JPH10508465A

JPH10508465A - 平行セレックス

Info

Publication number: JPH10508465A
Application number: JP8511062A
Authority: JP
Inventors: イートン，ブルース; ゴールド，ラリー
Original assignee: ネクスターファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1998-08-25
Anticipated expiration: 2015-09-19
Also published as: EP0782580B1; KR970706292A; EP0782580A1; RU2132853C1; US5723592A; NZ294127A; DE69535365D1; US5789160A; WO1996009316A1; EP0782580A4; US5858660A; CA2196286C; KR100457015B1; DE69535365T2; CA2196286A1; AU3679595A; JP4153030B2; US5723289A; AU714469B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、２種または３種以上の反応物からの生成物を、その生成物を形成する反応を促進できる核酸とともに共発生させる方法を開示する。本発明はさらにその方法で製造された生成物および促進性の核酸に関する。

Description

【発明の詳細な説明】平行セレックス発明の分野本発明は、２種またはそれ以上の反応物からの生成物の製造方法において、反応物の間の反応、好ましくは結合反応を、促進作用を有する核酸によって誘導する方法に関する。本発明はまた、この方法により製造された生成物を包含する。さらに特定すれば、本発明は、促進作用を有する核酸とその促進性核酸の誘導によって組立てられる生成物を共発生させる方法に関する。本発明はさらに、促進作用を有する核酸を同定する方法およびその核酸に関する。発明の背景標的分子に対し高い特異性で結合する核酸分子をインビトロにおいて発生させる方法は既に開発されている。この方法、Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生法）は、ＳＥＬＥＸ（セレックス）と呼ばれ、米国特許出願一連番号第07/536,428号（現時点では放棄。発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponenti al Enrichment）、1991年6月10日出願米国特許出願一連番号第07/714,131号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、1992年8月17日出願の米国特許出願一連番号第07/931,473号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands，米国特許第5,270,163 号として発行された。PCT/US91/04078も参照）に記載されている。これらの各出願は引用により本明細書に導入される。本明細書においては包括的にセレックス特許出願と呼ばれるこれらの各出願には、任意所望の標的分子に対する核酸リガンドを作成する基本的に新規な方法が記載されている。セレックス法は、同一の一般的選択スキームを使用して実際に任意所望の規準の結合親和性および選択性を達成するため、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択ならびに結合、分配および増幅の段階的反復を包含する方法である。セレックス法は核酸の混合物好ましくは無作為化された配列セグメントからなる混合物に出発し、その混合物を結合に好ましい条件下に標的と接触させ、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分配し、核酸−標的複合体を解離させ、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸の混合物を得て、ついで結合、分配、解離および増幅の工程を標的分子に対する高い特異性を有する高親和性核酸リガンドが生成するまで所望の回数反復する各工程を包含するものである。本発明者らは、セレックス法により、核酸は化学的化合物として形状、サイズおよびコンフィギュレーションの広範なアレイを形成することが可能であり、また生物系に存在する他の化合物に比べて、はるかに広範囲のレパートリーの結合および他の機能を発揮できることが証明されたことを認識してきた。多年にわたり、定説では、核酸が一義的には情報的役割をもつとされてきた。セレックスの適用を介して、本発明者らには、核酸が蛋白質と変わらない三次元構造的多様性をもつことが明らかになった。本発明者らは、したがって、セレックスまたはセレックス様方法を使用すれば、任意の与えられた標的に対して核酸リガンドを同定できるという点で、任意の選ばれた反応についてその促進が可能な核酸を同定できる可能性があると考えるに至った。理論的上、約10¹³〜10¹⁸個の核酸の候補混合物中に、広範囲の物理的および化学的相互作用の促進に適当な形状を有する少なくとも１個の核酸が存在すると本発明者らは考えている。これまでの研究では、狭い範囲の促進能力しかないわずか数種の核酸が同定されているにすぎない。数種のＲＮＡ触媒が知られている（Cech，1987，Science 236: 1532-1539; McCorkleら，1987，Concepts Biochem．64: 221-226）。これらの天然に存在するＲＮＡ酵素（リボザイム）は、今日まで、オリゴヌクレオチド基質に対して作用することが明らかにされているのみである。しかも、これらの分子は、蛋白質の生合成におけるＲＮＡの関与の可能性を除けば、これまでは大部分が、ホスホジエステル結合の縮合／加水分解に関する狭い範囲の化学的可能性でしか働いていない。ＲＮＡまたはＤＮＡ触媒を同定するための最近の集中的な研究にもかかわらず、わずかな成功しか達成されていないのである。ホスホジエステルの切断、アミノアシルエステル類の加水分解（Piccirilliら，1992． Science 256，1420-1424）、触媒の 5'トリホスフェート末端への 3'ＯＨを有するオリゴヌクレオチドのライゲーション（Bartelら，1993．Science 261：1411- 1418）、アミド結合の切断（Daiら，1995．Science 267: 237-240）、ビフェニルイソメラーゼ活性（Schultzら，1994．Science 264: 1924-1927）およびポリヌクレオチドキナーゼ活性（Lorschら，1994．Nature 371：31-36）が観察されている。Illangasekareら（Science 1995．267：643-647）は炭素−酸素結合の形成を触媒する最初のＲＮＡ分子を記載している。今日までに知られている核酸触媒には、結合の形成／切断反応におけるそれらの効率に関してある種の欠点がある。とくに、それらは蛋白質酵素に比較して作用が遅い、および上述のようにそれらはかなり狭い範囲の化学的可能性でしか働かないという欠点がある。多くの特定の目的を達成するためこれまでに基本的なセレックス法が改良されてきた。たとえば1992年10月14日出願の米国特許出願一連番号第07/960,093号、発明の名称 Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure には、特定の構造特性を有する核酸分子たとえば曲折構造ＤＮＡを選択するための、セレックスとゲル電気泳動の連結が記載されている。1993年9月17日出願の米国特許出願一連番号第08/123,935号、発明の名称 Photoselection of Nucleic Acid Ligands には、標的分子への結合および／または光架橋および／または光不活性化を可能にする光反応性の基を含有する核酸リガンドを選択するためのセレックスに基づく方法が記載されている。米国特許出願一連番号第08/123,935号のＣＩＰであり1994年9月19日に出願された係属中のＰＣＴ/ＵＳ94/10562号にはＨＩＶ-１Ｒｅｖ蛋白質に共有結合する 5-ヨードウラシル残基を含むある種の核酸配列が同定されたことが開示されている。この記載はとくに引用により本明細書に導入される。1993年10月7日出願の米国特許出願一連番号第 08/134,028号、発明の名称 High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffein には、極めて類似した分子を識別できる高度に特異的な核酸リガンドの同定方法が記載され、これはカウンターセレックス法と呼ばれている。1993年10月25日出願の米国特許出願一連番号第08/143,564号、発明の名称 Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX には、標的分子に対して高および低親和性を有するオリゴヌクレオチドの間のきわめて効率的な分配を達成することができるセレックスに基づく方法が記載されている。1995年3月8日出願の米国特許出願一連番号第08/400,440号、発明の名称 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi- SELEX には、核酸リガンドをその標的に共有結合的に連結する方法が記載されている。セレックス法には、インビボ安定性の改良または送達特性の改良のような改良された特性をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定が包含される。このような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基位置における化学的置換がある。修飾ヌクレオチドを含有するセレックスによって同定された核酸リガンドの記載が、1993年9月8日出願の米国特許出願一連番号第08/117,991号、発明の名称 High Affinity Nuc1eic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides に見られ、これには、ピリミジンの 5'- および 2'-位置が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている。前出の米国特許出願一連番号第08/134,028号には、 2'-アミノ（2'-ＮＨ₂），2'-フルオロ（2'-Ｆ）および／もしくは2'-Ｏ-メチル（2'-ＯＭｅ）で修飾された１または２種以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リカンドが記載されている。1994年6月22日出願の米国特許出願一連番号第08/264,029号、発明の名称 Novel Method of Preparation of 2'-Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement には、様々な 2'-修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。セレックス法には、1994年8月2日出願の米国特許出願一連番号第08/284,063号（発明の名称 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX）および 1994年4月28日出願米国特許出願一連番号08/234,997号（発明の名称 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX）にそれぞれ記載されているような、選ばれたオリゴヌクレオチドと選ばれた他のオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位との結合が包含される。これらの適用は、オリゴヌクレオチドの形状および他の性質の広範囲のアレイならびに効率的な増幅および複製性と、他分子の所望の性質との結合を可能にする。基本的なセレックス操作の改良について記載する上述の各特許出願は引用によりその全体が本明細書に導入される。最近、新しい薬物を発見するための方法として、組合せ（combinatorial）化学を使用する試みがなされてきた。異なる構造のアレイを有する組合せライブラリーを製造するために幾つかの精巧なスキームが考案されている。既知の組合せライブラリーに関連する構造には、セレックス法について前述した核酸、ペプチド（Brennerら，1992．PNAS 89: 5381-5383; Needlesら,1993. PNAS 90: 10700- 10704; Alper，1994．Science 264: 1399-1401; Longman,1994．In Vivo 23-31; Fodorら,1991，Science 251: 767-773）、その数ははるかに少ないが小さな有機分子（Ohlmeyerら，1993，PNAS 90: 10922-10926）がある。既知の組合せライブラリーのアプローチにはそれぞれに欠点がある。第一に、ペプチドもしくは小分子の組合せライブラリーの調製に用いられるスキームの一部は、アレイ／マトリックス中の任意の点で生じる化学のトラックを保持するための厳密な記録保持システムを要求することである。さらに、ペプチドおよび小有機分子は増幅されないので、所望の生成物の試験および同定を可能にするためには、個々の生成物それぞれがライブラリー中に比較的大量に存在しなければならない。特定の生成物の十分大量を得るためには、アレイを構成する反応が高度に効率的でなければならない。さらに重要な点は、これらのアプローチを作動させるためには、アレイ中の同一位置に生成物と副生物の混合物をもつことは不可能である。多様性は、それぞれが結果を予測できる単一反応からなる多段工程の多重の組合せによって生じる。しかしながら、多重の組合せの程度は収率によって制限され、記録保持によって束縛される。小分子の組合せアプローチの他の限界は、スキームには一般に不斉反応により新たな立体中心を生じる結合形成反応が除外されることである。不斉反応が除外されることにより、これらのアプローチは単一工程で発生可能な化学的多様性を与えない。多くの場合、不斉反応を制御することは困難で、したがって新たなキラル中心の形成反応が組合せスキームに包含されていても、ラセミ体の混合生成物を生じることになるものと思われる。ラセミ体の混合生成物は基本的な問題を招くことになる。たとえば、理想的な原子および基をアッセンブリーに導入することは可能であるが、生成物のキラリティーは所望の性質に対して決定的で、正しいエナンチオマーは全体の小部分としてしか存在しない可能性がある。このような例では、正しいエナンチオマーが、同定に十分な量生成するとは考え難い。しかも、反応物の大部分のアレイが不斉変換に包含される場合には、個々の反応それぞれのキラリティーを正確に予測することは、不可能である。したがって、ラセミ混合物に伴う難点は、旧来の手段によっては克服できるとは思われない。慣用の組合せライブラリーアプローチに不斉触媒を包含させるために必要な労力と時間は一般に実用的ではない。したがって、上述の問題を回避するために不斉反応は一般的に除外されることになる。しかしながら、不斉反応はすべての結合形成反応型の中で、最も強力な反応の一つである。組合せライブラリーアプローチに不斉反応が含まれないことは、作成できる生成物の型およびライブラリーの幅を著しく制限するものである。不斉反応によって与えられる膨大な多様性を以下の例によって示す。一般的に、反応物のマトリックスから生成する可能性がある生成物の数は、反応物の数をＭ、キラル中心の数をｎとすれば、Ｍ×２ⁿである。１個の不斉結合が形成される結合形成反応からなるマトリックスを考えることにする。可能な生成物の数はマトリックスの生成物を２倍に増大させる。一つの結合の形成毎に２個のキラル中心が発生する可能性があるので、１回の変換毎に可能な組合せの数は４もしくは２² になることに注意すべきである。特定の不斉反応の例として２個の炭素−炭素結合が形成され４個のキラル中心の生成の可能性があるジールスアルダー反応を考えることにする。ジールスアルダー反応では、ジエノフィル反応物の２個の末端の相対的立体化学はジエン反応物の２個の末端のそれとカップリングし、各ジエン／ジエノフィル対についての可能性の数は２³になる。これは１個のジエノフィルと10個のジエンの組合せでは、形成される可能性がある生成物の数は１×10×２³＝80（最初の反応物１個に第二の反応物80個）であることを意味する。単一の結合形成工程を用いて従来の組合せアプローチから同じレベルの多様性を得るためには、81個の化合物の直接的な合成が要求されることになる。10×10反応物のアレイの場合には標準の組合せアプローチでは100個の化合物が生成する。不斉ジールスアルグー反応アレイを10×10反応物に展開すると、最初の20個から800個の新しい化合物が生成ずる可能性がある。現在の組合せ戦略では、不斉変換のすべての可能な生成物をスクリーニングすることはできない。一般に所望の生成物それぞれを得ることはできないからである。上述のように、不斉反応の除外は慣用の組合せライブラリーアプローチの重大な限界である。理想的な組合せライブラリーアプローチは、オリゴヌクレオチド生成物が増幅できることにより収率は無関係なセレックス法を補足し、しかも一般に経口投与で活性であって製造経費も比較的安価な小有機分子を製造できるものであろう。本発明は、大きい、構造的に多様な生成物のライブラリーを発生させる新規なアプローチとセレックスの威力を組合せるものである。本発明に採用されたこのアプローチは、他の組合せライブラリーアプローチに伴う多くの不適正を克服し、将来の薬物の発見に革命的な考え方を提供するものである。発明の簡単な概要本発明は、１種または２種以上の化学反応物からそれぞれの数のライブラリーを生成させるために必要な相当する核酸促進物質と同時に発生させる生成物ライブラリーを提供するものである。とくに重要な点は、予め定められた所望の特性をもつ生成物が、生成物ライブラリーから同定できることである。以下、平行セレックス（Parallel SELEX）と呼ぶこの方法は、このような生成物ライブラリーを発生させ、ついで所望の特性を有する生成物を同定するために用いられるセレックス様方法である。セレックス法におけるように、膨大かつ多様な核酸試験混合物が提供される。それぞれの核酸は化学反応物にカップリングする。本発明は核酸ライブラリーが十分に大きければ、核酸に結合した化学反応物と遊離の化学反応物の間の化学反応を誘発できる核酸が核酸試験混合物中に同定可能であるという仮説を前提とするものである。さらに、ある化学反応を誘導できる核酸の亜群中、その一部は、すべての可能な生成物のそれぞれまたは実質的な部分の発生に高度に特異的である。したがって、生成物ライブラリーは、与えられた反応についてのすべての可能な生成物の少なくとも一部を含有する。核酸はその生成物に対する促進的特異性を提供し、一方、生成物は標的に対する予め定められた作用に関する特異性を提供する。平行セレックスは、従来技術における組合せライブラリーアプローチの多くの欠点を解消する。その最も基本的な形態において、平行セレックスは、反応物の一つが結合の形成を誘導できる核酸にカップリングしている２種またはそれ以上反応物を接触させて生成物ライブラリーを形成し、予め定められた所望の特性を有する生成物を選択し、セレックス法の増幅能を用いてその生成物を同定することからなる。平行セレックス法の模式的な説明図を図１に示す。本発明は、生成物ライブラリーから、標的に対して予め選択された機能を発揮できる能力について選ばれた所望の生成物を同定する方法において、それぞれが無作為化された配列の領域を有し、かつ第一の反応物と会合した核酸からなる核酸−反応物試験混合物を調製し、この核酸−反応物試験混合物を遊離の反応物と反応させて上記第一の反応物と遊離反応物の反応によって形成された生成物と会合した核酸からなる生成物ライブラリーを形成させ、上記生成物ライブラリーのメンバーを上述の予め選択された機能を発揮するそれらの相対的能力に基づいて分配し、それによって上記所望の生成物の同定を可能にすることからなる方法を提供する。本発明は、少なくとも１種のカップリングした反応物と遊離の反応物の間の反応であって、この場合上記カップリングした反応物は上記両反応物の間の反応を促進する核酸に結合している反応の結果である生成物の混合物からなる生成物ライブラリーを提供する。平行セレックスは、生成物とそれらの各化学のマトリックスのトラックを保持することを要求しないし、また高い効率も迅速な反応も要求しない。この利点は生成物の形成が特異的な核酸によって指示されるという事実の結果である。この指示されたアプローチは他の組合せライブラリーアプローチによって採用されるコードされたアプローチと対照的である。所望の生成物の形成を特異的に促進する核酸は容易に増幅できるし、生成物は以後の製造ラウンドで再現性よく再生産される。この方法は、最初に多数の反応を行うことを可能にし、予め定められた所望の特性を発揮する生成物の形成が確認されたのちに処理することができる。この方法では、生成物は詳細な構造情報がなくても発生させることができる。平行セレックスは不斉反応を用いる生成物ライブラリーの形成も包含できる。従来の組合せライブラリーアプローチとは異なり、反応の開始時には立体化学的な帰結が予測できなくても、不斉反応を包含させることが可能である。平行セレックスを行うために、特定の化学をトラックする必要はない。唯一の要求は、核酸が可能な反応の総数の少なくとも有限の一部を誘導することである。他の実施態様においては、促進性の核酸が提供される。促進性を有する核酸は結合形成または結合切断のような化学反応を誘発することができる。核酸は、付加的な電荷、分極能、水素結合、静電相互作用、および化学反応の誘導を助ける流動性を与える他の化学基を包含させるために様々な方法で修飾することができる。他の化学基、とくにアルキル基、アミノ酸鎖、各種補因子、および有機金属残基を包含させることができる。本発明は、促進性核酸が予め定められた所望の特性を有する生成物の合成を指示することを要求する。本発明はまた、本発明の生成物を含有する医薬組成物およびその組成物を投与する方法を包含する。さらに、本発明の生成物を含有する診断薬、農業用組成物および工業用組成物が本発明に包含される。図面の簡単な説明図１は、その最も基本的な形態における平行セレックス法を模式的に示す図である。図２は、促進性核酸がジエンとジエノフィルの間の一般的なジールスアルダー反応を誘発する平行セレックス法を模式的に示す図である。図３は、平行セレックス法において、第二の反応物分子のアレイの拡大のためのライゲーション配列の使用方法を示す図である。図３Ａ〜Ｅには、図２の場合の可能な16,384の可能性の５つを例示する。図４は、促進性核酸がケトンとアルデヒドの間の一般的な結合形成アルドール縮合反応を誘発する平行セレックス法を模式的に示す図である。図５Ａ〜Ｃは、図４に記載の混合アルドール反応の、生成物の構造的多様性に対する影響を示す。図５Ａは反応物を示す。図５Ｂは、Ａが求核試薬でＢが求電子試薬である場合に形成されるジアステレオマーを示す。図５Ｃは、Ｂが求核試薬でＡが求電子試薬である場合に形成されるジアステレオマーを示す。ジアステレオマーのみを示すが、各構造は相当するエナンチオマーを有する。図６Ａは、３種のアルキンの環状三量体化による置換ベンゼンの生成を示す。図６Ｂは、図６Ａに記載の３種のアルキンの環状三量体化によるベンゼン化合物の組立ての可能性のマトリックスを示す。図６Ｃは、アルキンの環状三量体化の機構を示す。可能な生成物の１個のみを示す。図７は、本発明の代表的な生成物を逆合成するための可能な戦略を示す。発明の詳細な説明セレックス法は、核酸にカップリングした第一の化学反応物のプールを遊離化学反応物のプールと結合させることによって形成される生成物ライブラリーを提供する。カップリングした核酸は、生成物ライブラリーを生じる化学反応を誘発し、さらにこの核酸は増幅が可能なので予め定められた所望の特性を有する生成物が生成物ライブラリー中に濃縮され、生成物ライブラリーから同定できる。その最も一般的な形態の平行セレックスは図１のように表示できる。第一の反応物（Ｒ）が試験混合物（無作為化配列をもつ10²〜10¹⁸の核酸を含有）中のそれぞれの核酸と結合することによって核酸−反応物試験混合物が形成される。この核酸−反応物試験混合物を第一の反応物（Ｒ）と結合して異なる生成物を形成する他の遊離の反応物（三角、五角および六角で示す）で処理する。核酸試験混合物（ＮＡ）からの別個の核酸配列が、図１に配列−Ａ，配列−Ｂおよび配列− Ｃによって示すような形状の異なる生成物の形成の促進に関与する点を銘記することが重要である。生成物は形状、反応性または形状および反応性の両者が相違する。所望の生成物の形状または反応性の分配は標的への結合またはそれとの反応によって達成される。蛋白質、小分子、脂質、糖など、すべてが標的（Ｔ）の例である。標的との結合または反応ののちに、相互作用しなかった生成物すなわち、図１に示したように配列−Ｂおよび配列−Ｃに結合する生成物は配列−Ａと分離され、廃棄される。核酸配列−Ａはついで、本技術分野の熟練者には既知の様々な方法によって増幅される。ついで配列−Ａを用い、出発反応物の混合物と処理して選ばれた生成物を形成する特定の反応を促進させることによって、所望の生成物の組立てを促進させる。典型的な反応では、配列−Ａは第一の反応物に再び結合することができるが、この再結合は必ずしも必要ではない。これは理想的な場合であり、多くの例では核酸促進物質が出発混合物からの２種以上の生成物と結合することになる。しかしながら、選択された生成物はすべて、標的と結合するかまたは標的と化学反応を起こす所望の性質をもっている。Ｉ．定義本発明を記述するため本明細書で用いられる一部の用語を以下に定義する。「核酸」は、一本鎖また二本鎖のＤＮＡ，ＲＮＡおよびそれらの任意の化学的修飾体を意味する。修飾には、それらに限定されるものではないが、個々の核酸塩基または核酸全体に付加的な電荷、分極能、水素結合、静電相互作用、および流動性を導入する他の化学基が与える修飾が包含される。このような修飾には、それらに限定されるものではないが、２'-位置の塩基修飾、５-位のピリミジン修飾、８-位置のプリン修飾、シトシンの環外アミンにおける修飾、５-ブロモウラシルの置換；骨格の修飾、メチル化、異常な塩基対の組合せ、たとえばイソ塩基、イソシチジンとイソグアニンなどが包含される。修飾には、３'および５'の修飾たとえばキャッピングも含まれる。増幅の各ラウンド後に行われる修飾も本発明に適合できる。増幅の各ラウンドののちに、可逆的にまたは不可逆的に増幅後修飾を付加することができる。実際、本発明においては任意の修飾が想定される。核酸の無作為化部分の長さは一般的には８〜250ヌクレオチド、好ましくは８〜160ヌクレオチドである。「核酸試験混合物」は、化学結合の形成および／または切断の誘導を可能にする形状を有する核酸を含めて、様々な無作為化配列の核酸の混合物である。「核酸試験混合物」の起源は、天然に存在する核酸もしくはそれらのフラグメント、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸、または上述の技術の組合せによって作成された核酸から選択できる。好ましい実施態様においては、増幅過程を容易にするために、それぞれの核酸は無作為化領域を取り囲む固定配列を有する。「促進作用を有する核酸」または「促進性核酸」または「核酸促進物質」は、化学反応を誘発または促進できる任意の核酸を意味する。化学反応は結合形成または結合切断反応とすることができる。本発明の好ましい実施態様では結合形成反応が意図される。核酸は必ずしも、促進作用を有する場合に考えられる触媒的代謝回転を示す必要はない。生成物形成の反応速度は核酸の存在によって増大するが、反応速度の増大は促進作用に必須ではない。促進性の核酸はその三次元構造が特定の化学反応を促進するようにフォールディングする。核酸は、単独で、直接核酸にカップリングした他の触媒残基との組合せで、またはたとえば溶液中に存在する他の触媒残基との組合せで、化学反応を誘発することができる。他の触媒残基には、有機金属残基、金属イオン等が包含される。核酸は異なる立体異性体を形成させることができる。核酸は、様々な種類の結合の形成または切断、それらに限定されるものではないがたとえば、縮合／加水分解、付加環化（ジールスアルダー反応、エン反応、および 1,3 双極付加反応）、α,β-不飽和化合物への共役付加、アルドール縮合、クライゼン反応、ペプチド、糖および脂質のグリコシル化を誘発することができる。さらに核酸修飾が有機金属残基を含む場合には、それらに限定されるものではないが、シクロプロパン化、エポキシ化、アズリジン化、水素化、アルキンの環状三量体化、不飽和分子の［３＋２］および［４＋１］付加環化、およびオレフィンメタセシスを含む対称または不斉生成物を形成できる他の反応を起こすことができる。「反応物」は、上述の修飾体を含めて核酸の熱的および化学的安定性に適合する結合形成または結合切断反応に関与することが可能な任意の化学的実体を意味する。反応物の語は、単一の化学的実体を意味する場合も、また数種の一般的化学構造の数種の反応物もしくは異なる一般的化学構造の数種の反応物を含む一群の化学的化合物を意味する場合もある。反応物は通常、２〜1000、好ましくは約 26〜500の範囲の分子量を有する。とくに好ましい反応物には小有機分子たとえばアルケン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、芳香族炭素環、異項環、ジエン、チオール、スルフィド、ジスルフィド、エポキシド、エーテル、アミン、イミン、ホスフェート、アミド、チオエーテル、スルホネートおよびハロゲン化化合物が包含される。本発明においては無機反応物も意図される。しかしながら、本発明の一部の実施態様においては、さらに大きい反応物たとえばポリマーまたは蛋白質も包含できる。使用する化学反応物の選択は、無作為に、または所望の生成物の本質、生成物がもつべき活性、生成物が作用すべき標的の本質に基づく情報を含む多くの規準をベースに行われる。「カップリングした反応物」または「第一の反応物」または「第一の化学反応物」は、核酸にカップリングして核酸−反応物試験混合物を形成する上述の反応物を意味する。第一の反応物の核酸へのカップリングは共有結合によるものでも非共有結合によるものであってもよい。第一の化学反応物は単一の化学的実体であってもまた数種の一般的化学構造の数種の反応物もしくは異なる一般的化学構造の数種の反応物を含む一群の化学分子であってもよい。たとえば第一の反応物は、１種のアルケン（たとえば、１-プロペン）または10種の異なるアルケン、または10種の異なるアルケンおよび10種の異なるアルキンとすることができる。「遊離反応物」または「第二の反応物」または「遊離化学反応物」は、核酸にカップリングしない反応物を意味する。１種の反応には、環状三量体化の場合のように、２種以上の遊離反応物を包含させることができる。遊離反応物は互いにまたはカップリングした反応物と同種でも異種でもよい。たとえば、遊離反応物は１種のアルケン（たとえば、1-プロペン）、または10種の異なるアルケン、または10種の異なるアルケンおよび10種の異なるアルキンとすることができる。「核酸−反応物試験混合物」は、それぞれが第一の化学反応物にカップリングした核酸の混合物を意味する。カップリングは、共有結合でも非共有結合でもよく、直接または核酸と反応物の間にリンカーを挟んで行われてもよい。核酸−反応物試験混合物は遊離化学反応物のプールと接触させて生成物ライブラリーを形成させることができる。「生成物」は、１種または２種以上の反応物の間の、核酸によって誘導された結合形成または結合切断反応から得られた化合物を意味する。好ましい実施態様においては、生成物は通常、カップリングした反応物と遊離反応物の間で形成される。生成物を作成するために反応する２種の反応物は異なる化学構造を有する反応物である必要はない。本発明の生成物は好ましくは、医薬として活性で治療効果を示すか、または診断薬もしくは農業用剤として有用な小有機分子である。生成物の通常の分子量は、約40〜2000，好ましくは約100〜1000の範囲である。しかしながら、ある実施態様においては、好ましさは劣るが、生成物はたとえばペプチド、蛋白質、ポリマー等のようなより大きな分子とすることができる。ある実施態様においては、好ましさは劣るが、反応は結合切断反応で、カップリングした生成物のみあるいは２種以上の反応物の間で起こる反応であってもよい。「生成物ライブラリー」は、促進性核酸にカップリングした反応物と好ましくは少なくとも１種の遊離反応物の間の化学反応によって形成される生成物の集合体を意味する。本発明の性質上、生成物ライブラリーは様々な化学構造を有する多くの多様な生成物を含有することができる。「標的に対して予め選択された機能を発揮する能力を有する生成物」もしくは「予め定められた特性を有する生成物」もしくは「所望の生成物」は、標的に対して予め定められた所望の様式で作用する生成物を意味する。予め定められた所望の標的に対する作用には、それらに限定されるものではないが、標的の結合、標的の触媒的変化、標的もしくは標的の機能活性を修飾／変化させる様式での標的との反応、自殺インヒビターとしての標的への共有結合による結合、標的と他分子の間の反応の促進が包含される。一例として、生成物ライブラリー中の予め定められた特性を有する生成物には、大部分の集団よりも大きな親和性で標的を結合する生成物がある。任意の与えられた生成物ライブラリー中には、与えられた標的に対して予め定められた特性を有する１種以上の生成物が存在しうる。予め定められた特性を有する生成物は、標的に対する結合親和性または標的に対するそれらの作用能力で互いに異なる複数の生成物であってもよい。「標的」は、平行セレックス法によって同定される生成物が予め定められた様式にて作用できる任意の化合物を意味する。標的分子は、蛋白質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖蛋白質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態の類縁体、補因子、インヒビター、薬物、染料、栄養物、増殖因子、細胞、組織等であり、制限はない。「分配」は、核酸試験混合物または核酸−反応物試験混合物のメンバーをその核酸が関連反応物の関与する反応を促進する能力に基づいて大量の試験混合物から分離し、所望の生成物を得ることができる任意の方法を意味する。分配は本技術分野において既知の様々な方法を用いて達成できる。フィルター結合、親和性クロマトグラフィー、液液分配、ろ過、ゲルシフト、密度勾配遠心分離、分子量フィルター分配、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除膜分離および等電点電気泳動はすべて、適当な分配方法の例である。分配方法の選択は標的および生成物の性質に依存し、本技術分野の熟練者には周知の原理および性質に従って行うことが可能である。さらに、最初の分配工程としては、生成物と会合している核酸（すなわち、促進性核酸）と第一の反応物とのみ会合している核酸（非促進性核酸）の間の分配が望ましい。この分配工程は、サイジングカラム、親和性クロマトグラフィー等のような本技術分野の熟練者には周知の多くの方法によって達成できる。このような分配工程後に、核酸試験混合物には促進性核酸が濃縮されることになる。「増幅」は、ある分子または分子群の量またはコピー数を増大させる任意の工程または工程の組合せを意味する。好ましい実施態様においては増幅は試験混合物が分配されたのちに行われ、増幅されるものは所望の生成物と会合した促進性核酸である。たとえばＲＮＡ分子の増幅は、３つの反応の連続、すなわち選ばれたＲＮＡのｃＤＮＡコピーの作成、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する各ｃＤＮＡコピー数の増大、およびｃＤＮＡコピーの転写による、選ばれたＲＮＡと同一の配列を有するＲＮＡ分子の獲得によって実施できる。本技術分野において周知の任意の反応または反応の組合せが適宜使用可能で、たとえば直接ＤＮＡ複製、直接ＲＮＡ増幅等が、本技術分野の熟練者により周知のように操作される。増幅法では、増幅前の混合物中の異なる配列の比率に対して増幅された混合物の比率の実質的な増大を生じる。核酸修飾の多くは酵素的増幅に適合することが知られている。増幅に適合しない修飾は増幅の各ラウンド後に、必要に応じて実施することができる。「無作為化」は、与えられた長さにわたって、核酸のセグメントが任意の可能な配列をもつことを記述して一般に用いられる語である。無作為化された配列は所望により約８〜100以上の範囲の様々な長さとする。無作為な配列セグメントを作成する化学的または酵素的反応では、未知のバイアスまたはヌクレオチドの優先性が存在して、数学的に無作為な配列を生じないことがある。「無作為」でなく「無作為化」の語が用いられるのは、このような非理想化からの偏向の可能性を反映したものである。現在知られている方法、たとえば連続化学合成では、大きな偏向が起こることは知られていない。20ヌクレオチド以下の短いセグメントでは、わずかな偏向があっても、その結果は無視できると思われる。単一合成の配列が長くなるほど、偏向の影響は大きくなる。偏向は、たとえば、合成反応中の前駆体ヌクレオチド（またはデオキシヌクレオチド）トリホスフェートのモル比を変化させることによって無作為化配列中に故意に導入することができる。たとえば、二次構造への影響、促進活性をもつことが知られている分子への偏向の導入、ある種の構造特性の導入または予備的な結果に基づいて、故意の偏向の導入が好ましい場合もある。「セレックス」法には、所望の様式たとえば蛋白質への結合で標的と相互作用する核酸リガンドの選択とこれらの選ばれた核酸の増幅の組合せが包含される。選択／増幅工程の反復サイクリングにより極めて多数の核酸を含むプールから標的と最も強力に相互作用する１種またはわずかな数の核酸の選択が可能になる。選択／増幅操作のサイクリングは選ばれた最終目的が達成されるまで継続する。本発明においては、セレックス法は所望の生成物と会合する核酸を増幅するために使用される。「平行セレックス」は、核酸試験混合物中の核酸を化学反応物にカップリングさせ、これをついで他の遊離の化学反応物と、生成物ライブラリーを製造するための結合形成を促進するのに好ましい条件下に接触させる方法である。生成物ライブラリーをスクリーニングして、予め定められた望ましい特性を有する生成物を同定する。生成物は、与えられた標的に対して予め定められた様式で作用するその能力（たとえば、標的への結合、ある方法での標的の修飾等）について試験することができる。所望の生成物はついで、望ましくない生成物から分配によって分離できる。所望の生成物は、その合成を指示した促進性核酸にカップリングしたままである。促進性核酸はプール中の他の物質から分配によって分離し、セレックス法に記載のようにして増幅することができる。促進性核酸は単独でまたは会合した所望の生成物とともに分配によって分離することができる。増幅された核酸には所望の生成物を組立てることができる核酸が濃縮される。増幅された核酸を、ついで第一の反応物と再びカップリングさせ、遊離の反応物と再接触させ、セレックス法の選択／増幅工程の反復サイクリングを導入して所望の生成物の合成、選択および同定が行われる。選択された核酸は最終的には、構造決定に十分な所望の生成物を産生することになる。 II．反応Ａ．核酸平行セレックスは、核酸が生成物の形成を誘導する能力に依存する。この方法では、核酸試験混合物を最初に調製することが必要である。一般的に、核酸試験混合物の調製の原理および方法は、前述の引用により本明細書に導入されたセレックス特許出願に概略が述べられている。簡略にいえば、様々な配列の核酸試験混合物が調製される。試験混合物中の個々の核酸は一般に、固定された配列の領域（すなわち、試験混合物の各メンバーは同一の位置に同一の配列を含有する）と無作為化配列の領域を包含する。固定された配列領域は、（ａ）セレックス特許に詳述されているように増幅工程の補助のため、（ｂ）ある反応を誘導することが既知の配列を模倣するため、または（ｃ）試験混合物中における与えられた構造配置の核酸の濃度を増大させるためのいずれかによって選択される。無作為化された配列は全体的に無作為化されるか（すなわち、任意の位置にある塩基が存在する確率は1/4である）または部分的に無作為化される（たとえば、任意の位置にある塩基が存在する確率は、０〜100％の任意のレベルで選択できる）。核酸試験混合物中に存在する核酸には、様々な化学反応を特異的に誘導するために適当なフォールディングが可能な核酸が包含される。核酸試験混合物は、核酸が促進性をもつ確率を増大させるために、様々な方法で修飾することができる。本発明によって意図される修飾は、正しい電荷、分極能、水素結合、静電相互作用、または流動性を導入し、その反応を行うために必要な形状を全体的に採用できるような任意の修飾である。理論によって限定されるものではないが、反応を実施するための機構には、それらに限定されるものではないが、反応遷移状態の安定化、特定の化学反応の容易化、およびカップリングした反応物に密接した近位に制限なく遊離の反応物を置く様式での遊離反応物への結合が包含されると考えられる。核酸の活性部位を増強させる修飾には、親水性残基、疎水性残基、各種酸化状態の金属イオン、剛性構造、蛋白質酵素の活性部位に見られる官能基、たとえばイミダゾール、一級アルコール、カルボキシレート、グアニジウム基、アミノ基、チオール等がある。さらに、有機金属または無機金属触媒を、反応物の酸化還元を可能にする場合のように、核酸の他の化学基として導入することができる。核酸試験混合物の各成分は様々な方法で修飾することができる。適当な修飾には、それらに限定されるものではないが、すべての核酸残基、無作為残基、すベてのピリミジンもしくはプリンまたはすべての特定の塩基（すなわち、Ｇ，Ｃ，Ａ，ＴまたはＵ）に対する修飾、あるいは１個の核酸あたり１個の修飾が包含される。ある種の分子（たとえば、金属触媒等）は、核酸に結合しないで溶液中に存在していてもよく、核酸の誘導作用に関連する反応の誘導に有用である。核酸が第一の化学反応物にカップリングする限り、ある様式で化学反応に関連すると考えられ、その方法および生成物は本発明の範囲に包含される。修飾は本発明の核酸の活性を促進するための前提要件ではない。ある環境下には、標的に結合する核酸を予め選択することが望ましい。この実施態様においては、反応物を核酸プールにカップリングさせる前に、無作為核酸プールを数（1〜10）ラウンドの標的分子に対するセレックスに付す。ｉ．他の化学基による核酸の修飾ヌクレオチドは、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置の修飾を含めた多くの方法で修飾することができる。一部の修飾は係属中の米国特許出願第08/117,991号（発明の名称：High Affinity Nucleic Acid Ligands Containig Modified Nucleotides）および第08/076,735号（発明の名称：Metho d for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products）に記載されている。これらは引用により本明細書に導入される。一実施態様においては、修飾は、他の化学基がピリミジンの５-位、プリンの８-位、または糖の２'-位置に結合される修飾である。個々の核酸に導入できる他の化学基の種類には制限はない。好ましい実施態様においては、得られた修飾ヌクレオチドは増幅可能であるか、または増幅工程後に修飾できる。いかなる意味においても本発明を限定するものではないが、一例として、生物模倣型の促進性核酸を企図することもできる。核酸の修飾の一つの選択として、ある塩基をそれらの化学的および物理学的性質において蛋白質により類似させる修飾がある。ピリミジンおよびプリン塩基のある種の修飾は、核酸が蛋白質のアミノ酸側鎖に類似する「側鎖」をもつと思われるようにすることを可能にする。アミノ酸誘導体である他の化学基をピリミジンの５-位またはプリンの８-位に結合させるためには幾つかの合成法を利用することができる。ピリミジンの５-位を修飾するための方法は、米国特許出願第08/076,735号、第08/347.600号および第08/458,421号ならびに他の刊行された操作に記載されている。核酸の修飾については発表された多くの操作が知られている。それらに限定されるものではないが、以下の記載、Limbach PA ら，1994．Nucleic Acids Res．22: 2183-2196 ならびにその引用文献；Hayakawa H ら，1985．Tetrahedron 41: 1675-83; Crouch GJ ら,1994. Nucleosides Nucleotides 13: 939-44; Scheit KH ら,1966. Chem .Ber. 99:3884; Bergstrom DE ら, 1975. J.Am.Chem.Soc. 98:1587-89: Bergsto m DE ら，1978. J.Am.Chem.Soc. 100: 8106-12; Bergstom DE ら，1978. J. Org . Chem. 43: 2870; Bergstom DE ら，1981. J.Org.Chem. 46: 1082; Bergstom D E ら, 1982. Nucleosides Nucleotides 1: 1-34; Crisp GT ら,1990. Tetrahedr on Lett．31: 1347-50; Hobbs FW Jr．1989．J．Org．Chem．54: 3420-22; Hiro ta K ら, 1993. Synthesis 213-5; Nagamati T ら,1974. J.Med.Chem. 17: 403- 6; Barton DHR ら, 1979. Tetrahedron Lett. 279-80; Hirota Kら，1993. J. O rg.Chem. 57: 5268; Mamos P ら, 1992. Tetrahedron Lett. 33:2413-16; Sessl er JL ら，1993. J.Am.Chem.Soc. 115: 10418-19; Long RA ら，1967. J.Org.Ch em.32: 2751-56; Prakash TP ら, 1993. Tetrahedron 49; 4035; Janokowski AJ ら，1989. Nucleosides Nucleotides 8: 339; Norris AR ら, 1984. J.Inorg.C hem. 22:11-20; Moffat JG ら in Nucleosides Analogues，RT Walker，E De Cl ercq,F Eckstein 編，71-163 頁，New York，Plenum Press; Townsend LB，1988 ，Chemistry of Nucleosides and Nucleotides，59-67頁，New York，Plenum Pr ess; Verheyden JPH ら, 1971. J.Org.Chem. 36: 250-54; Wagner D ら,1972. J .Org.Chem. 37:1876-78; Sproat BS ら，1991. in Oligonucleosidesand Analog ues, A Practical Approach．F Eckstein編，49-86頁，New York，Oxford Unive rsity Press; Lesnik EA ら, 1993.Biochemistry 32: 7832-38; Sproat BS ら, 1991. Nucleic Acids Res. 19: 733-38; Matsuda A ら，1991. J. Med. Chem. 3 4:234-39; Schmit C ら，1994. Synlett 238-40; Imazawa M ら,1979, J. Org. Chem. 44:2309-4; Schmit C ら，1994. Synlett 241-42; McCombie SW ら,1987. Tetrahedron Lett. 28: 383-6; Imazawa M ら，1975, Chem.Pharm.Bull. 23: 6 04-10; Divakar KJ ら,1990. J. Chem. Soc. Perkin Trans.1 969-74; Marriott JH ら，1991. Carbohydrate Res. 216: 257-69; Divakar KJ ら，1982. J. Chem. Soc . Pcrkin Trans. 1 1625-28; Marriott JH ら,1990. Tetrahedron Lett. 31:264 6-57がある。上述のアミノ酸修飾ヌクレオチドはネイティブなヌクレオチドを置換し、核酸試験混合物の配列中に導入することができる。上述のアミノ酸に代えて他の化学基によって修飾されたヌクレオチドも本発明によって意図される。多くの場合、どの修飾ヌクレオチドが核酸試験混合物への添加に最も望ましいかに関する作業仮説を立てることができる。たとえば、誘導を意図する反応がアルドール縮合でるとすると、クラスＩアルドラーゼの構造により導かれる必要な他の化学基は、カルボニル基質とイミンを形成する一級アミノ基を含むアミノ酸誘導体とその反応で求核試薬として働くエナミンの形成を促進する他の塩基性基であろう。 ii．核酸の有機金属基による修飾本発明によって意図される核酸試験混合物の他の修飾は、核酸試験混合物を構成する配列中への有機金属試薬の導入である。複雑な有機構造の合成における有機金属触媒の使用は有機合成に革命をもたらしている。有機金属触媒は、反応を誘導できる任意の金属および有機リガンドスフェアである。配位スフェアを形成できるリガンドは本技術分野の熟練者には周知のようにピリジンリガンド、ホスフィンリガンド、オキシムリガンド、ポルフィリン、イソシアナート、シアナート、カルボキシレート、チオール、一酸化炭素、アルケン、エーテル等がある。有用な金属は、ニッケル、ロジウム、コバルト、パラジウム、ジルコニウム、アルミニウム、鉄、マンガン、チタニウム、ルテニウム、モリブデンおよびホウ素である。たとえば、ピリジニウムニッケル錯体は尿素加水分解を触媒することが知られている。ロジウムアセテート触媒はシクロプロパン化を促進し、コバルト錯体は環状三量体化および［３＋２］付加環化を触媒し、パラジウム触媒は水素化および［３＋２］付加環化を触媒し、ルテニウムおよびモリブデン錯体はオレフィンメタセシスを触媒する。これらの反応を組合わせれば、すべて多くの医薬化合物の構造に有用なことが知られている３，４，５，６および７員環を製造することができる。さらに大きな環はπアリルパラジウム触媒により調製できる。キラル中心の形成は多くの生物学的に活性な化合物の合成に重要であり、無効のエナンチオマーは有害な薬理作用を示す場合が多い。単一のエナンチオマーを形成するための不斉水素化はパラジウムおよびジルコニウム錯体によって行うことができる。この実施態様においては、有機金属錯体をオリゴヌクレオチドに連結させるために、数種の選択が可能である。有機金属錯体はヌクレオチド塩基に直接、たとえばピリミジンの５-位で結合させることができる。この修飾オリゴヌクレオチドは良好な統合性で増幅できる筈である。核酸と有機金属錯体の間の連鎖はオリゴヌクレオチドを無傷のまま残して切断しなければならない場合もある。切断可能な連鎖には、それらに限定されるものではないが、光化学的に不安定なリンカー、ジスルフィドおよびカルボネートがある。これらの連鎖化学は本技術分野の熟練者にはよく知られていて、有機金属錯体を核酸の５'もしくは３'末端または核酸中のピリミジンの５-位に結合させるために使用することができる。他の選択では、有機金属錯体を包含するように合成できるカセットオリゴヌクレオチドが使用される。カセットオリゴヌクレオチドの実施態様は、有機金属錯体が会合した固定核酸配列を有し、それが選択の各ラウンドの開始時に核酸へのリガンドとなりうる。核酸試験混合物の各メンバーは通常、カセットの固定配列に相補性の同一の固定領域を有する。このカセットオリゴヌクレオチドは、他の接合方法の必要性を排除できる。有機金属触媒をオリゴヌクレオチド内に埋め込むことも望ましい。これらの実施態様の一部では、修飾を増幅の各ラウンド後に行うことができる。有機金属錯体をオリゴヌクレオチド内に埋め込む場合には、２個以上の切断可能な結合が望ましく、切断可能な結合それぞれの化学は独特であることが必要である。以下のスキームでは一例としてビピリジンリガンドが使用されている。ＡおよびＢと標識されたオリゴヌクレオチド成分は支持体から化学選択的に切断されるので、これらの配列は独立に測定できる。さらに、ＡおよびＢは化学的方法で容易に合成できる比較的短い配列から構成されている。一部の有機金属錯体では、金属は合成または転写後に導入する必要がある。これらの場合には、金属を結合するキレートリガンドを上に述べたようにオリゴヌクレオチドに結合させ、金属は核酸合成または増幅後にリガンド交換反応によって導入される。上に示した例から明らかなように、核酸が結合形成および結合切断のような化学反応を誘導できるように核酸を修飾するには、多くの方法がある。核酸のすべての修飾が本発明によって意図される。Ｂ．反応物その最も広い意味で、反応物の語は、結合形成および結合切断反応に関与できる核酸の熱的および化学的安定性に適合できる任意の化学的実体を意味する。本発明は反応物の種類によって限定されない。以下のクラスの小有機分子は可能性のある反応物の非限定的な例である。すなわち、アルケン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、芳香族炭素環、異項環、ジエン、チオール、スルフィド、ジスルフィド、エポキシド、エーテルおよびハロゲン化化合物である。反応物は好ましくは２〜1000の範囲、とくに好ましくは26〜 500の範囲の分子量を有する。所望の分子がさらに大きい場合には、反応物もさらに大きく。たとえばペプチド、蛋白質およびポリマーとなる。反応物は上に掲げた２種以上の官能基を含有してもよく、キラル中心をもっていてもよい。一般的には、反応物の名称は、その化学的反応単位によって決定される化学反応物の分類（たとえば、ジエン、エステル等）を表す。一例として、化学反応物は１〜 10ⁿの異なるメンバーを含むあるクラスの反応物とすることができる。与えられた反応について選ばれる反応物は数種のクラスの反応物を包含してもよい。平行セレックス法に適当な反応物を決定する過程のある段階で、標的を確認して、所望の生成物がこのような標的に作用する作用様式を決定しなければならない。この決定が行われたならば、所望の性質をもつと考えられる生成物のクラスを選択することができる。所望のクラスの生成物の生成に適当と思われる反応物をついで選択し、平行セレックス法に導入する。反応物の選択は無作為に決定できる。しかしながら、反応物の選択は、それらに限定されるものではないが、所望の特性を有する既知化合物との類似性、他の既知リガンド、コンピューターモデリングによるシミュレーション、ＮＭＲおよびＸ線データ／構造、酵素的および化学的フットプリント実験に基づく最初の構造仮説によって決定できる生成物の所望のクラスに基づいた反応物の選択を含めた多くの規準によって決定することが好ましい。生成物のクラスが同定されたならば、反応物は得られる多様性が最大限になるように選択される。可能な反応物の選択には多くの場合、逆合成操作が採用される。多くのクラスの反応物を同時に使用することもできる。本発明の目的では、核酸にカップリングされる反応物は第一の反応物またはカップリング反応物と呼ばれる。通常、第一の反応物は、結合形成を促進するのに好ましい条件下に少なくとも１種の遊離反応物と接触させ、得られた生成物をそれが予め定められた所望の特性をもつか否かを決定するためにアッセイに付す。第一の反応物は、２種以上の他の反応物（すなわち、第二、第三、第四等の反応物）と化学的に反応させて１種の生成物を形成させることが企図される。また、２種以上の化学反応を同時に行うことも企図される。生成物形成の異なる部分を促進するための多重の核酸を多分用いることになるが、多くの反応を同時に行うことも意図される。理想的には、反応物は、促進性核酸の能力に応じて、生成物ライブラリーが創成されるように選択される。Ｃ．核酸への反応物のカップリング平行セレックスでは、第一の反応物が核酸試験混合物中に存在する促進性を有する核酸にカップリングすることが必要である。第一の反応物は核酸に共有結合または非共有結合によってカップリングする。カップリングは理論的には核酸のどの位置に行われてもよい。しかしながら、実用的には、カップリングは核酸の５'または３'末端に行われる。通常、カップリングはライゲーション反応によって行われるが、任意の既知のカップリング反応が受入れられる。カップリングは５'ＧＭＰＳ，３'ジデオキシとターミナルトランスフェラーゼ等で可能なように、直接実施できる。核酸と反応物の間のカップリングにはリンカーを包含させることもできる。このようなリンカー基は核酸がより好ましいコンフォーメーションでフォールディングすることを可能にするので、結合形成反応を誘導する反応物との相互作用が良好になる。リンカー基は、第一の反応物がフォールディングした核酸の全表面および触媒ポケットを探査することを可能にする。リンカー基は任意の適当なスペーサー基とすることができる。リンカー基は、好ましくはポリマー単位から構成され、様々な反応物がフォールディングした核酸の全表面と結合ポケットに接近できるような可撓性の繋留を可能にする十分な長さをもたねばならない。リンカーの至適なサイズは核酸のサイズに依存する。一般的に、リンカー基のサイズは、10〜1000Å、好ましくは50〜300Åでなければならない。リンカー基は核酸−反応物試験混合物中で変動させ、所望の反応に至適な長さを選択させることができる。リンカー基はまた、反応条件下に容易に溶媒和するものがよい。適当なリンカー基の例にはＰＥＧ，ポリビニルアルコール、ポリアクリレートおよびポリペプチドがある。リンカー基と核酸の間の連結は切断可能で無傷の核酸を残すことが好ましい。適当な切断可能な連結の例には、それらに限定されるものではないが、光化学的に不安定なリンカー、ジスルフィド、およびカルボネートがある。この連結は酵素たとえばＤＮアーゼおよびプロテイナーゼで切断可能であってもよい。さらにこの連結は、1994年4月28日出願の米国特許出願一連番号第 08/234,997 号に記載のスプリント配合セレックス（Splint Blended SELEX）法によるものであってもよい。この記載は引用により本明細書に導入される。Ｄ．生成物の形成化学反応は、第一の反応物が少なくとも１種の第二の反応物と相互作用して生成物を形成した場合または第一の反応物がそれと会合した核酸によって促進される何らかの様式で切断された場合に起こる。平行セレックス法は任意の数の化学反応に適合する。反応が第一の反応物にカップリングした核酸によって誘導されることのみが必要である。核酸による誘導は反応物および所望の生成物に特異的であることが好ましいが、これは常にいえることではない。化学反応には、結合形成および結合切断の両者が包含される。様々な結合形成反応が本発明によって意図され、たとえば縮合／加水分解反応、ジールスアルダーおよびエン反応のような環化付加反応、α,β-不飽和化合物への共役付加、アルドール縮合、ペプチド、糖および脂質のグリコシル化が包含される。さらに、試験混合物中の核酸修飾が有機金属触媒の導入を包含する場合には、それらに限定されるものではないが、シクロプロパン化、水素化、アルキンの環状三量体化、不飽和分子の［３＋２］および［４＋１］付加環化、およびオレフィンメタセシスを含む他の反応が起こることがある。これらはすべて不斉生成物を形成することもできる。本発明は、これらの反応を単独でまたは任意の組合せで一緒に使用する場合についても意図する。本発明はさらに、第一の生成物を２種以上の反応物で形成させ、ついでこの生成物を他の遊離反応物との「反応物」として第二の生成物を形成させるなどの連続反応も意図する。結合切断反応も本発明に包含される。結合切断反応には幾つかの実施態様があり、それらに限定されるものではないが、第一の反応物の切断による標的と相互作用する生成物の形成、第一の反応物を第二の反応物とさらによく反応するように切断する新たな生成物の形成等がある。本発明また、本発明の方法によって形成された生成物を他の分子、それらに限定されるものではないが、標識、抗体、他の小分子等と結合させる実施態様も包含する。反応は本技術分野の通常の熟練者にはよく知られた核酸の安定性の要求に一致する様々な条件下に行われる。反応は任意の緩衝もしくは非緩衝水性溶媒、たとえば水、トリス、ＨＥＰＥＳ等、または適当なアルキルアンモニウムもしくは類似のカウンターイオンを含む無機溶媒系、たとえばメタノール／水、ＤＭＳＯ，ＤＭＦ／水中で行うことができる。温度範囲は一般的には−10℃〜100℃、好ましくは10℃〜50℃である。無作為化核酸−反応物試験混合物の濃度は一般的には１ｐＭ〜10ｍＭ，好ましくは１〜100μＭの範囲であり、第二の反応物の濃度は一般的には１μＭ〜I0Ｍ，好ましくは10μＭ〜10ｍＭの範囲である。Ｅ．予め定められた所望の特性を有する生成物の分配化学反応が行われたならば、生成物ライブラリーを予め定められた所望の特性を有する生成物についてスクリーニングしなければならない。前述のように、予め定められた所望の特性には、標的への結合、標的の触媒的変化、標的もしくは標的の機能活性を修飾／変化させる様式での標的との化学的反応、および自殺インヒビターとしての標的への共有結合が包含される。標的は任意の関心化合物であってよい。標的分子は、蛋白質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖蛋白質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類縁体、補因子、インヒビター、薬物、染料、栄養物、増殖因子、細胞、組織等であり、制限はない。生成物をスクリーニングする条件は、上記Ｄ項に記載の生成物の形成のための条件によって制限されない。スクリーニング条件は本技術分野の通常の熟練者にはよく知られている。予め定められた所望の特性を有する生成物は、本技術分野の通常の熟練者に既知の様々な方法により、それらの形成を促進した核酸に結合したままで、生成物ライブラリーの残部からの分配により分離される。重要な点は、核酸が増幅可能なように、結合した核酸の化学的分解を起こさないで、所望の生成物を全生成物ライブラリーから分配により分離することである。ついで、所望の生成物が結合したまま、または所望の生成物を分離したのちに、基本的セレックス法に教示されているようにして、核酸を増幅する。最も好ましい実施態様においては、所望の生成物は標的に作用し、所望の生成物に結合した核酸と標的の間には相互作用はない。核酸は、結合した反応物と遊離の反応物の間の反応を促進して所望の生成物を生成させ、また所望の生成物が続いて再生産され最終的に膨大な生成物ライブラリーから同定できるように増幅が可能である。しかしながら、この好ましい実施態様においては、核酸が直接標的と相互作用することは意図されていない。核酸は、標的と接触させてそれが標的と相互作用しないことを確認する前に、修飾することができる。修飾は、標的との相互作用の可能性が低くなるように核酸を二本鎖にすることを含めて、数種の方法で行うことができる。好ましさがわずかに劣る実施態様においては、核酸は独立にまたはその合成を促進した所望の生成物と共同して、標的に作用することができる。この実施態様においては、最終的な生成物は生成物と関連核酸との組合せであることもありうる。一実施態様においては、生成物は標的を結合し、結合した核酸−生成物−標的の複合体を、非結合生成物から多くの方法で分配できる。この方法には、ニトロセルロースフィルター結合、カラムクロマトグラフィー、ろ過、親和性クロマトグラフィー、遠心分離、および他のよく知られた方法が包含される。簡略に述べれば、生成物ライブラリーを、標的を結合させたカラムのような分配方法に付す。生成物を形成しなかった核酸または望ましくない生成物と会合した核酸はすべてカラムを通過するか、またはカウンターセレックスによって除去される。所望の生成物はカラムに結合し、カラムの条件を変えることによって溶出させることができるか、または所望の生成物に会合した核酸を生成物から切断して直接溶出させることもできる。さらに、標的と反応する生成物は標的とは反応しない生成物から分離できる。一つの例では、標的に共有結合する生成物（たとえば、自殺インヒビター）は、極めて緊縮な条件下に洗浄できる。得られた生成物−標的複合体をついでプロテイナーゼ、ＤＮアーゼまたは他の適当な試薬で処理してリンカーを切断し、所望の生成物に会合した核酸を遊離させる。遊離した核酸は増幅できる。他の例では、所望の生成物の予め定められた所望の特性は、化学基（たとえばアシル基）を標的に導入して標的を不活性化する生成物の能力である。すべての生成物がチオエステル化学基を有する生成物ライブラリーを準備したとする。標的と接触すると、所望の生成物は化学基を標的に導入し、同時に所望の生成物はチオエステルからチオールに変化する。したがって、その時は（チオエステルではなく）チオールである生成物を同定する分配方法が所望の生成物の選択およびそれに会合した核酸の増幅を可能にする。本発明に適合し、本技術分野の通常の熟練者に既知の他の分配およびスクリーニング方法がある。一実施態様においては、生成物は多くの共通の方法で分画化され、ついで各分画について活性をアッセイすることができる。分画化方法にはサイズ、ｐＨ，疎水性等を包含できる。前述のようにセレックス法には所望の生成物の効率的分配を導入できる他の実施態様、それらに限定されるものではないが、光セレックス（Photo-SELEX）、カウンターセレックス等を包含できる。一実施態様においては、分配工程の前に、核酸は標的と相互作用する可能性が低くなるような様式で処理される。一例では、核酸を分配前に、二本鎖にすることができる。他の実施態様においては、反応物を核酸にカップリングする前に、核酸試験混合物をカウンターセレックスによって分配し、標的に直接作用する核酸を除去することができる。Ｆ．増幅所望の特性を有する生成物の合成を指示する核酸の増幅は、本技術分野の通常の熟練者には既知の方法を用い、基本的セレックス法に記載されているように行われる。必要に応じてまたは所望により、修飾または他の付加された性質（たとえばリンカー基）は増幅に先立って除去してもよい。ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）は、核酸を増幅する方法の一例である。ＰＣＲ法の記載はたとえば、 Saiki ら, 1985. Science 230: 1350-1354; Saiki ら, 1986. Nature 324: 163- 166; Scharf ら，1986. Science 233: 1076-1078; Innis ら，1988. Proc.Natl. Acad.Sci．85: 9436-9440 ならびに米国特許第4,683,195（Mullisら）および米国特許第4,683,202（Mullisら）に見出される。ＰＣＲ増幅はその基本的形態においては、ssＤＮＡの３'および５'末端に相補性の特異的オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長、ならびにＤＮＡ変性を用い、所望の一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡのｃＤＮＡコピーの複製反復サイクルを包含する。１つのプライマーから伸長によって発生した生成物は他のプライマーからの伸長の鋳型として働く。他の既知の増幅方法も本発明によって意図される。標準置換増幅（ＳＤＡ）は別の増幅法の一例である（Walker ら，1992．Proc. Natl.Acad.Sci．89: 392-396; Walkerら，1992．Nucleic Acids Res．20: 1691 - 1696）。ＳＤＡは、ssＤＮＡから ssＤＮＡを増幅する技術であり、ＰＣＲと類似した部分がある。ＰＣＲと同様、ＳＤＡではプライマー間に存在するＤＮＡを増幅するために、２つの収束プライマーのセットを使用し、その実施にＤＮＡポリメラーゼの活性を必要とする。ＳＤＡでも、新たに合成されたＤＮＡを以後のＤＮＡの合成の鋳型として利用する指数関数的増幅スキームを使用する。ＰＣＲとは異なり、ＳＤＡは一定の温度（約40℃）で行われ、あるクラスのポリメラーゼの、それが新たな鎖を合成すると前に合成した鋳型の鎖を置換する能力に依存する。これがＰＣＲで用いられる熱変性工程の代わりをする。ＳＤＡはさらに他の酵素、制限エンドヌクレアーゼの作用を必要とし、dsＤＮＡ鋳型内にニックを生成させる。ニックの３'側のＤＮＡが新たなＤＮＡ合成のプライマーとして働き、一方、ニックの５'側のＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼによって溶液中に置換され、ここでそれはＳＤＡプライマーの一つとアニーリングしてさらにＤＮＡを合成する鋳型として働く。ＤＮＡリガンドが所望の場合、平行セレックスに対してＳＤＡは多くの利点を与える。ＳＤＡ法では、ある種の修飾ｄＮＴＰを容易に付加するこが知られている性質のよくわかったポリメラーゼであるＤＮＡポリメラーゼクレノウ exo(−)をＤＮＡの合成に使用する。特徴がよくわかっていることから、どの修飾ｄＮＴＰを作成するかについての合理的決定が容易である。プライマー伸長が繋留反応基へのＤＮＡリガンドの接合のためのライゲーションを代行する単純なスキームを考案することができた。ＳＤＡはＰＣＲと同様な増幅性を示す（ＤＮＡについては＜200 nt 長）が、特殊な装置の必要度が低く、より短時間で実施できる。増幅された核酸はついで、任意の必要な増幅後修飾に付され、第一の反応物に再カップリングされ、上述の過程が反復される。この過程は適当な促進活性を有する核酸を濃縮するのに必要な回数、および／または最高の望ましい特性をもつ所望の生成物が得られるまで反復される。１ラウンドの平行セレックスだけで、所望の特性を有する生成物が得られる場合が多い。終点は、本技術分野の通常の熟練者に理解されている多くの方法、たとえば結合曲線、ＩＣ₅₀値によって測定される阻害、不活性化の速度、毒性像、生物学的利用性、薬物動態等によって決定することができる。Ｇ．所望の生成物の分析核酸促進物質を増幅し、十分な量の所望の生成物が産生されたならば、１種または一連の生成物の構造が、本技術分野の通常の熟練者にはよく知られた慣用の分光学的方法で解析される。このためには、最初の反応条件が適切に反復されなければならない。第一の反応物を核酸促進物質に再カップリングし、得られた核酸−反応物を第二の反応物のプールと混合し、形成された所望の生成物を単離する。この過程を最も有効にする前提は、核酸が所望の反応を含む個々の反応または少なくとも比較的少数の反応を特異的に促進することである。慣用の分光学的方法には、それらに限定するものではないが、ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、ＨＰＬＣスペクトル、赤外スペクトル、ＵＶ可視スペクトル、円二色性、旋光分析およびＸ線結晶解析が包含される。所望の生成物の構造が決定されたならば、それは、標準的な化学合成操作または本明細書に概説した促進性核酸を用いる製造操作により大量に製造できる。 III．一般的実施例以下の一般的実施例には、平行セレックス法の付加的な説明が包含される。平行セレックスの最も基本的なスキームの概略を図１に示した。以下の実施例は、本発明において意図される反応の少数の例について詳細に説明する。これらの例は例示の目的のみで提供されるものであって、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。ａ．ジールスアルダー反応以下の記述では、図２に示したジールスアルダー反応を利用して、どのようにしてＲＮＡ促進物質および一般的標的に結合するシクロヘキセン小分子が共発生されるかを述べる。この平行セレックスの例の他のバージョンではＤＮＡが使用される。ＤＮＡがＲＮＡより好ましい場合がある。出発のＲＮＡ（図２のＡ）は、転写を可能にするためと、第一の反応物ジエノフィルに連結するＰＥＧスペーサーへの接合のためのライゲーション部位を与えるための３'および５'固定領域を含有する。出発のＲＮＡ（Ａ）は、異なる配列からなる約４^N（ＮはＲＮＡ配列中のヌクレオチド数）個の無作為化領域を有する。正確な数は無作為領域の長さおよびその作成に用いたＲＮＡ合成の規模に依存する。ＰＥＧスペーサーは、第一の反応物ジエノフィルがフォールディングしたＲＮＡ（図２のＣおよびＤ）の全表面および結合ポケットに接近できるような可撓性の繋留を可能にする十分な数のポリマー単位を含有する。第一の反応物にカップリングする出発のＲＮＡ（Ａ）は明快にするため線状構造として示してある。正確なＲＮＡの構造はＣおよびＤに表示したように様々のフォールディングモチーフからなる。この例では工程１にはＢ_1-10で標識された10種の第二の反応物ジエンのプールが包含される（Ｒ¹，Ｒ²およびＲ³は水素ではない）。このプールを基Ｒ¹，Ｒ² およびＲ³の１つまたはすべてが水素である第二の反応物ジエンを含むように拡大しなかったのはとくに理由があるわけではない。これは単に形成される立体中心の数が減るからである。構造ＣおよびＤは、第一の反応物ジエノフィルのアプローチの２つの可能性を示している。それぞれの位置異性体には形成可能な４つの立体異性体があり、すべてが製造されると11の化合物が80に変換される。模式的な構造エレメントａおよびｂは、第二の反応物ジエンまたは第一の反応物ジエノフィルと相互作用して第二の反応物ジエンの方向性および遷移状態における第二の反応物ジエンのアプローチを決定する理論的な突出部を示している。たとえばＥ_1-10で、Ｒ³がＲ²よりも小さいと、ジエンの好ましい方向性はＲＮＡの特徴ｂとジエノフィル基Ｒ²の間の立体障害により、Ｇ/Ｇ^*およびＨ/Ｈ^*ではなく、Ｅ/Ｅ^*およびＦ/Ｆ^*の形成が優位になる。アプローチＣにおいては、エナンチオマーＥ/Ｅ^*ならびにＦ/Ｆ^*が形成されることになる。ジエノフィルのカルボキシレート酸素と標識されたＲＮＡの間のＨ-結合のような吸引相互作用はエンド生成物の形成を促進する。Ｒ¹とｂで標識したＲＮＡ表面の間の吸引力もエンド攻撃を優先させる。これに反して、ＲＮＡの構造特性ａおよびｂはジエノフィルのカルボキシレートおよびＲ¹と反発相互作用を示し、エキソ生成物の形成を生じる。対Ｅ/Ｅ^*とＦ/Ｆ^*はジアステレオマーであり、したがって、Ｒ¹，Ｒ²およびＲ³置換基が同一でも物理学的性質は異なることに注意すべきである。アプローチＤでは、エナンチオマーＧ/Ｇ^*およびＨ/Ｈ^*が生成され、対Ｇ/Ｇ^*およびＨ/ Ｈ^*の間の関係はジアステレオマーである。しかしながら、オリゴヌクレオチドには固有のキラリティーがあるので、ＲＮＡ促進性部位はエナンチオマー対の遷移状態とエネルギー的に異なるジアステレオマー相互作用を有し、これが、エネ能にする。シクロヘキセン所望生成物の選択は工程２によって説明する。標的が蛋白質であり、所望の生成物が標的への結合のために選択される場合、工程２は、最初のラウンドを過剰の標的蛋白質中で行い、ついでシクロヘキセン所望生成物の濃縮が進むに従い、蛋白質濃度を低下させていく。標的蛋白質の例には、酵素、ホルモン、細胞受容体、細胞接着分子等が包含される。競合アッセイでは、最高の親和性を示す所望の生成物が結合する。これは、最初のたとえばＥ/Ｅ^*とＦ/Ｆ^*の全群の選択を可能にする。この例では、標的蛋白質により強固に結合するという理由で１種のエナンチオマーのセットたとえばＥが選択され、たとえば、わずか５〜10種の可能な構造が匹敵する親和性をもつと仮定する（それぞれのジアステレオマーから誘導された所望の生成物を得ることはできないと考えなければならない理由はない）。選択された所望の生成物、およびそれらに結合し、共発生したＲＮＡ促進物質は望ましくない生成物から分配され、ＲＮＡ促進物質は標準セレックス操作により工程３〜５で増幅される。工程５ののちには、ＲＮＡはＥ群の化合物を特異的に形成する促進活性によって濃縮されている。この時点では５種以上のＲＮＡがあったとする。次のラウンドのセレックスを実施するためには、最初のＰＥＧスペーサーと第一の反応物ジエノフィルを新たに濃縮されたＲＮＡプールとライゲートする工程６が必要になる。工程１〜６を反復すると、工程５ののちに得られるＲＮＡの促進活性はさらに濃縮される。さらに、シクロヘキセン所望生成物の結合親和性も最大に達する。ＲＮＡプールがこの時点ではランダムではないと仮定すると、様々なＲＮＡのクローニングおよび配列決定により、個々のＲＮＡ分子をそれらの促進活性について試験することができる。これらのＲＮＡ分子を同じ第一および第二の反応物ジエノフィルおよびジエンで処理しても必ずしも共発生シクロヘキセン所望生成物の形成を生じるとは限らない。十分な量のＲＮＡ促進物質が生成したのち、１種または一連のシクロヘキセン所望生成物の構造を慣用の分光分析法で解析する。上に挙げた例では、単一の第一の反応物ジエノフィルを10種の第二の反応物ジエンのプールで処理した。共発生過程に包含される単一の第一の反応物ジエノフィルの数は単に、多数の異なる第一の反応物ジエノフィルをライゲーション配列に結合させることにより拡大することができる。共発生、クローニングおよび配列決定後に、個々のＲＮＡ促進物質をついで第一および第二の反応物ジエンおよびジエノフィルで処理して、促進性ＲＮＡによって形成される個々の所望の生成物を分光分析法による構造の同定を可能にする十分量形成させる。上に示した平行セレックスの例では第一の反応物ジエノフィルをＲＮＡに結合させるので、促進性ＲＮＡは、他のＲＮＡに結合した反応物とは異なり、結合した第一の反応物ジエノフィルの反応に特異的であるとも考えられる。単一の促進性ＲＮＡを第一および第二の反応物ジエンおよびジエノフィルで処理すると第二の反応物ジエンと極めて特異的な反応が起こることがわかる。第二の反応物ジエンが選択されるものであり、選択時に結合された第一の反応物ジエノフィルへの選択性は劣るからである。他方、第一および第二の反応物の両者を変動させると、両反応物に対する特異性が得られる。改良された実施態様では、図３に示すように、特定の核酸に結合する第一の反応物ジエノフィルをコードするライゲーション配列を使用し、マトリックスの拡大を可能にする。このアプローチを用いると、個々の促進性ＲＮＡのクローニングおよび配列決定時に、ライゲーション部位の配列は、ＰＥＧリンカーを介してそれに結合したのは第一の反応物ジエノフィルであることを指示する。この方法では、特定の促進性ＲＮＡに相当する第一の反応物ジエノフィルのみを共発生所望生成物の最終的調製に使用することになる。単一の第一の反応物ジエンをＲＮＡリゲーション配列に結合し、工程１に第二の反応物ジエノフィルのプールを導入する図２において提案した実験に対する補助実験を何故用いないかには理由はない。多数の第一の反応物と１種の第二の反応物を使用することも可能である。ジールスアルダーは多くの極めて有力な不斉結合形成反応の一つにすぎない。ｂ．アルドール反応合成および生合成化学に有用な他の反応型にアルドール縮合がある。ジールスアルダー反応について論じた基本的な考え方が、１種または２種以上のアルデヒドが一方の反応物で、１種または２種以上のケトンが他方の反応物であるアルドール反応にも当てはまる。アルドール縮合に平行セレックスを適合させるための論理的な変換は以下の例および図４に記述する。ＲＮＡ（またはＤＮＡ）は転写のための３'および５'固定領域からなる。ＲＮＡにはＰＥＧリンカー（20〜50エチレン単位長）を結合させその他端には第一の反応物アルデヒドを連結させる。第一の反応物アルデヒドは、第二の反応物ケトンに比較してその大きな反応性のために、アルドール反応においては求電子試薬として作用する。Ａの標識を付したＲＮＡ配列のプールは様々な構造モチーフにフォールディングしている。様々な化学基Ｒ¹およびＲ²を有するＢ_1-10で標識された第二の反応物ケトンは、図４の工程１においてＡで処理される。ＲＮＡは、ケトンのカルボニルに付加して，Ｃ_1-10，Ｄ_1-10，Ｅ_1-10およびＦ_1-10によって表されるエナミンを形成できるアミンを含有する必要がある。ＲＮＡの形状がＥ- またはＺ-エナミンを形成するか否か決定することになる。エナミンはついで結合したアルデヒドとのアルドール反応において求核試薬として働く。エナミンを取巻くＲＮＡの立体的および電子的環境が与えられたＲＮＡ配列に求められるエナンチオ選択性を決定する。この例の目的においては、アルドール縮合生成物Ｇ_1-10，Ｈ_1-10．Ｇ^* _1-10およびＨ^* _1-10は第一の反応物アルデヒドの同一表面からの攻撃によって誘導される。異なるエナミンと第一の反応物アルデヒドの相対的方向性が生じれば、これは起こりうること思われるが、逆の面からの攻撃によって同じ生成物が形成される可能性もある。２つの新たなキラル中心が形成される点が重要で、40のすべての化合物はＧ_1-10，Ｈ_1-10，Ｇ^* _1-10およびＨ^* _1-10で表される。アルドール生成物Ｇ_1-10/Ｇ^* _1-10はエナンチオマーであり、Ｈ_1-10/Ｈ^* _1-10も同様である。水中では、Ｇ_1-10，Ｈ_1-10，Ｇ^* _1-10およびＨ^* _1-10のイミン結合は可逆性で、加水分解されると相当するβケトアルコール生成物を与える。最高の親和性のβ ケトアルコール所望生成物の選択は、得られた生成物ライブラリーを、ビオチンまたはカラム支持体に連結した蛋白質標識による分配で達成される。平衡化させたのち、選択されたＲＮＡを標準セレックス法で図３の工程３〜５に示すように増幅させる。最大レベルの促進が達成されるか、または標的への結合親和性がプラトーになったならば、所望の生成物に会合した促進性ＲＮＡをクローン化して配列を決定する。ついで、促進性ＲＮＡを別個に合成し、βケトアルコール所望生成物を、分光分析法による構造特性の追跡に十分な量を単離できる規模で合成する。ジールスアルダーの例の場合と同様に、平行セレックスに用いられる第一の反応物アルデヒドのアレイは、様々な第一の反応物アルデヒドをＰＥＧリンカーに結合させ、第一の反応物アルデヒドがどの核酸に結合したかのためのライゲーション配列をコードすることによって拡大させることができる。上述のジールスアルダー反応の例からは、２つの立体中心の創成に対し４のファクターが得られる。しかしながら、アルドール縮合では、これよりはるかに大きな確率を生じる可能性がある。第一および第二の反応物として、カルボニル炭素に匹敵する電子親和性とα炭素に類似の核親和性を有する２種のケトンを用いる混合アルドール反応を考えるとする（図５）。通常、有機合成ではこの種類の反応は、生成物に極めて複雑な混合物を生じるので回避される。平行セレックス戦略においては、この多様性の増大は利点を付加するものである。構造Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ．ＩおよびＪはすべて異なるジアステレオマーである。これらの生成物はそれぞれ相当するエナンチオマーを有し、これは、図４の混合アルドール縮合反応では、最初の20（Ａ_1-10およびＢ_1-10）から構造の異なる1600の生成物が形成されることを意味する。ｃ．［２＋２＋２］環状三量体化反応平行セレックスならびに促進性ＲＮＡおよび所望の生成物の共発生は、キラル中心を創成する構造をもつ生成物の形成に限定されるものではない。多くの重要な医薬化合物は結合したキラル置換基を有する非キラル芳香基を含有する。芳香環系（ベンゼン、ナフタレン、ピリジン等）からなる生成物の構築のために最も有力な方法の一つは第一、第二および第三の反応物アルキンの、シクロペンタジエニルコバルト（ＣｐＣｏ）誘導環状三量体化である。［２＋２＋２］環状三量体化はアルキン反応物に限定されるものではなく、アルキンおよびアルケン反応物の組合せによって非芳香性６員環生成物を組立てることもできる。ここで述べる例には、ＲＮＡ（またはＤＮＡ）中への有機金属触媒の導入およびその平行セレックスにおける使用の本発明の実施態様を包含する。図２および４に示す上述の工程１〜６はすべての平行セレックスに一般的であるので生成される生成物の構造の可能な数に対する環状三量体化の効果についてのみ述べる。３種のアルキン反応物によるベンゼン環を含む生成物の形成の場合、得られる可能性の最大数を、各反応物の各末端に異なる置換基が結合している３種の異なるアルキン反応物を用いて調べた（図６参照）。図６に示すように、アルキン反応物の環状三量体化では、４ＭＮ²の可能な位置異性生成物がある（ＭはＲＮＡに結合された非対称アルキンの第一の反応物の数であり、ＮはＲＮＡ−第一の反応物の混合物と接触させる遊離の非対称アルキン第二および第三反応物の数である）。図６は３種のアルキンのみでの可能性のマトリックスを示す。この場合、第一の反応物はＲＮＡに結合し第二および第三の反応物は遊離している。平行セレックスをＲＮＡ分子に結合するアルキン第一反応物を10種、第二および第三反応物10種を包含するように拡大すると、4,000 種のベンゼン生成物が形成される可能性がある。ＣｐＣｏがアルキン反応物の環状三量体化を触媒する機構は図６の下部のパネルに示す。ＣｐＣｏ（またはアルキンを環化できる他の金属錯体）を上述のようにオリゴヌクレオチドに結合することにより、環状三量体化を促進するＲＮＡの形成が可能である。有機金属センターの周囲にフォールディングするＲＮＡ構造が図６、Ｂ→ＣまたはＣ→Ｄに示した結合形成工程のいずれかの選択性に影響する。平行セレックスの分配の使用により、所望のベンゼン生成物の合成に対する特異性を提供することになる。クローニングおよび十分な量の促進性ＲＮＡの調製後に、共発生芳香族生成物が、選択使用されたアルキン混合物でＲＮＡを処理することによって製造される。得られた芳香族生成物はついで慣用の方法で構造的特性を明らかにすることができる。ｄ．逆合成戦略一般的に、すべての平行セレックススキームは、上述のようにまた図２および４に示したように、工程１〜６を共通して包含する。異なる化学は形成される生成物の種類および数の変化のみである。平行セレックスにどの化学を包含させるのが最善かを考える場合、興味のある構造的生成物クラスについて逆合成分析を行うことは価値がある。図７に示した生成物の可能な切断を考えることにする。切断Ａはジールスアルダー変換に、Ｂはアルドール縮合に関連すると思われる。これらの結合形成反応については上述した。この生成物には他の多くの切断が可能である。一般に、環形成生成物変換を含む逆合成戦略は、最大数の結合または立体中心を形成するので望ましい。どの種類の反応が平行セレックスに最も有力であるかを考える場合には、考慮すべき他の因子が必要である。たとえば、反応条件下における試薬の利用性ならびにオリゴヌクレオチドの反応性および安定性である。極めて重要なことは、形成される可能性がある立体または位置異性体の数である。ジールスアルダーおよびアルドール縮合反応では、新たな立体中心の形成の結果として多数の生成物が創成される可能性があったが、逆合成経路Ｃでは有意な数の位置異性体生成物を提供することができる。本発明には、１種または２種以上の促進性核酸および２種または３種以上の異なる反応物を同時にまたは順次関与させて、本発明の生成物を作成する数種の化学反応を包含させることが意図する。 IV．投与および使用本発明の所望の生成物の適用には、各種の治療、予防、診断および化粧料的使用が包含される。化学生成物に望まれる任意の使用が本発明の範囲に含まれる。特定のクラスの状態には、それらに限定されるものではないが、炎症、心脈管系疾患、新生物状態、代謝性疾患、寄生虫疾患および感染性疾患が包含される。さらに特定すれば、本発明の生成物は癌、アンギナ、関節炎、喘息、アレルギー、鼻炎、ショック、炎症性腸疾患、低血圧の処置および予防、ならびに痛みおよび炎症、局所外傷たとえば創傷、火傷、発疹の全身性処置に有用である。本発明の所望生成物は、平行セレックスによって同定されたのちは、慣用の化学合成経路によりまたは反応物間の反応を誘導する促進性核酸を用いて、大規模製造によって調製することができる。本発明の生成物は不斉原子を含んでいてもよい。不斉原子は、炭素、リン、ケイ素、硫黄等から選択できる。すなわち、本発明は個々の立体異性体、およびそれらの混合物を包含する。個々の異性体は本技術分野で既知の方法によって調製または単離することができる。所望生成物は本技術分野の通常の熟練者に周知の任意の方法で投与することができる。投与様式にはそれらに限定されるものではないが、経腸（経口）投与、非経口（静脈内、皮下、および筋肉内）投与、局所投与、および粘膜（経鼻、吸入等）投与がある。本発明による処置方法は、所望生成物の有効量を処置を必要とする対象に生体内または局所投与することからなる。本発明の方法の所望生成物またはそれを含有する医薬組成物の用量は、一般的に所望生成物 0.01〜500 mg/kg 好ましくは 0.1〜50 mg/kg の範囲から選択される有効、非毒性量である。本技術分野の熟練者は臨床試験により、処置すべき特定の疾患に対する至適用量を決定することができる。望ましい用量は一般に、対象に１日１〜６回、静脈内、経口的、経直腸的、非経口的、局所的に、または吸入により投与される。本発明の所望生成物の効力は本技術分野の通常の熟練者に周知の標準方法で決定することができる。投与のための生成物の医薬製剤の製造は本技術分野の熟練者に周知の様々な方法で実施できる。本発明の範囲内の適当な医薬的に許容される塩は鉱酸たとえば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸および硫酸、ならびに有機酸たとえば酒石酸、フマール酸、乳酸、シュウ酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等から誘導され、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩、ベンゼンスルホン酸、ｐ-トルエンスルホン酸塩等をそれぞれ与える。本発明の所望生成物は非経口投与のためには、注射用水溶液に処方され、これには抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、可溶化剤、化学保護剤等を含有させることができる。用時調製注射液は、滅菌された丸剤、顆粒剤または錠剤から調製され、これにはすべて通常の熟練技術者にはよく知られた希釈剤、分散剤および界面活性剤、結合剤および滑沢剤を含有させることができる。経口投与の場合には、所望生成物の粉末または顆粒を希釈剤ならびに分散剤および界面活性剤と処方することができるし、また水中もしくはシロップ中に、乾燥状態でカプセルでカプセルもしくはカシュー中に、または懸濁剤を用いて非水性懸濁液に処方することができる。所望生成物はまた、必要に応じて結合剤および滑沢剤とともに錠剤の形態として、水もしくはシロップ中の懸濁液として、油もしくは油中水乳化液として、または生物分解性もしくは生物腐食性ポリマーからの持続放出性形態として投与することができる。これらには、フレーバー、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、および乳化剤を包含させることができる。経口投与用のカプセル剤または錠剤はコーティングしてもよく、また製薬技術の熟練者にはすべて周知の他の医薬的に許容される試剤および処方を利用することもできる。固体または液体の担体も使用できる。固体担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウムニ水和物、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、アガール、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が包含される。液体担体には、シロップ、落花生油、オリーブ油、食塩水、および水が包含される。軟膏およびクリームは、様々のよく知られた親水性および疎水性の基剤を用いて調製される。局所用の保有層をもつ製剤は既知のポリマー材料たとえば、所望の放出特性を与えるように選択された各種アクリル基剤のポリマーを用いて適当に調製される。坐剤は標準基剤たとえばポリエチレングリコールおよびココア脂を用いて調製できる。本発明の生成物の担体としてリポソームを使用することもできる。さらに、本発明の所望生成物には、農業用剤としての用途を認めることができる。とくに、所望生成物は、除草剤、有害生物殺滅剤、成長調整剤等である場合がある。本発明の生成物の農業用の目的での使用および投与は本技術分野の通常の熟練者に周知である。本発明の生成物はまた化学工業の過程で使用することもできる。実施例以下の実施例には、本発明の製造方法の好ましい実施態様および生成物を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。例１ジールスアルダー反応を促進するための非修飾ＲＮＡの使用ＰＥＧリンカーの合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、核酸（この場合には、40Ｍ8 ＲＮＡ）（配列番号：２）と第一反応物（この場合、マレイミド）の間のスペーサーとして作用するように合成した。リンカー合成のスキームを以下に示す。トシル化-ＰＥＧ（Ｔｓ−ＰＥＧ）（２）の合成−1.0ｇ（0.670ミリモル）のポリエチレングリコール１（平均分子量 1500）を 15 ml の乾燥ＴＨＦに溶解し、溶媒を真空中で除去した。残った残留物を 15 ml の乾燥ＴＨＦに溶かし、これにＤＢＵ 52 mg（0.335 ミリモル）ついで 64 mg（0.335 ミリモル）のｐ−トルエンスルホニルクロリドを加えた。混合物をアルゴン下室温で10日間攪拌した。この間に白色の沈殿が形成された。10日後反応混合物をろ過し溶媒を真空中で除去した。モノトシル化生成物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（７％ＭｅＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製するとかすかに黄色の固体 320 mg（58％）が得られた（Ｒｆ＝0.31）。生成物は¹ＨＮＭＲスペクトルに基づいて同定された。アミノ-ＰＥＧ（３）の合成−2 ml の乾燥したＤＭＦ中に、Ｔｓ-ＰＥＧ 400 mg（0.243 ミリモル）ついでリチウムアジド 119 mg（2.43 ミリモル）を添加した。アルゴン雰囲気下に反応混合物を80℃で５時間加熱した。室温に冷却したのち、混合物をシリカゲルパッドを通してろ過し、パッドを反応生成物が溶出液中に検出されなくなるまで10％ＭｅＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。ろ液を合わせて減圧下に蒸発乾固した。残った残留物を 4 ml のＭｅＯＨに溶解し、これに 30 mg の５％Ｐｄ/Ｃを加えて１気圧の水素下に16時間攪拌した。混合物をついでセライトを通してろ過した。セライトパッドをＭｅＯＨで洗浄し、ろ液を合わせて減圧下に溶媒を蒸発させると灰白色の固体が得られた。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（12％ＭｅＯＨ・ＮＨ₃/ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製すると所望のアミノ-ＰＥＧ生成物（３）279 mg（77％）が白色固体として得られた（Ｒｆ＝0.38, 15％ＭｅＯＨ・ＮＨ₃/ＣＨ₂Ｃｌ₂）。ＦＭＯＣ-ＰＥＧ（４）の合成−アミノ-ＰＥＧ（３）の 840 mg（0.563 ミリモル）を 75 ml の乾燥ＴＨＦに溶解し、次に溶媒をロータリーエバポレーターで除去して乾燥させた。アルゴン雰囲気下、ついでアミノ-ＰＥＧを 50 ml の乾燥ＴＨＦに溶かし、190 mg（0.563 ミリモル）の 9-フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボネートで処理し、この液をアルゴン下室温で２時間攪拌した。ついで溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（８％ＭｅＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製すると白色固体 863 mg（92％）が得られた（Ｒｆ＝0.28，10％ＭｅＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂）。ＦＭＯＣ-ＰＥＧホスホラミダイト（５）の合成−ＦＭＯＣ-ＰＥＧ（４）173 mg（0.104 ミリモル）を 25 ml の乾燥ＴＨＦに溶解し、ついで溶媒をロータリーエバポレーターで除去して乾燥させた。アルゴン雰囲気下、ついでＦＭＯＣ- ＰＥＧを 25 ml の乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、38.4 ml（0.208 ミリモル）のシイソプロピルエチルアミン、ついで36.2 ml（0.156 ミリモル）の 2-シアノ-Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルクロロホスホラミダイトで処理した。この混合物を室温で１時間攪拌した。ついで溶媒および過剰の塩基を減圧下に除去した。所望のホスホラミダイト生成物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（８％ＭｅＯＨ/ ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製すると、白色固体 190 mg（97％）が得られた（Ｒｆ＝0.30, 10％ＭｅＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂）。ＤＮＡ-ＰＥＧ接合および第一反応物の付加上に合成した保護ＰＥＧ-リンカーをついで、以下のスキームに示すように、ＤＮＡ 10-マーの５'末端に接合し（無作為ＲＮＡとのライゲーションを容易にするため）、続いて、第一の反応物（この場合はマレイミド）とカップリングさせた。 Applied Biosystem DNA シンセサイザーを用いてＤＮＡ 10-マー（5'-ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＣ）（配列番号：１）を合成し、上に示した標準ホスホラミダイト化学を用いる一工程操作で上に合成したＦＭＯＣ-ＰＥＧホスホラミダイトを接合させた。ＤＮＡ-ＰＥＧ接合体をＣＰＧ（制御多孔ガラス）固相支持体から切断し、濃水酸化アンモニウム中の標準一夜インキュベーションを用いて完全に脱保護して、ＤＮＡ-ＰＥＧを含まないアミン種６を得た。ついで、ＰＥＧの末端には様々な反応を用いて任意の基質を付加することができる。たとえばジールスアルダー反応のためのマレイミドジエノフィルは、アミノＤＮＡ-ＰＥＧをマレイミド活性化エステル７と反応させることにより結合させ、アミド８を得る。５'モノホスフェートを有する無作為ＲＮＡプールの製造無作為配列 40Ｎ8 ＲＮＡプール（配列番号：２）は標準セレックスの戦略と技術を用いて、Operon（Alameda，CA）から入手した合成無作為配列一本鎖標準ＤＮＡ（ssＤＮＡ）鋳型から調製した。無作為領域はオリゴヌクレオチド合成時に４種のヌクレオチド（導入ヌクレオチドの 1:1:1:1 比が得られるように調整されたモル比）の混合物を用いて発生させた。ssＤＮＡには、プライマーハイブリダイゼーションを可能にする特定の５'および３'末端に隣接した40ヌクレオチドの連続無作為配列が含有された。Ｔａｑポリメラーゼによって合成された二本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）分子は５'末端に転写を促進するＴ7 ＤＮＡポリメラーゼプロモーターを有する。それぞれの転写反応は、100 ピコモルの 40Ｎ8 dsＤＮＡを 80μl の５×Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（200ｍＭトリス-ｐＨ 8.0，60ｍＭＭｇＣｌ₂，５ｍＭスペルマジン，25ｍＭＤＴＴ，20％グリセロール．0.01％ Triton-X-100）， 40μl の 10ｍＭＧＴＰ，40μl の 10ｍＭＣＴＰ，40μl の 10ｍＭＡＴＰ， 40μl の 10ｍＭＵＴＰ，40μl の 500ｍＭＧＭＰ，8μlのＲＮasin（Promega ,40,000 単位/ml）．24μl のＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs， 50,000 単位/ml），およびｄＨ₂Ｏと混合し、最終容量400μl として行った。一夜37℃でインキュベーションしたのち、５'モノホスフェートＲＮＡを８％変性ポリアクリルアミドゲルを用いて精製した。５'モノホスフェートは以下に記述するように、ＲＮＡをリンカー配列のＤＮＡ部分にライゲートするために必要である。無作為ＲＮＡのＤＮＡ-ＰＥＧ-マレイミドへのライゲーション上述のようにして無作為配列ＲＮＡプールを発生させた。ライゲーション反応に用いたＤＮＡ 10-マー（配列番号：１）とＤＮＡブリッジオリゴ（5'-ＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＧＴＧＣＣＴＧＧ）（配列番号：３）はOperon（Alameda，C A）から入手した。無作為 40Ｎ8 ＲＮＡ（配列番号：２）100 ピコモルを細菌アルカリホスファターゼ（Gibco，BRL）による脱リン酸化、ついでＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）およびγ-[³²Ｐ]ＡＴＰでのリン酸化によって末端標識した。ライゲーション反応は、50 ピコモルの無作為 40Ｎ8 ＲＮＡ，約60,000ＣＰＭの無作為５'-末端標識 40Ｎ8 ＲＮＡ，100 ピコモルのＤＮＡ-ＰＥＧ-マレイミド，150 ピコモルのＤＮＡブリッジオリゴ，2.5 ml の10×Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ緩衝液（50ｍＭトリス-ｐＨ 7.8，10ｍＭＭｇＣｌ₂，10ｍＭＤＴＴ，１ｍＭＡＴＰ，25 mg/ml ウシ血清アルブミン），ＲＮasin（Promega，40,000 単位/ml ）0.5μl ，最終濃度 1.2 Weiss単位/ml のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（New England B iolabs）およびｄＨ₂Ｏと混合し、最終容量 25μl として行った。1.2 Weiss 単位/ml はカタログに見られる変換ファクター（1 ＮＥＢ＝0.015 Weiss 単位）を用いて New England Biolabs の単位を Weiss 単位に変換して得られた。ＲＮasin およびＴ4 ＤＮＡリガーゼを除くすべての成分を混合し、70℃で３分間インキュベーションした後、徐々に37℃以下まで冷却した。ついでＲＮasin およびＴ4 ＤＮＡリガーゼを加え、混合物を37℃で90分間インキュベーションした。インキュベーション後、ＲＮＡ負荷緩衝液を加え、混合物を70℃で３分間加熱し、ついで予熱した８％変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。ライゲーションの収率は、オートラジオグラフィーから得られた。生成したＲＮＡ-ＤＮＡ- ＰＥＧ-マレイミドは核酸-反応物試験混合物である。ビオチン化ジエン接合体の調製ＮＨＳ-ビオチン（Pierce，99.3 mg，0.291ミリモル）および2,4-ヘキサジエン-1-オール（66.2 mg，2.3 当量）をアルゴン下、０℃で、10 ml の乾燥ピリジン中に混合し、暗所で一夜攪拌し、この間に温度を室温まで上昇させた。反応混合物のＴＬＣ（50％ＥｔＯＡｃ/ヘキサン）モニタリングでは反応が遅いことを示し、この液をアルゴン下に一夜還流させた。溶媒を真空中で除去し、ついでフラッシュシリカゲル上５％ＭｅＯＨ/ＥｔＯＡｃついで６％ＭｅＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂ で連続クロマトグラフィーを行うと、純粋な生成物９が得られた。これは、その¹ Ｈおよび¹Ｈ-¹ＨＣＯＳＹＮＭＲスペクトルに基づいて特性を解析した。化学反応上に調製した核酸-反応物試験混合物（ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＰＥＧ-マレイミド）を第二の反応物（ビオチン化ジエン）と以下の条件にて反応させる。１〜２ナノモル（約50,000 cpm）の核酸-反応物試験混合物を 50μl の反応緩衝液（10ｍＭＭＥＳ，200ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ 6.5）に溶解する。また反応緩衝液は、10ｍＭトリス，300ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ 7.0 としてもよい。混合物を70℃に５分間加熱する。ついで、ＭｇＣｌ₂をそれぞれ最終濃度 100ｍＭおよび 10ｍＭ加え、溶液を徐々に（約10分間）室温まで冷却する。ビオチン化ジエンをついで最終濃度１ｍＭになるように加え、混合物を室温に放置して12時間インキュベーションする。ついで溶液を固定化ストレプトアビジンカラムに負荷し、カラムを10μＭＭｇＣｌ₂を含む反応緩衝液で徹底的に洗浄する。結合したＲＮＡをカラムマトリックスから、プロテイナーゼＫで処理し、ついでカラムを反応緩衝液で洗浄して遊離させる。別法として、ＲＮＡを逆転写し、なお樹脂またはジスルフィドで連結したビオチン-ジエン基質に結合しているものを使用することもできる。この場合、ＲＮＡはカラムから 50ｍＭＤＴＴを用いて溶出させる。プールの濃縮化は標準プロテイナーゼＫ処理後に溶出する cpm 数によって追跡する。溶出したＲＮＡはついで逆転写し、得られたｃＤＮＡは通常のセレックス実験の場合のようにＰＣＲ増幅に付し、dsＤＮＡを転写させる。ＤＮＡ-ＰＥＧ-マレイミド接合体を上述のようにＲＮＡにライゲートし、この方法をその構造の決定に十分な生成物が生成するまで反復する。例２ジールスアルダー反応を促進するための非修飾ＲＮＡおよび溶液中金属の使用反応溶液に金属イオン、アルミニウム（III）およびコバルト（II）を含有させて、例１の操作を正確に繰り返す。例３ジールスアルダー反応を促進するための修飾ＲＮＡ（ピリジン修飾ＵＴＰ導入）の使用本発明の核酸は前述の様々な操作で修飾することができる。修飾核酸の一例として、ＵＴＰ分子がその５-位におけるピリジン型残基の導入により修飾されている核酸を挙げる。ピリジン修飾ＵＴＰは前述のように無作為ＲＮＡ中に導入する。修飾ＲＮＡをＰＥＧリンカーを介して反応物に結合させてジールスアルダー反応を促進するため用いた。塩基の５-位に、ピリジン型の残基が結合しているウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）誘導体の合成は以下の操作に従った。ピリジンカルボキシアミド修飾ＵＴＰの調製カルボキシアミド化 5-ヨードウリジン-2',3'-イソプロピリデン（0.225 g，0.545ミリモル）およびPd(ＰＰｈ₃)₄（0.1 当量，56 mg）、トリエチルアミン（10 当量，0.76 ml）、4-(アミノメチル)-ピリジン（4 当量，0.23 ml）の乾燥ＴＨＦ 10 ml 中溶液をアルゴン下、テフロン栓を装着した焔乾燥ガラスボンベ内に調製した。ボンベに50 psi のＣＯを充填し排気させる操作を３回反復し、ついで 50 psi のＣＯを充填して密閉した。このフラスコを70℃に加熱しながら激しく攪拌した。２時間後までにパラジウムの壁への付着が始まった。フラスコをさらに18時間攪拌し、冷却し、排気し、溶液を蒸発させると帯黄色の油状物が得られた。シリカゲル上８〜10％ＭｅＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂勾配溶出を用いクロマトグラフィーに付すと、1 0 が白色の固体 0.177ｇ（78％）として得られた。特性の解析は¹Ｈ，¹³ＣＮＭＲスペクトルによった。分析サンプルはメタノールからの再結晶により得られた。トリホスフェートの調製トリホスフェートは上に調製した５'-ヒドロキシル修飾ウリジンから、Ludwig & Eckstein（J．Org．Chem．1989，54，631-635）の操作によって調製した。蒸留水中の反応混合物を陰イオン交換カラム（Sephadex DEAE）に0.05〜1.00ＭＴＢＫ（トリエチルアンモニウム重炭酸塩）緩衝溶液を用いて通し、トリホスフェートを精製した。トリホスフェートを含む分画を凍結乾燥するとイソプロピリデン保護トリホスフェートが得られ、この特性は³¹ＰＮＭＲにより解析した。トリホスフェートを 5 ml の蒸留水中 100 mg の Dowex 50WX8 樹脂（Ｈ⁺型）と70 ℃に15分間加熱し、ついで２ＭＴＢＫ緩衝液で中和（ｐＨ８に）してイソプロピリデン保護基を除去した。この溶液の最終精製は、逆相製造ＨＰＬＣ（Ｃ18カラム）により、0.05ＭＴＢＫ緩衝液中３〜５％ＣＨＣＮ勾配を用いて実施した。このようにして調製されたトリホスフェートはトリス（トリエチルアンモニウム）塩の型として¹Ｈ，¹³ＣＮＭＲスペクトルによって特性を解析し、ＵＶ吸収（277 nm，ε＝14,600Ｍ^-1cm^-1）によって定量した。反応は上記例１に記載したように継続した。例４ＧＲＰの切断を促進するための修飾ＲＮＡ（ヒスチジン修飾ＵＴＰ導入）の使用本発明の核酸は前述の様々な操作で修飾することができる。修飾核酸の一例として、ＵＴＰ分子がその５-位におけるヒスチジン型残基の導入により修飾されている核酸を挙げる。ヒスチジン修飾ＵＴＰは前述のように無作為ＲＮＡ（配列番号：２）中に導入する。修飾ＲＮＡをＰＥＧリンカーを介して反応物に結合させてガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）の切断を促進するため用いた。ヒスチジン修飾ＵＴＰの合成５-位にヒスチジン型の残基が結合したウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の合成は以下の操作に従った。不活性気体グローブボックス内において、均圧化滴下ろ斗を装着した自動供給カップリング装置に、702.3 mg の12、44.9 mg（0.20ミリモル）の酢酸パラジウム、114.3 mg（0.60ミリモル）のヨウ化銅（Ｉ）および157.4 mg（0.60ミリモル）のトリフェニルホスフィンを秤量して加えた。装置を密閉し、ボックスから離れて、装置の丸底部分にカニューレで 30 ml の無水ＴＨＦを加えた。滴下ろ斗部分にカニューレを介して、40 ml の無水ＴＨＦ中 0.643 ml（2.2ミリモル）のビニルトリブチル錫のアルゴン充填溶液を加えた。フラスコに連続してＣＯの排気充填を３回繰り返し、ついで70℃に1.5時間加熱すると、黄色の溶液はわずかに橙色に変化した。ついで、ビニルトリブチル錫溶液を10秒に１滴の速度で加えた。５〜10％の試薬を加えると、溶液は暗赤色に変わった。この溶液を70℃に５時間加熱し、放冷し、真空中で濃縮した。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカのパッド上に負荷し、200 mlのヘキサン、200 ml ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、生成物を５％ＣＨ₃ＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出した。溶出液をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに付し、５％ＣＨ₃ＯＨ/ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出すると、２が白色の固体、0.294 g として得られた。ヒスチジノールマイケル付加生成物ＴＢＤＭＳ保護ヒスチジノール14−アルゴン下、ＤＭＦ 3.0 ml にヘキサンで３回洗浄したＮａＨ 205 mg（5.1ミリモル）を加えた溶液を攪拌しながら、これに、ヒスチジノール二塩酸塩500 mg（2.3ミリモル）を少量ずつ加えると緩和な気体の発生を生じた。溶液を1.5時間攪拌し、ついで 1.8 ml（23ミリモル）の無水ピリジンと 693.0 mg（4.6ミリモル）のＴＢＤＭＳＣｌを加えた。溶液 1.5時間攪拌し、真空中で濃縮し、シリカゲル上15％ＣＨ₃ＯＨ・ＮＨ₃/ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付すと３が生成した。マイケル付加物15−10 ml の無水ＤＭＦ中 167.9 mg（0.6ミリモル）の13の溶液を攪拌しながら、これに 0.105 ml（0.6ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンを加えたのち 1.85 ml の無水ＤＭＦ中 185 mg（0.72ミリモル）の３の溶液を滴下した。溶液を１時間攪拌し、真空中で濃縮しシリカゲル上15％ＣＨ₃ＯＨ・ＮＨ₃/酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーに付すと 90.0 mg の 15 が白色固体として得られ、¹Ｈ，¹³ＣＮＭＲスペクトルによって特性を解析した。トリホスフェートの調製ジオキサン/ピリジン中15の溶液に、2-クロロ-4H-1,2,3-ベンゾジオキサホスホリン-4-オンのＴＨＦ中溶液を滴下し、この溶液を20分間攪拌し、ついでビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェートのＤＭＦ中 0.5Ｍ溶液およびトリブチルアミンを同時に加えた。この溶液をさらに20分間攪拌し、Ｉ₂のピリジン/水溶液を加え、溶液20分間攪拌した。過剰のヨウ素を５％重亜硫酸ナトリウムで分解し、15分間攪拌し、溶液を濃縮し、濃水酸化アンモニウムで加水分解した。アンモニアを真空中で除去し、残った溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂で２回、酢酸エチルで１回洗浄し、真空中で濃縮した。残留物を水に溶かし、Dowex 樹脂と70℃に15分間攪拌した。溶液をろ過し、２ＭＴＢＫ緩衝液で中和し、直接ＤＥＡＥセファデックス上に負荷し、0.05Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液（ＴＢＫ緩衝液）〜1.0ＭＴＢＫ緩衝液の勾配で溶出すると、サリチレート種ならびにＴＢＤＭＳおよびイソプロピリデン保護基がなお無傷の少量がわずかに夾雑している生成物が得られた。この物質を再びＤowex で処理し、逆相ＨＰＬＣＣ18カラム上０〜５％アセトニトリル/0.05ＭＴＢＫ緩衝液の勾配により15分を要して精製すると、純粋な16が得られ、¹Ｈ，¹³Ｃおよび³¹ＰＮＭＲによって特性を解析した。上記例１に概説したように実験を継続したが、シクロヘキセン生成物を形成するよりも核酸はＧＲＰ蛋白質を加水分解した。例５５'-ホスホロチオート修飾ＲＮＡのＮ-ブロモアセチル-ブラジキニンへの結合この例では、カップリングする反応物は無作為核酸試験混合物に直接結合した５'グアノシンモノホスホロチオエート（ＧＭＰＳ）である平行セレックス操作を説明する。遊離反応物はブラジキニン標的（ＢｒＢＫ）に結合したブロモアセチル基である。この例では、Ｎ-ブロモアセチル化ブラジキニン（ＢｒＢＫ）と特異的に反応し、ＲＮＡとＢｒＢＫペプチドの間のチオエーテル結合の形成を促進する５'グアノシンモノホスホロチオエート置換ＲＮＡ（ＧＭＰＳ-ＲＮＡ）の選択および解析を記載する。この領域での以前の研究では、ブラジキニンに対するリガンドの取得は、遊離溶液中でも支持マトリックスに接合していても困難であった。開始時のプールに比較し、Ｎ-ブロモアセチル化ブラジキニンに対し以下に記載するように、ＲＮＡはｋ_cat/Ｋ_mで 6700 倍、結合親和性で 100倍の上昇を示すことが確認された。このＲＮＡはその基質と高度な特異性をもって結合し、至適活性のためにはペプチドのアミノおよびカルボキシ末端の両者にアルギニン残基を要求する。Ａ．平行セレックス平行セレックス反応はＲＮＡ試験混合物に結合するカップリング反応物として５'グアノシンモノホスホロチオエート（ＧＭＰＳ）を遊離反応物および標的の両者としてブロモアセチル化ブラジキニン（ＢｒＢＫ）用いて行った。ＧＭＰＳ -ＲＮＡは、ＲＮＡのチオエート基をＢｒＢＫの臭素基で迅速に置換する能力によって選択される。生成物、ＢＫ-Ｓ-ＲＮＡはついで、残った非反応ＧＭＰＳ- ＲＮＡから除去的に分配し、次の選択サイクルを実施する前に再増幅する。１．ＧＭＰＳ-ＲＮＡ平行セレックスは、最初の無作為レパートリーとして Schneiderら（FASEB,7, 201，1993）に詳述された30無作為化ヌクレオチド（30Nl）（配列番号：４）の中心領域を、増幅のための鋳型として働く非無作為領域とともに用いて行った。核酸反応物試験混合物は、最初ＧＭＰＳの封入によって形成され、以後のすべての転写反応ではＴ7 ＲＮＡポリメラーゼによる転写のプライミングにおいて等モルのＧＴＰよりも優先的に利用されて、完全長生成物の約80％はＧＭＰＳで開始された。ＧＭＰＳ-ＲＮＡは転写され、Amicon Microcon-50 スピン分離によって過剰のＧＭＰＳが除去され精製された。ＧＭＰＳ-ＲＮＡはチオプロピルセファロース６Ｂを用いて非ＧＭＰＳ-ＲＮＡから精製され、マトリックスからジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって溶出して、ＤＴＴからは他の Microcon-50 スピン分離によって精製された。チオプロピルセファロース６Ｂ（Pharmacia）はカラム緩衝液（500ｍＭＮａＣｌ，20ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ7.0）で前洗浄し、使用前に 12,000 g において遠心分離して乾燥した。ＧＭＰＳ-ＲＮＡの精製には、Microcon-50 カラム精製ＲＮＡを 500ｍＭＮａＣｌ．10ｍＭＥＤＴＡおよび 20mＭＨＥＰＥＳｐＨ 7.0 の最終濃度とし、空隙容量 60μl 当り 25μl の割合でマトリックスに加えた。ついで混合物を70℃で５分間反応させ、12,000 g で遠心分離し、４カラム容量の 90％ホルムアミド，50ｍＭＭＥＳ，ｐＨ 5. 0 により70℃で遠心洗浄し、４カラム容量の 500ｍＭＮａＣｌ，50ｍＭＭＥＳ，ｐＨ 5.0 で遠心洗浄し、４カラム容量の 50ｍＭＭＥＳ，ｐＨ 5.0 中 100ｍＭＤＴＴで遠心溶出した。これらの条件はＧＭＰＳ-ＲＮＡのみの保持および以後の溶出に至適化された。２．ブロモアセチル化ブラジキニンブロモアセチル化ブラジキニン（ＢｒＢＫ）はこの例では、遊離反応物および標的の両者として用いられた。ブロモアセチル基は遊離反応物である。ＢｒＢＫは 50μl の５ｍＭブラジキニンを 250μl 部の42ｍＭのブロモ酢酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルと、室温において、12分間隔で３回連続して反応させて合成した。過剰のブロモ酢酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルは 5 mlのアミノエチルアクリルアミド上でろ過して除去し（室温で５分間反応）、ついでＧＳ-10 セファロース上でＢｒＢＫを分離した。ＢｒＢＫ濃度は 220 nm で吸光係数収 12,000 cm^-1Ｍ^-1によって測定した。３．選択反応ＢｒＢＫとの反応を最も実施できるこれらのＧＭＰＳ-ＲＮＡ種は、セレックスの多重ラウンドの反復により選択される。選択のラウンドは、反応緩衝液中、ＢｒＢＫ濃度 1.1ｍＭ，および表１に示した与えられた時間および温度におけるＧＭＰＳ-ＲＮＡ濃度において実施した。選択時には、ＢｒＢＫペプチドの濃度は、ＢｒＢＫのラウンド０プールのＫm より12倍低い濃度 1.1ｍＭに保持した。選択の進行を通じて反応を総ＧＭＰＳ- ＲＮＡの５％以下に制限するため、反応時間は制限し、反応温度は低下させた。この目的は、結合および化学の両者における改良を選択するために、二次反応を維持することにあった。ＢｒＢＫの活性は，12.5μＭＢｒＢＫにおいて 25μＭＧＭＰＳ-ＲＮＡでアッセイした。この場合は、反応は完結するまで行い、50％のＲＮＡがＢｒＢＫによって共有結合で結合され、ペプチドのブロモアセチル化は実質的に完結したことを示した。反応は、最終濃度 235ｍＭのチオリン酸ナトリウム（ラウンド１〜８）またはチオ硫酸ナトリウム（ラウンド９〜12）で停止させ、変性尿素８％ポリアクリルアミドＡＰＭゲル（ラウンド１〜８）または親和性クロマトグラフィー（ラウンド９〜12）上で除去的に分配した。反応ＲＮＡ％は、総ＧＭＰＳ-ＲＮＡに対して、アクリルアミドゲル分配からＢＫ-Ｓ-ＲＮＡとして存在する％、または親和性カラム分配においてＢＫ-Ｓ-ＲＮＡとして遊離して溶出する％を意味する。バックグランドは回収されたＲＮＡからいずれの場合も差し引いた。バックグランドは反応がＢｒＢＫの添加前に停止された対照処置から回収されたＲＮＡの量を意味する。バックグランド比は、反応下ＲＮＡとバックグランドとして存在するＲＮＡの比である。セレックスのラウンドを通して反応時間を調整することによって、この比を２〜10に保持することを試みた。除去的分配は、チオプロピルセファロース６Ｂ上ＧＭＰＳ-ＲＮＡの除去またはＡＰＭポリアクリルアミドゲル上２種の分離によって行われた。[(β-アクリロイルアミノ)フェニル]塩化水銀（ＡＰＭ）は、G.L.Igloi，Biochemistry 27， 3842（1988）に報告されているように合成し、チオール含有ＲＮＡの遅滞のために変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に 25μＭの濃度で使用した。ＧＭＰＳ- ＲＮＡは、ＡＰＭ-ポリアクリルアミドゲルから 100ｍＭＤＴＴの存在下に溶出して精製した。引用した文献と一致して、新たに精製したＡＰＭ遅滞ＧＭＰＳ- ＲＮＡをＡＰＭゲル上に流すと、適用した総ＧＭＰＳ-ＲＮＡの約３％を構成する非遅滞ＲＮＡの遊離バンドを与えることが見出された。遊離の移動ＲＮＡは、ＢＫ-ＲＮＡと極めて接近して移動し（ゲル中に用いたアクリルアミドの％とは無関係に）、したがって分配時のバックグランドを増大させるので問題である。この遊離の移動性ＲＮＡをゲルから精製してＡＰＭゲル上に流したところ、このＲＮＡの約50％は同様遊離して移動し、ＧＭＰＳ-ＲＮＡとして移動するＲＮＡと均衡していた。遊離して移動するＲＮＡの量は沈殿時に費やした時間に比例したが、ｐＨの影響、ＤＴＴ、酢酸マグネシウム、ホルムアミド、尿素もしくは熱の存在または不存在とは関係がなかった。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応は Schneiderら（FASEB 7，201，1993）の報告に従って実施した。ＧＭＰＳ-ＲＮＡプールのｋ_obs値は４〜６ラウンドにおいて 100倍に上昇したが以後のラウンドでは増加は２倍にすぎなかった。ｋ_obs 値を測定するための反応は反応緩衝液（50ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ 7.0，５ｍＭＭｇＣｌ₂，150ｍＭＮａＣｌ）中０℃において、２μＭＧＭＰＳ-ＲＮＡおよび 130μＭＢｒＢＫで行い、0，1，3，10，30 および 90 分にモニタリングした。ＧＭＰＳ-ＲＮＡは70℃で３分間変性し、室温まで徐々に冷却させたのち、最終反応緩衝液条件に希釈し、氷上に移し、ＢｒＢＫを添加した。反応は氷上で 235ｍＭチオ硫酸ナトリウムによって停止させ、変性７Ｍ尿素８％ポリアクリルアミドＡＰＭゲルに流した。ｋ_obs値は未反応ＧＭＰＳ-ＲＮＡ濃度対時間の関係のプロットからデータの点が直線の範囲の負の傾斜として測定された。ラウンド 10およびラウンド12のプールをクローニングおよび配列決定に使用した。Ｂ．クローン 56の独立のクローンを配列決定に使用した。16種の反応物をＢｒＢＫとの反応性について 30Ｎ1 バルクプールと比較した。試験した反応物はすべて元のプールに比較してｋ_obsの10〜100 倍の上昇を示す。反応物12.１（配列番号：５）を（ｉ）ブラジキニンと競合する反応阻害の予備実験で、ブラジキニンに対して最低のＫiを示した（データは示していない）こと、（ii）ラウンド12の集団中に最も高頻度に現れたこと、および（iii）試験した反応物で第二に早いｋ_obsを持っていたこと、の３つの規準に基づいて以後の動態分析に選択された。反応物 12.1 のｋ_obsの選択された上昇は反応性および結合の両者に起因するものである。ＢｒＢＫとの反応では、反応物 12.1 ではバルク 30Ｎ1 ＧＭＰＳ- ＲＮＡに比較してｋ_catは67倍に上昇し、Ｋ_mは100倍に低下し、ｋ_cat/Ｋ_mは全体的に6700倍の上昇を示した（表１参照）。Ｃ．特異性反応物 12.1 による至適結合のために要求されるＢｒＢＫの構造エレメントをブラジキニン類縁体による反応の阻害により検討した。バルク 30Ｎ1 ＧＭＰＳ- ＲＮＡのＢｒＢＫとの反応にはＢＫによる阻害は検出されなかった（データは示していない）のに対し、ネイティブなブラジキニン（ＢＫ）は反応物 12.1 とＢｒＢＫの間の反応について 140±60μＭのＫiを示した。この値は非阻害反応のＫ_mとほぼ同一である。Des-Arg⁹-BK（カルボキシル末端のアルギニンを欠くＢＫ類縁体）のＫiは 2.6±0.5ｍＭである。すなわち、カルボキシル末端アルギニンの欠失はＢＫと反応物 12.1の間の結合を18倍低下させる。さらに、Des-Arg¹-BK （アミノ末端のアルキニンを欠くＢＫ類縁体）は反応物 12.1 とＢＫの間の反応の検出可能な阻害を示さず、アミノ末端のアルギニンは反応物 12.1 とＢＫの間に認められる結合に絶対的に必要であることを指示する。しかしながら、遊離のＬ-アルギニンは検出可能な反応の阻害を示さないことから、アルギニンの認識はペプチド内部におけるものである。すなわち、反応物 12.1 のＢＫに対する親和性がバルク 30Ｎ1 ＧＭＰＳ-ＲＮＡに比し上昇しているのは、一部ＢｒＢＫのアミノ末端アルギニンの反応物による認識に起因するものであり、またその程度は低いがカルボキシル末端アルギニンの認識によるものである。反応物 12.1 の固有の反応活性を、最小のブロモアシル構造としてＮ-ブロモアセトアミド（ＢｒＡｃＮＨ₂）を用いて検討した。反応物 12.1 および 30Ｎ1 ＲＮＡプールのＢｒＡｃＮＨ₂との反応のＫ_mおよびｋ_cat値はほぼ同じであった。したがって、ＢｒＢＫとの反応物 12.1 の反応速度の上昇はチオール基の求核性の増大によるものではなく、２つの基質の配置における立体的および／またはエントロピー因子の結果と考えられる。すなわち、平行セレックスに求められた通りの化学反応の促進が達成された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．生成物ライブラリーから、標的に対して予め選択された機能を実施する能力について選択される生成物を同定する方法において、（ａ）それぞれ無作為化配列の領域を有し、それぞれ第一の反応物に会合している核酸からなる核酸-反応物試験混合物を調製し、（ｂ）上記核酸-反応物試験混合物を遊離反応物と反応させて、上記第一の反応物と遊離の反応物によって形成される生成物からなる生成物ライブラリーを形成させ、この場合、上記反応は上記第一の反応物と会合している核酸によって促進され、（ｃ）標的に対して予め選択された機能を実施する相対的能力に基づいて上記生成物ライブラリーのメンバーを分配し、それによって予め選択された機能を実施する能力を有する上記生成物を同定する方法。２．標的に対して予め選択された機能を実施する能力は上記標的への結合である「請求項１」の方法。３．標的に対して予め選択された機能を実施する能力は上記標的との反応および上記標識の性質の変化である「請求項１」の方法。４．核酸-反応物試験混合物は保存された配列の領域と無作為化配列の領域を有する核酸から構成される「請求項１」の方法。５．核酸は一本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡからなる群より選択される「請求項１」の方法。６．核酸試験混合物は修飾ヌクレオチドからなる「請求項１」の方法。７．修飾ヌクレオチドはリボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置において化学的に修飾されている「請求項６」の方法。８．修飾ヌクレオチドは２'-または５'-位においてピリミジンが修飾されたヌクレオチドである「請求項６」の方法。９．修飾ヌクレオチドは８-位においてプリンが修飾されたヌクレオチドである「請求項６」の方法。 10．修飾ヌクレオチドはヌクレオチドの電荷、分極能、水素結合、静電相互作用または流動性を増大させる化学基によって修飾される「請求項６」の方法。 11．化学基は疎水性残基、親水性残基、各種酸化状態の金属原子、剛性構造、イミダゾール、一級アルコール、カルボキシレート、グアニジウム基、アミノ基、チオールおよび有機金属触媒からなる群より選ばれる「請求項10」の方法。 12．化学基はアミノ酸側鎖またはその類縁体からなる「請求項10」の方法。 13．核酸試験混合物中に導入された有機金属触媒からさらになる「請求項１」の方法。 14．第一の反応物と核酸の間をカップリングするリンカー基からさらに構成される「請求項１」の方法。 15．リンカー基は10〜1000Åの範囲のサイズを有する「請求項14」の方法。 16．リンカー基はＰＥＧ．ポリビニルアルコール、ポリアクリレートおよびポリペプチドからなる群より選ばれる「請求項15」の方法。 17．第一の反応物はジエノフィルであり、第二の反応物はジエンであり、生成物はシクロヘキセン誘導体である「請求項１」の方法。 18．「請求項１」の方法で製造された生成物。 19．キラル中心を有する「請求項18」の生成物。 20．約80〜約2000の範囲の分子量を有する「請求項18」の生成物。 21．２種の反応物の間の生成物から構成される生成物ライブラリーであって、各生成物はその生成物の形成を促進する核酸と会合している生成物ライブラリーから、標的に対して予め選択された機能を実施する能力を有する生成物を同定する方法において、標的に対して予め選択された機能を実施する相対的能力に基づいて上記生成物ライブラリーのメンバーを分配し、それにより上記の予め選択された機能を実施する能力を有する上記生成物を同定す方法。 22．生成物ライブラリーから、標的分子に結合する能力について選択される生成物を同定する方法において、（ａ）それぞれ無作為化配列の領域を有し、それぞれ第一の反応物に会合している核酸からなる核酸-反応物試験混合物を調製し、（ｂ）上記核酸-反応物試験混合物を遊離反応物と反応させて、上記第一の反応物と第二の反応物によって形成される生成物に会合している核酸からなる生成物ライブラリーを形成し、（ｃ）生成物ライブラリーを標的と接触させて、生成物ライブラリーに関して標的に対する親和性が増大している生成物を、生成物ライブラリーの残部から分配し、（ｄ）標的に対する親和性が増大している生成物を、生成物ライブラリーの残部から分配し、ついで（ｅ）標的に対する親和性が増大している生成物と会合している核酸を増幅して、それにより上記生成物の同定を可能にする方法。 23．工程ｂとｃの間で、さらに生成物ライブラリーを非標的と接触させて、この非標的に結合する生成物を分配分離する「請求項22」の方法。 24．標的に対して予め選択された機能を実施する能力を有する生成物を製造する方法において、（ａ）核酸試験混合物の各メンバーを第一の反応物とカップリングさせて核酸反応物試験混合物を形成し、（ｂ）上記核酸反応物試験混合物を遊離反応物と、第一の反応物と遊離の反応物の間の結合形成に好ましい条件下に接触させ、この場合、上記結合形成反応は上記第一の反応物にカップリングした核酸の促進によって誘導され、（ｃ）工程（ｂ）の生成物ライブラリーを標的と接触させ、生成物ライブラリーに関して標的に対する予め選択された機能を実施する能力を有する生成物を生成物ライブラリーの残部から分配し、（ｄ）標的に予め選択された機能を実施する能力を有する上記生成物を生成物ライブラリーの残部から分配し、上記生成物を同定する方法。 25．複数種の反応物から予め選択された機能を実施する能力を有する生成物を形成する反応を促進する能力で選択される促進性核酸を同定する方法において、（ａ）それぞれ無作為化配列の領域を有し、それぞれ第一の反応物に会合している核酸からなる核酸-反応物試験混合物を調製し、（ｂ）上記核酸-反応物試験混合物を複数種の遊離反応物と、上記反応物の間の上記生成物を形成する反応を促進する核酸に好ましい条件下に混合し、ついで（ｃ）生成物と会合した上記核酸-反応物試験混合物のメンバーを単離し、その促進性核酸の同定を可能にする上記同定方法。 26．予め選択された機能を実施する能力について選択される生成物を同定する方法において、生成物ライブラリーと同時にその、生成物の形成を促進する促進性核酸のクラスを共発生させることからなる上記同定方法。 27．少なくとも第一の反応物と遊離の反応物の間の生成物ライブラリーを形成する反応を促進する促進性核酸の同定と生成物ライブラリーの製造を同時に行う方法において、（ａ）それぞれ無作為化配列の領域を有し、それぞれ第一の反応物に会合している核酸からなる核酸-反応物試験混合物を調製し、（ｂ）上記核酸-反応物試験混合物を遊離反応物と反応させて生成物ライブラリーを形成させ、その際に、促進性核酸を同定する方法。 28．促進性核酸と標的に対する予め選択された機能を実施する能力を有する生成物を一緒に製造する方法において、（ａ）核酸試験混合物の各メンバーを第一の反応物とカップリングさせて核酸反応物試験混合物を形成し、（ｂ）上記核酸反応物試験混合物を遊離反応物の混合物と、結合形成に好ましい条件下に接触させて生成物ライブラリーを形成させ、この場合、上記結合形成は上記第一の反応物にカップリングした促進性を有する核酸によって誘導され、（ｃ）生成物ライブラリーを標的と接触させ、生成物ライブラリーに関して標的に対する予め選択された機能を実施する能力を有する生成物を生成物ライブラリーの残部から分配し、（ｄ）生成物に会合した核酸を増幅して、促進活性が濃縮された核酸混合物を得る方法。 29．さらに、（ｅ）標促進活性が強化された核酸を第一の化学反応物とカップリングさせ、（ｆ）標的に対する予め選択された機能を実施する能力を有する生成物が同定に十分な量生成するまで工程（ｂ）〜（ｅ）を反復する「請求項28」の方法。 30．少なくとも１種のカップリングした反応物と遊離の反応物の間の反応の結果である生成物の混合物からなり、カップリングした反応物は上記反応物の間の反応を促進する核酸に結合している生成物ライブラリー。 31．それぞれ核酸試験混合物のメンバーにカップリングしている第一の反応物の混合物を遊離反応物の混合物と、第一の反応物と遊離反応物の間の結合形成に好ましい条件下に接触させ、この結合形成反応は第一の反応物がカップリングしている核酸によって誘導される生成物ライブラリーの製造方法。 32．第一の反応物と遊離反応物の間の生成物を形成する反応を促進する核酸であって、反応物の間の反応時には第一の反応物が会合している促進性核酸。 33．化学反応を促進できる非天然核酸。 34．第一の反応物と遊離反応物の間の結合形成に好ましい条件下に第一の反応物と遊離反応物を接触させ、この場合、上記結合形成反応は核酸によって促進される生成物の製造方法。