Grundstoffen, wie z.B. Polyethylenglykol und Kakaobutter, hergestellt. Liposomen können ebenfalls als Träger für die erfindungsgemäßen Produkte eingesetzt werden.
  • Zusätzlich dazu können die erwünschten Produkte der vorliegenden Erfindung als landwirtschaftliche Wirkstoffe eingesetzt werden. Die erwünschten Produkte können spezifisch Herbizide, Pestizide, Wachstumsregulatoren etc. sein. Die Verwendung und Verabreichung der erfindungsgemäßen Produkte für landwirtschaftliche Zwecke ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die erfindungsgemäßen Produkte können ebenfalls in chemischen Herstellungsverfahren eingesetzt werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der bevorzugten Ausführungsformen der Herstellungsverfahren und Produkte der vorliegenden Erfindung und sollen nicht als Einschränkung der Erfindung ausgelegt werden.
  • Beispiel 1
  • Verwendung von nicht-modifizierter RNA zur Erleichterung einer Diels-Alder-Reaktion
  • Herstellung eines PEG-Linkers
  • Ein Polyethylenglykol-(PEG-)Linker wurde synthetisiert, um als Spacer zwischen den Nucleinsäuren (in diesem Fall 40N8 RNA) (Seq.-ID Nr. 2) und dem ersten Reaktanten (in diesem Fall Maleinimid) zu dienen. Das Schema für die Synthese des Linkers wird untenstehend angeführt.
    Figure 00520001
  • Synthese von tosyliertem PEG (Ts-PEG) (2)
  • Polyethylenglykol 1, 1,0 g (0,670 mmol, mittleres Molekulargewicht 1500), wurde in 15 ml trockenem THF gelöst, und das Lösungsmittel wurde in Vakuum entfernt. Zu dem verbleibenden Rückstand, gelöst in 15 ml trockenem THF, wurden 52 mg (0,335 mmol) DBU gefolgt von 64 mg (0,335 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Argon bei Raumtemperatur 10 Tage lang gerührt, wobei sich in dieser Zeit ein weißer Niederschlag bildete. Nach 10 Tagen wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Lösungsmittel wurde in Vakuum entfernt. Die Reinigung des monotosylierten Produkts durch eine Flash-Silicagel-Chromatographie (7% Me OH/CH2Cl2) brachte eine Ausbeute von 320 mg (58%) eines leicht gelben Feststoffs (Rf = 0,31). Das Produkt wurde auf Basis seines 1HNMR-Spektrums identifiziert.
  • Synthese von Amino-PEG (3)
  • In 2 ml trockenem DMF wurden 400 mg (0,243 mmol) Ts-PEG (2) gefolgt von 119 mg (2,43 mmol) Lithiumazid gelöst. Unter Rühren und einer Argonatmosphäre wurde das Reaktionsgemisch 5 h lang auf 80°C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch durch ein Silicakissen filtriert, und das Kissen wurde mit 10%igem MeOH/CH2Cl2 gewaschen, bis das Produkt in dem Elutionsmittel nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Das vereinigte Filtrat wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingedampft. Der verbleibende Rückstand wurde in 4 ml MeOH gelöst, zu dem 30 mg 5% Pd/C zugesetzt wurden, und die Lösung wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre 16 h lang gerührt. Das Gemisch wurde dann durch Celite filtriert. Das Celite-Kissen wurde mit MeOH gewaschen, das Filtrat vereinigt und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck ausgedampft, wodurch man einen weiß-grauen Feststoff erhielt. Die Reinigung durch eine Flash-Silicagel-Chromatographie (12% MeOH·NH3/CH2Cl2) brachte eine Ausbeute von 279 mg (77%) des gewünschten Amino-PEG-Produkts 3 (Rf = 0,38, 15% MeOH·NH3/CH2Cl2) als weißen Feststoff.
  • Synthese von FMOC-PEG (4)
  • Amino-PEG (3) wurde getrocknet, indem 840 mg (0,563 mmol) in 75 ml trockenem THF gelöst wurden, worauf die Entfernung des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung folgte. Unter einer Argon-Atmosphäre wurde das Amino-PEG dann in 50 ml trockenem THF gelöst, mit 190 mg (0,563 mmol) 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat behandelt, und die Lösung wurde 2 h lang unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann durch Rotationsverdampfung entfernt und das Produkt durch Flash-Silicagel-Chromatographie (8% MeOH/CH2Cl2) gereinigt, wodurch man 863 mg (92%) eines weißen Feststoffs erhielt (Rf = 0,28, 10% MeOH/CH2Cl2).
  • Synthese von FMOC-PEG-Phosphoramidit (5)
  • FMOC-PEG (4) wurde getrocknet, indem 173 mg (0,104 mmol) in 25 ml trockenem THF gelöst wurden, worauf die Entfernung des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung folgte. Unter einer Argon-Atmosphäre wurde das FMOC-PEG dann in 25 ml trockenem CH2Cl2 gelöst, mit 34,8 ml (0,208 mmol) Diisopropylethylamin gefolgt von 36,2 ml (0,156 mmol) 2-Cyano-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit behandelt. Das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel und die überschüssige Base wurde dann unter reduziertem Druck entfernt. Das erwünschte Phosphoramidit-Produkt wurde durch Flash-Silicagel-Chromatographie (8% MeOH/CH2Cl2) gereinigt, wodurch man 190 mg (97%) eines weißen Feststoffs erhielt (Rf = 0,30, 10% MeOH/CH2Cl2).
  • DNA-PEG-Konjugation und Zugabe des ersten Reaktanten
  • Der oben hergestellte, geschützte PEG-Linker wird dann an das 5'-Ende eines DNA-10-mers (um die Ligation mit Zufalls-RNA zu erleichtern) gefolgt vom Binden des ersten Reaktanten (in diesem Fall Maleinimid) wie im unten gezeigten Schema konjugiert.
    Figure 00540001
  • Ein DNA-Synthesegerät von Applies Biosystems wird eingesetzt, um das DNA-10-mer (5'-CCAGGCACGC) (Seq.-ID Nr. 1) zu synthetisieren und das oben hergestellte FMOC-PEG-Phosphoramidit in einem Verfahren zu konjugieren, das herkömmliche Phosphoramidit-Chemie, wie oben angeführt, verwendet. Das DNA-PEG-Konjugat wird von dem CPG-(Glas mit definierter Porengröße) Festphasenträger gespalten und unter Einsatz einer herkömmlichen Inkubation über Nacht in konzentriertem Ammoniumhydroxid vollständig entschützt, um die freie DNA-PEG-Aminspezies 6 zu erhalten. Ein beliebiges Substrat kann dann an das Ende der PEG-Kette unter Einsatz von verschiedenen Reaktionen addiert werden. Beispielsweise wird ein Maleinimid-Dienophil für eine Diels-Alder-Reaktion gebunden, indem das Amino-DNA-PEG mit dem aktivierten Maleinimidoester 7 umgesetzt wird, um das Amid 8 zu erhalten.
  • Herstellung eines zufälligen RNA-Pools mit einem 5'-Monophosphat
  • Ein 40N8-RNA-Pool mit zufälliger Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) wurde unter Einsatz von herkömmlichen SELEX-Strategien und -Techniken aus einer Matrize einer synthetischen, einzelsträngigen DNA mit zufälliger Sequenz (ssDNA) von Operon (Alameda, Calif.) hergestellt. Die zufällige Region wurde unter Einsatz eines Gemischs aus 4 Nucleotiden (deren Molverhältnisse so angepasst werden, dass man ein 1:1:1:1-Verhältnis von integrierten Nucleotiden erhält) während einer Oligonucleotidsynthese hergestellt. Die ssDNAs enthielten 40 Nucleotide mit einer zusammenhängenden zufälligen Sequenz, flankiert durch definierte 5'- und 3'-Enden, die eine Primer-Hybridisierung ermöglichen. Die doppelsträngigen DNA-(dsDNA-)Moleküle, durch Taq-Polymerase hergestellt, weisen einen T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende auf, um die Transkription zu erleichtern.
  • Jede Transkriptionsreaktion umfasste 100 pmol 40N8-dsDNA kombiniert mit 80-μl 5 × T7-RNA-Polymerasepuffer (200 mM Tris, pH 8,0; 60 mM MgCl2; 5 mM Spermadin; 25 mM DTT; 20% Glycerin, 0,01% Triton-X-100), 40 μl 10 mM GTP, 40 μl 10 mM CTP, 40 μl 10 mM ATP, 40 μl 10 mM UTP, 40 μl 500 mM GMP, 8 μl RNasin (Promega; 40.000 Einheiten/ml), 24 μl T7-RNA-Polymerase (New England Biolabs; 50.000 Einheiten/ml) und dH2O auf ein Endvolumen von 400 μl.
  • Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurde die 5'-Monophosphat-RNA unter Einsatz eines 8%igen denaturierenden Polyacrylamidgels gereinigt. Das 5'-Monophosphat ist für die Ligation der RNA an den DNA-Anteil der Linkersequenz wie untenstehend erläutert erforderlich.
  • Ligation der zufälligen RNA an DNA-PEG-Maleinimid
  • Ein RNA-Pool mit zufälliger Sequenz wurde wie oben beschrieben hergestellt. Ein DNA-10-mer (Seq.-ID Nr. 1) und DNA-Brücken-Oligo (5'-CTTGTCTCCCGCGTGCCTGG) (Seq.-ID Nr. 3), die in der Ligationsreaktion verwendet wurden, wurden von Operon (Alameda, Calif.) bezogen und vor ihrer Verwendung gelgereinigt. 100 pmol zufälliger 40N8-RNA (Seq.-ID Nr. 2) wurden durch die Dephosphorylierung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (Gibco BRL) und die darauf folgende Phosphorylierung mit T4-Plynucleotid-Kinase (New England Biolabs) und γ-[32P]-ATP endmarkiert.
  • Die Ligationsreaktion umfasst 50 pmol zufälliger 40N8-RNA, etwa 60.000 CPM zufälliger, 5'-endmarkierter 40N8-RNA, 100 pmol DNA-PEG-Maleinimid, 150 pmol DNA-Brücken-Oligo, 2,5 ml 10 × T4-DNA-Ligasepuffer (50 mM Tris, pH 7,8; 10 mM MgCl2; 10 mM DTT; 1 mM ATP; 25 mg/ml Rinderserumalbumin), 0,5 μl RNasin (Promega; 40.000 Einheiten/ml), T4-DNA-Ligase auf eine Endkonzentration von 1,2 Weiss-Einheiten/ml (New England Biolabs) und dH2O auf ein Endvolumen von 25 μl. Die 1,2 Weiss-Einheiten/ml wurden erhalten, indem die New-England-Biolabs-Einheitendefinition in Weiss-Einheiten umgewandelt wurde, wobei der in ihren Katalogen angeführte Umrechnungsfaktor verwende wurde (1 NEB = 0,015 Weiss-Einheiten).
  • Alle Komponenten, bis auf RNasin und T4-DNA-Ligase, wurden vermischt, bei 70°C 3 min lang inkubiert und langsam auf weniger als 37°C abgekühlt. RNasin und T4-DNA-Ligase wurden dann zugesetzt, und das Gemisch wurde 90 min lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde RNA-Ladepuffer zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 min lang auf 70°C erhitzt und dann auf ein vorerhitztes 8%iges denaturierendes Polyacrylamidgel geladen. Die Ligationserträge wurden durch Autoradiographie erhalten. Das resultierende RNA-DNA-PEG-Maleinimid stellt das Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch dar. Herstellung von biotinyliertem Dien-Konjugat
    Figure 00570001
  • NHS-Biotin (Pierce; 99,3 mg; 0,291 mmol) und 2,4-Hexadien-1-ol (66,2 mg, 2,3 Äqu.) wurden in 10 ml trockenem Pyridin unter Argon bei 0°C kombiniert und in Dunkelheit über Nacht gerührt, während das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Die Überprüfung des Reaktionsgemischs mittels DC (50% EtOAc/Hexane) deutete auf eine langsame Reaktion hin, und die Lösung wurde dann unter Argon über Nacht rückflusserhitzt. Die Entfernung des Lösungsmittels in Vakuum gefolgt von einer fortlaufenden Chromatographie auf Flash-Silicagel mit 5% MeOH/EtOAc und dann 6 MeOH/CH2Cl2 ergab das reine Produkt 9, das auf Basis seiner 1H- und 1H-1H-COSY-NMR-Spektren charakterisiert wurde.
  • Die chemische Reaktion
  • Das oben hergestellte Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch (RNA-DNA-PEG-Maleinimid) wird mit dem zweiten Reaktanten (biotinyliertes Dien) unter den folgenden Bedingungen umgesetzt. 1-2 nmol (~ 50.000 cpm) Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch werden in 50 μl Reaktionspuffer (10 mM MES, 200 mM NaCl, pH 6,5) gelöst, alternativ dazu kann der Reaktionspuffer (10 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 7,0) sein. Das Gemisch wird 5 min lang auf 70°C erhitzt. MgCl2 wird dann bis zu einer Endkonzentration von 100 μM bzw. 10 μM zugesetzt, und die Lösung kann dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen (etwa 10 min). Das biotinylierte Dien wird dann bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt, und das Gemisch wird dann 12 h lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Die Lösung wird dann auf eine immobilisierte Straptavidin-Säule geladen und die Säule extensiv mit Reaktionspuffer, der 10 μM MgCl2 umfasst, gewaschen. Die gebundene RNA wird von der Säulenmatrix durch Behandlung mit Proteinase K gefolgt von Waschen der Säule mit Reaktionspuffer freigesetzt. Alternativ dazu kann die RNA einer Umkehrtranskription unterzogen werden, während sie weiterhin an das Harz gebunden ist, oder ein Disulfid, das an das Biotin-Dien-Substrat gebunden ist, kann eingesetzt werden, wobei die RNA in diesem Fall unter Einsatz von 50 mM DTT von der Säule eluiert wird. Nach der Anreicherung des Pools folgt die Anzahl der cpm, die nach der Standard-Proteinase-K-Behandlung eluiert wurden. Die eluierte RNA wird dann umkehrtranskribiert, die resultierende cDNA mittels PCR amplifiziert und die dsDNA wie in typischen SELEX-Experimenten transkribiert. Das DNA-PEG-Maleinimid-Konjugat wird, wie oben beschrieben, an die RNA ligiert, und das Verfahren wird so lange wiederholt, bis die Menge des resultierenden Produkts ausreichend ist, um dessen Struktur zu bestimmen.
  • Beispiel 2
  • Verwendung von nicht-modifizierter RNA und Metallen in Lösung zur Vereinfachung einer Diels-Alder-Reaktion
  • Das Verfahren aus Beispiel 1 wird genau gleich übernommen, wobei die Metallionen Aluminium(III) und Cobalt(II) in die Reaktionslösung eingeführt werden.
  • Beispiel 3
  • Verwendung von modifizierter RNA (umfassend Pyridin-modifiziertes UTP) zur Erleichterung einer Diels-Alder Reaktion
  • Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können durch verschiedene Verfahren modifiziert werden, die bereits zuvor erläutert wurden. Ein Beispiel für eine modifizierte Nucleinsäure ist die Modifikation von UTP-Molekülen, um einen Rest des Pyridin-Typs an der 5-Position einzuführen. Das Pyridin-modifizierte UTP wird in die zuvor beschriebene zufällige RNA integriert. Die modifizierten RNAs werden durch eine PEG-Linker an den Reaktanten gebunden und eingesetzt, um eine Diels-Alder-Reaktion zu vereinfachen.
  • Das folgende Verfahren wurde eingesetzt, um ein Uridin-Triphosphat-(UTP-)Derivat zu synthetisieren, das einen an die 5-Position der Base gebundenen Rest des Pyridin-Typs aufweist. Herstellung eines Pyridylcarboxamid-modifizierten UTP
    Figure 00590001
  • Carboxyamidierung:
  • Eine Lösung aus 5-Ioduridin-2',3'-isopropyliden (0,225 g, 0,545 mmol), Pd(PPh3)4 (0,1 Äqu., 56 mg), Triethylamin (10 Äqu., 0,76 ml) und 4-(Aminomethyl)pyridin (4 Äqu., 0,23 ml) wurde in 10 ml trockenem THF unter Argon in einer flammengetrockneten, mit einem Teflon-Absperrhahn ausgestatteten Glasbombe hergestellt. Die Bombe wurde fortlaufend mit 50 psi CO geladen und drei Mal evakuiert, dann auf 50 psi CO gebracht und versiegelt. Der Kolben wurde stark gerührt, während er auf 70°C erhitzt wurde. Nach 2 h hatte die Abscheidung von Palladium sichtbar begonnen. Der Kolben wurde weitere 18 h lang gerührt, abgekühlt und belüftet, und die Lösung dampfte zu einem gelblichen Öl aus. Die Chromatographie auf Silicagel mit einer Gradientenelution von 8-10% MeOH/CH2Cl2 ergab 0,177 g (78%) von 10 als weißen Feststoff. Es folgte eine Charakterisierung durch die 1H- und 13C-NMR-Spektren. Analytische Proben konnten durch Umkristallisieren aus Methanol erhalten werden.
  • Triphosphatherstellung
  • Das Triphosphat wurde durch das Verfahren von Ludwig und Eckstein (J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989)) unter Einsatz eines wie oben hergestellten 5'-Hydroxyl-modifizierten Uridins hergestellt. Das Triphosphat wurde gereinigt, indem das Reaktionsgemisch in destilliertem Wasser durch eine Anionenaustauschsäule (Sephadex DEAE) mit 0,05-1,00 TBK-(Triethylammoniumbicarbonat-)Pufferlösung geleitet wurde. Durch die Lyophilisierung der Fraktionen, die das Triphosphat enthielten, erhielt man das Isopropyliden-geschützte Triphosphat, das durch sein 31P-NMR-Spektrum charakterisiert wurde. Die Isopropyliden-Schutzgruppe wurde durch 15-minütiges Erhitzen des Triphosphats in 5 ml destilliertem Wasser mit 100 mg Dowex-50WX8-Harz (H+-Form) bei 70°C entfernt, worauf die Neutralisierung mit 2 M TBK-Puffer (auf pH 8) folgte. Die Endreinigung dieser Lösung erfolgte durch eine präparative Umkehrphasen-HPLC (C18-Säule) mit 3-5%igem Gradienten aus CH3CN in 0,05 M TBK-Puffer. Das so hergestellte Triphosphat (11) wurde auf Basis seiner 1H- und 13P-NMR-Spektren als die Tris(triethylammonium)-Salzform charakterisiert und durch UV-Absorption (277 nm, ε = 14.600 M-1 cm-1) quantifiziert.
  • Die Reaktion wurde wie in Beispiel 1 obenstehend angeführt fortgesetzt.
  • Beispiel 4
  • Verwendung von modifizierter RNA (umfassend Histidin-modifiziertes UTP) zur Erleichterung der Spaltung von GRP
  • Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können durch verschiedene, zuvor beschriebene Verfahren modifiziert werden. Ein Beispiel einer modifizierten Nucleinsäure ist eine, in der die UTP-Moleküle modifiziert wurden, um einen Rest des Histidin-Typs an der 5-Position zu inkorporieren. Das Histidin-modifizierte UTP wird in eine zuvor beschriebene, zufällige RNA (Seq.-ID Nr. 2) integriert. Die modifizierten RNAs wer den mittels PEG-Linker an einen Reaktanten gebunden und eingesetzt, um die Spaltung von gastrinfreisetzendem Peptid (GRP) zu erleichtern.
  • Synthese von Histidin-modifiziertem UTP
  • Das folgende Verfahren wurde eingesetzt, um Uridintriphosphat-(UTP-)Moleküle zu synthetisieren, die einen an die 5-Position gebundenen Rest des Histidin-Typs aufweisen.
    Figure 00610001
    • Schlüssel: (a) Pd(OAc)2, CuI, PPh3, CH2CHSn(Bu)3, CO, THF, 70°C, 5 h. (b) Hünigs Base, DMF, RT, 1 h. (c) 2-Chlor-4H-1,2,3-Benzdioxaphosphorin-4-on, P2O7 4-(HNBu3)2 2+, Pyridin, Dioxan. (d) I2, Pyridin/H2O (98:2). (e) NH4OH. (f) Dowex 5wx8, H2O, 70°C, 15 min.
  • In einen abgeschlossenen Kopplungsapparat, der mit einem Zugabetrichter mit Druckausgleich ausgestattet war, wurden in einer Glovebox unter einer inerten Atmosphäre 702,3 mg (2,0 mmol) 12, 44,9 mg (0,20 mmol) Palladiumacetat, 114,3 mg (0,60 mmol) Kupfer(I)-iodid und 157,4 mg (0,60 mmol) Triphenylphosphin eingewogen. Der Apparat wurde versiegelt, aus der Box entfernt, und 30 ml wasserfreies THF wurden über eine Kanüle zum runden Teil des Apparats zugesetzt. Zum Zugabetrichter wurde über eine Kanüle eine mit Argon gereinigte Lösung aus 0,643 ml (2,2 mmol) Vinyltributylzinn in 40 ml wasserfreiem THF zugesetzt. Der Kolben wurde fortlaufend evakuiert und drei Mal mit CO beladen, dann 1,0 h lang auf 70°C erhitzt, bis die gelbe Lösung leicht orange wurde. Die Vinyltributylzinn-Lösung wurde dann in einer Geschwindigkeit von 1 Tropfen/10 sek zugesetzt. Die Lösung wurde dunkelrot, nachdem 5-10% des Reagens zugesetzt worden waren. Die Lösung wurde 5 h lang auf 70°C erhitzt, abgekühlt und in Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in CH2Cl2 gelöst, auf ein Silicakissen geladen, mit 200 ml Hexan, 200 ml CH2Cl2 gewaschen, und das Produkt wurde mit 5%igem CH3OH/CH2Cl2 eluiert. Dieser Eluent wurde eingeengt und einer Flash-Chromatographie auf Silicagel mit 5%igem CH3OH/CH2Cl2 unterzogen, wodurch eine Ausbeute von 0,284 g von 2 als weißer Feststoff erhalten wurde.
  • Histidinol-Michaeladditionsprodukt
  • TBDMS-geschütztes Histidinol 14
  • Zu einer gerührten Lösung aus 205 mg (5,1 mmol) NaH, die 3× mit Hexan gewaschen wurde, in 3,0 ml DMF wurden unter Argon chargenweise 500 mg (2,3 mmol) Histidinoldihydrochlorid zugesetzt, wodurch es zu einer mäßigen Gasentwicklung kam. Die Lösung wurde 1,5 h lang gerührt, dann wurden 1,8 ml (23 mmol) wasserfreies Pyridin und 693,0 mg (4,6 mmol) TBDMSCI zugesetzt. Die Lösung wurde 1,5 h lang gerührt, in Vakuum eingeengt und mit 15%igem CH3OH·NH3/CH2Cl2 einer Flash-Chromatographie auf Silicagel unterzogen, wodurch 3 erhalten wurde.
  • Michaeladditionsprodukt 15
  • Zu einer gerührten Lösung aus 167,9 mg (0,6 mmol) 13 in 10 ml wasserfreiem DMF wurden 0,105 ml (0,6 mmol) Diisopropylethylamin zugesetzt, und dann wurde eine Lösung aus 185 mg (0,72 mmol) 3 in 1,85 ml wasserfreiem DMF zugetropft. Die Lösung wurde 1 h lang gerührt, in Vakuum eingeengt und auf Silicagel mit 15%igem CH3OH·NH3/Ethylacetat einer Flash-Chromatographie unterzogen, wodurch man 90,0 mg 15 als weißen Feststoff erhielt, der auf Basis seines 1H-NMR-Spektrums charakterisiert wurde.
  • Triphosphat-Herstellung
  • Zu einer Lösung aus 15 in Dioxan/Pyridin wurde eine Lösung aus 2-Chlor-4H-1,2,3-Benzdioxaphosphorin-4-on in THF zugetropft, und die Lösung wurde 20 min lang gerührt, dann wurden eine 0,5 M Lösung aus Bis(tributylammonium)pyrophosphat in DMF und Tributylamin gleichzeitig zugesetzt. Die Lösung wurde zusätzliche 20 min lang gerührt, und eine Pyridin/Wasser-Lösung von I2 wurde zugesetzt, und die Lösung wurde 20 min lang gerührt. Überschüssiges Iod wurde mit 5%igem Natriumbisulfit zerstört, die Lösung wurde 15 min lang gerührt, eingeengt und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid hydrolysiert. Der Ammoniak wurde in Vakuum entfernt, die verbleibende Lösung wurde zwei Mal mit CH2Cl2, ein Mal mit Ethylacetat gewaschen und in Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und mit Dowex-Harz 15 min lang bei 70°C gerührt. Die Lösung wurde filtriert, mit 2 M TBK-Puffer neutralisiert, direkt auf DEAE-Sephadex geladen und mit einem Gradienten aus 0,05 M Triethylammoniumbicarbonat-Puffer (TBK-Puffer) bis 1,0 M TBK-Puffer eluiert, um ein Produkt zu erhalten, das mit einer Salicylat-Spezies und einer kleinen Menge, bei der die TBDMS- und Isopropyliden-Schutzgruppen noch intakt waren, leicht verunreinigt war. Das Material wurde erneut mit Dowex-Harz behandelt und auf einer Umkehrphasen-HPLC-C18-Säule mit einem Gradienten aus 0-5% Acetonitril in 0,05 M TBK-Puffer 15 min lang gereinigt, um reines 16 zu erhalten, dass mittels 1H-, 13C- und 31P-NMR charakterisiert wurde.
  • Das Experiment wird wie obenstehend in Beispiel 1 erläutert fortgesetzt, wobei die Nucleinsäure jedoch, anstatt ein Cyclohexenprodukt zu bilden, das GRP-Protein hydrolysiert.
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel ist, wenngleich es keine Ausführungsform der beanspruchten Erfindung ist, nützlich, um die beanspruchte Erfindung zu verstehen und sie umzusetzen.
  • 5'-Thiophosphat-modifizierte RNA, die an N-Bromacetylbradykinin bindet
  • Dieses Beispiel beschreibt ein Parallel-SELEX-Verfahren, bei dem der gebundene Reaktant 5'-Guanosin-Monothiophosphat (GMPS) ist, das direkt an eine zufälliges Nucleinsäure-Testgemisch gebunden ist. Der freie Reaktant ist eine Bromacetylgruppe die an das Bradykinin-Target (BrBK) gebunden ist. Dieses Beispiel beschreibt die Auswahl und die Analyse einer mit 5'-Guanosin-Monothiophosphat substituierten RNA (GMPS-RNA), die spezifisch mit N-Bromacetyliertem Bradykinin (BrBK) reagiert und die Bildung einer Thioether-Bindung zwischen der RNA und dem BrBK-Peptid erleichtert. Frühere Arbeiten in diesem Bereich haben gezeigt, dass es schwierig ist, Liganden für Bradykinin, sowohl in freier Lösung als auch an eine Trägermatrix gebunden, zu erhalten. Wie nun erläutert wird, wurde eine RNA mit einem 6700fachen Anstieg in Bezug auf kcat/Km und einem 100fachen Anstieg in Bezug auf ihre Bindungsaffinität für N-Bromacetyl-Bradykinin bezogen auf den Ausgangspool identifiziert. Diese RNA bindet ihr Substrat mit hoher Spezifizität, wobei amino- und carboxyterminale Argininreste des Peptids für eine optimale Aktivität erforderlich sind.
  • A. Das Parallel-SELEX-Verfahren
  • Die Parallel-SELEX-Reaktion erfolgte unter Einsatz von 5'-Guanosin-Monothiophosphat (GMPS) als gebundenem Reaktant, der an das RNA-Testgemisch gebunden war, und Bromacetyliertem Bradykinin (BrBK) als freiem Reaktant und als Target. Die GMPS-RNA wurde aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, die Thioatgruppe der RNA schnell für die Bromidgruppe von BrBK zu substituieren. Das Produkt, BK-S-RNA, wird dann substraktiv von der verbleibenden, nicht umgesetzten GMPS-RNA getrennt und vor dem Fortfahren mit einem weitern Auswahlzyklus erneut amplifiziert.
  • 1. GMPS-RNA
  • Das Parallel-SELEX-Verfahren erfolgte mit einem anfänglichen, zufälligen Repertoire von etwa 5 × 1013 GMPS-RNA-Molekülen mit einer Länge von 76 Nucleotiden und einer zentralen Region mit 30 randomisierten Nucleotiden (30N1) (Seq.-ID Nr. 4), detailliert von Schneider et al. (FASEB 7, 201 (1993)) beschrieben, wobei die nicht- zufälligen Regionen als Matrizen für die Amplifikation dienen. Das Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch wurde durch das Einführen von GMPS in die ursprüngliche und alle darauf folgenden Transkriptionsreaktionen so gebildet, dass es vorzugsweise statt äquimolarem GTP beim Primen der Transkription durch T7-Poljrmerase verwendet wurde, so dass etwa 80% der des Produktes voller Länge durch GMPS initiiert wurden. GMPS-RNA wurde transkribiert und durch Amicon-Microcon-50-Schleudertrennung gereinigt, um überschüssiges GMPS zu entfernen. GMPS-RNA wurde unter Einsatz von Thiopropyl-Sepharose 6B von nicht-GMPS-RNA gereinigt, von der Matrix mittels Dithiothreit (DTT) eluiert und durch eine weitere Amicon-Microcon-50-Schleudertrennung von dem DTT gereinigt. Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia) wurde in Säulen-Puffer (500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,0) vorgewaschen und dann vor der Verwendung bei 12.000 g trockengeschleudert. Für die GMPS-RNA-Reinigung wurde mittels einer Microcon-50-Säule gereinigte RNA auf eine Endkonzentration von 500 mM NaCl, 10 mM EDTA und 20 mM HEPES, pH 7,0, gebracht und zu einer Matrix in einem Maß von 25 μl pro 60 μl Hohlraumvolumen zugesetzt. Das Gemisch wurde dann bei 70°C 5 min lang umgesetzt, bei 12.000 g geschleudert, mit vier Säulenvolumina aus 90% Formamid, 50 mM MES, pH 5,0, bei 70°C schleudergewaschen und mit vier Säulenvolumina aus 500 mM NaCl in 50 mM MES, pH 5,0, schleudergewaschen und mit vier Säulenvolumina aus 100 mM DTT in 50 mM MES, pH 5,0, schleudereluiert. Diese Bedingungen wurden für die Retention und die darauf folgende Elution von nur GMPS-RNA optimiert.
  • 2. Bromacetyliertes Bradykinin
  • Bromacetyliertes Bradykinin (BrBK) wurde in diesem Beispiel als freier Reaktant und als Target eingesetzt. Die Bromacetylgruppe ist der freie Reaktant. BrBK wurde synthetisiert, indem 50 μl 5 mM Bradykinin mit drei aufeinander folgenden 250-μl-Chargen 42 mM Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester in 12-min-Intervallen bei Raumtemperatur umgesetzt wurden. Überschüssiger Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester wurde durch Filtration über 5 ml Aminoethylacrylamid (5 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur) entfernt, worauf die Trennung von BrBK über GS-10-Sepharose folgte. Die BrBK-Konzentration wurde bei 220 nm unter Einsatz eines Absorptionskoeffizienten von 12.000 cm-1 M-1 ermittelt.
  • 3. Die Auswahlreaktion
  • Die GMPS-RNA-Spezies, die am meisten in der Lage sind, die Reaktion mit BrBK durchzuführen, werden schrittweise durch mehrfache SELEX-Runden ausgewählt. Die Auswahlrunden erfolgen in Reaktionspuffer mit 1,1 mM BrBK und bei den untenstehend in Tabelle 1 angeführten GMPS-RNA-Konzentrationen für die jeweilige Zeit und Temperatur. Tabelle 1
    Figure 00660001
  • Während der Auswahl wurde die BrBK-Peptid-Konzentration auf 1,1 mM gehalten, eine Konzentration, die 12-mal geringer ist als die Km des Runde-0-Pools mit BrBK. Bei der Durchführung der Auswahl wurde die Reaktionszeit beschränkt und die Reaktionstemperatur gesenkt, um die Reaktion auf 5% oder weniger der gesamten GMPS-RNA zu beschränken. Das Ziel war es, die Reaktionsbedingungen zweiter Ordnung aufrechtzuerhalten, um Verbesserungen in Bezug auf Bindung und chemische Zusammensetzung auszuwählen. Die Aktivität des BrBK wurde bei 12,5 μM BrBK mit 25 μM GMPS-RNA gestestet; wenn die Reaktion bis zur Vollendung ausgeführt wurde, wurden 50% der RNA kovalent durch das BrBK gebunden, was darauf hindeutete, dass die Bromacetylierung des Peptids im Wesentlichen vollständig war.
  • Die Reaktionen wurden mit einer Endkonzentration von entweder 235 mM Natriumthiophosphat (Runden 1-8) oder Natriumthiosulfat (Runden 9-12) abgeschreckt und subtraktiv getrennt, entweder durch denaturierende 7-M-Harnstoff-8-%-Polyacrylamid-APM-Gele (Runden 1-6) oder durch eine Affinitäts-Chromatographie (Runden 7-12). % der umgesetzten RNA bezieht sich auf den Prozentsatz der gesamten GMPS-RNA, der als BK-S-RNA nach der Trennung durch Arcrylamid-Gel oder als frei eluierende BK-S-RNA bei der Trennung durch eine Affinitäts-Säule vorhanden ist. Der Hintergrund wurde in beiden Fällen von der gewonnenen RNA abgezogen; Hintergrund bezieht sich auf die Menge der RNA, die aus einer Kontrollbehandlung gewonnen wird, bei der die Reaktion vor der Zugabe von BrBK beendet wurde. Das Hintergrundverhältnis ist das Verhältnis der umgesetzten RNA zu der, die als Hintergrund vorhanden ist. Es wurde der Versuch unternommen, dieses Verhältnis während der SELEX-Runden durch eine Anpassung der Reaktionszeit zwischen 2 und 10 zu halten.
  • Die substraktive Trennung wurde entweder durch die Subtraktion der GMPS-RNA über Thiopropyl-Sepharose 6B oder durch die Trennung der beiden Spezies auf einem APM-Polyacrylamid-Gel durchgeführt. [(B-Acryloylamino)phenyl]quecksilber(II)-chlorid (APM) wurde synthetisiert und in einer Konzentration von 25 μM in einer denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Retardation von thiolhältiger RNA, wie von G. L. Lgloi, Biochemistry 27, 3842 (1988), berichtet, eingesetzt. GMPS-RNA wurde von APM-Polyacrylamid durch Elution in der Gegenwart von 100 mM DTT gereinigt. Im Gegensatz zu der zitierten Literatur wurde festgestellt, dass frisch gereinigte, APM-retardierte RNA, wenn sie wieder auf ein APM-Gel aufgetragen wurde, eine freie Bande von nicht-retardierter RNA ergab, die aus etwa 3% der gesamten, eingesetzten GMPS-RNA bestand. Frei laufende RNA stellte insofern ein Problem dar, da sie sehr nahe bei BK-RNA lief (unabhängig von dem in dem Gel eingesetzten Acrylamid-Prozentsatz) und so den Hintergrund während der Trennung steigerte. Wenn diese frei laufende RNA von dem Gel gereinigt wurde und erneut auf ein APM-Gel aufgetragen wurde, blieben etwa 50% dieser RNA frei laufend, wobei der Rest der RNA als GMPS-RNA lief. Die Menge der frei laufenden RNA verhielt sich proportional zu der Menge der Zeit, die für die Ausfällung verwendet wurde, hing aber nicht von der Wirkung des pH-Werts, der Gegenwart oder dem Fehlen von DTT, Magnesiumacetat, Formamid, Harnstoff oder Hitze ab.
  • Eine Umkehrtranskription und eine Polymerase-Kettenreaktion wurden wie von Schneider et al. (FASEB 7, 201 (1993)) berichtet durchgeführt. Der kobs-Wert des GMPS-RNA-Pools stieg zwischen den Runden 4 und 6 um das 100fache an, während er mit den weiteren Runden nur um das 2fache anstieg. Die Reaktionen zur Bestimmung der kobs-Werte wurden bei 0°C in Reaktionspuffer (50 mM HEPES, pH 7,0; 5 mM MgCl2; 150 mM NaCl) bei 2 μM GMPS-RNA und 130 μM BrBK durchgeführt, wobei bei Minute 0, 1, 3, 10, 30 und 90 eine Überprüfung erfolgte. GMPS-RNA wurde 3 min lang bei 70°C denaturiert und langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, bevor eine Verdünnung auf die endgültigen Reaktionspuffer-Bedingungen, die Übertragung auf Eis und die Zugabe von BrBK erfolgte. Die Reaktionen wurden auf Eis mit 235 mM Natriumthiosulfat gestoppt und auf einem denaturierenden APM-Gel aus 7 M Harnstoff und 8% Polyacrylamid laufen gelassen. Die kobs-Werte wurden als negativer Anstieg des linearen Bereichs der Datenpunkte der grafischen Darstellungen, die die Konzentration der nicht umgesetzten GMPS-RNA mit der Zeit in Beziehung setzen, erhalten. Die Pools aus Runde 10 und Runde 12 wurden zum Klonieren und Sequenzieren herangezogen.
  • B. Die Klone
  • 56 unabhängige Klone wurden sequenziert. 16 Reaktanten wurden mit dem 30N1-Massepool in Bezug auf ihre Reaktivität mit BrBK verglichen; alle getesteten Reaktanten weisen einen 10- bis 100fachen Anstieg der kobs bezogen auf den Ausgangspool auf. Reaktant 12.1 (Seq.-ID Nr. 5) wurde für eine weitere kinetische Analyse basierend auf drei Kriterien ausgewählt: (i) in einer ersten Studie der Reaktionsinhibition mit konkurrierendem Bradykinin wies er die niedrigste Ki für Bradykinin auf (Daten nicht angeführt); (ii) er war in der Runde-12-Population das am häufigsten vorhandene Molekül; und (iii) er wies die zweitschnellste kobs der getesteten Reaktanten auf.
  • Der gewählte Anstieg der kobs von Reaktant 12.1 ist auf die Anstiege der Reaktivität und der Bindung zurückzuführen. Bei der Reaktion mit BrBK weist Reaktant 12.1 einen 67fachen Anstieg der kcat in Bezug auf den der Masse-30N1-GMPS-RNA auf, wobei die Km um das 100fache zurückgeht, wodurch kcat/Km insgesamt um das 6700fache ansteigt (siehe Tabelle 1).
  • C. Spezifizität
  • Strukturelle Elemente von BrBK, die für die optimale Bindung durch Reaktant 12.1 erforderlich sind, wurden durch die Inhibition der Reaktion durch Bradykinin-Analoga untersucht. Während die Inhibition durch BK in der Reaktion der Masse-30N1-GMPS-RNA mit BrBK nicht messbar ist (Daten nicht angeführt), weist natives Bradykinin (BK) eine Ki von 140±60 μM für die Reaktion zwischen Reaktant 12.1 und BrBK auf. Dieser Wert entspricht annähernd dem der Km der nicht gehemmten Reaktion. Des-Arg9-BK (ein BK-Analogon ohne das Carboxyl-terminale Arginin) weist eine Ki von 2,6±0,5 mM auf. Das Fehlen des carboxyterminalen Arginins senkt die Bindung zwischen BK und dem Reaktanten 12.1 demnach weiter um das etwa 18fache. Außerdem weist das des-Arg1-BK (ein BKA-Analogon ohne das aminoterminale Arginin) keine messbare Inhibition der Reaktion zwischen Reaktant 12.1 und BrBK auf, was darauf hindeutet, dass das aminoterminale Arginin für die beobachtete Bindung zwischen Reaktant 12.1 und BrBK absolut unerlässlich ist. Das Erkennen eines Arginins muss jedoch im Kontext des Peptids erfolgen, da freies L-Arginin allein die Reaktion nicht hemmt. Der Anstieg in Bezug auf die Affinität von Reaktant 12.1 im Vergleich zu der der Masse-30N1-GMPS-RNA für BrBK ist also teilweise darauf zurückzuführen, dass der Reaktant das aminoterminale Arginin, und in geringerem Ausmaß das carboxyterminale Arginin, von BrBK erkennt.
  • Die intrinsische Reaktionsaktivität von Reaktant 12.1 wurde unter Einsatz von N-Bromacetamid (BrAcNH2) als eine minimale Bromacetyl-Struktur untersucht. Die Km- und kcat-Werte in der Reaktion von Reaktant 12.1 und dem 30N1-Pool mit BrAcNH2 entsprechen einander annähernd. Deshalb ist die verbesserte Reaktionsgeschwindigkeit von Reaktant 12.1 mit BrBK offensichtlich nicht auf die gesteigerte Nucleophilie der Thioatgruppe zurückzuführen, sondern ist vielmehr ein Ergebnis von sterischen und/oder entropischen Faktoren in der Positionierung der beiden Substrate. Demnach wurde eine chemische Reaktion erleichtert, genau wie für das Parallel-SELEX-Verfahren erforderlich ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001

Claims (29)

  1. Verfahren zur Identifikation eines Produkts aus einer Produktbibliothek, worin das Produkt aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt wird, eine vorbestimmte Funktion an einem Ziel auszuüben, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Herstellen eines Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs, das Nucleinsäuren umfasst, die jeweils eine Region mit einer randomisierten Sequenz aufweisen und an einen ersten Reaktanten gebunden sind; (b) das Umsetzen des Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs mit mehreren unterschiedlichen freien Reaktanten, um eine Produktbibliothek herzustellen, die ein Gemisch aus Produkten umfasst, die durch die Umsetzung des ersten Reaktanten mit den freien Reaktanten gebildet werden, worin die Reaktion dadurch erleichtert wird, dass die Nucleinsäure an den ersten Reaktanten gebunden ist; und (c) das Trennen der Elemente der Produktbibliothek ausgehend von ihrer relativen Fähigkeit, die vorbestimmte Funktion am Target auszuüben, wodurch die Produkte mit der Fähigkeit, eine vorbestimmte Funktion auszuüben, identifiziert werden können.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Umsetzung in Schritt (b) eine Bindungsbildungsreaktion zwischen dem ersten und den freien Reaktanten ist und worin Schritt (b) unter Bedingungen stattfindet, die für die Bindungsbildung zwischen dem ersten und den freien Reaktanten günstig sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fähigkeit zur Ausübung einer vorbestimmten Funktion an einem Target die Bindung an das Target ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin Schritt (c) durch folgende Schritte durchgeführt wird: (i) das Kontaktieren der Produktbibliothek mit dem Target, worin Produkte mit, in Bezug zur Produktbibliothek, einer höheren Affinität zum Target vom Rest der Produktbibliothek getrennt werden können; und (ii) das Trennen der Produkte mit höherer Affinität zum Target vom Rest der Produktbibliothek.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, weiters Folgendes umfassend: (d) das Amplifizieren der an das Produkt mit höherer Affinität zum Target gebundenen Nucleinsäure.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, das zwischen Schritt (b) und (c) weiters das Kontaktieren der Produktbibliothek mit einem Nichttarget und das Abtrennen von Produkten umfasst, die an das Nichttarget binden.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fähigkeit, eine vorbestimmte Funktion an einem Target auszuüben, das Reagieren mit dem Target und das Ändern der Eigenschaften des Targets ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäure-Testgemisch Nucleinsäure mit einer Region mit konservierten Sequenzen und einer Region mit randomisierten Sequenzen umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nucleinsäure aus der aus einzelsträngiger RNA, einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäure-Testgemisch modifizierte Nucleotide umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die modifizierten Nucleotide an den Ribose- und/oder Phosphatpositionen chemisch modifiziert sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, worin die modifizierten Nucleotide Pyrimidine sind, die an der 5-Position modifiziert sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, worin die modifizierten Nucleotide an der 2'-Riboseposition chemisch modifiziert sind.
  14. Verfahren nach Anspruch 10, worin die modifizierten Nucleotide Purine sind, die an der 8-Position modifiziert sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 10, worin die modifizierten Nucleotide mit einer chemischen Gruppe modifiziert sind, welche die Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbindung, elektrostatische Wechselwirkung oder Fluxionalität des Nucleotids erhöhen.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die chemische Gruppe aus der aus hydrophoben Gruppierungen, hydrophilen Gruppierungen, Metallatomen in unterschiedlichen Oxidationszuständen, starren Strukturen, Imidazolen, primären Alkoholen, Carboxylaten, Guanidiumgruppen, Aminogruppen, Thiolen und organometallischen Katalysatoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, worin die chemische Gruppe eine Aminosäure-Seitenkette oder Analoga davon umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, worin weiteres ein organometallischer Katalysator in das Nucleinsäure-Testgemisch inkorporiert ist.
  19. Verfahren nach Anspruch, worin eine Linkergruppe zwischen dem ersten Reaktanten und der Nucleinsäure gebunden ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Linkergruppe eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 Å aufweist.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Linkergruppe aus der aus PEG, Polyvinylalkohol, Polyacrylaten und Polypeptiden bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Reaktant ein Dienophil ist, der freie Reaktant ein Dien ist und das Produkt ein Cyclohexenderivat ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Produkt ein Chiralitätszentrum aufweist.
  24. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Produkt ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 80 bis etwa 2.000 aufweist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Verfahren in vitro durchgeführt wird.
  26. Verfahren zur Identifikation einer erleichternden Nucleinsäure, worin die Nucleinsäure aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt wird, die Umsetzung verschiedener Reaktanten zur Bildung eines Produkts mit der Fähigkeit, eine vorbestimmte Funktion, auszuüben, zu erleichtern, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Herstellen eines Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs, das Nucleinsäuren umfasst, die jeweils eine Region mit einer randomisierten Sequenz aufweisen und an einen ersten Reaktanten gebunden sind; (b) das Umsetzen des Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs mit mehreren unterschiedlichen freien Reaktanten unter Bedingungen, die für eine durch eine Nucleinsäure erleichterte Reaktion zwischen den Reaktanten zur Bildung des Produkts günstig sind; und (c) das Isolieren von Elementen des Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs, die an das Produkt gebunden sind, wodurch die erleichternde Nucleinsäure identifiziert werden kann.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, worin das Verfahren in vitro durchgeführt wird.
  28. Verfahren zur Coproduktion einer erleichternden Nucleinsäure und eines Produkts mit der Fähigkeit, eine vorbestimmte Funktion an einem Target auszuüben, umfassend: (a) das Binden eines ersten Reaktanten an die einzelnen Elemente eines Nucleinsäure-Testgemischs, um ein Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemisch zu bilden; (b) das Herstellen einer Produktbibliothek, die ein Gemisch von Produkten umfasst, durch Kontaktieren des Nucleinsäure-Reaktanten-Testgemischs mit einem Gemisch aus verschiedenen freien Reaktanten unter Bedingungen, die für die Bindungsbildung günstig sind, worin die Bindungsbildung durch die Nucleinsäure mit erleichternden Eigenschaften vermittelt wird, die an den ersten Reaktanten gebunden ist; (c) das Kontaktieren der Produktbibliothek mit dem Target, worin Produkte mit der Fähigkeit zur Ausübung einer bestimmten Funktion am Target in Bezug auf die Produktbibliothek vom Rest der Produktbibliothek getrennt werden können; (d) das Amplifizieren der mit dem Produkt assoziierten Nucleinsäure, um ein Gemisch aus Nucleinsäure zu erhalten, die angereichert sind, um die Aktivität zu erleichtern.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, worin das Verfahren in vitro durchgeführt wird.
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