JP2010537638A - 合成アポリポ蛋白質ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法 - Google Patents

合成アポリポ蛋白質ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規な合成アポリポ蛋白質Ｅ（ＡｐｏＥ）模倣ペプチドを提供し、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインは、よく特徴付けられた脂質会合モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチドである１８Ａ、またはその修飾されたバージョンに共有結合により連結される。そのようなペプチドは低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）の線維芽細胞またはＨｅｐＧ２細胞への結合、またはそれらの細胞による分解を増強させる。また、ヒト血漿ＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールレベルを降下させ、それにより、アテローム性動脈硬化症を阻害することにおける当該合成ペプチドの可能な適用も提供する。また、本発明は、ＨＤＬ機能を改善し、および／または抗炎症特性を発揮することができる合成ペプチドにも関する。

Description

関連特許出願への相互参照
本出願は、本明細書中に参照によってその全体を援用する、２００７年８月２８日に出願された、発明の名称が「合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法」である、米国仮出願第６０／９６８，３５５号に対する優先権を主張する。
本発明は、ポリペプチドおよびポリペプチドミミックスを含めた分子生物学および蛋白質生物学の分野に関する。また、本出願は、コレステロール代謝、異化、およびコレステロール関連障害の治療および管理の分野にも関する。また、本発明は、一般に、心血管医学の分野にも関する。さらに具体的には、本発明は、細胞による増強されたＬＤＬおよびＶＬＤＬ取り込みおよび分解を通じて血漿コレステロールを迅速に降下させることができる合成ペプチドに関する。本発明は、ＨＤＬ機能を改善し、および／または抗炎症特性を発揮することができる合成ペプチドにも関する。
疫学的研究は、増大した血漿コレステロールレベルがアテローム性動脈硬化症に対する危険性を増大させることを示す。５つの完了した主な試行は、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロールを主として低下させることを目的とする治療からの利益の決定的証拠を提供している（非特許文献１）。他のリポ蛋白質危険因子の中には家族性異常β蛋白血症であり、これは、カイロミクロンおよびＶＬＤＬの異化に由来する残留アテローム形成性リポ蛋白質の蓄積をもたらす（非特許文献２）。血漿コレステロールレベルの１％減少は冠動脈疾患の危険性を２％減少させることが示されている（非特許文献３）。血管造影法の焦点はＬＤＬ低下に当てられており、これらの研究は３０％〜３５％を超えるＬＤＬコレステロールの減少が冠動脈事象のより低い発症率に関連することを示している。（非特許文献４）。また、トリグリセリドが豊富なリポ蛋白質は内皮機能に悪影響を及ぼす可能性があり、小型高密度ＬＤＬの産生を促進することによって、および高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）レベルを低下させることによって酸化的ストレスを増大させ得る証拠が増えている（非特許文献５）。
アポリポ蛋白質Ｅ（アポＥ）は、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロンのようなトリグリセリドが豊富なリポ蛋白質の代謝において重要な役割を果たす。アポリポ蛋白質ＥはＬＤＬ受容体関連蛋白質（ＬＲＰ）、超低密度リポ蛋白質受容体（ＶＬＤＬＲ）およびアポＥ２受容体（アポＥ２Ｒ）を含めた、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）受容体（アポＢ、Ｅ受容体）およびその遺伝子ファミリーのメンバーへのアポＥ含有リポ蛋白質の高親和性結合を媒介する（非特許文献６）。アテローム性動脈硬化症におけるアポＥの推定されるおよび複雑な役割はいくつかの観察によって強調されている：（ｉ）ヒトアポＥを過剰発現するマウスはより低いレベルの全血漿コレステロールレベルを有する。（非特許文献７）、（ｉｉ）コレステロールを与えたウサギへのヒトアポＥの静脈内注射は、これらの動物をアテローム性動脈硬化症から保護する（非特許文献８）、および（ｉｉｉ）マウスにおけるアポＥ遺伝子の喪失は自然発生アテローム性動脈硬化症を生じ（非特許文献９）、そのアテローム性動脈硬化症はマクロファージ特異的アポＥ発現がアポＥ欠乏マウスにおいて開始される場合に軽減される（非特許文献１０）。
アポリポ蛋白質Ｅは、脂肪に結合し、２つの主なドメインを有する蛋白質である（非特許文献１１）。２２ｋＤａアミノ末端ドメインは、Ｘ線結晶学的研究によって、４らせん束であり（非特許文献１２）、正に荷電した受容体結合ドメインを含有することが示されている。この領域が、その受容体への超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）結合を媒介するためには、アポリポ蛋白質はリポ蛋白質表面に会合しなければならず、これは、Ｃ末端両親媒性らせん領域によって可能となる。正に荷電した受容体結合ドメインを含有する４らせん束がリポ蛋白質表面上で開かない場合、ＶＬＤＬは、受容体への結合において欠陥がある。かくして、ＡｐｏＥの正に荷電したアルギニン（Ａｒｇ）に富むクラスタードメインおよびＣ末端両親媒性らせんドメインの双方が、アテローム形成性ＡｐｏＥ含有リポ蛋白質の増強された取り込みのために必要とされる。
ＡｐｏＥは、３４，２００の分子量を有する２９９アミノ酸残基蛋白質として分泌される。アポＥの２つの断片へのトロンビン切断に基づき、２ドメイン仮説は、アポＥのＣ末端領域（１９２−２９９）が、高トリグリセリド血症ＶＬＤＬへのその結合にとって必須であり、Ｎ末端の２２ｋＤａドメイン（１−１９１）がＬＤＬ−Ｒに結合するという事実を説明するために最初に提案された（非特許文献１３）。蛋白質およびその突然変異体のさらなる物理化学的特徴付けはこの概念を拡大し、領域１９２−２１１がリン脂質に結合し、他方、アミノ末端ドメイン（１−１９１）は、４らせん束においてＬＤＬ受容体結合ドメインを含有する球状構造であることを示している（非特許文献１２）。合成ペプチド（Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．）およびモノクローナル抗体に関する研究は、アポＥのＬＤＬ受容体結合ドメインの位置を、正に荷電したアミノ酸ＡｒｇおよびＬｙｓが豊富化されたドメインである、残基１２９−１６９の間の残基であると特定した（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；および非特許文献１７）。
合成ペプチドに関するさらなる研究を用いて、ＬＤＬ受容体とのその相互作用を媒介するアポＥの結合ドメインの構造的特徴が特徴付けられた（非特許文献１６；非特許文献１７；および非特許文献１８）。アポＥの残基１４１−１５５は、正に荷電した残基を含有するが、ヒト皮膚線維芽細胞アッセイにおいてＬＤＬの結合に対して競合せずに、タンデム共有結合リピート［すなわち、（１４１−１５５）２］としてのみ競合した。（１４１−１５５）２ペプチドのＮ−アセチル化は、他方、線維芽細胞へのＬＤＬ結合を増強させた（非特許文献１９）。Ｎ−アセチル化（１４１−１５５）２アナログはコレステロールに富むリポ蛋白質と選択的に会合し、インビボにてそれらの急性クリアランスを媒介した（非特許文献１９）。さらに、これらの研究は、受容体結合に対する先要条件は、ペプチドがらせん状であることを示した（非特許文献１８）。Ａｐｏ Ｅの天然１２９−１６９配列のＮ末端におけるグリシンのＮ，Ｎ−ジステアリル誘導化によって脂質会合を増大させるように修飾された合成ペプチド（非特許文献２０）を用いて、増強されたＬＤＬの取り込みおよび分解も観察された（非特許文献２０）。ＬＤＬ結合はヒトＡｐｏＥのカチオン性配列１４１−１５５によって媒介されるが、Ｂｒａｄｄｏｃｋら（非特許文献２１）は、高度に保存されたアニオン性ドメイン（ヒトＡｐｏＥの４１−６０）のモデルペプチドもまた、ＬＤＬの細胞表面受容体への結合および内在化を調節することを示している。しかしながら、これらのペプチドはＬＤＬ分解を増強させない。
カイロミクロンは血漿中に見出されるリポ蛋白質であり、これは、腸からの脂質を他の身体組織に運び、蛋白質リン脂質コーディングによって囲われたトリアシルグリセロールの液滴よりなる。カイロミクロン残留物は、ディッセ腔における隔離の後に肝臓によって取り込まれ（非特許文献２２）、これは、ＡｐｏＥの存在下で増強される（Ｋｗｉｔｅｒｏｖｉｃｈ，Ｂ．Ｏ．，Ｊｒ．，１９９８；Ｄｅｅｄｗａｎｉａ，Ｐ．Ｃ．，１９９５；およびＷａｔｔｓ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＡｐｏＥは、ＬＤＬ受容体またはＬＲＰによる肝臓残留物リポ蛋白質取り込みの主要なメディエーターである。６０を超える正常なＶＬＤＬ Ｓｆ（副画分）の脂肪分解は、脂肪分解残留物のＬＤＬ受容体への結合を可能とする（非特許文献２３；非特許文献２４）。リポ蛋白質リパーゼ（ＬｐＬ）は、ＡｐｏＢ含有リポ蛋白質の膜ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への局所化を通じて（非特許文献２５；非特許文献２６）、および／またはＬＤＬ受容体関連蛋白質（ＬＲＰ）への結合を通じて（非特許文献２７）の取り込みを容易とすることができる。細胞表面ＨＳＰＧはまた、受容体としても機能することができ、ＡｐｏＥの特異的アイソフォームに対する可変結合親和性を有する。特に、ＡｐｏＥは肝臓によって合成され、また単球／マクロファージによっても合成され、コレステロールホメオスタシスに対するその効果を発揮する。ＡｐｏＥの欠如の局所的な効果についてのインビボでの証拠は、ＡｐｏＥ欠乏マウスからの骨髄を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける加速化アテローム性動脈硬化症を示したＬｉｎｔｏｎおよびＦａｚｉｏの観察に由来する（非特許文献２８）。ＡｐｏＥ依存性ＬＤＬコレステリルエステルの取り込み経路は、ネズミ副腎皮質細胞において示されている（非特許文献２９）。これは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）および２マクログロブリン受容体が関与するようである。
合成クラスＡ両親媒性らせん状ドメインに共有結合により連結したＡｒｇ残基（１４１−１５０）が豊富なＡｐｏＥの受容体結合ドメインは、肝臓アテローム形成性リポ蛋白質取り込みを増強させることが示されている（非特許文献３０）。最近の研究は、ＡｐｏＥの可能性のある抗アテローム形成作用はそれがへパラン硫酸（ＨＳ）の内皮産生を刺激するというものであることを示す（非特許文献３１）。リポ蛋白質は、１以上の蛋白質に結合した１以上の脂質の複合体であって、水不溶性脂肪を血液に輸送する。コレステロールはリポ蛋白質によって血流を通して運ばれる。リポ蛋白質の結合メカニズムを介してコレステロールを低下させる入手可能な薬剤はない。増大したコレステロールに関連する疾患および状態を低下させるために、被験体においてコレステロールを低下させることができるより効果的な薬剤に対する要望が存在する。
米国特許第６，５０６，８８０号は、脂質結合がリポ蛋白質上へのペプチドの表面局所化に、およびアポＥの受容体結合ドメインが適切に接近可能にＬＤＬ受容体に結合するのに必須であるので、モデルクラスＡ両親媒性らせん１８Ａのような十分に特徴付けられた脂質会合ペプチドの、アポＥの１４１−１５０ペプチド配列への接合は、生物学的活性を付与するのに十分なはずであるという仮説に基づいて、アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを合成するための最初の試みを示す。それらのペプチドは細胞へのＬＤＬ／ＶＬＤＬ結合を増強させ、細胞によるＬＤＬ／ＶＬＤＬ分解を増大させ、アテローム性動脈硬化症を有する必要とする個体においてＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールを降下させたことが判明した。
本発明は、新規な合成アポリポ蛋白質Ｅ（ＡｐｏＥ）模倣ペプチドを提供し、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインが十分に特徴付けられた脂質会合モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチドである１８Ａに共有結合により連結され、ならびにヒトＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールレベルを降下させ、かくして、アテローム性動脈硬化症を阻害することにおけるその合成ペプチドの可能な適用を提供する。また、本発明は、ＨＤＬ機能を改善し、および／または抗炎症特性を発揮する合成ペプチドの可能な適用も提供する。
Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ ＲＤ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１９９９，１０：３８３−３８６ Ｋｗｉｔｅｒｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｏ．，Ｊｒ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９８，８２：３Ｕ−７Ｕ Ｄｅｅｄｗａｎｉａ，Ｐ．Ｃ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．１９９５，７９：９７３−９９８ Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９８，４１４：１７−３０ Ｍａｒａｉｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．２０００，１１：５９７−６０２ Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，６２２−６３０ Ｓｈｉｍｏｎｏ，Ｈ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，２０８４−２９９１ Ｙａｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６，６６５−６６９ Ｚｈａｎｇ．Ｓ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８，４６８−４７１ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３４９，１０９−１２１ Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９９，４０：６２２−６３０ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１８１７−１８２２ Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２７，４０−４８ Ｒａｌｌ，Ｓ．Ｃ．，Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７９，４６９４−４７００ Ｌａｌａｚａｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，３５４２−２５４５ Ｄｙｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９６，２２８０３−２２８０６ Ｄｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５００９−１５０１５ Ｄｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６，８０−８８ Ｎｉｃｏｕｌｉｎ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，２２３−２３４ Ｍｉｍｓ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９−２０５３９−２０６４７ Ｂｒａｄｄｏｃｋ．Ｄ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１３９７５−１３９８４ Ｈａｖｅｌ，Ｒ．Ｊ．，１９８５，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．５：５６９−５８０ Ｃａｔａｐａｎｏ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１００７−１００９ Ｓｃｈｏｎｆｉｅｌｄ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４：１２８８−１２９７ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２０１３−２０２１ Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５：２９３２４−２９３３０ Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１６２−１６４ Ｌｉｎｔｏｎ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｆａｚｉｏ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｅｎｉ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１９９９，１０：９７−１０５ Ｓｗａｒｎａｋａｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２１１２１−２１１２６ Ｄａｔｔａ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００，３０：２１３−２２０ Ｐａｋａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：４８１６−４８２３
本発明は、ポリペプチド、組成物、および該ポリペプチドおよび組成物の使用方法を提供する。合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを本明細書中で開示する。例えば、配列番号１５のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの脂質会合ペプチドは、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａであり得る。例えば、脂質会合ペプチドは配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含むことができる。
また、配列番号１５のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、該合成ペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端において、それぞれアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはアセチル基でＮ末端保護もされ得る。開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはアミド基でＣ末端保護もされ得る。
また、配列番号１７のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメインおよび受容体結合ドメインペプチドを含み、該脂質結合ドメインは該受容体結合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも本明細書中で開示する。そのような合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの受容体結合ドメインペプチドはＡｐｏＥのヒト受容体結合ドメインペプチドであり得る。例えば、これらの合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの受容体結合ドメインペプチドは、配列番号１または１５のアミノ酸配列を含むことができる。これらの合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの受容体結合ドメインペプチドは、配列番号２、３、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸配列を含むこともできる。
また、配列番号１７のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメインおよび受容体結合ドメインペプチドを含み、該脂質結合ドメインは該受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されており、該合成ペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端において、それぞれアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも本明細書中で開示する。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものであり得る、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、該受容体結合ドメインは逆向きに該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組成物よりなり、該受容体結合ドメインはドメインがスイッチされた向きに該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインはスクランブル化される、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの脂質会合ペプチドはスクランブル化される、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよびアポリポ蛋白質Ｅの脂質会合ペプチドの双方がスクランブル化される、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインもしくはアポリポ蛋白質Ｅの脂質会合ペプチド、または双方がスクランブル化されており、該ペプチドは逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸も開示する。例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸であって、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む、核酸を開示する。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターも開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含む宿主細胞も開示する。例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含む真核生物宿主細胞および原核生物宿主細胞を開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含む組換え細胞も開示する。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを産生する組換え細胞も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドに結合する抗体も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含むトランスジェニック非ヒト被験体も開示する。例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含むトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物を開示する。
また、開示されたアポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト被験体も開示する。また、細胞へのＬＤＬ結合を増強させる方法であって、該細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響されることを含む方法も開示する。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響されることを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物をとして投与される、方法も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響されることを含み、被験体の細胞へのＬＤＬの結合は増強され、被験体の細胞によるＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＬＤＬコレステロールは降下し、被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合は増強され、被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＶＬＤＬコレステロールは降下し、および／または被験体におけるコレステロールの全血漿濃度は降下する、方法も開示する。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響されることを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、方法も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響されることも含み、該被験体は冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、方法も開示する。
また、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示する。また、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、方法も開示する。また、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、被験体の細胞へのＬＤＬの結合は増強され、被験体の細胞によるＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＬＤＬコレステロールは降下し、被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合は増強され、被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＶＬＤＬコレステロールは降下し、および／または被験体におけるコレステロールの全血漿濃度は降下する、方法も開示する。
また、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、方法も開示する。また、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該被験体は冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、方法も開示する。
また、被験体において血清コレステロールを低下させる方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示する。また、被験体において血清コレステロールを低下させる方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、方法も開示する。
また、被験体において血清コレステロールを低下させる方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、被験体の細胞へのＬＤＬの結合は増強され、被験体の細胞によるＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＬＤＬコレステロールは降下し、被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合は増強され、被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＶＬＤＬコレステロールは降下し、および／または被験体におけるコレステロールの全血漿濃度は降下する、方法も開示する。
また、被験体において血清コレステロールを低下させる方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、方法も開示する。また、被験体において血清コレステロールを低下させる方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該被験体は冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、方法も開示する。
また、ＨＤＬ機能を増強する方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。また、炎症を減少させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含み、該ペプチドは、パラオキサナーゼを増加させることによって脂質ヒドロペルオキシドを血漿から除去する、方法も開示する。
また、血漿パラオキソナーゼ（ＰＯＮ−１）活性を増大させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。また、アテローム形成を阻害する方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。また、アテローム形成を阻害する方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含み、血漿コレステロールレベルは減少しＨＤＬ機能は増大する、方法も開示する。
また、血管壁からアテローム形成性リポ蛋白質を除去する方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。また、ＬＤＬのアテローム形成性を減少させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿中ＨＤＬが影響される方法も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬが影響されることを含む方法であって、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、方法も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬが影響されることを含む方法であって、ＰＯＮ活性は増大し、脂質ヒドロペルオキシドは除去され、アテローム形成性リポ蛋白質レベルは血漿中において低下し、内皮機能は改善され、および／またはアテローム形成性リポ蛋白質は血管壁から除去される、方法も開示する。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬは影響される方法であって、該被験体は炎症性腸状態（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、アルツハイマー病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性結腸炎、クローン病、自己免疫溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー氏病、血小板減少性紫斑病、アレルギー；喘息、アトピー性疾患、心筋障害、糸球体腎炎、再生不良性貧血、代謝症候群Ｘ、末梢血管疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、喘息、特発性肺線維症、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、骨粗鬆症、パジェット病、冠動脈石灰化、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、ヴェーゲナー肉芽腫症、中枢神経系血管炎（ＣＮＳＶ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、ＡＩＤＳ炎症応答、インフルエンザ、鳥類インフルエンザ、ウイルス性肺炎、エンドトキシンショック症候群、敗血症、敗血症症候群、外傷／創傷、核膜潰瘍、慢性／非創傷治癒、再灌流負傷（予防および／または治療）、虚血性再灌流負傷（予防および／または治療）、脊髄負傷（緩和効果）、癌、骨髄腫／多発性骨髄腫、卵巣癌、乳癌、結腸癌、骨癌、変形性関節炎、アレルギー性鼻炎、悪液質、アルツハイマー病、インプラント補綴、バイオフィルム形成、皮膚炎、急性および慢性、湿疹、乾癬、接触皮膚炎、勃起不全、黄斑変性、腎臓障害、神経障害、パーキンソン病、末梢血管疾患、および髄膜炎、器官移植後の認知および拒絶を含む、方法も開示する。
また、「炎症性傷害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示する。また、「炎症性障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、方法も開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドからなり、該受容体結合ドメインはドメインがスイッチされた向きで該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインは逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、該脂質会合ペプチドは逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインは該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドの双方が逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインよりなる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインよりなり、該受容体結合ドメインは修飾されているか、または改変されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインよりなり、該受容体結合ドメインは突然変異しており、スクランブル化され、および／または逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、脂質会合ペプチドよりなる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、脂質会合ペプチドよりなる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示され、ここに、該脂質会合ペプチドは修飾されているか、または改変されている。また、脂質会合ペプチドよりなり、該脂質会合ペプチドは変異され、スクランブル化され、および／または逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。
本明細書に援用され、その一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施態様を説明し、記載と一緒になって、本発明の原理を説明する役割を果たす。これらは非限定的例である。
図１は、ｈＥ−１８Ａ、およびｈＥ−１８Ａのスクランブル化された形態の間の差のらせん状の網表示を示す。図面の左側に見られるように、「α両親媒性らせん」はらせんの１巻き当たり３．６個のアミノ酸残基を有し、他方、「πらせん」は１巻き当たり４．４個のアミノ酸残基を有する。らせん状網は面の分離を示さず、かくして、両親媒性のらせんの性質は失われる。らせん状網は、それが円筒の中央で水平に切断され、平坦に置かれた場合、らせん円筒の２次元表示である。 図２は、病変形成に対するアポＥノックアウトマウス（１６週）における４週間のＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２（ｉ．ｖ．投与）の効果を示す。病変の程度はエンフェイス（ｅｎ ｆａｃｅ）調製およびオイルレッドＯでの染色によって分析する。 図３は、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２の一回投与の長期効果を示す（各群中ｎ＝９）。血漿コレステロールの最初の低下に続いて、コレステロールレベルは２４時間で元の値に復帰する。有意な減少は４日目に観察され、８日間維持された。 図４は、１２５Ｉ−Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２と共に５分間および６０分間インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞を示し、ヘパリンおよびヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ（Ｈ／Ｈ）によって放出可能なペプチドを決定した。６０分間のインキュベーションの後にＨ／Ｈによって放出されたペプチドの割合は５分において観察されたものよりも大きく、他方、細胞においては、ペプチドはより少ない。 図５は、２４、４８および７２時間の時点においてペプチド：Ａｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２（Ｉ）、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（ＩＩＩ）、および４Ｆ（ＩＩ）で処理されたＨｅｐＧ２細胞のＡｐｏ Ａ−Ｉ分泌を示す：細胞を密集するまで成長させ、ＦＢＳを含まない培地中でペプチド（５０μｇ／ｍｌ）で処理した。ペプチドを含有する培地を最初のＯ／Ｎインキュベーション後に除去し、（ペプチドを含まない）ＦＢＳを含まない培地で置き換えた。第２のＯ／Ｎインキュベーションの後に、培地を除去し、ＦＢＳを含まない培地で置き換え、第３および最後の夜の間インキュベートした。アガロースゲルを各時点について泳動させた。ウエスタンブロットをヒトＡｐｏ Ａ−Ｉに対して行って、前β−ＨＤＬ粒子の分布を決定した。Ｃ＝ペプチドを含まない対照細胞。これらの結果は、ペプチドが内在化され、再度放出されるので、該ペプチドはより長い時間の間効果を有することを示す。 図６は、ＶＣＡＭ発現に対するウエスタンブロットを示す。ＨＵＶＥＣをペプチド単独、ペプチド＋ＬＰＳ、およびＬＰＳでチャレンジした。ＬＰＳはＶＣＡＭ−１の発現を誘導する（レーン３）。ペプチドそれ自体（レーン１）はいずれの悪影響も示さず、他方、それはＬＰＳによって誘導されたＶＣＡＭ−１の発現を８０％を超えて阻害する（レーン２）。これらの結果は、ペプチドが抗炎症効果を有することを示す。 図７は、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２でのＴＨＰ−１由来マクロファージの処理がアポＥの合成を高めることを示す。細胞を３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識し、ペプチド（２５μｇ／１０６細胞）で５時間処理し、培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。バンドをオートラジオグラフィーによって発色させ、デンシトメトリーによって定量した。これらの結果は、ペプチドがアポＥの合成、およびコレステロール低下能力に対するペプチドの慢性的効果を刺激することができ、抗炎症能力は部分的にはアポＥ合成を促進するその能力によるものであることを示す。 図８は、雌アポＥ ｋｏマウスにおける６週間の１８Ｌ−２ＹおよびＲ１８Ｌ−２Ｙの経口摂取（１ｍｇ／マウス）の効果を示す。ペプチド１８Ｌ−２ＹおよびＲ１８Ｌ−２Ｙを６週間与えた４週齢雌アポＥノックアウトマウス。ペプチドを通常の餌に混合し（１ｍｇ／４ｇ餌）、自由に摂食させた。６週間の最後に、動物を安楽死させ、アテローム性動脈硬化症病変領域をオイルレッドＯで染色し、定量した。対照（実線黒色）および１８Ｌ−２Ｙ処理群（明るい灰色）についてｎ＝２０およびＲ１８Ｌ−２Ｙ処理群（暗い灰色）においてｎ＝２３。†，ｐ＜０．０１対対照（暗色）および‡，ｐ＜０．０１対１８Ｌ−２Ｙ。 図９は、ＴＨＰ−１由来マクロファージにおけるｍＲＮＡレベルに対するＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２の効果を示す。 図１０は、開示されたペプチドの１つを投与しないプロアテローム形成効果の模式図を示し、開示されたペプチドの１つは抗炎症メカニズムによってこれを修正することができることを示す。 図１１は、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２を投与したウサギにおける経時的な血漿コレステロールレベルを示す。６００ｍｇ／ｄｌの範囲での初期コレステロール値（１％コレステロール食事での１週間）での、高脂肪の食事を投与したウサギへのＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２の投与。ペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を図面に示すように２回静脈内投与した（ｎ＝４）。１４日（アテローム形成性食事の開始から２１日後）の最後に、対照ウサギにおける血漿コレステロールレベルは２０００ｍｇ／ｄｌの範囲にあった（ｎ＝４）が、ペプチドを投与したウサギは１０００ｍｇ／ｄｌの範囲のコレステロール値を示した。血漿コレステロールの５０％減少がペプチドの投与後に観察された。 図１２は、１％食事を与えたＮＺＷウサギにおける回転実験が血漿からのコレステロールの初期減少（およびペプチドの消失）を示すことを示す。血漿からのペプチドの消失にもかかわらず、ペプチドの効果は１４日間続く。 図１３は、対照ウサギ、アテローム形成性食事を投与したウサギ、およびペプチド静脈内投与と共に食事を投与したウサギにおける大動脈リングを、内皮機能について調べたことを示す。食事を投与したウサギの大動脈リングはアセチルコリンに対して応答しなかったが、高脂肪の食事を投与したウサギおよびペプチドを投与したウサギからの大動脈は、正常な食事を投与したウサギからの大動脈とほとんど同様に、アセチルコリンに対して用量依存的弛緩を示した。 図１４は、クラスＡペプチドが１８Ｌ誘導溶解を阻害することを示す：この阻害についての分子的基礎は、これらの分子の反対の断面形状である。１８ＬにおけるＫがＲによって置き換えられた場合、ペプチドＲ１８Ｌにおける断面形状の台形への変化のため、溶解活性は最小まで低下する。 図１５は、溶解特性を低下させ、およびアテローム形成性リポ蛋白質の取り込みを高めるＲ１ ８Ｌ−２Ｙの合理的設計を示す。 図１６は、さらなる実験のためにＲ１ ８Ｌ−２Ｙを選択する合理的理由を示す。Ｅ−／−マウスにおける血漿コレステロールに対する１８Ｌ−２ＹおよびＲ１８Ｌ−２Ｙの効果（用量１００μｇ ｉ．ｖ．）。 図１７は、Ｒ１８Ｌ−２Ｙの経口投与がアポＥヌルマウスにおいて血漿コレステロールを減少させることを示す。１ｍｇ／４ｇの餌におけるペプチド（１日につき動物当たり）（アポＥ−／−マウス）は、３０日間で血漿コレステロールを降下させる（１ｍｇ／マウス／日）（各群においてｎ＝５）。 図１８は、血漿コレステロールレベルに対するペプチドＲ１８Ｌ−２Ｙ（１ｍｇ／４ｇの餌）投与の効果を示す。 図１９は、ＨＤＬ機能のペプチドＡｃ／ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２媒介改善を示す。 図２０は、ＺＤＦラットへのｈＥ−４Ｆ、ｈＥ−Ｓｃ２ＦおよびＬ−４Ｆ投与のタイムラインを示す。ペプチドは５ｍｇ／ｋｇの濃度にてラットに静脈内投与した。 図２１は、スクランブル化４Ｆペプチドとしてのペプチド配列４Ｆのらせん状ホイール表示を示す。 図２２は、２つの異なる時点（５分および２時間）における、アポＥヌルマウスでの血漿コレステロールに対する３つのペプチドの効果を示す。表されるペプチドはＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２、Ａｃ−ｈＥ４Ｆ−ＮＨ２、およびＡｃ−ｈＥ−Ｓｃ２Ｆ−ＮＨ２である。ペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２、Ａｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２およびＡｃ−ｈＥ−Ｓｃ１８ＡをアポＥヌルマウス（ｎ＝４）に投与し（ｉ．ｖ．）、血漿コレステロール値を投与前（０分）、投与から５分後および２時間後に測定した。Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２およびＡｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２は２時間の時点で血漿コレステロールレベルのより高い低下を示したが、ペプチドＡｃ−ｈＥ−Ｓｃ１８Ａ−ＮＨ２はかなりの差を示さなかった。 図２３は、αらせんまたはπらせんとしてプロットされたＳｃ−ｈＥ−１８Ａを示す。配列Ｓｃ−ｈＥ−１８Ａ（ＬＲＬＬＲＫＬＫＲＲ−ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＥＫＬＫＥＡＦ）において、ｈＥ部分はスクランブル化される。これがスクランブル化される場合、配列がアルファらせんとして折り畳まれる場合（３．６残基／１巻き）、得られるアルファらせんは両親媒性らせんではない。というのは、２つの（極性および非極性）面の分離がないからである。しかしながら、それがπらせんとして折り畳まれる場合（４．４残基／１巻き）、得られる構造はまた極性面および非極性面の分離を示さない。 図２４はｈＥ−Ｓｃ−１８Ａのらせん状網表示を示す。このらせん状網プログラム（すなわち、ペプチド配列はアルファらせんまたはπらせんとして折り畳まれ、面上に広げられている）においてはアルファらせんは極性面および非極性面の分離を示さず、他方、πらせんは中心（黒色の丸印）において明瞭な非極性面を示し、極性残基の青色および赤色の丸印はエッジに出現する。ペプチドはパイらせんとして脂質と会合することができる。
本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中に記載され、および特許請求される発明の日現在、当該分野で当業者に知られた技術水準をより十分に記載するために、前記または後記にかかわらず、本明細書中にその全体を参照によって援用する。
本発明は、特に断りのない限りは特定の合成方法、または特定の組換えバイオテクノロジーの方法、または特に断りのない限りは特定の試薬、特定の医薬担体、または特定の医薬製剤もしくは投与養生法に限定されないことが理解されるべきである。それは、それらが変化しうるからである。また、本明細書中で用いる専門用語は、特定の実施態様を記載する目的のためであり、限定的なことを意図しないことも理解されるべきである。
Ａ．定義および術語
本明細書中で用いる専門用語は、特定の実施態様を記載する目的のためだけであり、限定的なことを意図しない。
本明細書および添付の請求の範囲で用いる、単数形「１つの」（「ａ」および「ａｎ」）、および「該」（「ｔｈｅ」）は、文脈が明瞭にそうでないことを示すのでなければ、複数の言及を含むことができる。かくして、例えば、「１つの化合物」への言及は化合物の混合物を含み、「１つの医薬担体」への言及は、２以上のそのような担体の混合物を含む、などである。
範囲は、本明細書中においては、「約」一つの特定の値から、および／または「約」もう一つの特定の値までとして表すことができる。用語「約」は、本明細書中においては、「ほぼ」、「の領域の」、「大まかに」、または「およそ」を意味するのに用いる。用語「約」が数値の範囲と一緒に用いられる場合、それは、範囲の境界を記載された数値を超えるおよびそれを下回るように拡大することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、本明細書中においては、述べられた値を、２０％の偏差で、超えるかそれを下回るように変更するのに用いられる。そのような範囲が表された場合、もう一つの実施態様は、一つの特定の値からおよび／または他の特定の値まで含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似的なものとして表される場合、特定の値はもう一つの実施態様を形成することが理解されるだろう。各範囲の終点は他の終点に関連して、かつ他の終点とは独立しての両方において有効であることもさらに理解されるだろう。
本明細書中で用いる、用語「アミノ酸配列」とは、アミノ酸残基を表す略語、文字、記号または単語のリストをいう。本明細書中で用いるアミノ酸の略語はアミノ酸についての慣用的な１文字コードであって、以下のように表される：Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リシン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン。
本明細書中で用いる「ポリペプチド」とは、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、または蛋白質をいう。ポリペプチドは連続的アミノ酸から構成される。用語「ポリペプチド」は、天然に生じるか、または合成の分子を含む。
加えて、本明細書中で用いる、用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、例えば、等配電子体などによって相互に連結したアミノ酸をいい、２０の遺伝子にコードされたアミノ酸以外の修飾されたアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然プロセスによって、または当該分野でよく知られた化学的修飾技術によって修飾することができる。修飾は、ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めたポリペプチドのどこでも起こり得る。同一タイプの修飾は、与えられたポリペプチド中のいくつかの部位において同一または変化する程度で存在し得る。また、所与のたポリペプチドは多くのタイプの修飾を有することができる。修飾は、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、共有結合架橋または環化、フラビンの共有結合付着、ヘム部分の共有結合付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質または脂質誘導体の共有結合付着、ホスファチジルイノシトールの共有結合付着、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、システインまたはピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パージレーション（ｐｅｒｇｙｌａｔｉｏｎ）、蛋白質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびアルギニル化のようなアミノ酸の蛋白質へのトランスファーＲＮＡ媒介付加を含む（Ｐｒｏｔａｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｗｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔａｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｎｉｃ，Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３）参照）。
本明細書中で用いる、「ペプチドミメティック」は、通常のペプチド化学のいくつかの改変を含む蛋白質の機能の模倣を意味する。ペプチドミメティックスは、典型的には、生物学的特性において、特定の蛋白質の１以上の機能を模倣するアミノ酸の短い配列である。ペプチドアナログは、安定性の増大、効率の増大、送達の増強、半減期の増大などのような、元来のペプチドのいくつかの特性を増強させる。公知のポリペプチド配列に基づいてペプチドミメティックスを製造する方法は、例えば、米国特許５，６３１，２８０号、第５，６１２，８９５号、および第５，５７９，２５０号に記載されている。ペプチドミメティックスの使用は、非アミド結合を有する非アミノ酸残基の所与の位置での取込みを含むことができる。本発明の１つの実施態様は、化合物が、適当なミミックで置き換えられた結合、ペプチド骨格またはアミノ酸化合物を有するペプチドミメティックスである。適当なアミノ酸ミミックであり得る非天然のＬ−またはＤ−アミノ酸のいくつかの非限定的例は、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リシン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−δＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒドロキシプロリン、およびＢｏｃ−Ｌ−チオプロリンを含む。
本明細書中で用いる、単語「または」は、特定のリストの任意の１つの成員を意味し、また、そのリストの成員の任意の組み合わせを含む。
本明細書中で用いる、語句「核酸」とは、ワトソンクリック塩基対によって相補的核酸にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスであるかを問わず、天然に生じるかまたは合成オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをいう。本発明の核酸はまた、ヌクレオチドアナログ（例えば、ＢｒｄＵ）、および非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を含むこともできる。特に、核酸は、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはその任意の組み合わせを含むこともできる。
本明細書中で用いる、「逆向きの」、「逆向き」、「逆アナログ」または「逆配列」とは、ペプチド、または該ペプチドの一部が、非逆向きのペプチドと比較して、逆のアミノ酸配列を有することをいう（すなわち、元来の配列は右側から左側に読まれる（書かれる））。例えば、１つのペプチドがアミノ酸配列ＡＢＣＤＥを有する場合、その逆配列を有する逆アナログまたはペプチドはＥＤＣＢＡとなる。デュアルドメインペプチド、例えば、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２においては、ｈＥ配列は右側から左側に読まれるか、または１８Ａ配列は右側から左側に読まれるかのいずれかである。ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ−ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦの逆アナログはＲＬＬＲＫＲＬＫＲＬ−ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号６４）またはＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ−ＦＡＥＫＬＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＬＷＤ（配列番号８４）であり得る。
本明細書中で用いる、「デュアルドメインペプチド」、「デュアルドメイン合成ペプチド」、または「デュアルドメインＡｐｏＥ模倣ペプチド」は、脂質会合ペプチド／ドメインおよび受容体結合ペプチド／ドメインを含むペプチドを意味する。
本明細書中で用いる、「単一ドメインペプチド」、「単一ドメイン合成ペプチド」または「単一ドメインＡｐｏＥ模倣ペプチド」は、脂質会合ペプチド／ドメイン、あるいは受容体結合ペプチド／ドメインのいずれかを含むが、双方は含まないペプチドを意味する。
本明細書中で用いる、「ドメインがスイッチされた」、「スイッチされたドメイン」、または「スイッチされた」ペプチドは、脂質会合ペプチドが合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのＮ末端にあるように、脂質会合ペプチドがアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインに共有結合により連結していることを意味する。例えば、ペプチド１８Ａ−ｈＥ（配列番号３８）は、ドメインがスイッチしたペプチドの例である。
本明細書中で用いる、「スクランブル化」、「スクランブル化バージョン」、または「スクランブル化ペプチド」は、アミノ酸配列の組成がスクランブル化されていないペプチドと同一であるが、アミノ酸の配列が改変されており、かくして、ペプチドがα両親媒性らせんを形成できないようにするか、または脂質会合（またはＨＳＰＧ会合）特性を有しないことを意味する。しかしながら、いくつかの場合においては、本発明に記載されるように、スクランブル化ペプチドは、πらせんのような異なるらせん状構造を形成することができる状態である。例えば、１つのペプチドがアミノ酸配列ＡＢＣＤＥを有する場合、ペプチドのスクランブル化バージョンはアミノ酸配列ＤＥＡＢＣを有し得る。スクランブル化ペプチドは、しばしば、スクランブル化されたペプチドの部分に先立って「Ｓｃ」を有すると示される。例えば、Ｓｃ−ｈＥ−１８Ａは、ペプチドのｈＥ部分がスクランブル化されていることを示した。図２１、２３および２４はスクランブル化ペプチドの例を示す。
「α両親媒性らせん」は先に論じたが、らせんの１巻き当たり３．６個のアミノ酸残基を有し、他方、「πらせん」は１巻き当たり４．４個のアミノ酸残基を有する。例えば、図１および２４は、「α両親媒性らせん」および「πらせん」の間の差を示す。
本明細書中で用いる、「試料」は、本明細書中で説明されるようにアッセイされる、動物、動物からの組織または器官、（被験体内か、被験体から直接採取されたか、または培養下で維持されたか、もしくは培養細胞系からのいずれかの）細胞、細胞溶解物（または溶解物画分）または細胞抽出物、または本明細書中で記載されるようにアッセイされた、細胞または細胞材料（例えば、ポリプチドまたは核酸）に由来する１以上の分子を含有する溶液を意味する。試料は、細胞または細胞成分を含有する任意の体液または排出物（例えば、限定されるものではないが、血液、尿、糞、唾液、涙、胆汁）であってもよい。
本明細書中で用いる、「調節する」は、増大または減少によって変更することを意味する。
本明細書中で用いる、「脂質結合ドメインＥ」および「脂質会合ペプチド」は相互交換可能に用いられる。本明細書中で用いるように、双方の用語はアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメインを意味することができる。
本明細書中で用いる、「正常な被験体」は、「脂質障害」または「炎症障害」を有しない個体を意味する。
本明細書中で用いる、「脂質障害」は、被験体がその血液中に過剰の脂質または増大した炎症性脂質を有する場合を意味する。脂質は、限定されるものではないが、コレステロールおよびトリグリセリドを含む。炎症性脂質は、限定されるものではないが、ｏｘ−ＬＤＬ関連脂質（すなわち、酸化されたＰＡＰＣ（１−パルミトイル２−アラキドニルホスファチジルコリン））のような脂質を含む。ＬＤＬの脂質成分であるＰＡＰＣまたはＰＬＰＣの酸化は、酸化された脂質を生じる。脂質障害を有することは、アテローム性動脈硬化症および心臓病のような炎症疾患を発症させる可能性がより高い。
本明細書中で用いる、「炎症性障害」は、被験体が、いくつかのサイトカインレベルが上昇して、正常な生理的応答を改変する、酸化された脂質によって開始される反応のカスケードを経験する場合を意味する。炎症性障害は、限定されるものではないが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、アルツハイマー病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性結腸炎、クローン病、自己免疫溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー氏病、血小板減少症紫斑病、アレルギー；喘息、アトピー性疾患、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心筋障害、糸球体腎炎、再生不良性貧血、器官移植後の認知および拒絶を含む。炎症性疾患は、性質上、細菌性、真菌性、寄生性および／またはウイルス性であり得る。
本明細書中で用いる、化合物の「有効量」は、所望の効果を提供するための該化合物の十分な量を意味する。正確な必要量は被験体の種、年齢、および一般的状態、治療すべき疾患の重篤度（または基礎となる遺伝的欠陥）、用いる特定の化合物、その投与様式などに依存して、被験体の間で変化するであろう。かくして、正確な「有効量」を特定するのは不可能である。しかしながら、適切な「有効量」は、ルーチン的実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
本明細書中で用いる、「単離されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」は、ポリペプチドが本来通常会合している物質を実質的に含まないポリペプチド「またはその断片」を意味する。本発明のポリペプチド、またはその断片は、例えば、天然の源（例えば、哺乳動物細胞）からの抽出、（例えば、細胞において、または無細胞翻訳系において）ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはポリペプチドを化学的に合成することによって得ることができる。加えて、ポリペプチド断片は任意のこれらの方法によって、または全長蛋白質および／もしくはポリペプチドを切断することによって得ることができる。
本明細書中で用いる、「単離された核酸」または「精製された核酸」は、本発明のＤＮＡに由来する生物の天然に生じるゲノムにおいて、遺伝子に近接する遺伝子を含まないＤＮＡを意味する。該用語は、したがって、例えば、自己複製プラスミドもしくはウイルスのようなベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ（例えば、導入遺伝子）；または別々の分子（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、または化学的もしくはインビトロ合成によって産生されたゲノムまたはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。また、それは、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。用語「単離された核酸」はまた、ＲＮＡ、例えば、単離されたＤＮＡ分子によってコードされるｍＲＮＡ分子、または化学的に合成されるｍＲＮＡ分子、または少なくともいくつかの細胞成分、例えば、他のタイプのＲＮＡ分子またはポリペプチド分子から分離されたか、もしくはそれらを実質的に含まないｍＲＮＡ分子をも指す。
本明細書中で用いる、「導入遺伝子」は、技巧的な手段により細胞に挿入され、その細胞およびその子孫のゲノムの一部となる核酸配列を意味する。そのような導入遺伝子は（必ずしもそうではないが）細胞に対して部分的にまたは全体的に異種であってよい（例えば、異なる種に由来する）。
本明細書中で用いる、「トランスジェニック動物」は、上記した導入遺伝子を含む動物を意味する。トランスジェニック動物は当該分野でよく知られた技術によって作成される。
本明細書中で用いる、「ノックアウト変異」は、通常にコードされるポリペプチドの生物学的活性を変異していない遺伝子に対して少なくとも８０％低下させる核酸配列における改変を意味する。その変異は、限定されるものではないが、挿入、欠失、フレームシフト、またはミスセンス変異であってよい。「ノックアウト動物」、例えば、ノックアウトマウスはノックアウト変異を含有する動物である。ノックアウト動物はノックアウト変異に対してヘテロ接合性またはホモ接合性であってよい。そのようなノックアウト動物は、当該分野でよく知られた技術によって作成される。
本明細書中で用いる、「治療する」は、疾患もしくは状態の効果の悪化を予防し、または遅延させ、または疾患の効果を部分的にもしくは十分に逆行させるために、脂質障害を有するか、または冠動脈疾患、慢性リウマチ、および／もしくは全身性狼瘡を有するヒトまたは他の哺乳動物（例えば、動物モデル）のような被験体に本発明の化合物または分子を投与することを意味する。
本明細書中で用いる、「予防する」は、糖尿病の発症に対して増大した感受性を有する被験体が脂質障害を発症する可能性を最小限にすることを意味する。
本明細書中で用いる、「特異的に結合する」は、抗体がその同族抗原（例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド）を認識し、それと物理的に相互作用し、他の抗原を有意に認識することなく、それと相互作用することがないことを意味し、そのような抗体は、当該分野でよく知られた技術によって生じるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。
本明細書中で用いる、「プローブ」、「プライマー」またはオリゴヌクレオチドは、相補的配列（「標的」）を含有する第二のＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対して塩基対合できる定義された配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。得られたハイブリッドの安定性は、生じる塩基対の程度に依存する。塩基対の程度は、プローブおよび標的分子の間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度のようなパラメーターによって影響される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの程度は温度、塩濃度、およびホルムアミドのような有機分子の濃度のようなパラメーターによって影響され、当業者に公知な方法によって決定される。開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸に特異的なプローブまたはプライマー（例えば、遺伝子および／またはｍＲＮＡ）は、それらがハイブリダイズする開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸の領域に対して少なくとも８０％〜９０％の配列相補性、好ましくは少なくとも９１％〜９５％配列相補性、より好ましくは少なくとも９６％〜９９％配列相補性、最も好ましくは１００％配列相補性を有する。プローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、当業者によく知られた方法によって、放射能により、あるいは非放射能により検出可能に標識することができる。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、核酸配列決定、逆転写および／またはポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）分析、制限断片多形（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、ならびに電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のような核酸ハイブリダイゼーションに関連する方法に用いる。
本明細書中で用いる、「特異的にハイブリダイズする」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェンシー条件下で、実質的に相補的な核酸（例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸）を認識し、それと物理的に相互作用し（すなわち、塩基対合）、他の核酸とは実質的に塩基対合しないことを意味する。
本明細書中で用いる、「高ストリンジェンシー条件」は、６５℃の温度で、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（画分Ｖ）を含有する緩衝液、または４２℃の温度で、４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０．２Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で、長さが約４０ヌクレオチドのＤＮＡプローブの使用から得られるのと匹敵するハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。ＰＣＲ、ノザン、サザン、またはインサイチュハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定などのような高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションのための他の条件は、分子生物学の分野における当業者によってよく知られている（例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９８参照）。
本明細書中で用いる、「リポ蛋白質」または「リポ蛋白質類」は、蛋白質および脂質の双方を含有する生化学的アセンブリーを意味する。脂質およびそれらの誘導体は蛋白質に共有結合、または非共有結合してもよい。多くの酵素、トランスポーター、構造蛋白質、抗原、アドヘシン、およびトキシンはリポ蛋白質である。その例は、血液の高密度リポ蛋白質および低密度のリポ蛋白質、ミトコンドリアの膜蛋白質およびクロロプラストの膜蛋白質ならびに細菌リポ蛋白質を含む。
本明細書中で用いる、「高密度リポ蛋白質」（ＨＤＬ）は、コレステロールを輸送することができる、幾分そのサイズが変化する（直径が８〜１１ｎｍ）リポ蛋白質のクラスを意味する。
本明細書中で用いる、「超低密度リポ蛋白質」（ＶＬＤＬ）は、１つのリポ蛋白質サブクラスを意味する。それはコレステロールおよびアポリポ蛋白質から肝臓において組み立てられる。それは血流中で低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）に変換される。ＶＬＤＬ粒子は３０〜８０ｎｍの直径を有する。ＶＬＤＬは内因性産物を、カイロミクロンが外因性（規定食）産物を輸送する場所まで輸送する。
本明細書中で用いる、「低密度リポ蛋白質」または「ＬＤＬ」は、サイズが変化し（ほぼ２２ｎｍ）、現実に質量およびサイズ分布を有する脂肪酸の変化数を含有することができるリポ蛋白質を意味する。各天然ＬＤＬ粒子は、水性環境中に溶けるのを維持する脂肪酸を囲う単一のアポリポ蛋白質アポリポ蛋白質Ｂ−１００分子（ＡｐｏＢ−１００、４５３６アミノ酸残基を有する蛋白質）を含有する。ＬＤＬは通常は悪玉コレステロールと呼ばれる。
コレステロールは血液に溶解されない。それはリポ蛋白質とよばれるキャリアによって細胞へ、および細胞から輸送される必要がある。ＬＤＬおよびＨＤＬは、トリグリセリドが豊富なリポ蛋白質（ＶＬＤＬ）およびＬｐ（ａ）コレステロールと共に全コレステロールカウントを構成し、これは血液検査を通じて測定することができる。
本明細書中で用いる、「ＬＤＬコレステロール」は、ＬＤＬに会合したコレステロールを意味する。あまりにも多くのＬＤＬコレステロールが血液中を循環すると、それは心臓および脳に栄養を与える動脈の内壁中にゆっくり蓄積され得る。他の物質と一緒になって、それは動脈を狭くし、その柔軟性を低くし得る厚く堅い沈積物であるプラークを形成し得る。この状態はアテローム性動脈硬化症として知られている。血餅が形成され、狭くなった動脈を塞ぐ場合、心臓発作または脳卒中の結果となり得る。
本明細書中で用いる、「ＶＬＤＬコレステロール」は、ＶＬＤＬと会合するコレステロールを意味する。
本明細書中で用いる、「ＨＤＬコレステロール」はＨＤＬと会合したコレステロールを意味する。血中コレステロールの約１／４〜１／３は高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）によって運ばれる。高レベルのＨＤＬは心臓発作に対して保護すると思われるので、ＨＤＬコレステロールは「善玉」コレステロールとして知られている。低レベルのＨＤＬ（男性においては４０ｍｇ／ｄＬ未満、および女性においては５０ｍｇ／ｄＬ未満）もまた心臓疾患の危険性を増大させる。医学専門家は、ＨＤＬはコレステロールを動脈から運び出して肝臓へ戻す傾向があり、そこでそれは身体から通過すると考えている。幾人かの専門家は、ＨＤＬは動脈プラークから過剰のコレステロールを除去し、かくして、その蓄積を遅くさせると考えられる。
本明細書中で用いる、「Ｌｐ（ａ）」はＬＤＬ（悪玉）コレステロールの遺伝的変異体を意味する。高レベルのＬｐ（ａ）は、動脈における脂肪沈積物の早期発生に対する重要な危険因子である。Ｌｐ（ａ）は十分には理解されていないが、それは、動脈壁に見出される物質と相互作用し、脂肪沈積物の形成に寄与し得る。
Ｂ．本発明の化合物および組成物
開示された組成物を調製するのに用いられる成分、ならびに本明細書中で開示する方法内で用いられる組成物それ自体を開示する。これらのおよび他の物質は本明細書中で開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される際、これらの化合物の各々の種々の個々の組み合わせおよび順列ならびに集合的組み合わせおよび順列の特定の言及が明示的に開示されないことがあるが、各々は本明細書中においては具体的に考えられ、かつ記載されると理解される。
ペプチド
ヒトアポリポ蛋白質Ｅ（アポＥ）は、２つの区別されるドメインである、脂質会合ドメイン（残基１９２−２９９）、およびＬＤＬ受容体結合部位（残基１２９−１６９）を含有する球状ドメイン（１−１９１）よりなる。最小のアルギニンリッチなアポＥ受容体結合ドメイン（１４１−１５０）が、クラスＡ両親媒性らせんに共有結合により連結した場合に、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）の取り込みおよびクリアランスを増強させるのに十分であるという仮説を検証するために、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈらは、ヒトアポＥの受容体結合ドメイン、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ（「ｈＥ」とも言われるｈＡｐｏＥ［１４１−１５０］、配列番号１）が、よく特徴付けられた高親和性脂質会合ペプチド（「１８Ａ」とも呼ばれる、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ、配列番号４）である１８Ａに連結されて、ｈＡｐｏＥ［１４１−１５０］−１８Ａ（「ｈＥ−１８Ａ」とも呼ばれる、配列番号１１）で表されるペプチドを生じさせるペプチドを合成した（特異的アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよびそれらの使用のその教示については、本明細書中に参照によってその全体を援用する米国特許第６，５０６，８８０号参照）。また、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２（配列番号１２）として表されるｈＥ−１８Ａの末端保護アナログも合成された。リシン残基の重要性、および受容体結合ドメインにおける疎水性残基の役割もまた、二つのアナログ、ＬＲＲＬＲＲＲＬＬＲ−１８Ａ（「ｈＥ（Ｒ）−１８Ａ」とも呼ばれる、配列番号１３）およびＬＲＫＭＲＫＲＬＭＲ−１８Ａ（「ｍＥ１８Ａ」とも呼ばれる、配列番号１４）を用いて研究され、それにより、ヒトアポＥの受容体結合ドメインを修飾して、位置１４３および１４６におけるリシン（Ｋ）残基に代えてアルギニン（Ｒ）残基で置換（配列番号３）し、それにより、各々、マウスアポＥの受容体結合ドメイン配列番号２を１８Ａに連結された。次いで、ヒトＬＤＬ／ＶＬＤＬの細胞による取り込みおよび分解に対するデュアル特性ペプチドの効果が決定された。
誘導されたＬＤＬ受容体を有するＭＥＦ１細胞において、ＬＤＬ内在化は、Ａｃ−ｍＥ−１８Ａ−ＮＨ２、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２、およびＡｃ−ｈＥ（Ｒ）−１８Ａ−ＮＨ２によってそれぞれ、３、５および７倍増強されたと決定された。全ての３つのペプチドはＬＤＬの分解を１００パーセント増大させた。Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２、および対照ペプチドＡｃ−１８Ａ−ＮＨ２の双方はＶＬＤＬと相互作用して、ＶＬＤＬからのアポＥの移動を引き起こした。しかしながら、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２会合ＶＬＤＬのみが、アポＥの不存在にもかかわらず、ＶＬＤＬ単独と比較してＶＬＤＬの取り込みを６倍、分解を３倍高めた。しかしながら、これらのペプチドの不存在下における線維芽細胞へのＬＤＬ結合は、実験したＬＤＬの濃度範囲にわたって飽和できなかった。
さらに、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈらは、ＬＤＬ受容体関連蛋白質（ＬＲＰ）またはＬＤＬ受容体または双方の存在とは独立して、ＬＤＬ内在化の同様な増強を示した。しかしながら、ヘパリナーゼおよびヘパリチナーゼでの細胞の予備処理は、細胞による８０％を超える高められたペプチド媒介ＬＤＬ取り込みおよび分解を喪失した。このデータは、デュアルドメインペプチドが、両親媒性脂質結合ドメイン（１８Ａ）を介してのＬＤＬへの結合によって、ＬＤＬ取り込みおよび分解を高めることを示した。しかしながら、最小１４１−１５０ＡｒｇリッチなドメインはＬＤＬレベルを減少させなかったが、１８Ａ脂質会合ドメインと組み合わせた場合にのみ減少させ、ＬＤＬ受容体結合を付与しなかったが、ＬＤＬペプチド複合体を線維芽細胞による取り込みおよび分解のためにＨＳＰＧ経路に向けた。
本発明のポリペプチドおよびペプチドの非限定的例
本発明は、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドまたはポリペプチドを用いる方法に関する。本発明の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドまたはポリペプチドの非限定的例を以下に提供する。配列番号１５のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを本明細書中に開示する。このように、受容体結合ドメインは、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ（ｈＡｐｏＥ［１４１−１５０］、配列番号１）の位置１４８および１４９における２つのリシン（Ｌ）残基を２つのフェニルアラニン（Ｆ）残基で置き換えた。これらの合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのための脂質会合ペプチドは、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａであり得る。例えば、脂質会合ペプチドは配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含むことができる。
また、配列番号１７のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメイン、および受容体結合ドメインペプチドを含み、前記脂質結合ドメインは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも本明細書中に開示する。このように、脂質結合ドメインが、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（１８Ａ、配列番号１６）の２つのロイシン（Ｌ）残基を２つのフェニルアラニン（Ｆ）残基で置き換え、その結果、配列ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ（配列番号１７、修飾された１８Ａまたはｍ１８Ａとも呼ばれる）が得られた。合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの受容体結合ドメインペプチドは、ＡｐｏＥのヒト受容体結合ドメインペプチドであり得る。例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの受容体結合ドメインペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号１５のアミノ酸配列を含むことができる。そのような合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのン受容体結合ドメインペプチドは、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタ、およびイヌよりなる群から選択される種からのものでもあり得る。
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドについての受容体結合ドメインペプチドは、アポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）のＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインでもあり得る。ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、配列ＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号１０４）を有することができる。ＡｐｏＢ−１００は、ＬＤＬ受容体の結合ドメインとしての役割を果たす、９つのアミノ酸（３３５９−３３６７）を有する５５０，０００Ｄａ糖蛋白質である（Ｓｅｇｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４２，ｐｐ．１３４６−１３６７（２００１））。クラスリン被覆ピットにおけるＬＤＬＲへの結合に際して、ＬＤＬをエンドサイトーシスを介して内在化し、エンドソームに移動させ、そこで、ｐＨの降下は受容体をＬＤＬから解離させる。受容体は細胞の表面まで戻ってリサイクルされ、他方、ＬＤＬはリソソームに移動され、そこで、粒子は分解される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１，ｐｐ．１−３９（１９８５））。ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、開示されたペプチドと共に用いる場合、ＡｐｏＥについて本出願を通じて記載されるように改変、および／または修飾することもできる。例えば、ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、開示された脂質会合ペプチドと共に用いることができ、ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている。加えて、ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインがスクランブル化され、逆向きとし、以下に記載するようにドメインがスイッチされたペプチドの一部であり得る。
開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドに用いることができる受容体結合ドメインペプチドの例を表１に掲げる。
表１におけるイタリック体の残基はヒト配列からの変化を示す。しかしながら、アミノ酸の特性は保存されている。表１中の太字−イタリック体の残基は、その位置におけるヒト配列からの差を示す。
また、開示されたアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合より連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。開示された組成物に用いることができるさらなる脂質会合ペプチドは、脂質会合ペプチドのその教示について、本明細書中に参照によってその全体を援用する、米国特許出願第１１／４０７，３９０号（Ｆｏｇｅｌｍａｎら）に記載されている。例えば、米国特許出願第１１／４０７，３９０号の表２〜６の脂質会合ペプチドは、開示された組成物に用いることができる。
また、開示されたアポリポ蛋白質Ｂの受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの非限定的例を表２に掲げる。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、アセチル基およびアミノ基を用いてＮ末端を保護することもできる。
また、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは、ドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、開示されたアポリポ蛋白質Ｂの受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチド組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは、ドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。これらのペプチドは、「ドメインがスイッチされた」、「スイッチされたドメイン」、または「スイッチされた」ペプチドと呼ぶことができる。例えば、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインが、上記、および表２に記載されたものに対してドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。具体的には、脂質会合ペプチドは、前記脂質会合ペプチドが合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのＮ末端にあるように、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインに共有結合により連結されている。開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの非限定的例を表３に掲げる。
開示されたドメインがスイッチされた合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、アセチル基およびアミノ基を用いてＮ末端保護することもできる。
また、開示されたアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは、逆向きに前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。例えば、開示されたアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、受容体結合ドメインの配列、または脂質会合ペプチドの配列いずれか、または双方の配列が逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。また、開示されたアポリポ蛋白質Ｂの受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは逆向きに前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの非限定的例を表４に掲げる。
開示された逆向きの合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドもまた、アセチル基およびアミド基を用いてＮ末端およびＣ末端保護することもできる。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインはスクランブル化されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。例えば、配列番号５８のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。また、アポリポ蛋白質Ｂの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインが前記脂質会合ペプチドに共有結合による連結されており、アポリポ蛋白質Ｂの受容体結合ドメインがスクランブル化されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、該脂質会合ペプチドはスクランブル化されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。例えば、本明細書中において、配列番号５９のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメイン、および受容体結合ドメインペプチドを含み、前記脂質結合ドメインは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、およびアポリポ蛋白質Ｅの脂質会合ペプチドよりなり、受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドの双方はスクランブル化されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。開示されたスクランブル化合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの非限定的例を表５に掲げる。
開示されたスクランブル化合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、アセチル基およびアミド基を用いてＮ末端およびＣ末端保護することもできる。開示されたスクランブル化合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、上記のように逆向きとすることもできる。
また、単一ドメイン合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。単一ドメイン合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインまたは脂質会合ペプチドよりなり得る。受容体結合ドメインまたは脂質会合ペプチドは、上記のように修飾または改変することができる。例えば、受容体結合ドメインまたは脂質会合ペプチドは変異させる、スクランブル化する、および／または逆向きにすることができる。デュアルドメインポリペプチドについて、本明細書中で開示される任意の他の修飾または改変を、単一ドメインペプチドにも用いることもできる。本明細書中で開示されたペプチドの多数の他の変種または誘導体も意図される。例えば、スクランブル化ポリペプチドを逆向きにすることもでき、またはスイッチされた向きとすることもできる。加えて、逆向きのペプチドをスイッチされた向きとすることができる。開示されたペプチドの全ての他の組み合わせも考えられる。該ペプチドの非限定的例が本明細書中に記載されている（例えば、表１〜５参照）。本明細書中で用いる、用語「アナログ」は「変種」および「誘導体」と相互交換可能に用いられる。変種および誘導体は当業者によく理解されており、アミノ酸配列の修飾が関与し得る。そのようなアミノ酸配列の修飾は、典型的には、３つのクラス、すなわち、実質型変種、挿入型変種、または欠失型変種のうちの１以上に該当する。挿入はアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一アミノ酸残基または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入型は、通常は、例えば、１〜４の残基の順序で、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さな挿入である。これらの変種は、通常、蛋白質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発させ、それにより、変種をコードするＤＮＡを生じさせ、その後、該ＤＮＡを組換え細胞培養において発現させることによって用意される。公知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位において置換変異を行うための技術はよく知られており、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発である。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものであるが、一度に多数の異なる位置において起こり得る。置換、欠失、挿入またはその任意の組み合わせを合わせて、最終の誘導体またはアナログに到達することができる。置換変種は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。そのような置換が、一般には、表６および７にしたがってなされ、保存的置換と呼ぶ。
機能または免疫学的同一性の実質的変化は、表６中のそれよりも保存的でない置換を選択する、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはらせん立体配座としての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対してそれらの効果がより有意に異なる残基を選択することによってなされる。一般に、蛋白質特性の最大の変化を生じさせると予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルに対して（またそれによって）置換される；トリプトファン、チロシニル（ｂ）システインまたはプロリンが任意の他の残基に対して（またはそれによって）置換される、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルが電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアルパルチルに対して（またはそれによって）置換される、（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しないもの、例えば、この場合はグリシンに対して（またはそれによって）置換される、または（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数を増大させる置換である。
本明細書中における開示される蛋白質の変種および誘導体を定義する１つの方法は、それらを、特定の公知の配列に対する相同性／同一性の点で定義することであると理解される。本明細書中で具体的に引用される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドに対して少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％相同性を有する、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、および本明細書中に開示された他の蛋白質またはペプチドの変種を具体的に開示する。当業者であれば、どのようにして２つの蛋白質の相同性を決定するかを容易に理解する。
本明細書中で種々のポリペプチドおよびポリペプチド配列が検討される際、それらのポリペプチド配列をコードすることができる核酸もまた開示することは理解される。これは、具体的ポリペプチド配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のポリペプチド配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびに蛋白質配列の開示された変種および誘導体をコードする、縮重核酸を含めた全ての核酸を含むであろう。かくして、本明細書中において、各特定の核酸配列は記載されない場合があるが、各々およびあらゆる配列は事実開示され、開示されたポリペプチド配列を通じて本明細書中に記載されると理解される。
ブロッキング／保護基およびＤ残基
本明細書中に記載される種々の組成物は保護基無しで示すことができる一方で、（例えば、特に経口投与のための）ある実施態様においては、それらは１、２、３、４以上の保護基を有することができる。保護基は、ペプチドのＣ末端および／またはＮ末端、および／またはペプチドを含む１以上の内部残基にカップリングさせることができる（例えば、構成要素のアミノ酸上の１以上のＲ基をブロックすることができる）。かくして、例えば、ある実施態様においては、本明細書中に記載される任意のペプチドは、例えば、アミノ末端を保護するアセチル基および／またはカルボキシル末端を保護するアミド基を有することができる。そのような「デュアル保護ペプチド」の１つの例はＡｃ−ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ−ＮＨ２（ブロッキング基を有する配列番号１２）であり、これらの保護基のいずれかまたは双方は、本明細書中に記載されるように、脱離、および／またはもう１つの保護基で置換することができる。 特定の理論によって拘束されないが、保護、特に、本発明の主題のペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の保護は、経口送達を改良することができ、また血清半減期を増大させることができるというのが本発明の１つの発見である。
広く多数の保護基がこの目的に適している。そのような基には、限定されるものではないが、アセチル基、アミド基、およびアルキル基が挙げられ、アセチル基およびアルキル基は、Ｎ末端保護のために特に好ましく、アミド基は、カルボキシル末端保護のために好ましい。例えば、保護基は、限定されるものではないが、脂肪酸におけるようなアルキル鎖、プロペオニル、ホルミルその他を含むことができる。カルボキシル保護基はアミド、エステルを含み、エーテル形成保護基をも用いることもできる。例えば、アセチル基を用いてアミノ末端を保護することができ、アミド基を用いて、カルボキシル末端を保護することができる。これらのブロッキング基はペプチドのらせん形成傾向を増強させる。さらなるブロッキング基は種々の長さのアルキル基、例えば、ｎが１〜約２０、好ましくは約１〜約１６または１８、より好ましくは約３〜約１３、最も好ましくは約３〜約１０の範囲である式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯを有する基を含む。
加えて、保護基は、限定されるものではないが、脂肪酸におけるようなアルキル鎖、プロペオニル、ホルミルその他を含む。例えば、カルボキシル保護基はアミド基、エステル基、およびエーテル形成保護基を含むことができる。これらのブロッキング基はペプチドのらせん形成傾向を増強させることができる。ブロッキング基は、種々の長さのアルキル基、例えば、ｎが約３〜約２０、好ましくは約３〜約１６、より好ましくは約３〜約１３、最も好ましくは約３〜約１０の範囲である式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯを有する基を含むことができる。
他の保護基は、限定されるものではないが、Ｆｍｏｃ、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボキシル基、９−フルオレンカルボキシル基、９−フルオレノン−１−カルボキシル基、ベンジルキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（Ｍｅｂｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）を含む。
保護／ブロッキング基は、当業者によく知られており、そのような基を本発明のペプチドを含む適当な残基へカップリングさせる方法も同様である（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｙｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，Ｎ．Ｊ．参照）。例えば、アセチル化は、ペプチドが無水酢酸を用いる樹脂の上にある場合、合成の間に達成することができる。アミド保護は、合成のための適切な樹脂の選択によって達成することができる
本明細書中に開示された組成物はまた、本明細書中に記載されるように１以上のＤ−形態（レボよりはむしろデキストロ）アミノ酸を含むこともできる。例えば、少なくとも２つのエナンチオマーアミノ酸、少なくとも４つのエナンチオマーアミノ酸、または少なくとも８または１０のエナンチオマーアミノ酸は「Ｄ」形態のアミノ酸であり得る。加えて、本明細書中に記載されるペプチドのあらゆる他の、またはあらゆるアミノ酸（例えば、あらゆるエナンチオマーアミノ酸）でさえＤ−形態アミノ酸である。
加えて、エナンチオマーアミノ酸の少なくとも５０％は「Ｄ」形態であり得、エナンチオマーアミノ酸の少なくとも８０％は「Ｄ」形態であり、エナンチオマーアミノ酸の少なくとも９０％、または全てのエナンチオマーアミノ酸でさえが「Ｄ」形態のアミノ酸であり得る。
ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは当該分野で公知の任意の方法によって製造することができる。開示されたポリペプチドを製造する１つの方法は、蛋白質化学技術によって、２以上のアミノ酸残基、ペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結させることである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学物質またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化物質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）いずれかを用い、現在入手可能な実験室器具を用いて化学的に合成される。ペプチドまたはポリペプチドは合成することができ、その合成樹脂から切断することはできず、他方、ペプチドまたは蛋白質の他の断片は合成でき、引き続いて、樹脂から切断することができ、それにより、末端基を露出させ、これは、他の断片上に機能的にブロックキングすることができる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つの断片は、各々、それらのカルボキシル末端およびアミノ末端においてペプチド結合を介して共有結合により連結することができる（Ｇｒａｎｔ ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ Ｍ ａｎｄ Ｔｒｏｓｔ Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドはインビボにて独立して合成される。一旦単離されれば、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを連結させて、同様なペプチド縮合反応を介してペプチドまたはその断片を形成することができる。
例えば、クローン化ペプチド断片または合成ペプチド断片の酵素のライゲーションによって、比較的短いペプチド断片が連結されてより大きなペプチド断片、ポリペプチドまたは全蛋白質ドメインを生じさせることができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然化学ライゲーションを利用して、より短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成により構築することができる。この方法は２工程化学反応よりなる（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。最初の工程は、保護されていない合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有するもう１つの保護されていないペプチドセグメントとを化学選択的に反応させて、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結中間体を得ることである。反応条件の変化なしで、この中間体は自然発生的で迅速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位において天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｍ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：６６２３−３０（１９９４））。
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的に連結され、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメントの間に形成された結合は非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、蛋白質ドメインのアナログ、ならびに十分な生物学的活性を有する大量の比較的純粋な蛋白質を合成するのに用いられている（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ Ｒｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
抗体
また、本明細書中に開示する合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上に特異的に結合する単離された抗体、抗体断片およびその抗原結合断片も本明細書中に開示する。所望により、単離された抗体、抗体断片、またはその抗原結合断片は中和抗体であり得る。本明細書中に開示された抗体、抗体断片および抗原結合断片は、本明細書中に開示する方法を用いて同定することができる。例えば、本発明のポリペプチドに結合する抗体は、本明細書中の他の個所に記載される抗原マイクロアレイを用いて単離することができる。
用語「抗体」は本明細書中においては広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方を含む。無傷免疫グロブリン分子に加えて、免疫グロブリンの抗体断片またはポリマー、および免疫グロブリンまたはその断片のヒトまたはヒト化バージョンも、それらが本明細書中に開示するポリペプチドと相互作用するその能力について選択される限りは、開示される。「抗体断片」は完全な抗体の一部である。完全な抗体とは、２つの完全な軽鎖および２つの完全な重鎖を有する抗体をいう。抗体断片は１以上の鎖の全てまたは一部を欠如する。抗体断片の例は、限定されるものではないが、半抗体および半抗体の断片を含む。半抗体は単一の軽鎖および単一の重鎖から構成される。半抗体および半抗体の断片は、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する抗体または抗体断片を還元することによって生じさせることができる。そのような抗体断片は還元抗体と呼ばれる。還元抗体は露出されかつ反応性のスルフヒドリル基を有する。これらのスルフヒドリル基は、反応性化学基、または抗体断片への生体分子のカップリングとして用いることができる。好ましい半抗体断片はＦ（ａｂ）である。抗体または抗体断片のヒンジ領域は、軽鎖が終了し、重鎖が続く領域である。
抗体複合体に用いられる抗体断片は抗原に結合することができる。好ましくは、抗体断片は抗原に対して特異的である。抗体または抗体断片は、それが有意により大きな親和性でもって他のエピトープよりも１つのエピトープに結合する場合、抗原に対して特異的である。抗原は任意の分子、化合物、組成物、または抗体断片が結合することができるその部分であり得る。分析物は目的の任意の分子、化合物または組成物であり得る。例えば、抗原は本発明のポリヌクレオチドであり得る。抗体または抗体断片は、本明細書中に記載されるインビトロアッセイを用い、または同様な方法によってその所望の活性についてテストすることができ、その後、そのインビボ治療活性または予防活性を公知の臨床試験方法にしたがってテストする。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で用いる場合、抗体の実質的に均一な集団から得られた抗体を指し、すなわち、該集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットに存在し得る可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。また、重鎖もしくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、他方、鎖の残りは別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に同一であるか、または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の拮抗活性を呈する限りはそのような抗体の断片も開示する（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。
開示されたモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を生じる任意の手法を用いて作成することができる。例えば、開示されたモノクローナル抗体が、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されたもののようなハイブリドーマ方法を用いて用意することができる。ハイブリドーマ方法においては、マウスまたは他の適当な宿主動物を、典型的には、免疫化剤で免疫化して、該免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生し、または産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球は、例えば、本明細書中で記載されるＨＩＶ Ｅｍｖ−ＣＤ４−コ−受容体複合体を用いてインビトロにて免疫化してもよい。
また、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）に記載されるもののような組換えＤＮＡ方法によって作成することもできる。開示されたモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、慣用的な手法を用いて容易に単離し、配列決定することができる。抗体または活性な抗体断片のライブラリーもまた、例えば、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，８０４，４４０号、およびＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，０９６，４４１号に記載されているように、ファージディスプレイ技術を用いて作成してスクリーニングすることもできる。
インビトロ方法もまた、一価抗体を調製するのに適している。抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または抗体の他の抗原結合部分を生じさせるための抗体の消化は、当該分野で公知のルーチン的な技術を用いて達成することができる。例えば、消化はパパインを用いて行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されており、一価抗体を調製するための抗体のパパイン消化の教示について、本明細書中に参照によってその全体を援用する。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂ断片とよばれる２つの同一の抗原結合断片を生じ、各々は単一の抗原結合部位、および残存Ｆｃ断片を有する。ペプシン処理により、２つの抗原組み合わせ部位を有し、依然として、抗原を架橋することができる１つの断片が生じる。
断片は、他の配列に付着しているか否かを問わず、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または他の選択された修飾を含むこともできるが、但し、抗体または抗体断片の活性は非修飾抗体または抗体断片と比較して有意に改変され、または損なわれていないものとする。これらの修飾は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸の除去／付加、その生物寿命の増大、その分泌特徴などの改変のような、いくつかの更なる特性を提供することができる。いずれの場合においても、抗体または抗体断片は、その同族抗原への特異的結合のような生物活性特性を有しなければならない。抗体または抗体断片の機能的領域または活性領域は、蛋白質の特定の領域の変異誘発、続いての、発現されたポリペプチドの発現およびテストによって同定することができる。そのような方法は当業者に容易に明らかであり、抗体または抗体断片をコードするアミノ酸の部位特異的変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
本明細書中で用いる、用語「抗体」または「抗体類」は、ヒト抗体またはヒト化抗体をも指し得る。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラットまたはウサギに由来するもの）はヒトにおいて本来抗原性であり、かくして、ヒトに投与した場合に望ましくない免疫応答を生起させ得る。したがって、該方法におけるヒト抗体またはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を低くする役割を果たす。
開示されるヒト抗体は任意の技術を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のための技術の例は、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，１９９１）によって記載されるものを含む。ヒト抗体（およびその断片）は、ファージディスプレイライブラリーを用いて産生することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１，１９９１）。
開示されるヒト抗体はトランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫化に応答して、ヒト抗体の十分なレパートリーを産生することができるトランスジェニック突然変異マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）参照）。具体的には、これらのキメラマウスおよび生殖系突然変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体の産生の完全な阻害がもたらされ、そのような生殖系突然変異マウスへのヒト生殖系抗体遺伝子アレイの成功した導入の結果、抗原のチャレンジに際してヒト抗体の産生がもたらされる。所望の活性を有する抗体は、本明細書中に記載されるようなＥｎｖ−ＣＤ４−コ−受容体複合体を用いて選択される。
所望により、開示されたヒト抗体はヒトＢ細胞のエプスタイン・バール・ウイルス形質転換の方法を用いて記憶Ｂ細胞から作成することができる（例えば、記憶Ｂ細胞からのヒトモノクローナル抗体を作成するための方法のその教示については、本明細書に参照によってその全体を援用する、Ｔｒｉａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｌｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ：ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ Ａｕｇ；１０（８）：８７１−５．（２００４）参照）。簡単に述べれば、通常の感染で生存した被験体からの記憶Ｂ細胞を単離し、照射された単核細胞、および記憶Ｂ細胞のポリクローナルアクチベータとして作用するＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下で、ＥＢＶで不滅化する。記憶Ｂ細胞を培養し、特定の抗体の存在について分析する。次いで、クローニングの効率を増大させるためにＣｐＧ２００６を加えて、照射された単核細胞の存在下で限界希釈法によって、所望の特異性の抗体を産生する培養からのＥＢＶ−Ｂ細胞をクローン化し、培養する。ＥＢＶ−Ｂ細胞の培養の後に、モノクローナル抗体を単離することができる。そのような方法は、（１）生涯にわたって安定であって、末梢血液から容易に単離することができる記憶Ｂリンパ球の不滅化によって産生される抗体、および（２）通常の感染で生存した感作天然宿主から単離された抗体を提供し、かくして、実験動物の免疫化の必要性を排除し、これは異なる感受性を示すことができ、したがって、異なる免疫応答を示すことができる。
抗体ヒト化技術は、一般に、抗体分子の１以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術の使用を含む。したがって、非ヒト抗体（またはその断片）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体からの抗原結合部位の一部を含有するキメラ抗体または抗体鎖（またはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、もしくは抗体の他の抗原結合部分のようなその断片）である。
ヒト化抗体を作り出すためには、レシピエント（ヒト）抗体分子の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基を、所望の抗原結合特徴（例えば、標的抗原に対するある特定のレベルの特異性および親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１以上のＣＤＲからの残基によって置き換える。いくつかの例において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基を対応する非ヒト残基によって置き換える。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見出されない残基も含有してもよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源由来のヒト化抗体に導入された１以上のアミノ酸残基を有する。実際は、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および、場合により、いくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体における同様な部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト抗体の少なくとも一部を含有する（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８），およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体を、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法にしたがい、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって作成することができる。ヒト化抗体を産生するのに用いることができる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．）、および米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．）にも記載されている。本明細書中に開示する抗体は被験体に投与することもできる。抗体送達のための核酸アプローチも存在する。本明細書中に開示するポリペプチドに対する広く中和する抗体および抗体断片もまた、被験体自身の細胞が核酸を取り込み、コードされた抗体または抗体断片を産生し、分泌するように、抗体または抗体断片をコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）として被験体に投与することもできる。
核酸およびベクター
また、本発明は、本明細書中に開示する合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの任意の１以上をコードする単離された核酸に関する。例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはｃＤＮＡを含む、核酸を開示する。本明細書中に開示するポリペプチドをコードする核酸を作成するのは当業者にとってルーチン的なものであろう。というのは、ポリペプチドを構成する各アミノ酸に対するコドンが知られているからである。
開示された核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドから構成される。これらおよび他の分子の非限定的例は本明細書中で考察する。例えば、ベクターが細胞で発現される場合、発現されたｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、ＧおよびＵから構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因性送達を通じて細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は、細胞環境においてアンチセンス分子の分解を低下させるヌクレオチドアナログより構成されるのが有利であろうと理解される。
本発明のヌクレオチドは１以上のヌクレオチドアナログまたは置換を含むことができる。ヌクレオチドアナログは、塩基部位、糖部位またはリン酸部位に対していくつかのタイプの修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部位への修飾は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然および合成修飾、ならびにウラシル−５−イル（Ψ）、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イルのような異なるプリン塩基またはピリミジン塩基を含むだろう。修飾された塩基は、限定されるものではないが、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。さらなる塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に見出すことができる。２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めた、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンのようなある特定のヌクレオチドアナログ。５−メチルシトシンは二本鎖形成の安定性を増大させることができる。しばしば、塩基修飾は、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルのような糖修飾と組み合わせて、増大した二本鎖安定性のようなユニークな特性を達成することができる。一定範囲の塩基修飾を詳細に記載する、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号のような多数の米国特許がある。これらの特許の各々を本明細書に参照によって援用する。
また、ヌクレオチドアナログは糖部位の修飾を含むこともできる。糖部位への修飾はリボースおよびデオキシリボースの天然修飾、ならびに合成修飾を含むだろう。糖修飾は、限定されるものではないが、２’位置における以下の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルまたはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルを含み、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換、または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。２’糖修飾は、限定されるものではないが、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含み、ｎおよびｍは１〜約１０である。
２’位置における他の修飾は、限定されるものではないが、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様な特性を有する他の置換基を含む。同様な修飾は、糖上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置または２’−５’連結オリゴヌクレオチド、および５’末端ヌクレオチドの５’位置において行ってもよい。修飾された糖は、ＣＨ２およびＳのような、架橋環酸素において修飾を含有するものも含むだろう。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位のような糖ミメティックスも有してよい。第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号のようなそのような修飾された糖の構造の調製を教示する多数の米国特許があり、修飾およびそれに関連する方法のその教示について、その各々を本明細書に参照によってその全体を援用する。
ヌクレオチドアナログはリン酸部位において修飾することもできる。修飾されたリン酸部位は、限定されるものではないが、２つのヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートを含有するように修飾することができるものを含む。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸結合または修飾されたリン酸結合は３’−５’結合または２’−５’結合を介することができ、該結合は３’−５’〜５’−３’または２’−５’〜５’−２’のような逆転した極性を含有することができると理解される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が修飾されたリン酸を含有するヌクレオチドをどのようにして製造し、用いるかを教示しており、限定されるものではないが、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号を含み、修飾およびそれに関連する方法のその教示について、その各々を本明細書に参照によってその全体を援用する。
ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドと同様な機能的特性を有する分子であるが、それらはペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなリン酸部位を含有しない。ヌクレオチド代替物は、ワトソン−クリックまたはフーグスチンの様式で核酸を認識するが、リン酸部位以外の部位を通じて一緒に連結される分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用する場合に、二重らせん型構造に適合させることができる。
ヌクレオチド代替物は、リン酸部位または糖部位が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド代替物は標準リン原子を含有しない。リン酸についての代替物は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド結合であり得る。これらは、（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成された）モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格、ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものを含む。多数の米国特許がこれらのタイプのリン酸代替物をどのようにして製造し、用いるかを開示しており、限定されるものではないが、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号を含み、修飾およびそれに関連する方法のその教示について、その各々を本明細書に参照によってその全体を援用する。
また、ヌクレオチド代替物においては、ヌクレオチドの糖およびリン酸部位は、例えば、アミドタイプの結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができると理解される。米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号はどのようにしてＰＮＡ分子を製造し、それを用いるかを教示しており、修飾およびそれに関連する方法のその教示については、その各々を本明細書に参照によってその全体を援用する（また、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７−１５００（１９９１）参照）。
また、他のタイプの分子（複合体）をヌクレオチドまたはヌクレオトドアナログに連結させて、例えば、細胞取り込みを高めることも可能である。複合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結させることができる。そのような複合体は、限定されるものではないが、コレステロール部位（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，３９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｎｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部位（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキサアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部位（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）のような脂質部位を含む。
多数の米国特許がそのような複合体の調製を教示しており、限定されるものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号を含み、修飾およびそれに関連する方法のその教示について、その各々を本明細書に参照によってその全体を援用する。
ポリペプチドに関して本明細書中で他の個所で記載されるような相同性を計算する同一の方法が、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６に開示されるアルゴリズムによって、核酸について得ることができ、少なくとも核酸アラインメントに関する物質について本明細書に参照によって援用する。
また、本明細書中に開示するポリヌクレオチド配列と相互作用することができる、プライマーおよびプローブを含めた組成物を開示する。例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上をコードすることができる核酸の増幅が可能なプライマー／プローブを開示する。開示されたプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅反応を支援することができる。典型的には、プライマーは配列特異的な様式で延長され得るだろう。配列特異的な様式でのプライマーの延長は、プライマーがハイブリダイズされるかそうでなければ会合される核酸分子の配列または組成物が、プライマーの延長によって生じる生成物の組成物または配列を方向付けし、またはそれに影響する任意の方法も含む。したがって、配列特異的な様式でのプライマーの延長は、限定されるものではないが、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ延長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写を含む。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。ある実施態様において、プライマーは、ＰＣＲまたは直接的配列決定のようなＤＮＡ増幅反応で用いられる。ある実施態様においては、プライマーを非酵素技術を用いて延長することもでき、例えば、プライマーを延長するのに用いるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それらが化学的に反応して、配列特異的な様式でプライマーを延長するように修飾されると理解される。典型的には、開示されたプライマーは本明細書中で開示するポリヌクレオチド配列、または本明細書中に開示するポリヌクレオチド配列の領域とハイブリダイズするか、それらは本明細書中に開示するポリヌクレオチド配列の相補体、または本明細書中に開示するポリヌクレオチド配列の領域の相補体とハイブリダイズする。
ある実施態様において本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列との相互作用のためのプライマーまたはプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅またはプローブもしくはプライマーの単純なハイブリダイゼーションのようなプライマーの所望の酵素的操作を支持する任意のサイズとすることができる。典型的なプライマーまたはプローブは、少なくとも６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長またはその間の任意の長さであろう。
また、開示されるポリヌクレオチドと相互作用することができる機能的核酸も開示する。機能的核酸は、標的分子の結合、または特異的反応の触媒のような特異的機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は以下のカテゴリーに分けることができ、それは限定的なことを意味しない。例えば、機能的核酸はアンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、トリプレックス形成性分子、および外部ガイド配列を含む。機能的核酸分子は標的分子によって保有される特異的活性の影響因子、阻害因子、調節因子、および刺激因子として作用することができるか、または機能的核酸分子は任意の他の分子から独立してデノボ活性を保有することができる。
機能的核酸分子は、ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、ポリペプチド鎖または炭水化物鎖のような任意のマクロ分子と相互作用することができる。かくして、機能的核酸は本明細書中に開示するポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡもしくは本明細書中に開示するポリヌクレオチド配列のゲノムＤＮＡと相互作用することができるか、またはそれらは本明細書中に開示するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと相互作用することができる。しばしば、機能的核酸は、標的分子および機能的核酸分子の間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況において、機能的核酸分子および標的分子の間の特異的認識は、機能的核酸分子および標的分子の間の配列相同性に基づくものでなく、むしろ、特異的認識が起こるのを可能とする３次構造の形成に基づく。
開示されるポリヌクレオチドと相互作用するアンチセンス分子が本明細書中で開示する。アンチセンス分子は、カノニカル塩基対合または非カノニカル塩基対合いずれかを通じて標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子および標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を通じて標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写または複製のような、標的分子に通常起こるだろうプロセッシング機能を中断させるように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによるアンチセンス効率の最適化のための多数の方法が存在する。例示的な方法は、インビトロ選択実験、およびＤＭＳおよびＤＥＰＣを用いるＤＮＡ修飾研究であろう。アンチセンス分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）でもって標的分子に結合するのが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用を補助する方法および技術の代表的な例は、以下の米国特許の非限定的リスト、すなわち第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号、および第６，０５７，４３７号に見出すことができ、修飾およびそれに関連する方法のその教示について、その各々を本明細書に参照によってその全体を援用する。
また、開示されるポリヌクレオチドと相互作用するアプタマーも開示する。アプタマーは、標的分子と好ましくは特異的な方法で相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステムループまたはＧ−カルテットのような規定された２次構造および３次構造に折り畳まれる長さが１５〜５０塩基の範囲にある小さな核酸である。アプタマーはＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）のような小さな分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）のような大きな分子に結合することができる。アプタマーは、１０−１２Ｍ未満の標的分子からのｋｄでもって非常に密接に結合することができる。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄでもって標的分子に結合するのが好ましい。アプタマーは非常に高度な特異性でもって標的分子に結合することができる。例えば、結合親和性において、標的分子、および分子上の単一の位置のみが異なる別の分子の間で１０，０００倍よりも大きな差を有するアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーはバックグラウンド結合分子とのｋｄよりも少なくとも１０分の１、１００分の１、１０００分の１、１０，０００分の１、または１００，０００分の１の標的分子とのｋｄを有するのが好ましい。例えば、ポリペプチドについて比較を行う場合、バックグラウンド分子は異なった分子であるのが好ましい。例えば、アプタマーの特異性を決定する場合、バックグラウンド蛋白質はｅｆ−１αであり得る。種々の異なる標的分子に結合するためのアプタマーをどのようにして製造し、使用するかの代表的な例は、米国特許の以下の非限定的リストに見出すことができる：第５，４７６，７６６号、第５，５０３，９７８号、第５，６３１，１４６号、第５，７３１，４２４号、第５，７８０，２２８号、第５，７９２，６１３号、第５，７９５，７２１号、第５，８４６，７１３号、第５，８５８，６６０号、第５，８６１，２５４号、第５，８６４，０２６号、第５，８６９，６４１号、第５，９５８，６９１号、第６，００１，９８８号、第６，０１１，０２０号、第６，０１３，４４３号、第６，０２０，１３０号、第６，０２８，１８６号、第６，０３０，７７６号、および第６，０５１，６９８号。
また、開示されるポリヌクレオチドと相互作用するリボザイムも開示する。リボザイムは、化学反応を分子内または分子間のいずれかで触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、かくして、触媒的核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒するのが好ましい。ハンマーヘッドリボザイム（例えば、限定されるものではないが、以下の米国特許：第５，３３４，７１１号、第５，４３６，３３０号、第５，６１６，４６６号、第５，６３３，１３３号、第５，６４６，０２０号、第５，６５２，０９４号、第５，７１２，３８４号、第５，７７０，７１５号、第５，８５６，４６３号、第５，８６１，２８８号、第５，８９１，６８３号、第５，８９１，６８４号、第５，９８５，６２１号、第５，９８９，９０８号、第５，９９８，１９３号、第５，９９８，２０３号、Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ ＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９８５８０５８、Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ ＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９８５８０５７、およびＬｕｄｗｉｇ ａｎｄ ＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９７１８３１２）、ヘアピンリボザイム（例えば、限定されるものではないが、以下の米国特許：第５，６３１，１１５号、第５，６４６，０３１号、第５，６８３，９０２号、第５，７１２，３８４号、第５，８５６，１８８号、第５，８６６，７０１号、第５，８６９，３３９号、および第６，０２２，９６２号）、およびテトラヒメナリボザイム（例えば、限定されるものではないが、以下の米国特許：第５，５９５，８７３号および第５，６５２，１０７号）のような、天然系に見いだされるリボザイムに基づいてヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼタイプの反応を触媒する多数の異なるタイプのリボザイムがある。また、天然系に見出されないが、デノボにて特異的反応を触媒するように操作された多数のリボザイムもある（例えば、限定されるものではないが、以下の米国特許：第５，５８０，９６７号、第５，６８８，６７０号、第５，８０７，７１８号および第５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合，及びそれに続く切断を通じて核酸基質を切断する。この認識は、しばしば、カノニカル塩基対相互作用または非カノニカル塩基対相互作用に主に基づく。この特性によって、リボザイムは、核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補となる。なぜならば、標的基質の認識は標的基質配列に基づくからである。種々の異なる反応を触媒するリボザイムをどのようにして製造し、使用するかの代表的例は、以下の米国特許の非限定的例に見出すことができる：第５，６４６，０４２号、第５，６９３，５３５号、第５，７３１，２９５号、第５，８１１，３００号、第５，８３７，８５５号、第５，８６９，２５３号、第５，８７７，０２１号、第５，８７７，０２２号、第５，９７２，６９９号、第５，９７２，７０４号、第５，９８９，９０６号、および第６，０１７，７５６号。
また、開示されたポリヌクレオチドと相互作用する三重鎖形成性機能的核酸分子も開示する。三重鎖形成性機能的核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、三重鎖とよばれる構造が形成され、ワトソン−クリックおよびフーグスチン塩基対合の双方に依存して、複合体を形成するＤＮＡの３本の鎖が存在する。三重鎖分子が好ましい。なぜならば、それは高い親和性および特異性でもって標的領域に結合できるからである。三重鎖形成性分子は１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄでもって標的分子に結合するのが好ましい。種々の異なる標的分子に結合する三重鎖形成性分子をどのように製造し、使用するかの代表的な例は、以下の米国特許の非限定的リストに見出すことができる：第５，１７６，９９６号、第５，６４５，９８５号、第５，６５０，３１６号、第５，６８３，８７４号、第５，６９３，７７３号、第５，８３４，１８５号、第５，８６９，２４６号、第５，８７４，５６６号、および第５，５６２，４２６号。
また、開示されるポリヌクレオチドとで複合体を形成する外部ガイド配列も開示する。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子に結合する分子であって、この複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅ Ｐによって認識される。ＥＧＳは、選択されるＲＮＡ分子を特異的に標的化するように設計することができる。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内でトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセッシングするのを補助する。細菌ＲＮＡｓｅ Ｐを動員して、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを用いることによって実質的に任意のＲＮＡ配列を切断することができる（ＹａｌｅによるＷＯ ９２／０３５６６、およびＦｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
同様に、ＲＮＡの真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ Ｐ指向性切断を利用して、真核生物細胞内の所望の標的を切断することができる（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８００６−８０１０（１９９２）；ＹａｌｅによるＷＯ ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ ９５／２４４８９；Ｙｕａｎ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，ＥＮＢＯ Ｊ １４：１５９−１６８（１９９５）、およびＣａｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒａｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１（１９９５））。種々の異なる標的分子の切断を容易とするためのＥＧＳ分子をどのようにして製造し、使用するのかの代表的例は、以下の米国特許の非限定的リストに見出すことができる。第５，１６８，０５３号、第５，６２４，８２４号、第５，６８３，８７３号、第５，７２８，５２１号、第５，８６９，２４８号および第５，８７７，１６２号。
また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物を含有するポリヌクレオチドも開示する。ＰＮＡは、ヌクレオベースがシュードペプチド骨格に付着したＤＮＡミミックである（Ｇｏｏｄ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１９９７；７（４）４３１−３７）。ＰＮＡは、伝統的に、ＲＮＡまたはＤＮＡを用いてきた多数の方法に利用することが可能である。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡまたはＤＮＡ配列よりも諸技術において良好に行われ、ＲＮＡまたはＤＮＡには無い用途がある。特徴付けを行う方法、および使用する方法を含めたＰＮＡの検討はＣｏｒｅｙによって提供されている（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７ Ｊｕｎｅ；１５（６）：２２４−９）。このように、ある実施態様においては、開示されたポリヌクレオチドに基づいてｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的なＰＮＡ配列を調製することができ、そのようなＰＮＡ組成物を用いて、開示されたポリヌクレオチド転写ｍＲＮＡの翻訳を調節し、改変し、減少させ、または低下させ、それにより、そのようなＰＮＡ組成物が投与される宿主細胞において開示されたポリヌクレオチドの活性のレベルを改変することができる。
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置き換える２−アミノエチル−グリシン結合を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ．６，１９９１；２５４（５０３７）：１４９７−５００；Ｈａｎｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｎｏｖ．２７，１９９２；２５８（５０８７）：１４８１−５；Ｈｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｊａｎｕａｒｙ；４（１）：５−２３）。この化学構造は３つの重要な結果を有する。第一に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは対照的に、ＰＮＡが中性の分子である。第二に、ＰＮＡはアキラルであり、これは、立体選択的合成を開発する必要性を回避する。および第三に、変更メリーフィールド法を含めた他の方法が用いられてきたが、ＰＮＡ合成は固相ペプチド合成のための標準的なＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルを用いる。ＰＮＡモノマーまたは既存のオリゴマーはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡ合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを用いる簡単なものである（Ｎｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９５ Ａｐｒｉｌ；３（４）：４３７−４５）。手動プロトコルそれ自体は化学的に修飾されたＰＮＡの産生、または密接に関連するＰＮＡのファミリーの同時合成に役に立つ。
ペプチド合成に関しては、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択された配列の特性に依存する。例えば、理論的にはＰＮＡはヌクレオチド塩基の任意の組み合わせを取り込むことができるが、隣接するプリンの存在は生成物における１以上の残基の欠失をもたらし得る。この困難性の予測して、隣接するプリンを有するＰＮＡの産生においては、不十分に付加される可能性のある残基のカップリングを反復すべきであることが提案される。これに続いて、逆相高圧液体クロマトグラフィーによるＰＮＡの精製を行うべきであり、ペプチドの合成の間で観察るのと同様な生成物の収率および純度を堤供する。
所与の用途のためのＰＮＡの修飾は、固相合成の間にアミノ酸をカップリングさせることによって、またカルボン酸基を含有する化合物を露出されたＮ末端アミンに結合させることによって達成することができる。あるいは、導入されたリシンまたはシステインにカップリングさせることによって、合成後にＰＮＡを修飾することができる。ＰＮＡを修飾することができる容易性は、良好な溶解性、または特定の機能的要件のための最適化を促進する。一旦合成されれば、ＰＮＡおよびそれらの誘導体が何であるかは、質量分析によって確認することができる。いくつかの研究においてＰＮＡの修飾を行い、それを利用している（例えば、Ｎｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９５ Ａｐｒｉｌ；３（４）：４３７−４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．１９９５ Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ；１（３）：１７５−８３；Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９５ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１９（３）：４７２−８０；Ｆｏｏｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａｕｇ．２０，１９９６；３５（３３）：１０６７３−９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ａｕｇ．１１，１９９５；２３（１５）：３００３−８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｊｕｎ．６，１９９５；９２（１２）：５５９２−６；Ｂｏｆｆａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｍａｒ．１４，１９９５；９２（６）：１９０１−５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．Ａｕｇ．１５，１９９６；８８（４）：１４１１−７；Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｎｏｖ．１１，１９９７；９４（２３）：１２３２０−５；Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９７ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；２３（３）：５１２−７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子、および診断薬、生物における蛋白質の調節、および治療薬に対して感受性のある状態の治療におけるそれらの使用を論じている。
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴付ける方法はＲｏｓｅ（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｄｅｃ．１５，１９９３；６５（２４）：３５４５−９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａｐｒ．２２，１９９７；３６（１６）：５０７２−７）において論じられている。Ｒｏｓｅは毛細管ゲル電気泳動を用いて、それらの相補的オリゴヌクレオチドへのＰＮＡの結合を決定し、相対的結合動態および化学量論を測定する。同様のタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術を用いてＪｅｎｓｅｎらによって行われた。記載され、かつ当業者に明白なＰＮＡの他の適用は、ＤＮＡストランド侵入、アンチセンス阻害、突然変異分析、転写のエンハンサー、核酸精製、転写的に活性な遺伝子の単離、転写因子結合のブロッキング、ゲノム切断、バイオセンサー、インサイチュハイブリダイゼーションなどにおける使用が含まれる。
所望により、単離されたポリペプチド、または単離されたヌクレオチドは精製することもでき、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、最も好ましくは、少なくとも約９９％純粋である。「単離された」ポリペプチド、または「単離された」ポリヌクレオチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に生じるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、それが天然系におけるいくつかまたは全ての共存物質から分離されている場合、単離されている。
また、開示される組成物を調製するのに用いられる成分、ならびに本明細書中で開示された方法内で用いられる組成物それ自体も開示する。これらの、および他の物質は本明細書中に開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される際、これらの化合物の各々の種々の個々の組み合わせおよび順列ならびに集合的組み合わせおよび順列の特定の言及が明示的に開示されない場合があるが、各々は、本明細書中において、具体的に意図され、記載されていると理解される。例えば、特定のポリヌクレオチドが開示され、論じられ、かつポリヌクレオチドを含めた多数の分子に対して行うことができる多数の修飾が論じられる場合、具体的に反対のことが示されているのでない限り、ポリヌクレオチドの各々およびあらゆる組み合わせおよび順列、および可能である修飾が具体的に意図される。かくして、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラス、および組み合わせ分子Ａ−Ｄの例を開示する場合、たとえ各々が個々に引用されていなくても、各々は個々にかつ集合的に考えられ、すなわち、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆを開示されると考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示される。かくして、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループは開示されていると考えられるであろう。この概念は、限定されるものではないが、開示された組成物を製造し、および使用する方法における工程を含めた、本出願の全ての態様に適用される。かくして、実行することができる種々のさらなる工程がある場合、これらのさらなる工程の各々は、開示された方法の任意の特定の実施態様または実施態様の組み合わせにて実行することができると理解される。
本明細書中において開示された遺伝子および蛋白質の任意の公知の変種および誘導体、または生起するかもしれないものを定義する１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性の点で、変種および誘導体を定義することによるものであると理解される。具体的に開示されているのは、記載された配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント相同性を有する本明細書中に開示された遺伝子および蛋白質の変種である。当業者であれば、２つの蛋白質、または遺伝子のような核酸の相同性をどのようにして決定するかを容易に理解する。例えば、相同性は、該相同性がその最高レベルとなるように２つの配列を整列させた後に計算することができる。
相同性を計算するもう１つの方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性のための検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよび、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、または調査によって行うことができる。
相同性の同一のタイプは、核酸については、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されたアルゴリズムによって得ることができ，本文献は、例えば少なくとも核酸整列に関連する物質について本明細書中に参照によって援用する。
例えば、本明細書中で用いる、もう１つの配列に対して特定のパーセント相同性を有するとして引用された配列とは、上記した計算方法の任意かの１以上によって計算されるような引用相同性を有する配列をいう。例えば、Ｚｕｋｅｒ計算方法を用いて第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有すると計算される場合、たとえ第一の配列が任意の他の計算方法によって計算されるように第二の配列に対して８０パーセント相同性を有しなくても、第一の配列は、本明細書中で定義するように、第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する。もう１つの例として、Ｚｕｋｅｒ計算方法ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算方法の双方を用いて、第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有すると計算される場合、たとえＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒ ｍａｎ計算方法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算方法、Ｊａｅｇｅｒ計算方法、または他の計算方法のいずれかによって計算して、第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有しなくても、第一の配列は、本明細書中で定義するように、第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する。なおもう１つの例として、（実践的には、異なる計算方法は、しばしば、異なる計算された相同性パーセンテージをもたらすが）各々の計算方法を用いて、第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する場合、第一の配列は、本明細書中に定義するように、第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する。
用語ハイブリダイゼーションは、典型的には、プライマーまたはプローブと遺伝子とのような、少なくとも２つの核酸分子間の配列による相互作用を意味する。配列による相互作用は、ヌクレオチド特異的な様式で２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間で起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは配列による相互作用である。典型的には、配列による相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスチン面で起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に知られた多数の条件およびパラメーターによって影響される。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応の温度は、全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響する。
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのためのパラメーターは当業者によく知られている。例えば、いくつかの実施態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程のいずれか、または双方の温度および塩濃度の双方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）の約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）におけるハイブリダイゼーション、それに続く洗浄温度がＴｍよりも約５℃〜２０℃低いとなるように選択された温度および塩濃度の組み合わせにおける洗浄を含むことができる。温度および塩の条件は、フィルターに固定化された参照ＤＮＡの試料が目的の標識された核酸にハイブリダイズされ、次いで、異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される予備的実験において経験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションについてより高い。該条件は、ストリンジェンシーを達成するために上記したように、または当該分野で知られているように用いることができる（少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関する物質について、本明細書に参照によってその全体を援用する、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣＯｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７）。本明細書中で用いる、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションについての「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥにおける（水溶液中の）約６８℃、それに続く６８℃における洗浄である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望であれば、所望の相補性の程度が減少するにしたがって、さらに、変動性が調べられる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存して低下させることができ、。同様に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望であれば、所望の相同性が増大するにしたがって、さらに、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔ豊富さに依存して増大させることができ、、全ては当該分野で公知の通りである。
選択的ハイブリダイゼーションを規定する別の方法は、他の核酸に結合する核酸の１つの量（パーセンテージ）を考察することによる。例えば、いくつかの実施態様において、限定的な核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが非限定的な核酸に結合する場合には選択的ハイブリダイゼーション条件であろう。典型的には、非限定的プライマーは例えば、１０または１００または１０００倍過剰である。このタイプのアッセイは、限定的および非限定的プライマーの双方が、例えば、それらのｋｄより１０分の１もしくは１００分の１もしくは１０００分の１であるか、または核酸分子の１つのみが１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍であるか、または一方もしくは双方の核酸分子がそれらのｋｄより高い条件下で行うことができる。
選択的ハイブリダイゼーションを規定する別の方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素操作を促進するのに必要な条件下で、酵素的に操作されるプライマーのパーセンテージを考察することによる。例えば、いくつかの実施態様において、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、酵素操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合には選択的ハイブリダイゼーション条件となろう。例えば、酵素操作がＤＮＡ延長である場合、プライマー分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが延長される場合には選択的ハイブリダイゼーション条件であろう。好ましい条件は、操作を実行する酵素について適当であるとして製造業者によって提唱される、または当該分野で示されるものも含む。
相同性の場合と同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するために本明細書中に開示する種々の方法が存在すると理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの異なるパーセンテージを与えることができると理解されるが、別の記載がない限り、該方法うちのいずれかの方法のパラメーターを満たしていれば、それで十分であろう。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要であり、かつハイブリダイゼーションがこれらの方法うちの任意の１つにおける必要なパラメーター内で起こる限り、それは本明細書中に開示されていると考えられる。
組成物または方法がハイブリダイゼーションを集合的にまたは単一に決定するためのこれらの基準のうちの任意の１つと適合する場合、それは本明細書中に開示する組成物または方法であると当業者は考えると理解される。所望により、本発明の単離されたポリヌクレオチドの１以上は固体支持体に付着される。固体支持体は本明細書中に開示されている。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含むアレイを本明細書中に開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含むアレイも開示する。
固体支持体は、分析物または分析物結合分子のような分子を結合させることができる固体状態基材または支持体である。石灰化ナノ粒子および蛋白質のような分析物が、直接的または間接的に固体支持体と結合させることができる。例えば、分析物は固体支持体に直接的に固定化することができる。捕捉化合物のような分析物捕捉剤もまた固体支持体に固定化することができる。例えば、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸に特異的に結合することができる抗原結合剤を本明細書中に開示する。固体支持体の好ましい形態はアレイである。固体支持体の別の形態はアレイ検出器である。アレイ検出器は、多数の異なる捕捉化合物または検出化合物がアレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンでカップリングされている固体支持体である。固体支持体に用いられる固体状態基材は、分子をカップリングすることができる任意の固体材料も含むことができる。これは、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グルコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような材料を含む。固体状態基材は、薄いフィルム、膜、ビン、皿、繊維、織物、成形されたポリマー、粒子、ビーズ、ミクロ粒子、または組み合わせを含めた任意の有用な形態を有することができる。固体状態基材および固体支持体は多孔性または非多孔性であり得る。固体状態基材の好ましい形態は標準９６ウェルタイプのようなマイクロタイター皿である。好ましい実施態様において、通常ウェル当たり１つのアレイを含有するマルチウェルスライドガラスを使用することができる。この特徴は、アレイの再現性、増大したスループットおよび試料の取扱いのより大きな制御、ならびに自動化の容易性を可能とする。
異なる化合物をセットとして一緒に用いることができる。該セットは、別々の反応において別々に用いられる化合物の全てもしくはサブセットとして用いることができ、またはアレイに固定化することができる。別々に、または混合物として用いられる化合物は、例えば、固体支持体との結合、または固体支持体上への固定化を通じて物理的に分離可能であり得る。アレイは、該アレイ上の同定された、または予め規定された場所において固定化された複数の化合物を含むことができる。アレイ上の各予め規定された場所は、一般に、１つのタイプの構成要素を有することができる（すなわち、その場所における全ての構成要素は同一である）。各場所は構成要素の多数のコピーを有する。アレイにおける異なる構成要素の空間的分離は、本明細書中に開示するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの別々の検出および同定を可能とする。
好ましいものであるが、与えられたアレイは単一のユニットまたは構造である必要はない。化合物のセットは任意の数の固体支持体に分布させることができる。例えば、１つの極端な例において、各化合物は別々の反応管もしくは容器中に、または別々のビーズもしくはマイクロ粒子上に固定化されてもよい。開示された方法の異なる様式は、固体支持体に固定化される異なる構成要素（例えば、異なる蛋白質に特異的な異なる化合物）で行うことができる。いくつかの固体支持体は、固体状態基材に付着された抗体のような捕捉化合物を有することができる。そのような捕捉化合物は、石灰化ナノ粒子、または石灰化ナノ粒子上の蛋白質に対して特異的であり得る。したがって、捕捉された石灰化ナノ粒子または蛋白質は、抗体のような第２の検出化合物の結合によって検出することができる。検出化合物は、石灰化ナノ粒子上の同一または異なる蛋白質に特異的であり得る。
固体状態基材へ抗体（および他の蛋白質）を固定化する方法は十分に確立されている。固定化は、標準的な固定化化学を用いて、例えば、アミノ化表面、カルボキシル化表面またはヒドロキシル化表面への付着によって達成することができる。付着剤の例は臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジン−ビオチン、光架橋剤、エポキシドおよびマレイミドである。好ましい付着剤はヘテロ二官能性架橋剤Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）である。これらの付着剤および他の付着剤、ならびに付着で用いるそれらの使用方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，ｅｄ．（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８７）ｐａｇｅｓ ２０９−２１６および２４１−２４２、ならびにＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄｓ；Ｃｒａｉｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）に記載されており、固体状態基材へ抗体を付着させる方法について、本明細書に参照によってその全体を援用する。抗体は、抗体上の遊離アミノ基を固体状態基材内に存在する反応性側鎖基に化学的に架橋させることによって基材に付着させることができる。例えば、抗体は、架橋剤として、各々、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、またはＧＭＢＳを用いて遊離アミド基、カルボキシル基、または硫黄基を含有する基材に化学的に架橋させてもよい。この方法においては、遊離抗体を含有する水溶液を、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下で固体状態基材と共にインキュベートする。
抗体または他の蛋白質を固体状態基材に付着させるための好ましい方法は、基材をアミノシランまたはチオールシランで官能化し、次いで、官能化された基材をビススルホスクシンイミジルスベレート（ＢＳ３）のようなホモ二官能性架橋剤、またはＧＭＢＳのようなヘテロ二官能性架橋剤で活性化することである。ＤＭＢＳでの架橋では、ガラス基材を、メルカプトプロピルトリメトキシシランの溶液（９５％エタノール中１％ｖｏｌ／ｖｏｌ，ｐＨ５．５）に１時間浸漬し、９５％エタノール中ですすぎ、１２０℃にて４時間加熱することによって化学的に官能化する。チオール誘導化スライドを、１％ジメチルホルムアミド、９９％エタノール中のＧＭＢＳの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液に室温にて１時間浸漬することによって活性化する。抗体または蛋白質を活性化された基材に直接的に加え、次いで、これを２％ウシ血清アルブミンのような薬剤を含有する溶液でブロックし、風乾する。他の標準的な固定化化学は当業者に知られている。
固体支持体に固定化された成分（例えば、化合物）の各々を、好ましくは、固体支持体の異なる予め規定された領域に位置付けられる。異なる予め規定された領域の各々は、異なる領域の相互から物理的に分離することができる。固体支持体の異なる予め規定された領域間の距離は、固定されているかまたは可変とすることができる。例えば、アレイにおいては、成分の各々は相互から固定された距離に配置することができ、他方、ビーズと結合する成分が固定された空間的関係にはない。特に、多数の固体支持体ユニット（例えば、多数のビーズ）の使用の結果、可変距離がもたらされる。
成分を任意の密度にて固体支持体に結合させ、または固定化することができる。成分は、好ましくは、立方センチメール当たり４００を超える異なる成分の密度にて固体支持体に固定化される。成分のアレイは任意の数の成分を有することができる。例えば、アレイは固体支持体上に固定化された少なくとも１，０００の異なる成分、固体支持体上に固定化された少なくとも１０，０００の異なる成分、固体支持体上に固定化された少なくとも１００，０００の異なる成分、または固体支持体上に固定化された少なくとも１，０００，０００の異なる成分を有することができる。
所望により、固体支持体上の少なくとも１つのアドレスは、本明細書中に開示する任意の核酸配列において記載される配列または配列の一部である。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示する任意のペプチド配列において記載される配列または配列の部分である固体支持体も開示する。固体支持体は少なくとも１つのアドレスを含有することもでき、これは、本明細書中に開示する任意の核酸配列において記載される配列または配列の一部の変種である。固体支持体は少なくとも１つのアドレスを含有することもでき、これは、本明細書中に開示する任意のペプチド配列おいてに記載される配列または配列の一部の変種である。
また、抗体応答の多重特徴付けのための抗原マイクロアレイも開示する。例えば、抗原アレイを構築し、それを用いて、サブマイクロリットル量の生物学的試料を用いる構造的に多様な抗原に対して向けられた抗体応答の大規模多重特徴付けを行うその教示について、本明細書に参照によってその全体を援用する、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，８（３）：２９５−３０１（２００２）に記載されるようなサブマイクロリットル量の生物学的試料を用いて本明細書中に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体に対して向けられた抗体応答の大規模多重特徴付けを行うための抗原アレイおよびミニアチュア化抗原アレイを開示する。
蛋白質変種および誘導体は当業者によく理解されており、アミノ酸配列修飾に関与することができる。例えば、アミノ酸配列修飾は、典型的には、３つのクラス、すなわち置換、挿入または欠失変種の１以上に当てはまる。本発明によって一般的に包含されるポリペプチド変種は、典型的には、本明細書中に記載されるポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、（以下に記載するように決定して）少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の同一性を呈する。
また、本明細書中に記載される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターも開示する。ある実施態様において、本発明は、本発明のペプチドの少なくとも１つ、例えば、配列番号１１〜１４および１８〜６１の少なくとも１つをコードする核酸を含むベクターを提供する、例えば、制御エレメントに操作可能に連結された、本明細書中の他の個所で記載されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを開示する。
また、本明細書中の他の個所に記載されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されるか、またはトランフェクトされた宿主細胞も開示する。また、本明細書中に記載される発現ベクターを含む宿主細胞も開示する。例えば、制御エレメントに操作可能に連結された、本明細書中の他の個所に記載されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を開示する。宿主細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードする単離された核酸を含む組換え細胞も開示する。さらに、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを産生する組換え細胞を開示する。
インビトロまたはインビボのいずれかにて、核酸を細胞に送達するのに用いることができる多数の組成物および方法がある。これらの方法および組成物は大きく２つのクラス、すなわちウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系に分けることができる。例えば、核酸はエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドのような多数の直接的送達系を通じて、またはカチオン性リポソームのような細胞もしくは担体中の遺伝物質の導入を介して送達することができる。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接的拡散のような物理機械的方法を含めたトランスフェクションの適当な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８（１９９１）によって記載されている。そのような方法は当該分野でよく知られており、本明細書中に記載される組成物および方法で用いるのに容易に適合させることができる。ある特定の場合には、大きなＤＮＡ分子で特異的に機能するように該方法は変更される。さらに、これらの方法を用いて、担体の標的化特徴を用いてある種の疾患および細胞集団を標的化することができる。
発現ベクターは、遺伝子を細胞に送達するのに用いられる（例えば、プラスミド）、または遺伝子を送達するための一般的戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部として用いられる任意のヌクレオチド構築であり得る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８（１９９３））。例えば、制御エレメントに操作可能に連結された開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上をコードすることができる単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを本明細書中で開示する。
発現ベクターに存在する「制御エレメント」は、宿主細胞蛋白質と相互作用し、転写および翻訳を行うベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’未翻訳領域）である。そのようなエレメントはその強度および特異性において様々であり得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導性プロモーターを含めた任意の数の適当な転写および翻訳エレメントを用いることができる。例えば、細菌系でクローニングする場合、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファゲミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどのような誘導性プロモーターを用いることができる。哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子からのプロモーター、または哺乳動物ウイルスからのプロモーターが一般的には好ましい。ポリペプチドをコードする配列の多数のコピーを含有する細胞系を作り出す必要がある場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターは、有利には、適当な選択マーカーと共に用いることができる。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルスのようなウイルスのゲノム、または異種哺乳動物プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、便宜に、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターは、便宜に、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０（１９８２））。加えて宿主細胞または関連種からのプロモーターを用いることもできる。
エンハンサーとは、一般には、固定しない転写開始部位からの距離において機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡの配列をいう。さらに、エンハンサーはイントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））ならびにコーディング配列自体の内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））であり得る。それらは、通常、長さが１０〜３００ｂｐの間であり、シスにて機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増大させる機能を果たす。また、エンハンサーはしばしば、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有する。プロモーターは、転写の調節を媒介する応答エレメントも含有することができる。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列が今日哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェト蛋白質およびインスリン）が典型的には、一般的発現のためには真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。好ましい例は、複製起点（ＢＰ１００−２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーターまたはエンハンサーは、その機能を誘発する光または特異的化学的事象のいずれかによって特異的に活性化してもよい。系はテトラサイクリンおよびデキサメタゾンのような試薬によって調節することができる。ガンマ照射のような放射線への暴露、またはアルキル化化学療法薬物によってウイルスベクター遺伝子の発現を増強させる方法もある。
所望によりプロモーターまたはエンハンサー領域を構成的プロモーターまたはエンハンサーとして作用させて、本発明のポリヌクレオチドの発現を最大化させることができる。ある構築体においては、プロモーターまたエンハンサー領域は、たとえそれが特定の時点において特定のタイプの細胞で発現されるに過ぎなくても、全ての真核生物細胞型において活性である。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターはＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＲである。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）に用いる発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響し得る転写の終止に必要な配列も含有してもよい。これらの領域は、組織因子蛋白質をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’翻訳領域は転写終止部位も含む。転写単位はポリアデニル化領域も含有するのが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位がプロセッシングされ、ｍＲＮＡのように輸送される可能性を増大させることである。発現構築体におけるポリアデニル化シグナルの特定および使用はよく確立されている。相同ポリアデニル化シグナルは導入遺伝子構築体において用いられるのが好ましい。ある転写体因子においては、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基よりなる。
発現ベクターはマーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を用いて、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されたのが発現されているかを決定する。好ましいマーカー遺伝子はβガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光蛋白質をコードする遺伝子である。
いくつかの実施態様において、マーカーは選択マーカーであってよい。哺乳動物細胞についての適当な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。そのような選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に成功裏に導入される場合、選択圧下に置かれれば、形質転換された哺乳動物宿主細胞は生存することができる。選択的養生法の２つの広く用いられている区別されたカテゴリーがある。最初のカテゴリーは、細胞の代謝、および補充された培地から独立して成長する能力を欠如する突然変異細胞系の使用に基づく。２つの例はＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＦＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の添加なくして成長する能力を欠如する。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠如するので、補充された培地中に不足のヌクレオチドが堤供されるのでなければ、生存することができない。培地を補充することに対する代替法は、各遺伝子を欠如する細胞に無傷ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を導入することであり、かくして、それらの成長要件を改変する。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地において生存することができない。
第２のカテゴリーは、任意の細胞型に用いる選択スキームを指す優性選択であり、突然変異細胞系の使用を必要としない。これらのスキームは典型的には、宿主細胞の成長を阻止するために薬物を用いる。新規な遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を付与する蛋白質を発現し、該選択において生存するであろう。そのような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））またはヒグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を用いる。この３つの例は、真核生物制御下で細菌遺伝子を使用して、耐性を、各々、適当な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはヒグロマイシンに搬送する。他のものはネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンを含む。
本明細書中で用いる、プラスミドまたはウイルスベクターは、分解なくして、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上をコードすることができる単離されたポリヌクレオチドのような開示された核酸を細胞に輸送する薬剤であり、それが送達される細胞における遺伝子の発現を生じるプロモーターを含む。いくつかの実施態様において、本明細書中に開示する単離されたポリヌクレオチドはウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロン向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む。またベクターとして用いるのに適当なものとするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルス科も好ましい。レトロウイルスは、ネズミマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝的ペイロードすなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子を運ぶことができ、この理由で、通常に用いられるベクターである。しかしながら、それらは非増殖性細胞においてはそれほど有用なものではない。アデノウイルスベクターは比較的安定であって、取り扱うのが容易であり高い力価を有し、エアロゾル処方にて送達することができ、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、熱安定性であって、室温で貯蔵することができる。好ましい実施態様は、ウイルス抗原によって引き起こされる宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されているウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８または１０に対するコーディング領域を運ぶであろう。
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入する化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力（すなわち、遺伝子を導入する能力）を有することができる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写体、複製および包膜に必要な逆方向末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして操作される場合には、ウイルスは、典型的には、初期遺伝子の１以上が除去され、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットを、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入する。このタイプの構築体は約８ｋｂまでの外来性遺伝物質を運ぶことができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスにて発現するように操作されている細胞系によって供給される。
レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ，ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）によって記載されており、それは、本明細書に参照によってその全体を援用する。遺伝子療法のためのレトロウイルスベクターを用いる方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載されており、遺伝子療法のためのレトロウイルスベクターを用いる方法のその教示については、その教示を本明細書に参照によってその全体を援用する。
レトロウイルスは、本質的には、核酸カーゴ中にパッキングしたパッケージである。核酸カーゴはそれと共にパッケージングシグナルを運び、これは複製された娘分子がパッケージコート内に有効にパッケージングされるのを確実とする。パッケージシグナルに加えて、複製、および複製されたウイルスのパッケージングのための、シスにて必要な多数の分子がある。典型的には、レトロウイルスゲノムは、蛋白質コートの作成に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有する。標的細胞に導入されるべき外来性ＤＮＡによって典型的に置き換えられるのは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写ユニットの開始をシグナリングする配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するためのプライマー結合部位を含めた逆転写に必要なエレメント、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡストランドのスイッチをガイドする末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２のストランドの合成のためのプライミング部位としての役割を果たす３’ＬＴＲへの５’側のプリンリッチな配列、および宿主ゲノムへ挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能とするＬＴＲの末端近くの特異的配列を含有する。核酸のこの量は、各転写体のサイズに依存して、１つから多くの遺伝子の送達に十分である。挿入において他の遺伝子と共に陽性または陰性の選択可能なマーカーのいずれかを含むのが好ましい。
ほとんどのレトロウイルスベクターにおける複製機構およびパッケージング蛋白質は除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、該ベクターは典型的にはパッケージング細胞系に入れることによって作り出される。パッケージング細胞系は、複製およびパッケージング機構を含有するが、任意のパッケージングシグナルを欠如するレトロウイルスでトランスフェクトされるか、また形質転換されている細胞系である。選択されたＤＮＡを運ぶベクターがこれらの細胞系にトランスフェクトされる場合に、目的の遺伝子を含有するベクターは、ヘルパー細胞によって、シスにて提供される機構によって、複製され、新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされる。機構のためにゲノムはパッケージングされない。なぜならば、必要なシグナルを欠如するからである。
複製欠陥アデノウイルスの構築は記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７−２７４（１９８６）：Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６−１２３９（１９８６）；Ｚｈａｎｇ ‘Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ’ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、該ウイルスが他の細胞型まで拡大できる程度に制限されていることである。というのは、ウイルスは初期感染細胞内で複製できるが、新しい感染ウイルス粒子を形成できないからである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位への直接的インビボ送達後に高有効性遺伝子導入を達成することが示されている（遺伝子療法のためにレトロウイルスベクターを用いる方法のその教示については、本明細書に参照によってその教示を全体的に援用する、Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）：Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎａｔｉｃｓ ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体へ結合することによって遺伝子形質導入を達成し、その後、ウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって野生型または複製欠陥アデノウイルスと同様に内在化される（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９（１９９３））。
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものであり得、これらのバイロンはヒト２９３細胞系のような細胞系において生じる。所望により、Ｅ１およびＥ３遺伝子の双方はアデノウイルスゲノムから除去される。
細胞系に本発明のポリヌクレオチドを導入するのに用いることができる別のタイプのウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠陥があるパルボウイルスは好ましいベクターである。なぜならば、それは多くの細胞型を感染させることができ、ヒトに対して非病原性だからである。ＡＡＶタイプのベクターは約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは染色体１９に安定に挿入されることが知られている。この部位特異的一体化特性を含むベクターが好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施態様は、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋまたは緑色蛍光蛋白質ＧＦＰをコードする遺伝子のようなマーカー遺伝子を含有することができる、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって製造されるＰ４．１Ｃベクターである。
別のタイプのＡＡＶウイルスにおいて、ＡＡＶは、異種遺伝子に操作可能に連結された細胞特異的発現を指令するプロモーターを含有する少なくとも１つのカセットに近接する１対の逆方向末端反復（ＩＴＩ）を含有する。この文脈における異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに対して天然でない任意のヌクレオチド配列または遺伝子も指す。典型的にはＡＡＶおよびＢ１９コーティング領域は欠失されており、その結果、安全な、非細胞毒性のベクターをもたらす。ＡＡＶ ＩＴＲ、またはその修飾形態は、感染性および部位特異的一体化を付与するが、細胞傷害性を付与せず、プロモーターは細胞特異的発現を促進する。ＡＡＶベクターに関連する物質について、米国特許第６，２６１，８３４号を本明細書に参照によってその全体を援用する。
ウイルスおよびレトロウイルスベクターに挿入された遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを助けるためにプロモーターまたはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に対して比較的固定された場所にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含有し、上流エレメントおよび応答エレメントを含有してもよい。
他の有用な系は、例えば、複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターを含む。加えて、開示されたポリヌクレオチドは、非核酸ベースの系において標的細胞に送達することができる。例えば、開示されたポリヌクレオチドはエレクトロポレーションを通じて、またはリポフェクションを通じて、またはリン酸カルシウム沈殿を通じて送達できる。選択される送達メカニズムは、部分的には、標的化された細胞のタイプおよび送達が、例えばインビボまたはインビトロで起こっているかに依存するであろう。
かくして組成物は、開示された発現ベクターに加えて、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣコレステロール）またはアニオン性リポソームのようなリポソームのごとき脂質を含むことができる。リポソームはさらに、所望であれば、特定の細胞の標的化を容易とする蛋白質を含むことができる。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、血液に、標的器官に投与することができるか、または呼吸器系管に吸入して呼吸器系管の細胞を標的化することができる。例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよびカチオン性リポソームを含む組成物被験体の肺細胞に投与することができる、リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照。さらに、化合物は、マクロファージ、または化合物の拡散もしくはマイクロカプセルからの化合物の送達が、特異的速度または用量のために設計されるような特定の細胞型に標的化することができるマイクロカプセルの成分として投与することができる。
組成物の送達
本明細書中で記載された方法において、組成物の細胞への送達は、種々のメカニズムを介することができる。上記で定義したように、本明細書中で開示するのは、医薬上許容される担体のような担体も含んでもよい本発明の組成物を製造するのに用いることができる本明細書中に記載されたポリペプチド、核酸、ベクターおよび／または抗体のいずれかの１以上を含む組成物である。例えば、本明細書中に開示する合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を開示する。
本発明のポリペプチド、核酸、ベクターまたは抗体は溶液または懸濁液に入れることができる（例えば、ミクロ粒子、リポソームまたは細胞に取り込むことができる）。これらの組成物は、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞タイプに標的化することができる。当業者であれば、本発明の組成物でどのようにしてそのような標的化剤を製造し、使用するのかを知っている。標的化剤は、抗体接合型リポソームなどのようなビヒクル、細胞特異的リガンドを通じてのＤＮＡの受容体媒介標的化、およびインビボでの細胞の高度に特異的なレトロウイルス標的化などであり得る。任意のそのようなビヒクルは、本発明の組成物の一部であり得る。一般に、受容体は、構成的またはリガンドで誘導されたかのいずれかである、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターはクラスリン被覆小胞を介して細胞に侵入し、そこで受容体がソーティングされる酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはライソゾーム中で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄養素摂取、活性化蛋白質の除去、マクロ分子のクリアランス、ウイルスおよびトキシンの日和見的侵入、リガンドの解離および分解、リガンド結合価、およびリガンド濃縮のような種々の機能を発揮する。
例えば、本明細書中に記載された組成物は医薬上許容される担体を含むことができる。「医薬上許容される」とは、当業者によく知られているように、有効成分のいかなる分解も最小限とし、および被験体においていかなる有害副作用も最小限とするように選択されるであろう物質または担体を意味する。担体の例はジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝生理食塩水またはマルチ小胞リポソームを含む。例えば、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチドまたはＰＣ：ペプチドを本発明において担体として用いることができる。他の適当な医薬上許容される担体およびそれらの製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。典型的には、適当な量の医薬上許容される塩を製剤に用いて、製剤を等張とする。医薬上許容される担体の他の例は、限定されるものではないが、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む。溶液のｐＨは約５〜約８、または約７〜約７．５とすることができる。さらなる担体は、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような維持放出調製物を含み、そのマトリックスは、成形された製品、例えば、フィルム、（血管形成術手法の間に血管にインプラントされる）ステント、リポソームまたはミクロ粒子の形態である。ある種の担体は、例えば、投与経路、および投与される組成物の濃度に依存して、より好ましいであろうことは当業者に明らかであろう。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝溶液のような溶液を含めた、ヒトへの薬物の投与のための標準的な担体であろう。
本発明のポリペプチド、ペプチド、核酸、ベクターの意図した活性が影響を受けない限り、医薬組成物はまた担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような（本発明の組成物に加えて）１以上の有効成分を含んでもよい。医薬組成物は、局所または全身治療が求められるか、および治療すべき領域に依存して多数の方法で投与することができる。
非経口投与の調製物は滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射有機エステルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含めて、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、加乳リンゲル、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは流体および栄養素補充液、（リンゲルデキストロースに基づくもののような）電解質補充液などを含む。例えば、抗微生物剤、抗オキシダント、キレート化剤、および不活性ガスなどのような保存剤および他の添加剤も存在させてもよい。
眼投与用の製剤は軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点剤、坐薬、スプレー、液体および粉末を含んでもよい。慣用的な医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であり、または望ましいであろう。
経口投与用の組成物は粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ剤または錠剤を含む。増粘剤、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、またはバインダーが望ましい場合がある。組成物のいくつかは、可能性として、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸のような有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、ならびにモノアルキル、ジアルキル、トリアルキルおよびアリールアミン、および置換エタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成された、医薬上許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与してもよい。
トランスジェニック被験体
また、本明細書中に記載される合成アポリポ蛋白Ｅ模倣ペプチドの１以上をコードすることができる核酸を含むトランスジェニック非ヒト被験体も開示する。また、本明細書中に記載される合成アポリポ蛋白Ｅ模倣ペプチドの１以上を発現するトランスジェニック非ヒト被験体も開示する。被験体は動物または植物である。本発明は、本明細書中に記載される合成アポリポ蛋白Ｅ模倣ペプチドの１以上を発現するトランスジェニック非ヒト被験体も提供する。
該動物は、本明細書中に記載される任意の核酸分子で動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスによって作成することができる。トランスジェニック動物を作成する方法は当業者に知られているであろう。例えば、発明の名称が「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｃｅｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ」である２００１年３月１３日に発行されたＧｒａｎｔ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，２０１，１６５号。非限定的実施態様において、動物は哺乳動物であり、哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはヒト、サル、類猿人、チンパンジーもしくはオラウータンのような霊長類である。また、本発明は（例えば、胚状態の間に）そのような動物に本明細書中に開示した任意の細胞を加えるプロセスによって作成された動物も提供する。
遺伝子破壊を受けることができる任意の動物において本発明のポリペプチドを生じさせるために標的化遺伝子破壊および修飾で用いることができる（ベクターのような）組成物および方法が提供される。遺伝子修飾および遺伝子破壊とは、動物の生殖系を通じて修飾を伝える方法にて、哺乳動物のような動物における遺伝子または染色体のストレッチの選択的除去または改変を囲う方法、技術および組成物をいう。一般に、細胞は、例えば、本明細書中に記載されているように、細胞内に含有された特定の染色体の領域と相同的に組換えるように設計されるベクターで形質転換される。この相同組換え事象は、例えば、インフレームにて、周囲のＤＮＡと共に導入される外因性ＤＮＡを有する染色体を生じさせることができる。このタイプのプロトコルは、ＤＮＡの点変異または挿入のような非常に特異的な変異が、細胞内に含有されるゲノムに導入される新しいポリペプチドをコードするのを可能とする。このタイプの相同組換えを行うための方法は当業者に知られている。
一旦遺伝子操作された細胞を、上記した方法を通じて産生すると、動物は、幹細胞技術またはクローニング技術のいずれかを通じてこの細胞から作成することができる。例えば、核酸がトランスフェクトされた細胞が、その生物に対する幹細胞であった場合、この細胞を、トランスフェクションおよび培養の後に用いて、生殖系細胞に遺伝子修飾または遺伝子破壊を含有するであろうトランスジェニック生物を作成することができ、次いで、これを用いて、その細胞の全てにおいて遺伝子修飾または遺伝子破壊を保有する別の動物を作成することができる。その細胞の全てにおいて遺伝子修飾または遺伝子破壊を含有する動物の作成のための他の方法において、クローニング技術を用いることができる。これらの技術は当業者に知られており、一般に、トランスフェクトされた細胞の核を取り出し、融合または置換融合のいずれかを通じて、トランスフェクトされた核を卵細胞と融合させ、次いで、これを操作して、動物を作成することができる。ＥＳ技術の代わりにクローニングを用いる手法の利点は、ＥＳ細胞以外の細胞をトランスフェクトすることができることである。例えば、培養するのが非常に容易な線維芽細胞を、この例で細胞として用いることができ、これはトランスフェクトされており、遺伝子修飾を有するか、または遺伝子破壊事象が起こり、次いで、この細胞に由来する細胞を用いて、全動物をクローン化することができる。また、例えば、相同組換えのために設計されたベクターにクローン化される目的の遺伝子を修飾するのに用いる核酸も開示する。
本発明の組成物を製造する方法
本明細書中に開示された組成物、および開示された方法を実行するのに必要な組成物は、特に別の記載がない限り、その特定の試薬または化合物について当業者に知られた任意の方法を用いて製造することができる。例えば、合成化学方法および標準分子生物学方法のようなこれらの組成物を製造するのに用いることができる種々の方法がある。本発明の、ペプチド、ポリペプチド、核酸およびベクターを用いて、本発明のある他の態様を実施することができる。例えば、本発明のペプチドおよびポリペプチドを用いて、本発明の抗体を産生することができる。本発明の核酸およびベクターを用いて、本発明のペプチドおよびポリペプチドおよび他の組換え蛋白質を産生することができる。本発明の宿主細胞を用いて、本発明の核酸、蛋白質、ペプチド、抗体、およびトランスジェニック動物を作成することができる。これらの合成方法は上記される。
上記のように、本発明のポリペプチドまたはペプチドを用いて、ポリペプチドまたはポリペプチドの断片に特異的に結合する抗体を生じさせることができる。得られた抗体を免疫親和性クロマトグラフィー手法に用いて、ポリペプチドを単離するか、もしくは精製し、またはポリペプチドが生物学的試料に存在するか否かを決定することができる。そのような手法において、抽出物のような蛋白質調製物または生物学的試料を、本発明のポリペプチド、それに実質的に同一の配列、またはこれまでの配列の断片の１つに特異的に結合することができる抗体と接触させる。
免疫親和性手法において、抗体をビーズまたはカラムマトリックスのような固体支持体に結合させる。蛋白質調製物を、抗体が本発明のポリペプチドの１つに特異的に結合する条件下で抗体に接触させる。非特異的に結合した蛋白質を除去するための洗浄の後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
抗体に結合する生物学的試料中の蛋白質の能力は、当業者が精通した種々の任意の手法を用いて決定することができる。例えば、結合は、蛍光剤、酵素標識、または放射性同位体のような検出可能な標識で抗体を標識することによって決定することができる。あるいは、抗体の試料への結合は、そのような検出可能な標識をその上に有する二次抗体を用いて検出することができる。特定のアッセイはＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、およびウエスタンブロットを含む。
本発明の抗体を固体支持体に結合させ、これを用いて、本発明のアポリポ蛋白質Ｅまたはポリペプチドを固定化することができる。本発明のポリペプチドに対して生じるポリクローナル抗体は、ポリペプチドの動物への直接注射によって、またはポリペプチドを動物に投与することによって得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチドそれ自体に結合する。このようにして、ポリペプチドの断片のみをコードする配列を用いてさえも、全天然ポリペプチドに結合することができる抗体に生じさせることができる。次いで、そのような抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離することができる。
Ｃ．使用方法
本発明は、本明細書中に開示される核酸、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、抗体および組成物を用いる多くの治療的方法も提供する。例えば、ＬＤＬの細胞への結合を増強させるための方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上と接触させ、混合し、または会合させることを含む、方法を開示する。以下の実施例セクションは、本発明の核酸、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、および抗体、ならびに組成物をどのように用い、テストすることができるかの例を提供する。当業者であれば、本明細書中に開示された核酸、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、抗体、および組成物をテストし、使用するために、実施例セクションにおいて提供された方法を変更することができるであろう。
また、ＬＤＬの細胞への結合を増強させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上と接触させ、混合し、または会合させ、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方に影響させることを含む、方法も開示する。加えて、ＬＤＬの細胞への結合を増強させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上と接触させ、混合し、または会合させ、それにより、血漿中Ｌｐ（ａ）が影響されることを含む、方法を開示する。
また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響されることを含む方法であって、ＬＤＬの被験体の細胞への結合は増強され、被験体の細胞によるＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＬＤＬコレステロールは降下し、ＶＬＤＬの被験体の細胞への結合は増強され、被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解は増大し、被験体におけるＶＬＤＬコレステロールは降下し、被験体におけるコレステロールの全血漿濃度は降下し、および／または血漿Ｌｐ（ａ）は降下する、方法も開示する。
また、ＬＤＬの細胞への結合を増強させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させ、混合し、または会合させ、それにより、ポリペプチドがＬＤＬに結合し、会合した細胞とのＬＤＬの結合および／または取り込みを増強させるのを可能とすることを含む、方法も開示する。また、被験体における細胞へのＬＤＬおよびＶＬＤＬの結合を増強させる方法であって、該方法は開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物の１以上を、被験体の細胞へのＬＤＬおよびＶＬＤＬの結合を増加させるのに有効な量にて被験体に投与することを含む、方法も開示する。また、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示する。また、被験体において血清コレステロールを低下させる方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示する。
本明細書中に開示する方法において、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与することができる。
有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物の投与は、ＬＤＬの細胞への結合を増強させ、被験体の細胞によるＬＤＬの分解を増大させ、被験体におけるＬＤＬコレステロールを降下させ、被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合を増強させ、被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解を増大させ、被験体におけるＶＬＤＬコレステロールを降下させ、および／または被験体におけるコレステロールの全血漿濃度を降下させることができる。
開示する方法についての被験体は、冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、全身性紅斑アテローム性動脈硬化症、冠動脈、異常ベータリポ蛋白質血症、および／または心筋梗塞を有し得る。開示された方法についての被験体はまた、炎症性腸状態（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性結腸炎、クローン病、自己免疫溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー氏病、血小板減少症紫斑病、アレルギー；喘息、アトピー性疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋障害、糸球体腎炎、再生不良性貧血、および器官移植後の拒絶を有し得る。
また、本発明は、冠動脈疾患、または増大した血清コレステロールに関連する任意の疾患または状態を有する被験体を治療する方法も提供する。この方法において、本発明のポリペプチドまたはその組成物を、被験体における血清コレステロールの細胞取り込みを有効に増強させる量で被験体に投与し、それにより、被験体において冠動脈疾患、または他の関連疾患を治療する。例えば、関連疾患または状態は異常ベータリポ蛋白質血症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、狭心症などであり得る。増大した血清コレステロールに関連する疾患または状態は当業者によく知られているであろう。
加えて、本発明は、被験体において心筋梗塞の危険性を低下させる方法を提供する。この方法において、本発明のポリペプチド、またはその組成物を、被験体において血清コレステロールの細胞取り込みを増大させるのに有効な量で被験体に投与し、それにより、被験体を治療し、心筋梗塞の危険性を低下させる。また、本発明は、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療する方法であって、血清コレステロールの細胞取り込みを増大させる有効量の本発明の組成物を被験体に投与し、それにより、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療する、方法も提供する。また、本発明は、例えば、被験体において増大した血清コレステロールに関連する疾患を治療するか、または被験体においてＬＤＬおよび／またはＶＬＤＬ血清レベルを低下させるための、本発明の組成物の製造のための本発明のポリペプチドの使用も提供する。また、本発明は、ＨＤＬ機能を増強させるための本発明のポリペプチドの使用も提供し、該方法は開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと細胞とを接触させることを含む。
また、本発明は、炎症を減少させるための本発明のポリペプチドの使用も提供し、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含み、該ペプチドはパラオキサナーゼを増加させることによって血漿から脂質ヒドロペルオキサイドを除去する。また、血漿パラオキソナーゼ（ＰＯＮ−１）活性を増大させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。また、アテローム形成を阻害するための方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。
また、アテローム形成を阻害するための方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含み、血漿コレステロールレベルは減少し、ＨＤＬの機能は増大する、方法も開示する。また、血管壁からアテローム形成性リポ蛋白質を除去する方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。また、ＬＤＬのアテローム形成性を減少させる方法であって、該方法は細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、方法も開示する。
多数の集団および動物の研究は、ＨＤＬのアテローム保護特性を確立している。末梢細胞からコレステロールを抽出し、排出のために肝臓へ送る（逆コレステロール輸送（ＲＣＴとも呼ばれる））その主なアテローム形成特性に加えて、ＨＤＬは抗炎症および抗オキシダント特性も保有する。動物モデルにおけるアポリポ蛋白質Ａ−Ｉの直接的注入が、抗アテローム性動脈硬化プラークの進行を阻害するという観察、ならびに特に、ヒトにおけるＨＤＬの再構成された形態に関する最近の研究は、内皮機能に対する利益、およびアテローム性動脈硬化症負荷の退行の双方を示す。アポＡ−Ｉ模倣ペプチドの結果、コレステロールレベルの変化はないにもかかわらず、アテローム性動脈硬化症感受性マウスモデルにおいてアテローム性動脈硬化病変の形成の低下がもたらされることが示されている。これは、ヒトアポＡ−Ｉについて説明される主な抗アテローム形成特性である、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）を破壊し、逆コレステロール輸送を増強させることができる増大したパロキソナーゼ−１（ＰＯＮ−１）活性を保有する前β−ＨＤＬ様粒子の形成を介して起こる。
開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬが影響されることを含む方法を本明細書中で開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬ機能が増大することを含む方法も本明細書中に開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬが影響されることを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、方法も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿中ＨＤＬが影響されることを含み、ＰＯＮ活性は増大し、脂質ヒドロペルオキシドは除去され、アテローム形成性リポ蛋白質レベルは血漿中で低下し、内皮機能は改善され、および／または粥腫形成リポ蛋白質は血管壁から除去される、方法も開示する。また、開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿中ＨＤＬが影響されることを含み、該被験体は炎症性腸状態（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性結腸炎、クローン病、自己免疫溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー氏病、血小板減少症紫斑病、アレルギー；喘息、アトピー性疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋障害、糸球体腎炎、再生不良性貧血、および器官移植後の拒絶を有する、方法も開示する。
また、「炎症障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示する。また、「炎症障害」を有する被験体を治療する方法であって、該方法は有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、方法も開示する。また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、該受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチされた向きに該脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。被験体がヒトのような哺乳動物であってよい。別の実施態様において、被験体は、ヒト治療剤をテストするのに用いられるモデル系であり得る動物である。そのような動物の非限定的例はイヌ、ブタ、霊長類、ネズミ、ネコ、ウシ、またはウマ動物を含む。
本発明の組成物のインビトロまたはインビボいずれかでの細胞への送達のために、多数の直接送達系を用いることができる。これらはリポソーム融合、遺伝子銃注射、エンドサイトーシス、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、または細胞への遺伝物質の導入を介すること、またはカチオン性リポソームのような担体を含む。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはＤＮＡのエレクトロポレーションおよび直接拡散のような物理機械的方法を含めた適当なトランスフェクションのための手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８（１９９１）によって記載されている。エクスビボ方法が使用される場合、当該分野でよく知られた標準的なプロトコルにしたがって、細胞または組織を取り除き、体外に維持することができる。組成物は、例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームのような任意の遺伝子導入メカニズムを介して細胞に導入することができる。次いで、形質導入された細胞を（例えば、医薬上許容される担体に）注入し、または細胞型もしくは組織型についての標準的な方法にしたがって被験体に戻して同位置に移植することができる。種々の細胞の被験体への移植または注入についての標準的な方法が知られている。そのような方法は当該分野でよく知られており、かつ本明細書中に記載された組成物および方法で用いるのに容易に適合させることができる。ある場合には、該方法を変更して、大きなＤＮＡ分子と特異的に機能させる。さらに、これらの方法を用いて、担体の標的化特徴を用いることにより、ある種の疾患および細胞集団を標的化することができる。
治療的使用
一般的には、治療で用いる場合は、治療組成物は局所鼻内投与または吸入器による投与を含めて、経口、非経口（例えば、静脈内または皮下投与）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮、体外、腔内投与、経皮、または局所などにより投与することができる。局所投与は眼科的、経膣的、直腸的、または鼻内によることができる。本明細書中で用いる、「局所鼻内投与」は、外鼻孔の一方または双方を通じての組成物の鼻および鼻通路への送達を意味し、スプレーイングメカニズムまたは液滴メカニズムまたは核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入器による組成物の投与は、スプレーイングまたは液滴メカニズムによる送達を介しての鼻または口を経由することができる。送達はまた、挿管法を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接的に行うこともできる。必要な組成物の正確な量は被験体の種、年齢、体重および一般的状態、治療すべき障害の重篤度、用いる特定の核酸またはベクター、その投与の様式などに依存して、被験体の間で変化する。特定の組成物および特定の被験体についての適当な量は、本明細書中における所与の教示を考えると、ルーチン的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
組成物の非経口投与は、用いられる場合、一般的には、注射によって特徴付けられる。注射剤は液状溶液または懸濁液、注射に先立っての液体中の懸濁液の溶解に適した固体形態として、またはエマルジョンとして、慣用的な形態で調製することができる。非経口投与は、一定の用量が維持されるような、持続放出、適時放出または徐放放出系の使用を含む。
組成物を投与するための効果的な用量またはスケジュールは経験的に決定することができ、そのような決定を行うのは当業者の技量内のものである。組成物の投与のための用量範囲は、障害の兆候が影響される所望の効果を生じさせるのに十分大きなものである。用量は、望まない交差反応、アナフィラキシー反応などのような有害な副作用を引き起こすほどあまり大きくすべきではない。一般に、用量は患者における年齢、状態、性別および疾患の程度、投与の経路、または他の薬物が療法に含まれているか否かで変化し、これは当業者によって決定することができる。用量は任意の反対の適応性（ｃｏｕｎｔｅｒ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の事象において個々の医師によって調整することができる。用量は変化させることができ、１日または数日の間、毎日１以上の用量投与において投与することができる。ガイダンスは、医薬製品の与えられたクラスについて適当な容量に対する文献で見出すことができる。例えば、１つ以上の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響されることを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、方法を開示する。
アテローム性動脈硬化症を治療し、抑制し、または予防するための合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのような開示された組成物の投与に続き、治療ペプチドの効力を当業者によく知られた種々の方法で評価することができる。例えば、当業者であれば、本明細書中に開示されるペプチドのような組成物は、該組成物がコレステロール、ＬＤＬ、もしくはＶＬＤＬレベルを低下させ、または本明細書中に開示するように、アッセイに存在するコレステロールの量を低下させることを観察することによって、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療し、または抑制するのに有効であることを理解するであろう。本明細書中に開示するような、増大したコレステロールレベル、ＬＤＬレベル、ＶＬＤＬレベル、アテローム性動脈硬化症または塞栓形成を抑制する組成物は、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞、塞栓形成の危険性がある患者または被験体に予防的に投与してもよい。
本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、抗体、ベクターおよび治療組成物は、既に用いられている他のよく知られた療法および予防ワクチンと組み合わせることができる。本発明の組成物は、患者を安定化させ、心臓に対する損傷を制限するのに用いられる薬物と組み合わせて用いることができる。そのような薬物は血栓溶解剤、アスピリン、抗凝固剤、鎮痛薬およびトランキライザー、ベータブロッカー、ａｃｅ阻害剤、ニトレート、リズム安定化薬物、および利尿剤を含む。心臓への損傷を制限する薬物は、心臓発作の数時間内に与えられた場合のみ作用する。血餅を破壊し、酸素が豊富な血液がブロックされた動脈を通じて流れるのを可能とする血栓溶解薬物は、心臓発作後可能な限り早く投与される場合、患者の生存の可能性を増大させる。心臓発作から数時間以内に与えられる血栓溶解剤は最も有効である。静脈内注射されると、これらはアニソイル化プラスミノゲンストレプトキナーゼアクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）またはアニストレプラーゼ、組換え組織型のプラスミノゲンアクチベーター（ｒ−ｔＰＡ）、およびストレプトキナーゼを含む。本発明の組成物は任意のこれらの薬物と組み合わせることができる。本発明のペプチドの組み合わせは、現在の治療とで相加的または相乗的効果を生じさせることができる。
本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、抗体、ベクターおよび治療組成物は、アテローム性動脈硬化プラークの形成、アテローム性動脈硬化病変形成、心筋梗塞、脳卒中、鬱血性心不全、細動脈機能、細動脈疾患、老化に関連する細動脈疾患、アルツハイマー病に関連する細動脈疾患、慢性腎臓疾患に関連する細動脈疾患、高血圧に関連する細動脈疾患、多梗塞認知症に関連する細動脈疾患、くも膜下出血に関連する細動脈疾患、末梢血管疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、喘息、特発性肺線維症、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、骨粗鬆症、パジェット病、冠動脈石灰化、慢性関節リウマチ、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、紅斑狼瘡、多発性硬化症、ヴェーゲナー肉芽腫症、中枢神経系血管炎（ＣＮＳＶ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、ＡＩＤＳ炎症応答、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生感染、インフルエンザ、鳥類インフルエンザ、ウイルス性肺炎、エンドトキシンショック症候群、敗血症、敗血症症候群、外傷／創傷、臓器移植、移植アテローム性動脈硬化症、移植拒絶反応、核膜潰瘍、慢性／非創傷治癒、潰瘍性結腸炎、再灌流負傷（予防および／または治療）、虚血性再灌流負傷（予防および／または治療）、脊髄負傷（緩和効果）、癌、骨髄腫／多発性骨髄腫、卵巣癌、乳癌、結腸癌、骨癌、変形性関節炎、炎症性腸状態、アレルギー性鼻炎、悪液質、糖尿病、アルツハイマー病、インプラント補綴、バイオフィルム形成、クローン病、皮膚炎、急性および慢性、湿疹、乾癬、接触性皮膚炎、強皮症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、若年発症糖尿病、糖尿病の発症の予防、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎臓障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜障害、勃起不全、黄斑変性、多発性硬化症、腎臓障害、神経障害、パーキンソン病、末梢血管疾患、および髄膜炎よりなる群から選択される状態の治療で用いることもできる。
ある実施態様において、開示された組成物はＣＥＴＰ阻害剤、ＦＴＹ７２０、サーティカン、ＤＰＰ４阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー、ＡｐｏＡ１誘導体またはミメティックまたはアゴニスト、ＰＰＡＲアゴニスト、ステロイド、グリーベック、コレステロール吸収ブロッカー（ゼチア）、ビトリン、任意のレニンアンギオテンシン経路ブロッカー、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（ディオバンなど）、ＡＣＥ阻害剤、レニン阻害剤、ＭＲアンタゴニストおよびアルデステロンシンターゼ阻害剤、ベータブロッカー、アルファアドレナリンアンタゴニスト、ＬＸＲアゴニスト、ＦＸＲアゴニスト、スカベンジャー受容体Ｂ１アンタゴニスト、ＡＢＣＡ１アゴニスト、アディポネクチン受容体アゴニストまたはアディポネクチン誘導因子、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼＩ（ＳＣＤ１）阻害剤、コレステロール合成阻害剤（非スタチン）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＩ（ＤＧＡＴ１）阻害剤、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２阻害剤、ＰＡＩ−１阻害剤、ＬＰ−ＰＬＡ２阻害剤、ＧＬＰ−１、グルコキナーゼアクチベーター、ＣＢ−１アゴニスト、ＡＧＥ阻害剤／ブレーカー、ＰＫＣ阻害剤、抗血栓剤／凝固剤、アスピリン、ＡＤＰ受容体ブロッカー、例えば、クロピジグレル、第Ｘａ因子阻害剤、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、第ＶＩＩａ因子阻害剤、ワルファリン、低分子量ヘパリン、組織因子阻害剤、抗炎症薬物、プロブコールおよび誘導体、例えば、ＡＧＩ−１０６７など、ＣＣＲ２アンタゴニスト、ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニスト、ニトレートおよびＮＯドナー、およびホスホジエステラーゼ阻害剤よりなる群から選択される薬物と組み合わせて投与することができる。
本発明を、以下の実施例を参照してさらに記載する。しかしながら、本発明はそのような実施例に限定されないと理解されるべきである。むしろ、本発明を実施するための現在の最良の形態を記載する本開示に鑑みると、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、多くの修飾および変形が、このように、当業者に提示される。特許請求の範囲の意味、および同等の範囲内にある全ての変化、修飾および変形はその範囲内にあると考えられるべきである。
同等物
当業者であれば、本明細書中で具体的に記載された特定の実施形態に対する多数の均等論を、ルーチン的に過ぎない実験を用いて認識し、または確認することができるだろう。そのような同等物は、特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。
アテローム性動脈硬化症に対する理想的な治療は、血漿コレスレロールの迅速なクリアランスおよび炎症経路の阻害を含むであろう（Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４５：９９３−１００７ ２００４；Ｓｗｅｒｔｆｅｇｅｒ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ＢｉｏＳｃｉ．６：５２６−５３５ ２００１）。超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）の蛋白質成分であるアポリポ蛋白質（アポ）Ｅはアテローム形成性アポＢ含有リポ蛋白質の迅速なクリアランスに関係しているが、ＨＤＬの主な蛋白質成分である高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）およびアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）は抗炎症特性を呈することが示されている。低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）のレベルを低下させると、心血管の危険性のほぼ３０％を低下させたにすぎないので、心血管疾患に対する次の標的はＨＤＬおよびアポＡ−Ｉであると思われる。コレスレロールエステルの導入蛋白質の阻害によるＨＤＬレベルの増大は、明らかにＨＤＬ機能の改善なくしてＨＤＬを増大させるように思われ、機能的ＨＤＬの存在がＨＤＬレベルよりも重要であることを示す。
アポＡ−Ｉミメティックレベルの最近の進歩は、ＨＤＬ機能を改善する可能性を示す（Ｓｈａ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．１５：２９１−２９６，２００５）。以下に記載するこの実施例は、血漿アポＢ含有リポ蛋白質を降下させる特性をアポＡ−Ｉミメティックペプチドに取り込んで、デュアル機能を有するヘプチドを得る方法を提供する。このように、活性なアポＡ−Ｉミメティックペプチドに共有結合により連結されて、アポＥの残基１４１−１５０（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ）が１８Ａ（ベースラインクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド）に連結されたデュアルドメインペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（配列番号１２）を生じさせる、アポＥからのカチオン性推定受容体結合ドメインを保有する新規なペプチドを設計した。また、アポＡ−Ｉミメティックスの脂質ヒドロペルオキシドスカベンジング特性が取り込まれた単一のカチオン性ドメインペプチドも設計された。このペプチド、Ｒ１８Ｌ−２Ｙ（配列番号６２；配列Ａｃ−ＧＦＲＲＦＬＧＳＷＡＲＩＹＲＡＦＶＧ−ＮＨ２を有する）は、αらせんとして折り畳まれる場合、極性面においてはＡｒｇを保有し、疎水性面の中心は脂質ヒドロペルオキシドを捉えることができる、π電子クラスターにおける芳香族残基を保有する（Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２６５０９−２６５１７，２００４）。カチオン性Ａｒｇが豊富なドメインは、普遍的細胞表面ヘパリン硫酸プロピオグリカン（ＨＳＰＧ）と会合すると考えられる。結果は、これらのペプチドの双方がＨｅｐＧ２細胞においてアテローム形成性リポ蛋白質の取り込みを増強させ、脂質異常症マウスモデルにおいて血漿コレステロールを除去し、ＨＤＮ機能を改善するようにも思われることを示す。また、結果は、これらの２つの候補ペプチドがアポＥヌルマウスにおいてアテローム性動脈硬化症を阻害することを示す。従前の結果は、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２（配列番号１２）は、異なる脂質異常症マウスモデルにおいて（Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：２１３−２２０ ２０００；Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ，ｅｔ ａｌ Ａ−Ｉ ａｎｄ Ｅ．Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．８０：１１−２０ ２００１；Ｄａｔｔａ，Ｇ．Ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２：９５９−９６６ ２００１；Ｒａｍｐｒａｓａｄ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ７９：２０７−２１８ ２００２；Ｇａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１６３：２２９−２３７ ２００３）、およびＷＨＡＬウサギにおいて（Ｇａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１６３：２２９−２３７ ２００３）、血漿コレステロールを劇的に減少させることを示す。
さらなる結果は、このペプチドが抗炎症ペプチドを保有することを示す。これは、血漿パラオキソナーゼ（ＰＯＮ−１）活性の有意な増大とともに生じる血漿脂質ヒドロペルオキシドレベルの降下を通じて起こる。ＷＨＨＬモデルにおいては、ＬＤＬ−Ｒ経路に影響があり、かくして、加速されたアテローム形成性リポ蛋白質クリアランスは、ネズミモデルにおいて先に記載されているように、細胞表面ＨＳＰＧ媒介経路を介するようである（Ｇａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１６３：２２９−２３７ ２００３）。アテローム性動脈硬化症の第２のモデルにおいて、ニュージランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギにアテローム形成性食事を与え、該ペプチドの単一の静脈内投与（３ｍｇ／ｋｇ）は１５日間で全血漿コレステロールレベルを有意に減少させた。５２日後における病変のエンフェイス分析は、生理食塩水処理ウサギ（対照）において約５０％の病変範囲を示し、他方、ペプチド処理動物においてはほとんどまたは全く病変を示さなかった。さらに、ＨｅｐＧ２細胞においてのインビトロ実験は、デュアルドメインペプチドがアポＡ−ＩおよびアポＥの分泌を特異的に増大させることを示した。インビトロ実験は、デュアルドメインカチオン性ペプチドがリサイクルされることも示している。デュアルドメインペプチドはアポＡ−Ｉ含有粒子のような前βＨＤＬの分泌も増強させ、その効果は（恐らくは、デュアルドメインカチオン性ペプチドのリサイクルのため）７２時間を超えて継続し、異なる動物モデルにおけるペプチドの慢性コレステロール降下効果は、前β−ＨＤＬ形態における肝臓アポＡ−Ｉの増強された分泌に関連させることができ、かくして、「機能的ＨＤＬ」レベルを増大させることを示唆する。
実施例１ アテローム形成性リポ蛋白質取り込みに対するカチオン性デュアルドメインペプチドの効果
ＨｅｐＧ２細胞における、および脂質異常症マウスモデルにおけるペプチドＡｃ−ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ−１８Ａ−ＮＨ２（Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２；配列番号１２）の効果は従前に記載されている（５，６，７，８，９）。これらの研究は、（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲまたはＡｃ−１８Ａ−ＮＨ２はそうではないが）ペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２はヒト血漿中のアテローム形成性アポＢ含有リポ蛋白質と会合することを示した。また、該ペプチドはＨｅｐＧ２細胞においてＬＤＬおよびＶＬＤＬの取り込みおよび分解を増強させることができることも示された（Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：２１３−２２０ ２０００）。予備的研究は、ＬＤＬ受容体が血漿コレステロールのクリアランスに関与していないことを示した。脂質異常症マウスモデルにおいては、研究は、当該ペプチドがアポＢ−４８含有リポ蛋白質と会合し、それらの取り込みおよび分解を増強させることができることを示した（Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：２１３−２２０ ２０００）。アテローム形成性食事が与えられたＣ５７ＢＬ６マウス、アポＥヌルマウス、アポＥ（ヌル）ＬＤＬ−Ｒ（ヌル）二重ノックアウトマウスにおいては、アテローム形成性リポ蛋白質ＬＤＬおよびＶＬＤＬは、主にアポＢ−４８、および少量のアポＢ−１００を含んだ。アテローム形成性リポ蛋白質の低下が観察された実験では、カラムリポ蛋白質プロフィール（ＣＬｉＰ）によって研究されたところ、ペプチドはＨＤＬレベルを低下させなかった（Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２：９５９−９６６ ２００１；Ｇａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１６３：２２９−２３７ ２００３）。
実施例２ Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２はアポＥヌルマウスにおいてアテローム性動脈硬化症を阻害する。
アテローム性動脈硬化症を自然発生的に発症するアポＥヌルマウスにおけるアテローム性動脈硬化症阻害研究も行った。１６週齢雌アポＥヌルマウスへの４週間のＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（５０μｇ／マウス、毎週３回）の後眼窩投与は、対照群と比較して４０％減少した病変を示した（ｐ値＜０．００１）（対照においてｎ＝１１、およびペプチド投与群においてｎ＝１２）。この投与手法においては、（合計１２回の投与の）多数回投与にかかわらず、動物の死亡はなく、目に見える動物に対する損失は観察されなかった。エンフェイス調製物を用いて病変分析を行った。１６週齢のマウスはよく確立された病変を有するはずであった。これらの結果（図２）は、当該ペプチドがアポＥヌルマウスにおいて病変形成を阻害し得ることを示す。これらの結果は、当該ペプチドが抗アテローム形成性であることと合致する。アテローム性動脈硬化症の阻害のメカニズムについての詳細な研究は後に記載する。
実施例３
トリグリセリドがリッチなリポ蛋白質上、ならびにＨＤＬ上のアポＥの一部は内在化され、リサイクルされることが示されている（Ｓｗｉｆｔ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２２９６５−２２９７０ ２００１；Ｆａｒｋａｓ Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：１５４６−１５５４ ２００４）。肝臓細胞はアポＥを内在化することができ、これは、結局は、再度放出される。アテローム形成性食事が与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（各群においてｎ＝９）への１００μｇのペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２の投与（ｉ．ｖ．）は、血漿コレステロールのレベルに対して二相効果を示した。最初に、ペプチドは血漿コレステロールを６５％より多く減少させた。より低い全コレステロールレベルが、継続したアテローム形成性食事投与にもかかわらず、対照群と比較してペプチド投与群において８日後においてさえ観察された（図３）。血漿コレステロールに対する効果は、血漿からのペプチドの消失後においてさえ見られる。アポＥミメティックペプチドがリサイクルされる可能性がある。ペプチドがそのような劇的な効果を発揮できるメカニズムを理解するために、１）ペプチド生物学的利用性についてのＨｅｐＧ２細胞に対するペプチドの効果、ならびに２）ＨＤＬおよびアポＡ−Ｉに対する効果を調べた。それを行うために、ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭ培地中で成長させた。８５％密集において、細胞を洗浄し、１０％ＬＰＤＳを含有するＭＥＭ培地を加えた。細胞を、１２５Ｉ−標識Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（１０ｊｔｇ／ｍｌ）と共に、および１２５Ｉ−標識Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（１０ｔｊｇ／ｍｌ）＋ＬＤＬ（１０ｔｊｇ／ｍｌ）と共に、５分間および３０分間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、培地を除去し、細胞をＴＢＡ含有ＢＳＡで３回、およびＴＢＡで２回洗浄した。次いで、細胞を、ヘパリンを含有する緩衝液と共に４℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞をヘパリナーゼおよびヘパリチナーゼで３７℃にて１時間処理した。ヘパリン洗浄およびヘパリナーゼ／へパリチナーゼ洗浄をカウントした。細胞を０．１Ｎ ＮａＯＨ中に吸引し、カウントした。全ての実験は三連で行い、カウントは合計カウントのパーセンテージとして表した。図４は、ヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ洗浄後６０分においてより多くのカウントが培地で見られ、対応してより少ないカウントが６０分において細胞で見られることを示す。これらの結果は、ペプチドが細胞表面で無傷のままであることを示す。これらの結果は、リサイクリングに関与することが知られている、アポＥで観察されたものと同様である（Ｓｗｉｆｔ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２２９６５−２２９７０ ２００１；Ｆａｒｋａｓ Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４５：１５４６−１５５４ ２００４）。
実施例４ アテローム性動脈硬化症の阻害
アポＡ−Ｉミメティックペプチドについて、該ペプチドがインフルエンザウイルスに感染したマウスにおいてＨＤＬおよびアポＡ−Ｉレベルを増大させ得るのが観察されている（Ｖａｎ Ｌｅｎｔｅｎ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０６（９）：１１２７−３２，２００２）。ＨｅｐＧ２細胞（Ｄａｓｈｔｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：１９１９−１９２８，２００４）、および他のマウスモデルにおいて、該ペプチドはＨＤＬのアテローム保護能力を改善することが示されている（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ Ａ−Ｉ ａｎｄ Ｅ．Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．８０：１１−２０ ２００１）。非極性面の中央においてπ電子を有するペプチド４Ｆ（配列番号１７）は、アポＡ−ＩおよびＰＯＮを動員することができるそれ自体の粒子を形成し、かくして、抗アテローム形成効果を発揮することができる。該ペプチドによって、新生円盤状ＨＤＬ合成に関与する膜蛋白質であるＡＢＣＡ１が安定化することも示されている。ＨｅｐＧ２細胞に対するＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２の可能な効果も調べた。クラスＡペプチドに関する従前の観察を考慮して、ＨＤＬ様粒子の形成における３つのペプチドの効果も研究した。図５に示すように、対照細胞からの上清と比較して、ペプチド処理細胞からの上清は、非変性勾配電気泳動によって見られるようにサイズがより小さなＨＤＬの顕著な増加は、前β−ＨＤＬと同様であることを示す。ＨｅｐＧ２細胞との等量のＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（配列番号１２）、Ａｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２（配列番号６３）、および４Ｆ（配列番号１７）（重量ベース）のインキュベーションは、前β−ＨＤＬを生じさせた（図５）。新鮮な細胞培地での第２および第３の一晩のインキュベーションの後でさえ、前β−ＨＤＬの量は第２の一晩のインキュベーションにおいて４Ｆと共に対照細胞培地と同様なレベルに減少したが、他の２つのカチオン性ペプチドによって有意な量の前３ｊＨＤＬを生じた。これらの結果は、恐らくは、リサイクリング現象のためデュアルドメインペプチドが、クラスＡペプチドよりもかなり長く前β−ＨＤＬ粒子を分泌する特性を保有することを支持し、かくして、これらのペプチドの長期抗アテローム形成性および抗炎症効果を説明する。
実施例５ 炎症経路に対する効果
サイトカインの潜在的誘導因子および細胞接着分子である細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の炎症応答に対するペプチドの効果もまた調べた。図６は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＬＰＳ誘導ＶＣＡＭ−１発現に対するＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２の阻害効果を示す。ＨＵＶＥＣと、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ、６時間暴露）およびＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（５０μｇ／ｍｌ）との共インキュベーションは、８０％を超える阻害を示した（レーン２、図６）。図６に示すように、本結果は、単球走化性蛋白質−１（ＭＣＰ−１）も該ペプチドによって阻害されることを示す。これらの結果は、ペプチドの抗炎症特性が、ＬＰＳに対する直接的な効果によるものか、または新しく分泌されたアポＡ−Ｉが、インビボにて、ＨＵＶＥＣレベルもしくは改善されたＨＤＬ機能もしくは双方に対するＬＰＳ効果の阻害を引き起こすことによるもののいずれかであり得ることを示す。
実施例６ ＡＣ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２は、マクロファージによるデノボ合成アポＥの分泌を増強させる。
ＴＨＰ−１単球由来マクロファージを、ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識した。マクロファージ（１０６個の細胞）をデュアルドメインペプチド（２５ｔｊｇ／１０６個の細胞）で５回処理した。条件培地を収集し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄した。ＭＥＭ、＋ロイペプチン（５０ｔｊｇ／ｍｌ）、ペプスタチンＡ（５０ｔｊｇ／ｍｌ）、およびアプロチニン（１００カリクレイン不活化単位／ｍｌ）を含有する調製カクテルを培地に加えて、酸化的損失および蛋白質分解損失を維持した。対照細胞からの培地、およびペプチド処理培地を等容量まで濃縮し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に定量的に負荷した（１２５ボルトでの４℃において２．５時間の４〜２０％ＰＡＧＥ）。ゲルをＸ線フィルムに一晩暴露した。ペプチド処理細胞培地で得られたバンドは、明瞭に、３６ｋＤａにおいてバンドを有し、このバンドの強度は、デンシトメトリーで決定されるように（図７）、対照細胞の培地から得られたバンドの４倍を超えた。アポＥの増大したデノボ合成は、アテローム形成性リポ蛋白質の取り込みを高めることができる。加えて、アポＥは、抗炎症特性、およびマクロファージからのコレステロール流出を高める特性を有する。これらの特性はマクロファージが泡沫細胞となるのを妨げるであろう。これらの研究は、ペプチドがインビボにて非常に迅速に回転され、肝臓における最大カウントが観察されたことを示した。かくして、ペプチドはリサイクルされ、ペプチドの存在は前βＨＤＬの産生、デノボアポＥの合成の増加に対して継続する効果を有し、該ペプチドは（恐らくはＨＳＰＧ経路を介して）直接的に、およびアポＥの増大した合成を介して間接的にアテローム形成性リポ蛋白質のクリアランスを高めるであろう。図８に示されるように、（Ｌアミノ酸を含有するペプチドとしてさえ）カチオン性単一ドメインペプチドＲ１８Ｌ−２Ｙ（配列番号６２）は、経口投与された場合に、アポＥヌルマウスにおいてアテローム性動脈硬化症を阻害した。
これに加えて、該ペプチドは、リポ蛋白質代謝に関与するさらなる抗アテローム形成性蛋白質の合成を刺激することができることが示された（図９）。ＴＨＰ−１由来マクロファージをＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２と共に５時間および一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。ＲＮＡをトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞から抽出した。当該遺伝子についてのＳＹＢＲ緑色および適当なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを決定した。結果をＧＡＰＤＨに対して正規化し、（ペプチドを含まない）対照細胞に対する倍増加として表した。これらの結果は、ペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２が長期効果を発揮し、その結果、循環アテローム形成性アポＢ含有リポ蛋白質の減少をもたらすのみならず、プロアテローム形成性蛋白質のレベルをシャットダウンし、およびアテローム形成性リポ蛋白質を除去するのに関与し得る蛋白質のレベルを増大させることに対して更なる効果を呈することを示す。かくして、該結果は、このペプチドの複数の抗アテローム形成効果および抗炎症効果によって説明することができる。
実施例７
Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２は、アテローム形成性食事を摂取した、アポＥヌルマウス、デュアルノックアウトマウス（ＬＤＬ−Ｒ（ヌル）アポＥ（ヌル））、およびＣ５７ＢＬ／６におけるアテローム形成性リポ蛋白質の肝臓取り込みおよび分解を高めたが、該ペプチドは正常な餌についてのＣ５７ＢＬ／６、正常な餌、またはウエスタンダイエットを摂取したＬＤＬ−Ｒ（ヌル）の血漿コレステロールレベルに対して効果を有しなかった。さらなる調査は、これらのマウスモデル（正常な餌摂取のＬＤＬ−Ｒ（ヌル）およびＣ５７ＢＬ６）においては、該ペプチドはＢ−１００含有粒子と会合できないことを示した。しかしながら、該ペプチドは（アポＢ−１００を含有する）ヒトＬＤＬおよびＶＬＤＬと会合することができ、ＨｅｐＧ２細胞およびＬＤＬ−Ｒ（ヌル）マウスモデルにおいて、アテローム形成性ヒトリポ蛋白質の取り込みおよび分解を高めることができる（Ｇａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１６３：２２９−２３７ ２００３）。アポＢ−１００含有ヒトＬＤＬおよびマウスＬＤＬの特性の差に対する理由は明らかでない。その差は、アポＢ−１００を保有するヒトＬＤＬおよびマウスＬＤＬの間の脂質パッキングにあるように思われる。アポＢ−１００含有マウスＬＤＬによって、該ペプチドが指数関数的に高い排除圧値（４８ｄｙｎｅ／ｃｍ）を保有するという事実にもかかわらず、該ペプチドのその表面への結合は可能でない（Ｇａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１６３：２２９−２３７ ２００３）。
これらの観察によって、図９にまとめる研究が得られた。ペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２は、アテローム形成性食事でのＷＨＨＬウサギおよびＮＺＷウサギからのアテローム形成性リポ蛋白質と会合し、その取り込みおよび分解を高めることができる。ウサギにおける本観察は、該ペプチドがＨＤＬ機能および、また、内皮機能を改善することができることを示す。内皮機能はＨＤＬ機能に密接に関連している。ＨＤＬ機能はＣＥＴＰ機能に相関するので、ウサギは、図１０に示すスキームを研究するための良好なモデルである。ＣＥＴＰ発現マウスモデルは、該ペプチドの効果を実験するために入手可能であるが、これらのマウスは（特に、ヒトアポＡ−Ｉ発現マウスモデルについて）アテローム性動脈硬化症感受性マウスモデルと交配しなければならず、これは、このように、別個の研究プロジェクトとなり、このような場合にも、これらのモデルで生じた遺伝子倍増加病変は、ヒト病変のタイプから有意に異なる。ここに選択されたＷＨＨＬウサギモデルはヒトにおける家族性高コレステロール血症に近く、脂質異常症は種々の病理学を伴う異なるタイプの食事を用いて生じさせることができるので、２つのウサギモデルにおけるペプチドの効果を研究した。さらに、ヒトと同様に、ウサギは、コレステロール代謝において重要な役割を果たすＣＥＴＰを保有する。かくして、本明細書中に記載される２つのウサギを用いて得られた結果は、ヒトアテローム性動脈硬化症に対する直接的関連性を有する。
実施例８ ＷＨＨＬウサギにおけるペプチド投与の効果
ペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２の単一投与は内皮機能および血漿コレステロールの減少に対して劇的な効果を発揮し、他方、対照ペプチドは不活性であったことは従前に示されている（Ｃｉｒｃ．２００５；１１１：３１１２−３１１８）。該ペプチドはＷＨＨＬウサギからのＬＤＬと会合し、ＬＤＬ表面電荷を修飾し、脂質ヒドロペルオキシド（シーディング分子）を除去する。該ペプチドはＬＤＬ−Ｒ（ヌル）マウスからの血漿ＬＤＬと会合しないので、該ペプチドがヒト高リポ蛋白質血症についてのモデルであるＷＨＨＬウサギからの血漿ＬＤＬと会合することができるかを決定するために研究を開発した。１００μｇの１２５Ｉ−標識ペプチドを６月齢ＷＨＨＬウサギからの１ｍｌの血漿と混合した。室温における１時間のインキュベーションの後、血漿をＣＬｉＰ分析に付した（６６）。異なる画分における放射能を決定し、ＣＬｉＰプロフィールについてプロットした。結果は、該ペプチドがＷＨＨＬ血漿に存在するリポ蛋白質の主なクラスであるＬＤＬと会合することを示した。ペプチド処理ＷＨＨＬ血漿ＬＤＬは、未処理ＷＨＨＬウサギからの血漿と比較して、低下した量のＬＯＯＨを含有する。Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２の単一のボーラス（１５ｍｇ／ｋｇ静脈内）投与は、ＷＨＨＬウサギにおいて、１８時間において血漿コレステロールレベルを５６２±２９ｍｇ／ｄｌから２８７±２２ｍｇ／ｄｌに低下させたのみならず、動脈内皮機能を有意に改善した。この改善は酸化的ストレスの２つのマーカーの低下に関連した。まず、血漿脂質ヒドロペルオキシド含有量は有意に低下し、これは、ＨＤＬパラオキソナーゼ活性の５倍増加に関連する効果であった。第２に、酸化窒素のスカベンジャーであるスーパーオキシドアニオンの形成もまたこれらの動物の動脈において有意に低下した。
脂質異常症および内皮機能不全はアテローム性動脈硬化症の疾患プロセスの共通の特徴であるので、これらのユニークなペプチドは、アテローム性動脈硬化症を緩和する理想的な複合特性を有する。ヒトでのアポＡ−ＩＭｉｌａｎｏｌｉｐｉｄ複合体注入研究についての報告により（Ｎｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ ２９０：２２９２−２３００ ２００３）、ＨＤＬが基となる療法の関心は増大した。アポＡ−ＩＭｉｌａｎｏについて記載される結果は有意であるが、注入される蛋白質：脂質複合体の量（蛋白質単独＋リン脂質の４０ｍｇ／ｋｇ）のため、そのような治療のコストは膨大である。これに関して、本結果は、両親媒性らせん状ペプチドの単一投与は、血漿コレステロールレベルを劇的に低下させ、内皮機能を改善するのに有効であることを示す。多量のペプチドを産生することができ、ペプチドは、脂質なくして投与して、インビボにて抗アテローム形成効果に対して鍵となる寄与的因子を達成することができる。
１％コレステロール食事に対するＮＺＷウサギへのペプチド投与の効果
上記結果は、該ペプチドが、肝臓クリアランスを高めることにおいて、およびＨＤＬ機能を改善することにおいて、アテローム形成性ＬＤＬに対して効果を発揮することを示す。非常に少量のクラスＡ両親媒性らせん状ペプチドであるＤ−４Ｆは、いくつかのＨＤＬ特性を修飾することが示されている（Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：３２１５−３２２ ２００４）。Ｄ−４Ｆは、ＨＤＬを再組織化して、脂質ヒドロペルオキシドを破壊し、それにより、逆コレステロール輸送を高めることにおいて高度に有効である「前βＨＤＬ様」粒子を生じさせる。ＮＺＷウサギに対して、異なる量のコレステロールを含有する食事を用いて、高コレステロール血症および相対的ＬＤＬおよびβ−ＶＬＤＬ産生について研究が行われている（Ｈｏｌｖｏｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：２３７６−２３８２ １９９７）。かくして０．１２５％（ｗ／ｗ）コレステロール食事に関しては、ＬＤＬコレステロールレベルは増大し；食事における０．５％以上のコレステロールレベルに関しては、（アポＢ−１００を含有する）β−ＶＬＤＬは劇的に増加する。これらのβ−ＶＬＤＬ粒子は増大した量の酸化された脂質を含有し、かくして、アテローム性動脈硬化症の進行を高める（Ｈｏｌｖｏｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：２３７６−２３８２ １９９７）。このウサギモデルにおいてペプチドの効果を評価するために、１％コレステロール食事を与えたＮＺＷウサギを利用した。
高コレステロール食事に応答するウサギを食事の開始から一週間後にランダム化して、同様な応答（同様な量の合計血漿コレステロール）を有するウサギを選択した。食事の開始から１５日後に、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、ウサギに全研究期間、高脂肪食事を続けた。最初の投与から１４日後に、血漿試料をペプチド投与ウサギおよび生理食塩水投与（対照）ウサギ（各群においてｎ＝３）双方から採取した。ペプチド投与ウサギからの血漿試料は混濁せず、他方、対照ウサギからの血漿試料は混濁していた。有意に減少した量のＶＬＤＬおよびＬＤＬも明らかであった。ペプチド投与群および対照からの代表的なウサギのカラムリポ蛋白質プロフィールは、アテローム形成性リポ蛋白質のレベルが減少したことを示す。第２の用量のペプチドを最初の処理から１５日後に投与した。コレステロールレベルはペプチド投与ウサギにおいて第２の投与から２週間後に低いままであったので、これらのウサギおよび生理食塩水投与ウサギを食事の開始から５１日後に屠殺した。ペプチド投与ウサギおよび対照ウサギからの大動脈をオイルレッドＯで染色した。ペプチド投与ウサギからの大動脈は、対照ウサギからの大動脈よりも４０〜５０％少ない病変を有した。
より短い間隔でペプチドの累積的効果を調べるために、僅かに異なるプロトコルを使用した。１週間の１％コレステロール食事投与に際して同様な血漿コレステロールを有するウサギを選択した。ペプチド（７．５ｍｇ／ｋｇ）を２つの間隔（最初は高脂肪食事開始から１週間後、第２は最初のペプチド投与から１週間後）で静脈内投与した。血漿コレステロールレベルは、ペプチドの投与の時点、第２の投与の前に、および第２の投与から１週間後に決定した。結果は、ペプチド処理ウサギにおいて、血漿コレステロールは実験の最後において対照ウサギよりも５０％少なかったことを示す（図１１）。血漿コレステロールレベルに対するペプチドの効果は、循環からのペプチドの消失の後においてさえ観察される（図１１参照）。３ｍｇ／ｋｇの放射性標識ペプチドを用いて、代謝回転研究は、該ペプチドの血漿クリアランス（図１２）がＷＨＨＬウサギで観察されたものよりもかなり早いことを示した。これは、血漿コレステロール降下が、該ペプチドが血漿区画から消失した後においてさえ継続することを示唆する。
したがって、アテローム形成性リポ蛋白質のクリアランスについての可能な理由は、アポＥの特性と同様な迅速な肝臓クリアランスに加えて、ＨＤＬ特性の調節、またはマクロファージアポＥの合成であり得る。これが真実であれば、このペプチドはまた、内皮機能に関してその効果を発揮することができる可能性がある。事実、アセチルコリン用量依存性大動脈弛緩によって研究したように、内皮機能の回復があることが観察された（図１３）。１％コレステロール食事投与から５１日後に（コレステロールレベル２０００ｍｇ／ｄｌを有する）対照ウサギは内皮機能を完全に喪失したが、ペプチド投与ウサギからの大動脈リングは、通常の食事でのウサギから得られた大動脈とほとんど同様な血管応答を示す（図１２）。これらの結果は、該ペプチドがスーパーオキシドアニオンの生成を阻害することによってか、または現在未知のメカニズムによって作用できることを示す。脂質降下は酸化的ストレスの低下を引き起こすことができ、かくして、内皮活性化の阻害を引き起こすことができる可能性がある。
実施例９ インビトロおよびインビボ研究における単一ドメインカチオン性ペプチドの概念
１８Ａ（配列番号１１）に共有結合により連結された、アポＥ推定受容体結合ドメインからの配列であるＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ（配列番号１）を有するデュアルドメインペプチドは、アポＢ含有リポ蛋白質の取り込みおよび分解を高める。過去の合成モデル溶解ペプチド（１８Ｌ、図１４）は赤血球細胞を溶解することができることは従前に示されている（Ａｉｋａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：１３９０−１３９６ ２００２）。また、Ｌｙｓ残基がＡｒｇによって置き換えられる場合、Ｌｙｓ含有ペプチドと比較して、得られたＡｒｇ含有ペプチドは２％に過ぎない溶解を有することが従前に示されている（Ａｉｋａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：１３９０−１３９６ ２００２）。非極性面の中心における中心芳香族残基プラスターは脂質ヒドロペルオキシドを捕捉することができ、かくして、得られたペプチドは抗炎症特性を呈することができるという考えに基づき、元のＲ１８Ｌを修飾した（図１５）。芳香族残基を非極性面の中心に組み込むための１８Ｌの非極性面の再編成によって１８Ｌ−２Ｙが生じる。（放射性標識のための）Ｔｙｒの添加によって、１８Ｌ−２Ｙが生じる（図１５）。全てのＬｙｓ残基をＡｒｇに変えると、Ｒ１８Ｌ２Ｙをもたらす（図１５）。１８Ｌ２ＹおよびＲ１８Ｌ−２Ｙのコレステロール低下特性を、アポＥヌルマウスにおいて比較し、これらの結果を図１６に示す。Ａｒｇ含有ペプチドＲ１８Ｌ−２Ｙは、１８Ｌ−２Ｙと比較して血漿コレステロールを除去する増大した能力を有した（図１６）。
また、経口投与されたクラスＡペプチド（Ｄ−４Ｆ）は、たとえ該ペプチドの生物学的利用性はナノモル量に過ぎないかったが、アポＥヌルマウスにおいてアテローム性動脈硬化症を阻害することも観察された。これは、血漿コレステロールレベルの変化がない状態で起こる。π電子密度クラスターはこのＲ１８Ｌ−２Ｙペプチドに組み込まれ、該ペプチドは極性面上の正に荷電したＡｒｇ残基の存在のため細胞表面プロテオグリカンと会合でき、腸を横切っても血漿に進入するので、血漿コレステロールレベルの減少が観察された。図１７に示されるように、（図１７に記載されるように餌と混合され、投与される）Ｒ１８Ｌ−２Ｙの経口投与は、１５日目および３０日目おいてコレステロールレベルの有意な減少を示した。これらの結果に基づき、ペプチド１８Ｌ−２ＹおよびＲ１８Ｌ−２Ｙを通常の餌と混合し（４ｇの餌に対し１ｍｇのペプチド）、４週齢雌アポＥヌルマウスに自由に与えた。研究は６週間継続した。研究期間の最後に動物を安楽死させ、各動物からの大動脈洞をオイルレッドＯを用いてアテローム性動脈硬化プラーク発生について分析した。図８に示すように、（他の２つの群はそうでないが）Ｒ１８Ｌ−２Ｙ処理群は対照マウスおよび１８Ｌ−２Ｙ処理マウス双方と比較して有意に小さな病変形成を有した。図１８に示すように、血漿コレステロールもまたＲ−１８Ｌ−２Ｙ群において有意に低下したが、他の２つの群ではそうでなかった。
実施例１０
アテローム形成を阻害し、血漿コレステロールレベルを減少させ、リポ蛋白質変化による内被細胞機能、特に、ＨＤＬ機能を改善するための２つの主な経路の研究を以下に記載する。本実施例は、上記したペプチドの例、特に、インビボでのデュアル特性、アテローム形成性リポ蛋白質の迅速な肝臓クリアランス、および内皮機能の改変を調節することができる薬剤として、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２（配列番号１２）、Ａｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２（配列番号６３）、およびＲ１８Ｌ−２Ｙ（配列番号６２）に焦点を当てる。総じての設計を図１０に模式的に記載する。その模式図は、カチオン性ペプチドと血漿リポ蛋白質との相互作用に際して、いくつかの変化が起こることを示す。（１）ペプチドはアポＢ含有アテローム形成性リポ蛋白質粒子と相互作用して、正に荷電したドメインを組み込む。次いで、これは、肝臓細胞表面の受容体によって認識され、これらのアテローム形成性リポ蛋白質は循環から除去され、かくして、アテローム性動脈硬化症を阻害する。（２）ペプチドは血漿中のＨＤＬを修飾して、ＰＯＮ活性を増大させ、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）レベルを減少させる（Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：３２１５−３２２０ ２００４）。より低い血漿ＬＯＯＨレベルは増大した機能的酸化窒素（ＮＯ）レベル、および脂質異常症動物モデルにおける内皮機能の回復を導く。単球走化性蛋白質−１（ＭＣＰ−１）合成の阻害は、したがって、低下した単球走化性およびマクロファージ蓄積をもたらすことができ、かくして、アテローム性動脈硬化症の阻害をもたらす。
ＨｅｐＧ２細胞、マウスおよびウサギ肝臓細胞におけるアポＢ含有リポ蛋白質の取り込み
ＨｅｐＧ２細胞で観察された結果は、ペプチドがアポＢ含有血漿リポ蛋白質と会合して、リポソーム表面上に正の電荷を組み込むことを示す。これによって、アポＢ含有リポ蛋白質がヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）と相互作用することが可能となる。マウスモデルおよび２つのウサギモデルにおける血漿コレステロールレベルの低下の様式に対するこれらのペプチドの効果は決定することができる。１％コレステロール食事を与えられたＮＺＷウサギにおいて血漿コレステロールの低下が観察され、これはペプチド投与後１４日間継続し、他方、ＷＨＨＬウサギにおいて、該低下は最初に迅速であり、３日以内に元のレベルに戻る。ＷＨＨＬウサギモデルはＬＤＬ受容体欠陥であるので、２つのモデルにおけるペプチドの異なる効果は、アテローム形成性リポ蛋白質の受容体媒介クリアランス経路の差によるものであり得る。ＨｅｐＧ２細胞、アポＥヌルマウスおよびＬＤＬ−Ｒヌルマウスからの肝臓細胞および初代ウサギ肝臓細胞を用いて、アテローム形成性リポ蛋白質の受容体媒介クリアランス経路における分子因子を決定することができる。
単離された肝臓細胞を、ペプチド：アポＢ含有リポ蛋白質複合体を用いて２つのマウスモデルから単離することができる（細胞表面リポ蛋白質受容体に対する該ペプチドの可能な効果を決定するため）。最初に、ヒト血漿リポ蛋白質を用いて、異なる動物モデルからの肝臓細胞における内在化の程度を決定することができる。これらの研究によって、肝臓細胞における共通性および差、ならびにリポ蛋白質表面を修飾するペプチドの能力を決定することができる。これらの修飾は、異なる肝臓細胞、およびペプチドＲ１８Ｌ−２Ｙ、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２およびＡｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２の存在下における取り込みおよび分解に相関させることができる。これらの複合体の取り込みおよび分解におけるＬＤＬ−Ｒ受容体およびＬＲＰ受容体の役割もまた決定することができる。該ペプチドが、ヘパリナーゼ／ヘパラチナーゼを用いるＨＳＰＧ媒介経路を介してアポＢ含有リポ蛋白質の取り込みおよび分解を高めるか否かは、Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：２１３−２２０ ２０００）によって記載されているように決定することができ、ならびにペプチドリポ蛋白質複合体が内在化されるか、どのメカニズムによってペプチドリポ蛋白質複合体が内在化されるか決定することができる。蛋白質分解を欠如する突然変異ＣＨＯ細胞（Ｅｓｋｏ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．，３：８０５−８１６ １９９１）を用いて、取り込みおよび分解におけるＨＳＰＧの役割も決定することができる。ＬＲＰの役割は、ＬＲＰ欠乏線維芽細胞を用いて研究することができる。これらの手法は、ヒト血漿ＬＤＬおよびＶＬＤＬ試料を用いるＤａｔｔａ ｅｔ ａｌ．によって記載されている（Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：２１３−２２０ ２０００；Ｄａｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２：９５９−９６６ ２００１）。ペプチドが投与されたマウスから単離したアポＢ含有リポ蛋白質（およびペプチド投与後、各々、３０分後および４時間以内により速いおよびより遅い時点でサンプリングした血液）の受容体会合能力に対するペプチド投与の効果を調べ、対照マウスからのアポＢ含有リポ蛋白質と比較される。これは、受容体リガンド相互作用ならびに酸化的状態の潜在的変化を同定するにはリポ蛋白質特性の注意深い特徴付けを必要とする。これらの実験のための対照は受容体を保有する正常な細胞系である。
ウサギにおいては、アポＡ−Ｉは腸で合成されるが、肝臓では合成されない（Ｐａｎ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９−１０４ １９８７）。かくして、これらの実験によって、アポＥのデノボ合成およびアテローム形成性アポＢ含有リポ蛋白質の取り込みの可能なメカニズムを決定することができる。ウサギ肝臓細胞研究において、高脂肪食事が与えられるペプチド投与ＷＨＨＬウサギおよびＮＺＷウサギから単離されたリポ蛋白質をこれらの研究で用いることができる。ＷＨＨＬウサギにおいては、受容体の欠陥のため、正常な受容体媒介アテローム形成性結合および取り込みに影響がある。かくして、いかなるアテローム形成性リポ蛋白質の取り込みもＨＳＰＧおよび／またはＬＲＰ経路によるものである。ペプチドでの処理は、リポ蛋白質の表面からＬＯＯＨを低下させるか、または排除さえすることができる。次いで、これらのリポ蛋白質を、ＨｅｐＧ２細胞において、およびウサギ肝臓細胞からの初代培養において、受容体媒介結合および取り込みについて研究することができる。ＬＯＯＨ単独の除去または低下がこれらのアテローム形成性リポ蛋白質の肝臓取り込みを変更できるかを決定するために、正の電荷をリポ蛋白質表面に組み込めないが、ＬＯＯＨレベルをなお低下させることができるペプチドを利用することができる。そのようなペプチドは４Ｆ（配列番号１７）、またはこのシリーズにおける他のクラスＡペプチドである（Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：３２１５−３２２０ ２００４）。この研究によって、アテローム形成性リポ蛋白質の取り込みを高める正に荷電したペプチドの取り込み対リポ蛋白質表面からのＬＯＯＨの除去または低下の間を区別することができる。これらの研究によって、かくして、クラスＡ部分または正に荷電したアポＥ部分（例えば、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ；配列番号１）、または２つの組み合わせが高められた肝臓取り込みを担うか否かを決定することができる。単一ドメインペプチドＲ１８Ｌ−２Ｙにおいて、これらの研究は、血漿ＬＯＯＨレベルを低下させるために非極性面を構成する情報を供給することができる。というのは、４Ｆは、カチオン性対それらの生物学的特性に対するクラスＡモチーフの間の差を決定するための対照ペプチドとしての役割を果たすからである。４ＦおよびＲ１８Ｌ−２Ｙの双方は、非極性面の中心にクラスター形成されたπ電子を保有する。ペプチドの観察は、２つのドメインを共有結合により連結することによって、その特性が２つのドメインの特性の単なる総和でなく、ユニークな特性を有するペプチドである新規な新しいペプチドが同定されたことを示す。アポＥヌルマウスおよびＬＤＬ−Ｒヌルマウスからの肝臓細胞の使用は、高められたアテローム形成性リポ蛋白質取り込みについてのＬＤＬ受容体、ＨＳＰＧおよび／またはＬＲＰ経路の役割についての情報を提供することもできる。これらの２つの系は、アポＥはアポＥヌルマウスの肝臓細胞においては合成されないので、その効果がどれくらいペプチドの直接的効果対内因性アポＥの高められた合成によるものであるかについての情報を提供することができる。これらの調査は、確立された細胞系の研究を補充するであろう。ウサギ肝臓細胞の使用は、ウサギにおけるアテローム形成性粒子の肝臓取り込みについての情報を与えるであろう。このように、ＷＨＨＬウサギおよびＮＺＷウサギからの肝臓細胞を用いてペプチド媒介取り込みを理解することができる。単一ドメインペプチドＲ１８Ｌ−２Ｙはアテローム性動脈硬化症を阻害し、全く異なるメカニズムでアポＢ含有リポ蛋白質を減少させる可能性がある。１４Ｃ−放射性標識ペプチドを用いて、我々は、図５、７および９に示すように、前β−ＨＤＬの合成、またはアポＥ、アポＡ−Ｉおよび可能性のある受容体のような抗アテローム形成性蛋白質の増大した合成のいずれかを介して、リサイクルし、および慢性抗アテローム形成特性を保有する各ペプチドの能力を決定する。
ペプチドが抗アテローム形成性蛋白質の合成を改変するかを決定するために、これらの動物モデルから得られたＨｅｐＧ２細胞および肝臓細胞をペプチドと共にインキュベートすることができ、蛋白質のレベルおよびｍＲＮＡレベルをこれらの蛋白質に対する適切なプライマーを用いて決定することができる。これらの系についての結果を図９に掲げる。２つのマウス（アポＥヌルマウスモデルおよびＬＤＬ−Ｒヌルマウスモデル）およびウサギモデルで見られた差、ＨｅｐＧ２細胞における前β−ＤＬ形態でのアポＡ−Ｉ合成の誘導についての結果（図５）（Ｄａｓｈｔｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：１９１９−１９２８ ２００４）に基づいて、以下の蛋白質、すなわち（ａ）アポＥ、（ｂ）ＬＤＬ−Ｒ、（ｃ）アポＡ−Ｉ、（ｄ）カイロミクロン−残留受容体、（ｅ）ＬＲＰ、（ｆ）ＬＰＬ、（ｇ）ＶＬＤＬ−Ｒの１以上の合成を研究することができる。ペプチドがリポ蛋白質の特性を改変するなら、蛋白質またはｍＲＮＡのレベルの差における変化はあり得ない。これらの研究によって、ペプチドの直接的および間接的抗アテローム形成効果を分離することができる。これらのモデルからの肝臓細胞の使用は、これらの２つの動物モデルにおけるペプチドの作用のメカニズムの可能な差を決定することもできる。
アテローム形成性リポ蛋白質の肝臓クリアランスは抗アテローム形成性と考えられるが、しかしながら、マクロファージ取り込みはアテローム発生性である。アポＥはアテローム形成性リポ蛋白質の肝臓取り込みを媒介することが示されている（Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４０：６２２−６３０ １９８８）。マクロファージはＬＰＬを培養基に分泌する。動脈壁におけるサイトカイン（インターロイキン）のようないくつかの因子は、マクロファージＬＰＬ発現を調節することができる。アポＥによるマクロファージＬＰＬ活性の阻害は、マクロファージによるリポ蛋白質残留物の取り込みを阻害するが、それらをアポＥ媒介肝臓取り込みに転換すると考えられている。ＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔおよびＷｉｔｚｔｕｍおよび共同研究者は、内皮細胞表面に存在するＬＰＬは、潜在的にアテローム形成性であり得る残留リポ蛋白質を生じさせることができることを示唆している（Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ６０：４７３−４８５（１９７９）；（Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１０１４３−１０１４７ １９９１）。これを記憶しつつ、ＬＰＬ活性を調節することにおけるインビトロでのペプチドの役割を決定することができる。従前に、クラスＡペプチドがＬＰＬ活性を調節することがインビトロで示されている（Ｃｈｕｎｅｇ．Ｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３７：１０９９−１１１２ １９９６）。双方のウサギモデルにおける主な予備的知見の１つは、該ペプチドが残留リポ蛋白質、およびＶＬＤＬの加速されたクリアランスを媒介することである。ペプチド投与ウサギからの血漿は濁度を示さず、他方、ペプチドで処理しなかったウサギからの血漿は濁度を示す。この結果は図１１および図１２中の結果によって裏付けされており、これは、ＶＬＤＬ様粒子が（１％コレステロール食事およびペプチドが投与された）ＮＺＷウサギおよびＷＨＨＬウサギにおいて有意に低下し、これは、（ＷＨＨＬにおける）血漿ＴＧレベルの有意な減少を示す。全血漿コレステロールレベルは、高コレステロール食事の継続給餌にもかかわらず、ペプチド処理ウサギにおいて増大しない。しかしながら、該ペプチドについての血漿滞留時間は図９に示すように比較的短い（ｔ１／２＝１〜２分）。該ペプチドが（ＷＨＨＬウサギからの血漿のような増大したＬＯＯＨレベルを含有する）ＶＬＤＬ、ＴＧＲＬＰ、修飾されたＬＤＬの蓄積をブロックするか否かを決定することができる。ｍＲＮＡおよび蛋白質のレベルを同一研究で決定することもできる。
ペプチドアナログが単球マクロファージによるアポＢ含有リポ蛋白質の取り込みを阻害することによってその効果を発揮するか否か、および／またはそれらがコレステロール負荷マクロファージからのコレステロールの流出を促進するかも決定することができる。従前に公表された結果は、クラスＡ両親媒性らせん状ペプチドが、培養されたＴＨＰ−１単球由来マクロファージにおけるＶＬＤＬ誘導泡沫細胞形成の能力を阻害することを示す（Ｃｈｕｎｇ，Ｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３７：１０９９−１１１２ １９９６）。ＬＰＬ活性調節を決定するための手法およびＴＨＰ−１単球由来蓄積に関する効果はＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌによって詳細に記載されており、（Ｃｈｕｎｇ，Ｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３７：１０９９−１１１２ １９９６）、記載された研究を用いて、本ペプチドの効果を決定することができる。このように、（ペプチドの投与の有りまたは無しの）これらの２つのウサギモデルから単離されたＶＬＤＬは、単離されたＬＰＬと共にインキュベートすることができ、得られた遊離脂肪酸の量をＬＰＬ活性の差の指標として決定することができる。ペプチドが（ＬＰＬについて提案されているのと同様に）ＨＳＰＤに結合するなら、従前に提案されているように、アテローム形成性リポ蛋白質は結合することができ、ＬＤＬ受容体関連蛋白質を介して内在化することができる（Ｂｅｓｉｅｇｅｌ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：８３４２−８３４６ １９９１）。これらの研究は、単一ドメインおよびデュアルドメイン双方を用いて実行することができる。
結果は、アポＢ−４８を増強した３１−ＶＬＤＬがコレステロールを与えたウサギの血漿中に出現することも示す。該ペプチドによるアテローム性動脈硬化症の阻害は、ＴＧＲＬＰ／アポＢ−４８受容体によるこれらリポ蛋白質の高親和性取り込みに関与するアポＢドメインのマスキングによるものであり得る。アポＢ−４８のドメインはＴＧＲＬＰ／アポＢ−４８受容体の高親和性結合に十分であることが示されている（Ｂｒｏｗｎ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７４８８−７４９３（２０００））。これを念頭に置き、濃度依存様式で（５ｔｊｇ〜１００ｊｔｇ）、ペプチドの存在下、および非存在下で、１００ｔｊｇＴＧ／ｍｌ ｒｐｎｉにおける唯一のアポＢ−４８種としてのアポＢ４８を含むカイロミクロンＳｆ＞４００で３７℃にて３時間インキュベートし、次いで、細胞質中性脂質液滴を検出するためにオイルレッドＯで染色された、アポＢ４８受容体でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を行うことができる。ベクターのみでトランスフェクトされた細胞は、同一の条件下でカイロミクロンと共にインキュベートし、オイルレッドＯで染色することができる。
ペプチドがＬＤＬのアテローム形成特性（すなわち、単球走化性に対する効果）を下させ、（およびインビトロにて肝臓受容体結合特性を高める）か否かに関して、インビトロおよびインビボ双方の結果は、デュアルドメインペプチドがＨＤＬ特性を変化させることを示す。Ｄａｓｈｔｉ ｅｔ ａｌ．に記載された方法（Ｄａｓｈｔｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：１９１９−１９２８ ２００４）を用いて、アポＡ−Ｉの合成および可能性のあるメカニズムの増大があるかを決定することができる。従前の研究では、ペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２の結果、ＨＤＬにおいて増大したＰＯＮ活性がもたらされ、これは、脂質ヒドロペルオキシドを破壊する。これらの変化が単球走化性蛋白質、およびＶＣＡＭ−１のような接着分子のレベルを改変するか否かもまた決定することができる。（図６）。予備的研究は、これらのペプチドがＬＤＬのアテローム形成特性を低下させることにおいてかなり大きな有効性を有するであろうことを示す。
ペプチド投与ウサギおよび対照ウサギから単離されたリポ蛋白質を用いて、ＬＤＬ（またはＶＬＤＬ）媒介単球走化性の程度を、（Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，４１：１４９５−１５０８ ２０００；Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０５：２９０−３０２ ２００２）に記載されているような内皮細胞平滑筋細胞共培養系を用いて決定することができる。培養された肝臓細胞を用いて、ペプチドの存在が、ペプチドで処理したウサギおよび対照ウサギからのアテローム形成性リポ蛋白質の取り込みを高めるか否かも決定することができる。
実施例１１ アポＡ−ＩおよびアポＥ含有粒子ならびにそれらの抗炎症特性における変化
アポＡ−ＩおよびアポＥ含有ペプチドならびにそれらの抗炎症特性における変化は、ＳＤＳ勾配ゲルにより異なるアポリポ蛋白質のレベルについて細胞上清を分析し、異なるアポリポ蛋白質に対するウエスタンブロッティング後の定量について、バンドをスキャンすることによって決定することができる。上記のように、異なる蛋白質を用いて分泌されたリポ蛋白質の変化を決定することができる。前３１ ＨＤＬの産生は、アポＢ含有リポ蛋白質の表面からの脂質ヒドロペルオキシドのクリアランスの点でＨＤＬサブ集団の増大した有利な効果と相関される。これらはＬＤＬ誘導単球走化性の阻害に関連する。酸化されたＬＤＬのレベルの低下は、サイトカインおよび接着分子の産生を阻害することが示されている。先に論じたように、ｍＲＮＡレベルがアポリポ蛋白質の増大したレベルに相関するか否かを決定することができる。これらの研究によって、ｍＲＮＡレベルに対する効果によるか、または単に増大した分泌による蛋白質合成の増大、および（分解とは反対に）公開された結果（Ｄａｓｈｔｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：１９１９−１９２８ ２００４）によって示されるように増大したリン脂質レベルによる蛋白質合成の増大の間を区別することができる。Ｄａｓｈｔｉらによって公表された方法（Ｄａｓｈｔｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：１９１９−１９２８ ２００４）を用いて、抗アテローム形成性であることが示されているアポリポ蛋白質Ａ−Ｉおよびアポリポ蛋白質Ｅのレベルの可能な変化に対する異なるペプチドの効果を決定することができる。新しい蛋白質の合成に続いて、３５Ｓ−メチオニンで標識された細胞をＤａｓｈｔｉらによって記載されているように用いることができる（Ｄａｓｈｔｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：１９１９−１９２８ ２００４）。３Ｈ−グリセロールを用いて、ペプチドインキュベーションに際して脂質組成の変化を決定することができる。ＨｅｐＧ２を無血清ＭＥＭ中でインキュベートすることができ、ペプチドの存在下および非存在下における脂質の異なるプールへの３Ｈ−グリセロール（５μＣｉ）の取り込みを、ペプチドとのインキュベーションから５時間後に決定することができる。培地、および細胞に存在する細胞は、Ｆｏｌｃｈらの方法によって抽出することができる（Ｆｏｌｃｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７−５０９ １９５７）。次いで、最終の抽出物は、従前に記載されたようにＴＬＣによって分析することができる（Ｄａｓｈｔｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４５：１９１９−１９２８ ２００４）。
実施例１２ 血漿コレステロールレベル、アテローム性動脈硬化症の動物モデルにおける病変阻害、およびＨＤＬ特性の調節に対するペプチドの効果
２つのマウスモデルを用いて、アテローム性動脈硬化症に対する、すなわち、餌を与えるアポＥヌルマウス、およびウエスタンダイエットを与えるＬＤＬ−Ｒヌルマウスに対する異なるペプチドの効果を研究することができる。アポＥヌルマウスは正常な餌にて自然発生的にアテローム性動脈硬化症を発症し、病変は、４〜６週の年齢で大動脈洞において形成し始める。１６週齢において、よく画定された病変が大動脈洞に形成される。このマウスモデルを用いて、４週齢においてペプチド投与を開始し、６週間投与することができる。後眼窩投与および尾静脈による投与によって、血漿コレステロールの減少が明らかになった。アテローム性動脈硬化症のマウスモデル（ＬＤＬ−ＲヌルマウスおよびアポＥヌルマウス）において、ペプチドを、上記のように、図２において、後眼窩投与することができる（５０μｇ／マウス）。この方法は、多数回のペプチドの投与を動物の健康に対する影響を最小にして可能とする。ペプチドは、まず、アポＥヌルマウスおよびＬＤＬ−Ｒヌルマウス（ウエスタンダイエット中）に静脈内投与することができ、血漿コレステロールレベルを低下させるこれらのペプチドの能力を比較することができる。血漿コレステロールレベルの低下の迅速相におけるこれらのペプチドの能力を決定するために、血漿コレステロールレベルを２分、３０分、１時間、４時間、８時間および一晩測定することができる。１４Ｃ−放射性標識ペプチドを用いて、血漿区画からのペプチド消失の動力学を決定することができる。異なるペプチドの器官分布もまた決定することもできる。
病変阻害に対する効果は、従前に記載された手法を用い、通常の餌を与えるアポＥヌルマウスおよびウエスタンダイエットを与えるＬＤＬ−Ｒ受容体ヌルマウスにおいて研究を行うことによって決定することができる。２５匹の動物を各群で用いることができる。ＬＤＬ−Ｒヌルマウスにおいては、それらにウエスタンダイエットを与えた場合にのみ病変が発生するので、生じた病変のタイプは異なり得る。かくして、ペプチドの投与に際しての病変の注意深い分析は、これらのペプチドがアテローム性動脈硬化症を阻害するメカニズムの可能な差を提供することができる。
加えて、病変の形態学は、ウサギにおける食事コレステロールによって選択的に改変することができる。文献および上記した結果に基づくと、１％コレステロール食事を与えたＮＺＷウサギは、マクロファージ由来泡沫細胞よりなる病変を発症し得る。ウサギにおける初期の泡沫細胞病変はヒトの脂肪線条に似ているが、これらの病変は後者とは異なると予想され、進行したヒト病変で見出される繊維状またはアテローム様プラークを形成する。しかしながら、食事中の低レベルのコレステロールへの長期間曝露は、動物の数の増加によって補われる、進行した繊維状プラークを含めた変動を増大させることが示されている。ペプチドがアテローム性動脈硬化症を低下させる分子事象を決定するために、２つの用量のペプチドを用いる対照ウサギおよびペプチド投与ウサギからの病変のマクロファージ含有量の差を決定することができる。ペプチドが病変形成に対して直接的に作用するなら、これらの２つの用量は異なる数のマクロファージ泡沫細胞を生じさせる。ペプチドがアテローム性動脈硬化症を低下させることにおいて間接的に作用するなら、２つの用量は同様なマクロファージ泡沫細胞数／病変面積を提供することができる。組織的分析は、脂質、（抗マクロファージモノクローナル抗体Ｒａｍ−１１を用いる）マクロファージ、および平滑筋細胞（ＳＭＣが豊富な繊維状キャップ形成を決定するために平滑筋細胞特異的アクチンに指向された、モノクローナル抗体ＨＨＦ−３）についての染色を含み、平滑筋移動の差は、内皮細胞機能不全を修正することに関連するペプチド投与の結果であり得る。
（ペプチドを与えていない）対照ウサギと比較して、高脂肪食事の養生法の間に血漿コレステロールおよびアテローム形成性リポ蛋白質レベルを減少させることによって、ペプチドがアテローム性動脈硬化病変の形成を阻害するか否かを決定することができる。これらの研究のために、食事に応答するＮＺＷウサギを選択することができる。全ての動物に１％コレステロール食事を与え、それらのコレステロール値を食事開始から３日後に決定する。同様なコレステロールレベルを有する２０匹のウサギを選択し、正常な食事に戻すことができる。正常な食事の１５日後に、コレステロール値を一旦再度決定して、値が正常に戻ったかをチェックすることができる。コレステロール値が食事前の値に戻らなかった動物を、正常となるか、または研究から除くまで、モニタリングすることができる。各群において１０匹のウサギを選択し、同時ペプチド投与および１％食事開始を続けることができる。予備的研究においては、日平均食物摂取および体重は、１％コレステロール食事の６週間後、およびペプチド投与（３ｍｇ／ｋｇ）から１月後においてさえ、対照およびペプチド投与群の間で有意に異ならなかった（対照群食物摂取は０．１６±０．０２ｋｇであり、平均体重は４．４５±０．２７ｋｇであり、ペプチド投与群においては平均食物摂取は０．１７±０．０３ｋｇであって、平均体重は４．８±０．４ｋｇであった）。用量応答効果を研究するために、より少数の数の動物（各群において５匹）に３用量のペプチドを投与することができる（５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇ）。最初の実験の後、ペプチドの用量を決定することができる。ペプチドの溶液（滅菌生理食塩水）を、耳静脈を通じて、研究の継続の間に１週間に１回注射することができる（従前の経験に基づき６週間）。研究パラメーターは全コレステロール、リポ蛋白質レベル、ＬＯＯＨレベル、血漿中のＰＯＮ活性を含む。６週間の最後において、ウサギを安楽死させ、組織学を評価する。
実施例１３ ＨＤＬ特性の調節
ＬＤＬの酸化は、血管の構造および機能の双方の変化に関連する。内皮細胞の活性化は、コレステロールの蓄積も増強させる接着分子、ならびにＶＣＡＭ−１、ＭＣＰ−１のようなケモカインの増大した発現に導く。これらの条件下で、反応性酸素種（ＲＯＳ）の増大した形成があり、その結果、内皮ＮＯの低下したレベルがもたらされる（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：１０４４−１０４８ １９９４；Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：８７４５−８７４９ １９９６）。ＷＨＨＬウサギにおいて、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２はアテローム形成性リポ蛋白質レベルを減少させるのみならず、現存するＨＤＬを再構成して、増大したＰＯＮ活性を有する、アポＡ−Ｉ含有粒子およびペプチド含有粒子を形成することが示されている。この粒子は、増加したＰＯＮ活性のため除去される脂質ヒドロペルオキシドを動員することもできる。ＬＤＬ酸化の阻害は単球走化性を阻害し、かくして、血管壁におけるその蓄積および病変形成を妨げる（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：８７４５−８７４９ １９９６）。クラスＡペプチドの研究に関するいくつかの刊行物は、マウスおよびサルモデルにおけるＨＤＬの再形成を示した。
血漿ＨＤＬの低下は、逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）の損傷に関連している。この結果、動脈壁内への細胞由来コレステロールの蓄積がもたらされ、これは、進行した頸動脈内膜媒体の増粘およびアテローム性動脈硬化症の顕著な感受性に現れる（Ｃｌｅｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１２６３−１２７０ ２０００）。低ＨＤＬを有する被験体におけるＨＤＬの増加は、アテローム形成性リポ蛋白質の除去／クリアランスを容易とし、内皮の機能を改善する（Ｂｉｓｏｅｎｄｉａｌ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０７：２９４４−２９４８ ２００３；Ｃａｌａｂｒｅｓｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３：１７２４−１７３１ ２００３；Ｋａｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４４：１３１１−１３１９ ２００４）。ペプチドはアポＡ−ＩおよびＰＯＮを動員することによってＨＤＬ機能を改善し（図１９）、血管壁からのアテローム形成性リポ蛋白質の除去を容易にすることによって内皮機能を保護すると考えられている。ＬＯＯＨの除去はＰＯＮ活性を増大させ、ＰＯＮ、ｍＲＮＡレベルまたはＰＯＮ蛋白質のレベルを増大させない。この回復が起こるメカニズムは、Ｎａｖａｂらによって記載されている手法を用いてＲＣＴに対するペプチドの効果を調べることによって決定することができる（Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：３２１５−３２２０（２００４）；Ｒａｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｂｉｏｌｏｇｙ．９２：４２Ｊ−４９Ｊ（２００３））。ウサギモデルにおいては、胆汁塩およびコレステロールエステルとして排出されるコレステロールの量は、Ｎａｖａｂらによって記載される方法を用いて調べることができる（Ｎａｖａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１１０：１２０−１２５ ２００４）。Ｊ７７４マクロファージへのＡＢＣＡ１媒介コレステロール流出に対するペプチドの効果もまた調べることができる。マクロファージＡＢＣＡ１発現は、ＲＴ−ＰＣＲおよびウスタンブロットによって決定することができる。マクロファージは、１０％ＦＤＳを含有するＤＭＥＭ中の１２ウェルプレートに、２×１０６細胞／ウェルの密度で播種し、一晩付着させる。平板培養から２４時間後に、Ｓｐａｒｒｏｗらのモデルにしたがって、細胞を３Ｈ−コレステロール（１０μＣｉ）で標識する。さらなる２４時間の後に、細胞を洗浄し、培地を、０．１％ＢＳＡを含有する無血清培地で交換することができる。研究は、ｃＡＭＰのブロモ誘導体の存在下または非存在下で行って、ＡＢＣＡ１媒介コレステロール流出、およびミクロ可溶化によるコレステロール流出を決定することができる。コレステロール流出は、ペプチドまたは精製されたＡ−１の添加によってさらに２４時間刺激することができる。次いで、培地を回収し、０．５％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳに細胞を可溶化することができる。次いで、培地および可溶化された細胞のアリコートにおける放射能を測定することができる。コレステロール流出は、培地中の放射能カウントを合計カウントのパーセンテージとして測定することによって分析することができる。アポＡ−ＩにおけるＴｙｒの塩素化またはニトロ化は機能不全のアポＡ−Ｉを生じることが示されている（Ｃｏｎｓｔａｎｚｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１３０３２−１３０３７，２００４）。放射性トレーサーペプチドをいくつかの状況で用いることができる。ペプチドのヨウ素化が該ペプチドの特性を改変する場合、１４Ｃ標識ペプチドは、１４Ｃ−酢酸を用いて該ペプチドをアセチル化することによって用いることができる。
パラオキサナーゼ（ＰＯＮ）の測定を行うこともできる。ＨＤＬの抗オキシダント能力は、主として、酵素ＰＯＮの存在によるものである。ＰＯＮ−１についての遺伝子を過剰発現するマウスから単離されたＨＤＬは、銅によって誘導されたＬＯＯＨ形成に対してかなり抵抗性である（Ｖａｌａｂｈｊｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０１：６５９−６７０ ２００１）。ＰＯＮ活性の減少は、レプチン欠乏マウスおよびＬＤＬ受容体欠乏マウスならびに糖尿病ヒトにおける脂質異常症およびインスリン抵抗性に関連する（Ｖａｌａｂｈｊｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１０１：６５９−６７０ ２００１；Ｇｒｉｅｎｄｌｉｎｇ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８６：４９４−５０１ ２０００；Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０７：１６４０−１６４６ ２００３；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ．１４：２７−３６ ２００１；Ｑｕｙｙｕｍｉ，Ａ．Ａ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０５：３２Ｓ−３９Ｓ １９９８； Ｈａｌｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０６：６５３−６５８，２００２）。これを念頭に置き、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２、Ａｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２、およびＲ１８Ｌ−２Ｙの長期投与が血漿中のＰＯＮ活性、および２つのウサギモデルの単離されたリポ蛋白質画分を増大させるか否かを決定することができる。ＰＯＮ活性は、基質としてのパラオキソンン（Ｏ，Ｏ−ジエチル−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルフォスフェート；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて決定することができる。
ペプチド投与が内皮機能を改善するか否かも決定することができる。内皮機能は炎症およびアテローム形成の条件下で影響を受ける（Ｑｕｙｙｕｍｉ，Ａ．Ａ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０５：３２Ｓ−３９Ｓ １９９８；Ｈａｌｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０６：６５３−６５８，２００２）。リポ蛋白質代謝および血管反応性における欠陥は、高コレステロール血症に対する基本的な病理学的応答である。広範な証拠が、ＲＯＳがこれらの病変の開始および進行において重要な役割を果たすことを示唆する（Ｇｒｉｅｎｄｌｉｎｇ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅｒａｃｈ．８６：４９４−５０１ ２０００）。アテローム性動脈硬化症患者および高コレステロール血症動物モデルからの血管は損なわれた内皮依存性弛緩を呈する（Ｑｕｙｙｕｍｉ，Ａ．Ａ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０５：３２Ｓ−３９Ｓ １９９８；Ｈａｌｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０６：６５３−６５８，２００２）。ＮＯはスーパーオキシドアニオン（Ｏ２）とのその反応を介して高脂血症環境において修飾され、その結果、低下したＮＯ生物活性がもたらされ、優れたオキシダントペルオキシニトライト（ＯＮＯＯ）を生じる（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：１０４４−１０４８ １９９４）。ＯＮＯＯは、ＮＯの有利な生理学的作用を低下させ、リポ蛋白質を酸化することによってアテローム形成を促進し得る（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：１０４４−１０４８ １９９４）。ＨＤＬ機能の改善の結果、ＬＤＬのアテローム形成の減少がもたらされ得るが、これはＬＤＬを（スカベンジャー受容体取り込みとは反対に）正常な取り込みに指向することができ、かくして、血漿コレステロール降下に指向することができる。これらの変化は、内皮由来ＮＯ生物活性を増大させると予測される。
抗炎症特性に対するペプチドの効果もまた決定することができる。内皮機能不全はアテローム性動脈硬化症の初期の特徴である（Ｑｕｙｙｕｍｉ，Ａ．Ａ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０５：３２Ｓ−３９Ｓ １９９８）。それは、冠動脈疾患を有するまたは有さない患者において重要な独立した臨床的予後指標である。さらに、内皮機能の改善は、改善された臨床的結果に関連する。内皮は、血管トーン維持、アテローム性動脈硬化症に関連する血栓症および炎症経路を含めた多様な病理生理学的プロセスに参画することによって血管ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす（Ｈａｌｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０６：６５３−６５８ ２００２）。内皮機能不全は、脂質異常症、高血圧、喫煙および、恐らくは、遺伝的影響および環境的影響を含めた多数の因子に関連する。種々の医薬介入のうち、アンギオテンシン阻害剤およびスタチンの使用は内皮機能の改善に関連する。スタチンの有利な作用は、合計血漿コレステロールおよびＬＤＬの降下に関連する。依然として、アテローム性動脈硬化症に関連する有意な死亡率および有病率がある。アテローム性動脈硬化症の広く認められた理論の１つは、酸化されたＬＤＬが内皮機能不全を引き起こし、平滑筋細胞への、および細胞増殖における損傷に至る「損失に対する応答」の仮説である。したがって、アテローム性動脈硬化症の鍵となる特徴は、内皮への、および内皮と通じての血液単球の動員、これらの単球のマクロファージへの活性化／分化、ならびに泡沫細胞を形成するためのマクロファージによる脂質およびリポ蛋白質の取り込みである。このように、ペプチド修飾ＨＤＬ構造および機能が内皮機能の改善に導くか否かを決定することができる（図１５）。コレステロール降下は、このように、高コレステロール血症ウサギの単離された動脈においてＮＯ生物学的利用性を有意に増大させることができる。また、該ペプチドが血管細胞においてプロオキシダント酵素の結合および／または発現を調節するか否かもテストすることができる。
ペプチド投与が高コレステロール血症ウサギの血管におけるスーパーオキシドの産生を低下させるか否かも決定することができる。酸化窒素は、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２）とのその相互作用を介して高脂血症環境において修飾されるようになり、その結果、減少した生理学的活性をもたらす（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０４４−１０４８ １９９４）。スーパーオキシドはプロオキシダント酵素（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなど）の活性化に応答して細胞内および細胞外の双方の区画で生じ、より膜浸透性かつ拡散可能なＮＯと反応し、優れたオキシダントペルオキシニトライト（ＯＮＯＯ）を生じる（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：８７４５−８７４９ １９９６；Ｇｒｉｅｎｄｌｉｎｇ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８６：４９４−５１０ ２０００）。上記の研究に対する帰結として、Ｏ２の生成はコエレンテラジン依存性ケミルミネセンスを用いて決定することができる。コエレンテラジンのＯ２依存性酸化の結果、それが基底状態に緩和するにしたがって光を発する高エネルギー中間体の形成をもたらす。ウサギ大動脈セグメント（およそ３ｍｍの広さ）を、２ｍｌの１０μＭコエレンテラジンＰＢＳを含有するバイアルに入れることができる。ベースラインＯ２の生成は、ルミノメーター（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を用いて、３０分間、３０秒毎に、ペプチド処理対照動物または生理食塩水処理対照動物からの組織においてモニタリングすることができる。バックグラウンドケミルミネセンスは、血管組織の不存在下においてコエレンテラジンＰＢＳの溶液中でモニタリングすることができる。対照実験において、Ｏ２生成に対するケミルミネセンスシグナルの特異性は、１００Ｕ／ｍＬ ＰＥＧ−ＳＯＤおよびＳＯＤミメティックテトラキス（Ｎ−エチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン（Ｔ２Ｅ）の添加によって確認することができる。これらの化合物は、各々、細胞外表面および細胞内空間に局所化され、Ｏ２を効果的に掃去する。該アッセイは、キサンチンオキシダーゼ（０．０５Ｕ）およびキサンチン（１０〜５０μｍｏｌ／Ｌ）によって生じた既知量のＯ２のケミルミネセンスシグナルをモニタリングすることによって較正される。これらのキサンチン／キサンチンオキシダーゼインキュベーション条件に関連したＯ２産生の速度は、フェリサイトクロームＣのＯ２依存性還元を測定することによって分光光度的に決定することができ、組織蛋白質に対して正規化することができる。
また、研究を行って、ペプチド投与が、コレステロールを与えたＮＺＷウサギおよびＷＨＨＬウサギの単離された動脈において血管ＮＯ放出を改善するか否かを決定することもできる。ペプチドまたは生理食塩水での慢性的処理に応答してのＮＯは、代謝産物ニトレート（ＮＯ３）およびニトライト（ＮＯ２）の形成をモニタリングすることによって評価することができる。大動脈リングセグメントは上記のように調製することができ、ＮＯＳ ＩＩＩのカルシウム依存性活性化を介して細胞ＮＯ形成を刺激するカルシウムイオノフォアである１μＭのＡ２３１８７を含有する０．５ｍｌのＰＢＳに入れることができる。２時間のインキュベーション期間の最後に、ＰＢＳの５０μｌ試料を収集することができる。この試料中のニトレートは、Ｅ．ｃｏｌｉ豊富化ニトレートレダクダーゼでの処理によって酵素的にＮＯ２まで還元することができる。合計ＮＯ２はＮＯ生成の指標として用いることができる（Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２７１５９−２７１６５ ２００１）。ニトライトはフルオロフォア２，３−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）を用いてｎＭ範囲で検出することができる。アルカリ性条件下で、ＤＮＡはＮＯ２を蛍光化合物１（Ｈ）−ナフトトリアゾールに変換する。次いで、ニトライト濃度は、１（Ｈ）−ナフトトリアゾールのスペクトロフルオロメトリック励起（３６０ｎｍ、４５０ｎｍにおける発光）によってモニタリングすることができる。蛍光強度値を濃度に変換するために、標準曲線をＮａＮＯ２（１−１，０００ｎＭ）について作成することができる。ニトライト形成は蛋白質濃度に対して正規化される。追加の実験において、ペプチド処理実験動物および生理食塩水処理実験動物から単離されたＮＯ代謝産物の血漿レベルを測定することができる。
さらなる研究を行って、ペプチドの投与がコレステロールを与えたＮＷＺウサギおよびＷＨＨＬウサギの動脈におけるプロオキシダント酵素の発現／活性に影響するか否かを決定することもできる。従前の研究は、コレステロールを与えたＮＺＷウサギにおける血漿コレステロールの増加が、循環へのプロオキシダント酵素キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）の放出、および血管内皮上のＨＳＰＧ結合部位におけるその濃度に関連することを示した（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：８７４５−８７４９ １９９６；Ａｄａｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．２８９（２）：５２３−５２７ １９９３）。この部位において、ＸＯはＯ２の源としての役割を果たし内皮機能不全の発症にの原因となった。ＸＯ結合と関連する弛緩の阻害は、ヘパリン、アロプルリノール、およびキメラヘパリン結合スーパーオキシドジスムターゼの添加によって逆行させることができた。ヒトの血管病変におけるＸＯの同定は、酵素がアテローム性動脈硬化症の治療的処置のための臨床的に関連する標的であり得ることを示唆する（Ｓｗａｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６８（３）：５１３−５１５ １９９５）。これは、ヒトにおけるＸＯ阻害剤オキシプリノールの注入がＨＣにおいて前腕血流を増大させるが、高血圧患者においてはそうでないという知見によって理解される（Ｃａｒｄｉｌｌｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３０：５７−６３ １９９７）。
ウサギにおける血漿コレステロールの慢性的上昇が、循環キサンチンオキシダーゼ濃度の増大を誘導することが従前に報告されている。肝臓および腸は循環ＸＯの主な源である。肝臓へのコレステロール蓄積は、肝臓細胞の損失、およびキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）のキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）に対する増大した変換に関連する。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の増大した血漿レベルは、加えて、循環におけるＸＯ放出に関連する。循環ＸＯは内皮細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＢＤ）に容易に結合し、取り込まれ、かくして、遠位部位における細胞外区画および細胞内区画の双方において酸化的損失を誘導する。ペプチドの投与により、２つのメカニズムを介して血管保護効果が発揮され得る。まず、上に示したように、ペプチド投与は、高コレステロール血漿ウサギにおけるコレステロール誘導肝臓の損失、および循環血漿ＸＯの活性を低下させると予測される合計血漿コレステロールを有効に低下させる。加えて、ペプチドは、ＨＳＰＧと相互作用するその能力によって、ＸＯと競合し、それを同じ細胞表面結合部位から移動させることができる。この動作は、内皮に対するＸＯ媒介オキシダント損失、および基礎となるＶＳＭＣを低下させることができる。これらの条件下で、循環ＸＯ活性は増大させることができるが、長期ペプチド処理は内皮細胞へのＸＯ結合を妨げることができ、この部位におけるＲＯＳの形成を低下させる。対照ウサギおよび高コレステロール血症ウサギからの血漿および組織のキサンチンオキシダーゼ活性は、ＨＰＬＣを用いて測定することができる（Ｗｈｉｔｅ．Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：８７４５−８７４９ １９９６）。屠殺の際に、血漿試料をテスト動物から入手し、直ちに−８０℃で凍結する。酵素活性の測定に先立って、次いで、内因性尿酸塩を、試料をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを通すことによって除去することができる。次いで、試料をオキソニン酸（２ｍＭ）で処理して、血漿ウリカーゼ活性を阻害することができるキサンチン（７５μＭ）を加えることができ、尿酸塩の生成をモニタリングすることによってＸＯ活性を評価することができる。ＸＯ活性および合計オキシデレダクターゼ（ＸＯ＋ＸＤＨ）活性を評価するために、これらの反応をＮＡＤ＋（０．５ｍＭ）およびピルビン酸（５ｍＭ）の非存在下および存在下で行う。ＸＯ／ＸＤＨによる尿酸塩生成のためのこの検出方法の特異性は、いくつかの試料において、アロプリノール添加に続いての尿酸塩形成の阻害によって確認することができる。均質化された動脈のＸＯ蛋白質含有量は、市販のモノクローナル抗ＸＯ抗体（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いてウエスタンブロットによって評価することができる。血管壁へのＸＯ結合／局所化に対するペプチド処理効果もまた、市販のＸＯ抗体を用いて免疫組織化学によってテストすることもできる。
あるいはペプチドはすなわち高コレステロール血症動物の動脈における血管スーパーオキシドの更なる源であるＮＡＤＰＨオキシダーゼの発現を標的化することができる。したがって、リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてコレステロールを与えたＮＺＷウサギおよびＷＨＨＬウサギの大動脈組織における、ｐ２２ｐｈｏｘ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの臨床的サブユニットについてのｍＲＮＡを定量することができる。 全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて大動脈から抽出することができ、ｐ２２ｐｈｏｘｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＴによって分析することができる。ｐ２２ｐｈｏｘｍＲＮＡはＴｅｃｈｎｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＨＣ−３においてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡと共増幅させることができる。ＰＣＲ産物は１．２％アガロース−臭化エチジウムゲルで分析することができる。次いで、ゲルを写真にとり、個々のｐ２２ｐｈｏｘバンドおよびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡバンドの強度はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｎａｍｉｃｓ Ｐｅｒｓｏｎａｌデンシトメーターを用いてレーザーデンシトメトリースキャンニングによって測定することができる。ｐ２２ｐｈｏｘｍＲＮＡレベルの変化は、ＧＡＰＤＨのそれに対するｍＲＮＡバンド強度の相対的比率として表される。
２つのウサギモデルにおける動脈の機能的応答に対するペプチド投与の効果もまた実行することができる。ウサギのコレステロール給餌は、血管機能および脂質酸化に対する高コレステロール血症の効果を研究するために広く用いられている（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：１０４４−１０４８，１９９４；Ｇｅｅｔａｎｊａｌｉ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１：９７−１０３ ２００２）。従前の研究は、βＶＬＤＬ含有量の増加によって特徴付けられる高コレステロール血症ＮＺＷウサギにおける血漿コレステロールレベルの有意な増大を示している。ＷＨＨＬウサギもまたアテローム形成のメカニズムを調べるのに通常用いられている。ＷＨＨＬウサギもまた高脂血症であって、コレステロールを与えたＮＺＷウサギとは対照的に、ＬＤＬコレステロールの増大した血漿レベルを呈する。実験を行って、コレステロールを与えたＮＺＷウサギおよびＷＨＨＬウサギの動脈における内皮依存性弛緩剤応答に対するペプチド投与の効果を評価することができる。
これらの実験では、上記した多くの動物を用いることができる。ニュージランドホワイトウサギ（２．５−３．０ｋｇ）（Ｍｙｒｔｌｅ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．）に、１％コレステロールを含有する変更された実験室餌（Ｐｕｒｉｎａ，Ｉｎｃ．）を６週間与えることができる。ＷＨＨＬウサギ（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｉｎｃ．）血漿コレステロールレベルはほぼ８０ｍｇ／ｄｌであって、６ヶ月までに６００±２００ｍｇ／ｄｌに増大する。各群からのウサギをランダムに割り当てて、（耳動脈を介してｉ．ｖ．注入によって投与された）ペプチドまたは生理食塩水のいずれかを３ｍｇ／ｋｇ／週にて７〜８週間摂取させる。処理期間後、ウサギを安楽死させ、大動脈を切り出し、脂肪および接着性組織を清浄化することができる。等尺性張力は従前に記載されているように測定することができる（Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：１０４４−１０４８ １９９４；Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：８７４５−８７４９ １９９６）。次いで、血管を個々のリングセグメント（幅が３〜４ｍｍ）に切断し、力変位トランスジューサーから組織浴に懸濁することができる。リングセグメントを、以下の成分（ｍＭ）：ＮａＣｌ １１８；ＫＣ ｌ４．６；ＮａＨＣＯ３ ２７．２；ＫＨ２ＰＯ４ １．２；ＭｇＳＯ４ １．２；ＣａＣｌ２ １．７５；Ｎａ２ＥＤＴＡ ０．０３、およびグルコース１１．１の炭酸緩衝化クレブスヘンセライト（Ｋ−Ｈ）溶液に浸すことができる。３ｇの受動的負荷を全てのリングセグメントに適用し、実験を通じてこのレベルに維持することができる。各実験の開始において、インドメタシン処理リングセグメントをＫＣｌ（７０ｍＭ）で脱分極して、血管の最大収縮能力を決定できる。インドメタシンをこれらの条件下に加えて、シクロオキシゲナーゼ由来血管活性代謝産物の形成を阻害する。次いで、リングを徹底的に洗浄し、平衡化させ得る。引き続いての実験において、血管をＰＥ（３×１０８ １０７Ｍ）で最大下収縮させることができる（ＫＣｌ応答の４０％）。張力の発生がプラトーに近付くとき、アセチルコリン（Ａｃｈ：１０９〜３×１０６Ｍ）を強制的に浴に加えて、内皮依存性弛緩を引き起こすことができる。各用量応答プロトコルの最後に、ナトリウムニトロプルシド（ＳＮＰ：５μＭ）を加えて、残存する内皮非依存性弛緩を惹起することができる。リアルタイムデータを全ての実験のために収集し、市販のソフトウエアを用いて分析のためにＩＢＭ ＰＣにダウンロードすることができる。予備的データは、ペプチド処理動物は回復された内皮機能を示すことを示す。これらの実験は、これがアテローム性動脈硬化症の食事誘導モデルおよび遺伝的モデル双方においてそうであるかを確立する。
大動脈組織の形態学的分析を引き続いて行って、脂肪線条で病変形成に対するペプチド処理の効果を決定することができる。病変領域は、光学顕微鏡およびオイルレッドＯ染色を用いて評価することができる（Ｎａｖａｂ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４１：１４９５−１５０８ ２０００；Ｇａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２：５４５−５５２ ２００１）。動脈壁のコレステロール含有量もまた、Ｔｈｏｒｎｇａｔｅ ｅｔ ａｌによって記載される技術を用いて測定することもできる（Ｔｈｒｏｎｇａｔｅ，Ｆ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０：１９３９−１９４５ ２０００）。
実施例１４
開示されるアポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのいくつかの、血漿コレステロールに対する効果を調べた。ＺＤＦｆａ／ｆａ（レプチン受容体において欠陥を有するズッカー糖尿病脂肪ラット）雄ラット（５〜６週齢、１８０〜２２０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から得た。ラットを個々のケージに収容し、任意の介入を実行するに先立って数日間順化させた。ラットの食事は２０１６ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ １６％蛋白質げっ歯類食事よりなるものであった。食事摂取の密接なモニタリングを行った。水は自由に供給した。
次いで、ラットを種々の群（ｎ＝７〜８／群）、すなわち対照（生理食塩水）およびペプチドに分けた。採血に先立って動物を一晩（１２時間）絶食させた。動物に尾静脈を介してペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水の一方を個々に投与した（投与のタイムラインのダイアグラムについては図２０参照）。任意の体重変化を綿密にモニタリングした。血液をベースライン、および前特定間隔で得た。血漿を分離し、アリコートした。
抽出された血液についての分析は、コレステロールおよび内分泌アッセイよりなるものであった。コレステロールアッセイは、比色コレステロールアッセイを用いて行った。該アッセイはコレステロール試薬（ＴｈｅｒｍｏＤＭＡ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＴＸ）を用いて行った。内分泌アッセイは、Ｌｉｎｃｏｐｌｅｘマルチ分析物ラット内分泌キットを用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃによって行われた。ラットアディポネクチンは、マウスアディポネクチンＲＩＡ方法を用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃによって測定された。
結果
上記のように、ペプチドＡｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２、Ａｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２およびＡｃ−ｈＥ−Ｓｃ１８ＡをアポＥヌルマウス（ｎ＝４）に投与し（ｉｖ）、血漿コレステロール値を投与前（０分）、投与から５分および２時間後に測定した。結果を図２２に示す。Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２およびＡｃ−ｈＥ−４Ｆ−ＮＨ２は２時間の時点において血漿コレステロールレベルの大きな低下を示したのに対し、ペプチドＡｃ−ｈＥ−Ｓｃ１８Ａ−ＮＨ２はそのような大きな差を示さなかったが、血漿コレステロールレベルは減少した。

Claims (133)

  1. 配列番号１５のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  2. 前記脂質会合ペプチドがモデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  3. 前記脂質会合ペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  4. 前記脂質会合ペプチドが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  5. 前記アポリポ蛋白質Ｅがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものである、請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  6. 前記合成ペプチドが、Ｎ末端およびＣ末端の各々においてアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  7. 請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
  8. 細胞を請求項１記載のポリペプチドと接触させることを含む、細胞へのＬＤＬ結合を増強させる方法。
  9. 請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与する方法であって、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響される、方法。
  10. 合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、請求項９記載の方法。
  11. 被験体の細胞へのＬＤＬの結合が増強される、請求項９記載の方法。
  12. 被験体の細胞によるＬＤＬの分解が増大する、請求項９記載の方法。
  13. 被験体におけるＬＤＬコレステロールが降下する、請求項９記載の方法。
  14. 被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合が増強される、請求項９記載の方法。
  15. 被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解が増大する、請求項９記載の方法。
  16. 被験体におけるＶＬＤＬコレステロールが降下する、請求項９記載の方法。
  17. 被験体におけるコレステロールの全血漿濃度が降下する、請求項９記載の方法。
  18. 前記合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項９記載の方法。
  19. 被験体が冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、請求項９記載の方法。
  20. 有効量の請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法。
  21. 該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、請求項２０記載の方法。
  22. 被験体の細胞へのＬＤＬの結合が増強される、請求項２０記載の方法。
  23. 被験体の細胞によるＬＤＬの分解が増大する、請求項２０記載の方法。
  24. 被験体におけるＬＤＬコレステロールが降下する、請求項２０記載の方法。
  25. 被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合が増強される、請求項２０記載の方法。
  26. 被験体への細胞によるＶＬＤＬの分解が増大する、請求項２０記載の方法。
  27. 被験体におけるＶＬＤＬのコレステロールが降下する、請求項２０記載の方法。
  28. 被験体におけるコレステロールの全血漿濃度が降下する、請求項２０記載の方法。
  29. 前記合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項２０記載の方法。
  30. 被験体が冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、請求項２０記載の方法。
  31. 有効量の請求項１記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、被験体において血清コレステロールを低下させる方法。
  32. 合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、請求項３１記載の方法。
  33. 被験体の細胞へのＬＤＬの結合が増強される、請求項３１記載の方法。
  34. 被験体の細胞によるＬＤＬの分解が増大する、請求項３１記載の方法。
  35. 被験体におけるＬＤＬコレステロールが降下する、請求項３１記載の方法。
  36. 被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合が増強される、請求項３１記載の方法。
  37. 被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解が増大する、請求項３１記載の方法。
  38. 被験体におけるＶＬＤＬコレステロールが降下する、請求項３１記載の方法。
  39. 被験体におけるコレステロールの全血漿濃度が降下する、請求項３１記載の方法。
  40. 前記合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項３１記載の方法。
  41. 被験体が冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、請求項３１記載の方法。
  42. 配列番号１７のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメイン、および受容体結合ドメインペプチドを含み、前記脂質結合ドメインは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  43. 前記受容体結合ドメインペプチドがＡｐｏＥのヒト受容体結合ドメインペプチドである、請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  44. 前記受容体結合ドメインペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  45. 前記受容体結合ドメインペプチドが配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  46. 前記アポリポ蛋白質Ｅがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタ、およびイヌよりなる群から選択される種のものである、請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  47. 前記合成ペプチドが、Ｎ末端およびＣ末端の各々においてアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  48. 請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
  49. 細胞を請求項４２記載のポリペプチドと接触させることを含む、細胞へのＬＤＬ結合を増強させる方法。
  50. 請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与することを含む方法であって、それにより、血漿ＬＤＬ、血漿ＶＬＤＬ、または双方が影響される、方法。
  51. 合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、請求項５０記載の方法。
  52. 被験体への細胞へのＬＤＬの結合が増強される、請求項５０記載の方法。
  53. 被験体の細胞によるＬＤＬの分解が増大する、請求項５０記載の方法。
  54. 被験体におけるＬＤＬコレステロールが降下する、請求項５０記載の方法。
  55. 被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合が増強される、請求項５０記載の方法。
  56. 被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解が増大する、請求項５０記載の方法。
  57. 被験体におけるＶＬＤＬコレステロールが降下する、請求項５０記載の方法。
  58. 被験体におけるコレステロールの全血漿濃度が降下する、請求項５０記載の方法。
  59. 前記合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項５０記載の方法。
  60. 被験体が冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、請求項５０記載の方法。
  61. 有効量の請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、「脂質障害」を有する被験体を治療する方法。
  62. 合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、請求項６１記載の方法。
  63. 被験体の細胞へのＬＤＬの結合が増強される、請求項６１記載の方法。
  64. 被験体の細胞によるＬＤＬの分解が増大する、請求項６１記載の方法。
  65. 被験体におけるＬＤＬコレステロールが降下する、請求項６１記載の方法。
  66. 被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合が増強される、請求項６１記載の方法。
  67. 被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解が増大する、請求項６１記載の方法。
  68. 被験体におけるＶＬＤＬコレステロールが降下する、請求項６１記載の方法。
  69. 被験体におけるコレステロールの全血漿濃度が降下する、請求項６１記載の方法。
  70. 前記合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項６１記載の方法。
  71. 被験体が冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、請求項６１記載の方法。
  72. 有効量の請求項４２記載の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドまたはその組成物を被験体に投与することを含む、被験体において血清コレステロールを低下させる方法。
  73. 合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、請求項７２記載の方法。
  74. 被験体の細胞へのＬＤＬの結合が増強される、請求項７２記載の方法。
  75. 被験体の細胞によるＬＤＬの分解が増大する、請求項７２記載の方法。
  76. 被験体におけるＬＤＬコレステロールが降下する、請求項７２記載の方法。
  77. 被験体の細胞へのＶＬＤＬの結合が増強される、請求項７２記載の方法。
  78. 被験体の細胞によるＶＬＤＬの分解が増大する、請求項７２記載の方法。
  79. 被験体におけるＶＬＤＬコレステロールが降下する、請求項７２記載の方法。
  80. 被験体におけるコレステロールの全血漿濃度が降下する、請求項７２記載の方法。
  81. 前記合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項７２記載の方法。
  82. 被験体が冠動脈疾患、慢性関節リウマチ、および／または全身性狼瘡を有する、請求項７２記載の方法。
  83. 請求項１記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  84. ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む、請求項８３記載の核酸。
  85. 請求項８３記載の核酸を含むベクター。
  86. 請求項８３記載の核酸を含む宿主細胞。
  87. 真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞である、請求項８６記載の宿主細胞。
  88. 請求項４記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  89. ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む、請求項８８記載の核酸。
  90. 請求項８８記載の核酸を含むベクター。
  91. 請求項８８記載の核酸を含む宿主細胞。
  92. 真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞である、請求項９１記載の宿主細胞。
  93. 請求項４２記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  94. ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む、請求項９３記載の核酸。
  95. 請求項９３記載の核酸を含むベクター。
  96. 請求項９３記載の核酸を含む宿主細胞。
  97. 真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞である、請求項９６記載の宿主細胞。
  98. 請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
  99. 請求項４記載のポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
  100. 請求項４２記載のポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
  101. 請求項８３、８８、または９３記載の核酸を含む、組換え細胞。
  102. 請求項１、４または４２記載のポリペプチドを産生する、組換え細胞。
  103. 請求項８３、８８、または９３記載の核酸を含む、トランスジェニック非ヒト被験体。
  104. 動物または植物である、請求項１０３記載のトランスジェニック被験体。
  105. 請求項１、４または４２記載のポリペプチドを発現する、トランスジェニック非ヒト被験体。
  106. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインはスクランブル化される、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  107. 配列番号５８のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  108. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、該脂質会合ペプチドはスクランブル化される、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  109. 配列番号５９のアミノ酸配列、および受容体結合ドメインペプチドを含み、前記脂質結合ドメインは前記受容体結合ドメインに共有結合により連結されている、アポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメイン。
  110. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドの双方はスクランブル化される、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  111. 細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、ＨＤＬ機能を増強させる方法。
  112. 細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含み、該ペプチドはパラオキサナーゼを増加させることによって血漿からの脂質ヒドロペルオキシドを除去する、炎症を減少させる方法。
  113. 細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、血漿パラオキソナーゼ（ＰＯＮ−１）活性を増大させる、方法。
  114. 細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、アテローム形成を阻害する方法。
  115. 細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含み、血漿コレステロールレベルは減少し、かつＨＤＬ機能は増大する、アテローム形成を阻害する方法。
  116. 細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、血管壁からアテローム形成性リポ蛋白質を除去する方法。
  117. 細胞を開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドと接触させることを含む、ＬＤＬのアテローム形成性を減少させる方法。
  118. 開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬは影響されることを含む、方法。
  119. 開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬは影響されることを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、方法。
  120. 開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬは影響されることを含み、ＰＯＮ活性は増大し、脂質ヒドロペルオキシドは除去され、アテローム形成性リポ蛋白質レベルは血漿中において低下し、内皮機能は改善され、および／またはアテローム形成性リポ蛋白質は血管壁から除去される、方法。
  121. 開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿ＨＤＬは影響されることを含み、該被験体は炎症性腸状態（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性結腸炎、クローン病、自己免疫溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー氏病、血小板減少症紫斑病、アレルギー；喘息、アトピー性疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋障害、糸球体腎炎、再生不良性貧血、および器官移植後の拒絶を有する、方法。
  122. 有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含む、「炎症障害」を有する被験体を治療する方法。
  123. 有効量の開示される合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、またはその組成物を被験体に投与することを含み、該合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与される、「炎症障害」を有する被験体を治療する方法。
  124. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインはドメインがスイッチされた向きに前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  125. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインは逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  126. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、該脂質会合ペプチドは逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  127. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドの双方は逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  128. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインよりなる、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  129. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインよりなり、該受容体結合ドメインは修飾されているか、または改変されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  130. アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインよりなり、該受容体結合ドメインは変異され、スクランブル化され、および／または逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  131. 脂質会合ペプチドよりなる、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  132. 脂質会合ペプチドよりなり、該脂質会合ペプチドは修飾されているか、または改変されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
  133. 脂質会合ペプチドよりなり、該脂質会合ペプチドは変異され、スクランブル化され、および／または逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド。
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